腦信號蛋白-4d結合分子治療神經變性疾病的用圖
【專利摘要】本文提供了減輕患有神經變性疾病的對象中癥狀的方法，包括向該對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白?4D(SEMA4D)或其叢蛋白?B1或叢蛋白?B2受體的分離的結合分子。還提供與選自VX15/2503或67的參照單克隆抗體特異性結合相同的SEMA4D表位的分離的結合分子。
【專利說明】腦信號蛋白-4D結合分子治療神經變性疾病的用途
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 該國際專利申請要求2014年6月16日提交的美國臨時專利申請號62/012,805、 2014年4月14日提交的美國臨時申請號61/979,384?及2013年10月21日提交的美國臨時申 請號61/893,814的權益，其內容各自通過引用全文納入本文。
[0003] 對提交的序列表的引用
[0004] 用本申請提交的電子提交ASCII文本文件序列表（名稱iSSOOS-lSTASeseq- istg.txt;大小 ：32,256 字節；和創建日期 ：2014 年 10 月 20 日）的內容通過引用全文納入本 文。
[0005] 發明背景
[0006] 腦信號蛋白4D(SEMA4D)，也稱作CD100,是一種屬于腦信號蛋白基因家族的跨膜蛋 白（例如，SEQ ID N0:1(人）；SEQ ID N0:2(鼠））。沈MA4D在細胞表面上表達為同二聚體，但 在細胞激活之后，SEMA4D可通過蛋白水解切割從細胞表面上釋放W生成該蛋白質的溶解形 式 SSEMA4D，運也是有生物活性的。參見 Suzuki 等，化Uire Rev. Immunol. 3:159-167(2003); Kiku1:ani等，Na1:ure Immunol .9:17-23(2008)。
[0007] SEMA4D在包括脾臟、胸腺和淋己結的淋己器官中W及如腦、屯、臟和腎臟的非淋己 器官中W高水平表達。在淋己器官中，SEMA4D在靜息T細胞上大量表達，但是僅在靜息B細胞 和抗原呈遞細胞(APC)如樹突細胞(DC)上弱表達。然而，在用各種免疫刺激激活之后，其表 達在運些細胞中上調。細胞激活也增加了可溶性沈MA4D從免疫細胞的釋放。
[000引SEMA4D設及神經變性疾病、自身免疫疾病、脫髓銷性疾病、和某些癌癥的發展。然 而，阻斷沈MA4D信號轉導對包括大腦和脊髓中樞神經系統(CNS)的功能和組織W及由CNS控 制的行為的影響仍有待闡明。運是重要的，因為CNS的變化對對象的行為和生活質量有顯著 影響。具體地，運種變化可能影響對象的神經精神行為、認知行為和運動技能。因此，仍然需 要減輕與神經變性疾病相關的癥狀的對神經變性疾病的治療。
[0009] 發明簡述
[0010] 本文公開了使用腦信號蛋白4D結合分子W減輕患有神經變性疾病的對象中癥狀 的方法。按照本文所示的本發明的方面，提供了用于改善患有神經變性疾病的對象中的癥 狀的方法，包括向該對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白4D(SEMA4D)并抑制、阻止、防 止、逆轉或延緩SEMA4D效應的分離的結合分子。
[0011] 按照本文所示的方面，提供了用于治療患有神經變性疾病的對象的方法，包括向 該對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白4D(SEM4D)的分離的結合分子，其中與SEM4D 結合的作用是改善與該疾病相關的癥狀。
[0012] 提供了用于減輕患有神經變性疾病的對象中的癥狀的方法，包括向該對象給予有 效量的特異性結合腦信號蛋白-4D(SEMA4D)的分離的結合分子。在運類方法的某些實施方 式中，結合分子抑制SEMA4D與其受體或其受體的部分的相互作用。在運類方法的某些實施 方式中，受體選自叢蛋白-B1和叢蛋白-B2。在運類方法的某些實施方式中，結合分子抑制 SEMA4D-介導的叢蛋白-B1信號轉導。在運類方法的某些實施方式中，分離的結合分子與選 自VX15/2503或67的參照單克隆抗體特異性結合相同的SEMA4D表位。在運類方法的某些實 施方式中，分離的結合分子競爭性抑制選自VX15/2503或67的參照單克隆抗體與SEMA4D的 特異性結合。在運類方法的某些實施方式中，分離的結合分子包括抗體或其抗原結合片段。 在運類方法的某些實施方式中，抗體或其抗原結合片段是單克隆抗體VX15/2503或67。在運 類方法的某些實施方式中，抗體或其抗原結合片段的可變重鏈(VH)含有VHCDR 1-3且可變 輕鏈(化)含有化CDR 1-3,其中VHCDR 1-3分別包含SEQ ID N0:6、7和8,化CDR 1-3分別包含 869 10^:14、15和16。在運類方法的某些實施方式中，￥聞^化分別包含沈9 10^:9和569 ID NO: 17或SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 18。在任意前述方法的某些實施方式中，神經變性 疾病選自下組:阿爾茨海默病、帕金森病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟失調、肌萎縮側索 硬化(ALS)、額顛性癡呆(FTDKHIV-相關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障礙、或其組合。在前 述方法的某些實施方式中，神經變性疾病是阿爾茨海默病或亨延頓氏病。在任意前述方法 的某些實施方式中，該癥狀選自下組:神經精神癥狀、認知癥狀、運動功能障礙及其任意組 合。在任意前述方法的某些實施方式中，神經精神癥狀選自下組:減少焦慮狀行為、改善空 間記憶、增加移動及其任意組合。
[0013] 提供了減輕患有神經變性疾病的對象中癥狀的方法，包括向該對象給予有效量的 特異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中結合分子競爭性抑制選自VX15/2503或67的參 照單克隆抗體與SEMA4D的特異性結合。在運類方法的某些實施方式中，結合分子抑制 SEMA4D與其受體或其受體的部分的相互作用。在運類方法的某些實施方式中，受體選自叢 蛋白-B1和叢蛋白-B2。在運類方法的某些實施方式中，結合分子抑制SEMA4D-介導的叢蛋 白-B1信號轉導。在運類方法的某些實施方式中，分離的結合分子包括抗體或其抗原結合片 段。在運類方法的某些實施方式中，抗體或其抗原結合片段是單克隆抗體VX15/2503或67。 在運類方法的某些實施方式中，抗體或其抗原結合片段的可變重鏈(VH)含有VHCDR 1-3且 可變輕鏈(VL)含有化CDR 1-3,其中V肥DR 1-3分別包含沈Q ID N0:6、7和8,化CDR 1-3分別 包含569 10^:14、15和16。在運類方法的某些實施方式中，￥財^化分別包含569 10^:9 和SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 18。在任意前述方法的某些實施方式中，神 經變性疾病選自下組:阿爾茨海默病、帕金森病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟失調、肌萎 縮側索硬化(ALS)、額顛性癡呆(FTDKHIV-相關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障礙、或其組 合。在任意前述方法的某些實施方式中，神經變性疾病是阿爾茨海默病或亨延頓氏病。在任 意前述方法的某些實施方式中，該癥狀選自下組:神經精神癥狀、認知癥狀、運動功能障礙 及其任意組合。在任意前述方法的某些實施方式中，神經精神癥狀選自下組:減少焦慮狀行 為、改善空間記憶、增加移動及其任意組合。
[0014] 本文提供了治療患有神經變性或神經炎性疾病的對象，或在患有神經變性或神經 炎性疾病的對象中達到所需結果的其他方法。提供了用于治療患有神經變性疾病的對象的 方法，包括向該對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白4D(SEMA4D)的分離的結合分子， 其中與SEMA4D的結合作用是減輕與該疾病相關的癥狀。提供了用于促進患有神經變性疾病 的對象中髓銷形成的方法，包括向該對象給予有效量的特異性結合SEM4D的分離的結合分 子，其中該結合分子調節星形膠質細胞介導的少±膠質細胞-髓銷功能活性。提供了用于防 止患有神經變性疾病的對象中神經細胞死亡的方法，包括向該對象給予有效量的特異性結 合SEMA4D的分離的結合分子，其中該結合分子調節星形膠質細胞介導的突觸活性。提供了 用于防止患有神經炎性或神經變性疾病的對象中血腦屏障損傷的方法，包括向該對象給予 有效量的特異性結合SEM4D的分離的結合分子，其中該結合分子調節星形膠質細胞介導的 血腦屏障的完整性維持。提供了用于防止患有、確定患有或疑似患有神經炎性或神經變性 疾病的對象中星形膠質細胞活化的方法，包括向該對象給予有效量的特異性結合SEMA4D的 分離的結合分子，其中該結合分子調節星形膠質細胞介導的血腦屏障的完整性維持。提供 了用于維持或恢復患有、確定患有或疑似患有神經炎性或神經變性疾病的對象中星形膠質 細胞介導的少±膠質細胞前體細胞(OPC)營養支持的方法，包括向該對象給予有效量的特 異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中該結合分子防止星形膠質細胞過程的回縮W及 OPC向損傷區域的趨化性移動。提供了保護抑制性神經元在早期阿爾茨海默病中免于變性 的方法，包括向患有、確定患有或疑似患有早期阿爾茨海默病的對象給予有效量的特異性 結合SEMA4D的分離的結合分子，其中該結合分子恢復對象中NYP-陽性神經元、生長激素抑 制素陽性神經元的數量，或同時恢復兩者。在前述方法的某些實施方式中，結合分子抑制 SEMA4D與其受體或其受體的部分的相互作用。在前述方法的某些實施方式中，受體選自叢 蛋白-B1和叢蛋白-B2。在前述方法的某些實施方式中，結合分子抑制SEMA4D-介導的叢蛋 白-B1信號轉導。在前述方法的某些實施方式中，分離的結合分子與選自VX15/2503或67的 參照單克隆抗體特異性結合相同的SEMA4D表位。在前述方法的某些實施方式中，分離的結 合分子競爭性抑制選自VX15/2503或67的參照單克隆抗體與SEMA4D的特異性結合。在前述 方法的某些實施方式中，分離的結合分子包括抗體或其抗原結合片段。在前述方法的某些 實施方式中，抗體或其抗原結合片段是單克隆抗體VX15/2503或67。在前述方法的某些實施 方式中，抗體或其抗原結合片段的可變重鏈(VH)含有VHCDR 1-3且可變輕鏈(VL)含有化CDR 1-3,其中V肥DR 1-3分別包含沈Q ID N0:6、7和8,化CDR 1-3分別包含沈Q ID N0:14、15和 16。在前述方法的某些實施方式中，￥聞^化分別包含56〇10^:9和56〇10^:17或56〇10 NO: 10和SEQ ID NO: 18。在前述方法的某些實施方式中，神經變性疾病選自下組:阿爾茨海 默病、帕金森病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟失調、肌萎縮側索硬化(ALS)、額顛性癡呆 (FTDKHIV-相關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障礙、或其組合。在前述方法的某些實施方式 中，神經變性疾病是阿爾茨海默病或亨延頓氏病。在前述方法的某些實施方式中，由運些方 法減輕的對象的癥狀選自下組:神經精神癥狀、認知癥狀、運動功能障礙及其任意組合。在 前述方法的某些實施方式中，由運些方法減輕的對象的神經精神癥狀選自下組:減少焦慮 狀行為、改善空間記憶、增加移動及其任意組合。在前述方法的某些實施方式中，通過處理 來自對象的樣品和圖像來確定該對象患有神經變性疾病。
[0015] 附圖簡述
[0016] 圖1:實施例中所述的實驗方案的示意圖。
[0017] 圖2:測量用抗-SEMA4D抗體r'MAb 67")或對照同種型r'MAb 2B穿'）治療的CVN小鼠 中焦慮狀行為的體內CNV模型。總移動（圖2A)和曠場中央的移動（圖2B)。
[001引圖3:在放射臂水迷宮（圖3A)中測量用抗-SEMA4D抗體r'MAb 67")或對照同種型治 療的CVN小鼠的空間記憶的體內CVN模型（圖3B)。
[0019] 圖4:測量用抗-沈MA4D抗體r'MAb 67")或對照同種型治療的CVN小鼠中GABA能突 觸密度和囊泡GABA轉運蛋白（VGAT)濃度的體內CVN模型。VGAT陽性囊泡（圖4A)和每個囊泡 的VGAT染色強度水平（圖4B)。
[0020] 圖5:測量用抗-SEMA4D抗體（"MAb 67")和對照同種型治療的小鼠中焦慮狀行為的 體內YAC128模型。進入曠場中央(圖5A)和花費的時間（圖5B)。
[0021] 圖6:測量用抗-SEMA4D抗體（"MAb 67")和對照同種型治療的小鼠的空間記憶的體 內YAC128模型。組圖A =試驗1(圖6A)，并且組圖B =試驗2(圖她）。
[0022] 圖7:測量用抗-SEMA4D抗體r'MAb 67")或對照同種型治療的小鼠中皮質（圖7A)和 脫服體(圖7B)體積的體內YAC128模型。
[0023] 圖8:測量用抗-SEMA4D抗體r'MAb 67")或對照同種型治療的小鼠的睪丸變性的體 內YAC128模型。
[0024] 圖9A-P:對在正常大鼠脊髓中表達沈MA4D、叢蛋白-B1和CD72的細胞類型的免疫組 化分析。Nkx2.2(組圖B)是少±膠質細胞前體細胞標志物，膠質細胞原纖維酸性蛋白（GFAP) (組圖G)是星形膠質細胞標志物，并且Ibal (組圖N)是小膠質細胞標志物。組圖A、E、I和Μ顯 示合并的圖像，并且組圖D、H、L和Ρ顯示用DAPI染色的相同切片W使細胞核可視化。
[0025] 圖10:正常(頂部Ξ個組圖）和CVN(底部Ξ個組圖）小鼠中淀粉樣病變和神經膠質 活化的DAB免疫組化分析。下托切片對淀粉樣-β1-42(左組圖）、小膠質細胞標志物化al (中 組圖）和星形膠質細胞標志物GFAP染色。
[0026] 圖11A-11B:CVN阿爾茨海默病小鼠模型中叢蛋白-B1和叢蛋白-B2受體的表達特征 和表征。圖11A顯示在正常（頂部組圖）和CVN(底部組圖）小鼠中對叢蛋白-B1表達的免疫組 化分析。就叢蛋白-B1、和GFAP、W及DAPI對大腦切片染色W使細胞核可視化。圖11B顯示在 抑制呢MA4D信號轉導之后叢蛋白-B1(左圖）和叢蛋白-B2(右圖）的表達水平。
[0027] 圖12:在正常（頂部組圖）和YAC128(底部組圖）小鼠中對叢蛋白-B2表達的免疫組 化分析。就叢蛋白-B2、和GFAP、W及DAPI對大腦切片染色W使細胞核可視化。
[0028] 圖13: SEMA4D信號轉導可在健康和疾病的星形膠質細胞功能的調節中起到的作用 的示意圖。左圖：叢蛋白+ (星形膠質細胞外表面的陰影區域)星形膠質細胞過程在SEMA4D+ NIKX2.化少±膠質細胞前體細胞(0PC)之間交錯并且提供營養支持(SEMA4D+，顯示為0PC外 表面的陰影區域）。在CNS疾病中，活化的星形膠質細胞上調叢蛋白表達并且通過SEMA4D信 號轉導回縮過程。局部地，運導致降低的營養支持和增加的趨化性驅動的0PC向損傷區域的 移動，同時在損傷部位缺少星形膠質細胞的支持阻止了髓銷再生。中間組圖：在CNS疾病中， 星形膠質細胞活化導致叢蛋白表達上調（星形膠質細胞外表面的陰影區域）、增加的沈MA4D 信號轉導和過程回縮，其導致神經元軸突導向喪失、營養支持減少、和/或谷氨酸攝入/釋放 失調。最終，根據疾病刺激的嚴重性，可能發生突觸損失和之后的興奮性神經元死亡。右組 圖：CNS疾病誘導的星形膠質細胞活化通過叢蛋白增加了沈MA4D信號轉導（星形膠質細胞外 表面的陰影區），運導致星形膠質細胞足過程(astrocytic foot processes)的回縮，如水 通道蛋白-4的再分布所示。運導致了 BBB的失調和滲透，從而促進內皮細胞炎癥和之后的白 細胞進入CNS。
[0029] 圖14:顯示在正常大鼠中取向與GFAP+星形膠質細胞過程緊密相關的沈MA4D-表達 0PC的免疫組化分析。就SEMA4D(0PC)、和GFAP(星形膠質細胞）、w及DAPI對大腦切片染色W 使細胞核可視化。
[0030] 圖15A、B、C、D:分別測量用抗-SEMA4D抗體r'MAb 67")或對照同種型治療的CVM小 鼠中下托或齒狀回內生長激素抑制素-(組圖A)、神經膚-Y(NPY)-(組圖B)、NPY受體1 (NPYIR)(組圖C)、或NPY受體2 (NPY2R)(組圖D)陽性信號轉導的體內CVN模型。誤差線指出標 準差。通過用Bonferroni多重比較檢驗的單因素 ANOVA，V' =p<〇.〇5并且"***" =p< 0.005。
[0031 ]圖16:正常和CVN小鼠中水通道蛋白-4表達特征的免疫組化分析。
[0032] 圖17:測量在加入抗-SEMA4D單克隆抗體VX15/2503之后血腦屏障完整性的體外 DIV-BBB 模型。
[0033] 圖18A-18B:顯示大鼠星形膠質細胞中星形膠質細胞活化的免疫細胞化學分析。圖 18A顯示在單獨或在用硫代乙酷胺(TAA)預處理之后用SEMA4D處理的培養大鼠星形膠質細 胞中星形膠質細胞活化的免疫細胞化學分析，反映為GFAP陽性面積的相對增加。圖18B是單 獨用SEMA4D或與前列腺素 D2組合處理的培養大鼠星形膠質細胞中的星形膠質細胞活化的 免疫細胞化學分析，反映為F-肌動蛋白與G-肌動蛋白比率。誤差線代表標準差。通過用 Bonf erron i多重比較檢驗的單因素 AN0VA/V' = P < 0.05。
[0034] 發明詳述
[0035] I.定義
[0036] 需要注意，術語"一個"或"一種"實體指一種或多種該實體;例如，一種"抗-SEMA4D 抗體"應理解為代表一種或多種抗-SEMA4D抗體。如此，術語"一個'（或"一種"）、"一個或多 個"和"至少一個"在本文中可互換使用。
[0037] 此外，本文使用"和/或"時應視作具體公開了兩種特征或組分的每一種，有或沒有 另一種。因此，本文短語"A和/或B"中使用的術語"和/或"旨在包括"A和B"、"A或B"、"A"(單 獨）、和"B"(單獨）。同樣，短語如"A、B、和/或C"中使用的術語"和/或"旨在包括各種W下實 施方式:A、B、和C;A、B、或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(單獨）；B(單獨）；和C(單 獨)。
[0038] 除非另有定義，本文使用的科技術語與本發明所屬領域普通技術人員所理解的通 常含義相同。例如，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology(《生物 醫藥和分子生物學簡明詞典》），Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社（CRC Press);The Dictionary of Cell and Mole州lar Biology(《細胞和分子生物學詞典》），第3版，1999， 學術出版社（Academic Press);和Oxford Dictionary OfBiochemistiT And Molecular Biology (《牛津生物化學和分子生物學辭典》），修訂，2000,牛津大學出版社（Oxford 化iversity Press),向技術人員提供了本發明使用的很多術語的常用詞典。
[0039] 單位、前綴和符號W它們的國際單位制（SI)接受的形式表示。數值范圍包括限定 該范圍的數值。除非另外說明，氨基酸W氨基到簇基的取向從左到右書寫。本文提供的標題 不是本發明的各種方面的限制，可W參考說明書整體理解本發明的各種方面或實施方式。 因此，下面緊接著定義的術語完全參考說明書全文定義。
[0040] 本文所用術語"非天然產生的"物質、組合物、實體，和/或物質、組合物、實體的任 意組合，或其任意語法變體是條件術語，其明確排除，但僅排除本領域普通技術人員熟知的 "天然產生的"，或者可W是在任何時間，由法官或行政機關或司法機關確定或理解為"天然 產生的"物質、組合物、實體，和/或物質、組合物、實體的任意組合的那些形式。
[0041] 本文所用術語"神經變性疾病"或"神經變性病癥"是指特征為神經元在神經系統 的一個或多個區域中死亡并且隨后受影響的部分功能損傷的中樞神經系統(CNS)疾病。神 經變性疾病的示例包括，但不限于，阿爾茨海默病、帕金森病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共 濟失調、肌萎縮側索硬化(ALS)、額顛性癡呆(FTDKHIV-相關認知障礙(HAND，HIV-相關神經 變性疾病）、CNS狼瘡和輕度認知障礙。神經變性疾病對受影響的個體的生活及其家庭和整 個社會有巨大影響。
[0042] 本文所用術語"阿爾茨海默病"是指初始表現為部分健忘，并且之后表現為煩躁不 安、定向障礙、失語癥、失認癥或失用癥(認知減退）、癡呆和有時表現為高興或抑郁的進行 性疾病。該病一般在40至90歲的年齡開始并且主要影響女性。至于其流行情況，估計占65歲 W上人群的約13%。
[0043] 本文所用術語"亨廷頓氏病"是指一種神經變性疾病，其是由于亨廷頓蛋白（由HTT 基因表達）的N-末端處聚谷氨酷胺通道的延伸導致，其中該延伸可W是在突變的蛋白質 (mHTT)中超過35-40個重復氨基酸谷氨酷胺。該疾病伴隨不同大腦區域中的進行性神經細 胞死亡而存在，包括紋狀體的中等尺寸的多棘神經元中的毒性，其確定出現典型的動作不 協調或移動如"亨廷頓舞蹈病"。mHTT的作用機制已經描述為與野生型蛋白相比功能的獲得 和喪失，并且包括獲得或喪失與不同細胞隔室中各種蛋白質的相互作用的能力。
[0044] 術語"治療有效量"是指對"治療"對象或哺乳動物中的疾病或病癥而言有效的抗 體、多膚、多核巧酸、小有機分子或其他藥物的量。在神經變性疾病的情況中，藥物的治療有 效量可減輕疾病的癥狀;減少、降低、延緩或停止癥狀出現;減少、降低、延緩癥狀的嚴重性； 抑制，例如，阻止、延緩、防止、停止或逆轉癥狀的表現;一定程度上緩解與該疾病相關的一 個或多個癥狀;降低發病率和死亡率;改善生活質量;或運類效果的組合。
[0045] 本文術語"癥狀"是指，例如，1)神經精神癥狀，2)認知癥狀，和3)運動功能障礙。神 經精神癥狀的示例包括，例如，焦慮狀行為。認知癥狀的示例包括，例如，學習和記憶缺陷。 運動功能障礙的示例包括，例如，移動。
[0046] 術語，如"治療"或"處理'或"減較'或"改善"同時指1)治愈、減緩、減少診斷的病理 病癥或疾病的癥狀、逆轉和/或終止診斷的病理病癥或疾病的進展和2)預防和/或減緩祀向 的病理病癥或疾病的發展的預防性措施。因此，需要治療的那些人包括已經患有疾病的那 些人；易于患有疾病的那些人;和需要預防疾病的那些人。有益或所需的臨床結果包括但不 限于可檢測或不可檢測的緩解癥狀、減輕疾病程度、疾病狀態穩定（即不惡化）、延遲或減緩 疾病進展、改善或減輕疾病狀態和緩解(部分或完全）。"治療"也可W指與不接受治療的期 望存活相比延長生存期。需要治療的人包括已經患有病癥或疾病的人，W及傾向于患有病 癥或疾病的人或需預防病癥或疾病的人。
[0047] 部象'或"個體"或"動物'或"患苦'或"哺乳動物'指需要診斷、預防或治療的任何 對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物對象包括人、家養動物、家畜和動物園動物、競技動物 或寵物，如犬、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛、熊等。
[0048] 本文所用的術語給予"抗-SEMA4D抗體時能夠獲益的對象"和"需要治療的動物"包 括能夠從給予抗-SEMA4D抗體或其它SEMA4D結合分子和/或從用抗-SEMA4D抗體或其它 SEMA4D結合分子治療（即減輕或預防疾病）中獲益的對象(如哺乳動物對象），該抗體或結合 分子可用于(例如)檢測抗-SEMA4D多膚(如用于診斷方法）。
[0049] 廣義來說，本發明的"結合分子"或"抗原結合分子"指特異性結合抗原決定簇的分 子。在一個實施方式中，結合分子特異性結合SEMA4D，例如，約150W)a的跨膜SEMA4D多膚或 約120kDa的可溶性沈MA4D多膚(通常稱為SSEMA4D)。在另一個實施方式中，本發明的結合分 子是抗體或其抗原結合片段。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括抗體分子的至 少一個重鏈或輕鏈CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體 分子的至少2個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分 子的至少3個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分子 的至少4個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分子的 至少5個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分子的至 少6個CDR。
[0050]本發明設及減輕患有神經變性疾病的對象中癥狀的方法，包括向對象給予抗- SEMA4D結合分子，例如抗體，或其抗原結合片段、變體或衍生物。除非特別提到完整大小的 抗體如天然產生的抗體，術語"抗-SEMA4D抗體"包括完整大小的抗體W及運種抗體的抗原 結合片段、變體、類似物或衍生物，例如天然產生的抗體或免疫球蛋白分子，或W類似于抗 體分子的方式結合抗原的經工程改造抗體分子或片段。
[0051 ]本文所用的"人"或"全人"抗體包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，包括分 離自人免疫球蛋白文庫或不表達內源性免疫球蛋白的一種或多種人免疫球蛋白轉基因動 物的抗體，如下文所述，例如，Kucherlapati等的美國專利號5,939,598。"人"或"全人"抗體 也包括至少含重鏈可變區或至少重鏈和輕鏈可變區的抗體，其中所述可變區具有人免疫球 蛋白可變區的氨基酸序列。
[0052] "人"或"全人"抗體還包括如上所述包含本文所述抗體分子(如VH區和/或區）的 變體(包括衍生物)或基本由其組成或由其組成的"人"或"全人"抗體，所述抗體或其片段免 疫學特異性結合于沈MA4D多膚或其片段或變體。可利用本領域技術人員已知的標準技術在 編碼人抗-SEM4D抗體的核巧酸序列中引入突變，包括但不限于，引起氨基酸取代的定點誘 變和PCR介導的誘變。在一些實施方式中，相對于參照VH區、V肥DR1、V肥DR2、VHCDR3、化區、 VLCDR1、化CDR2或化CDR3，該變體(包括衍生物)編碼少于50個氨基酸取代、少于40個氨基酸 取代、少于30個氨基酸取代、少于25個氨基酸取代、少于20個氨基酸取代、少于15個氨基酸 取代、少于10個氨基酸取代、少于5個氨基酸取代、少于4個氨基酸取代、少于3個氨基酸取代 或少于2個氨基酸取代。
[0053] 在某些實施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代，如下所詳述。或者，也可沿 所有或一部分編碼序列隨機引入突變，例如通過飽和誘變引入，可篩選所得突變體的生物 學活性W鑒定保持活性(例如，結合SEMA4D多膚，如結合人SEMA4D、鼠 SEMA4D或同時結合人 和鼠 SEMA4D的能力）的突變體。"人"或"全人"抗體的運類變體（或其衍生物化可稱為"優 化"或"就抗原結合優化"的人或全人抗體，包括對抗原親和性提高的抗體。
[0054] 術語"抗體"和"免疫球蛋白"在本文中可互換使用。抗體或免疫球蛋白至少包括重 鏈可變區，通常至少包括重鏈和輕鏈的可變區。較好地理解了脊椎動物系統中的基本免疫 球蛋白結構。參見例如，化rlow等（1988)《抗體：實驗室手冊KAntibodies :A LaboratoiT Manual)(第2版;冷泉港實驗室出版社（Cold Spring 化rbor Laboratoiy Press))。
[0055] 本文所用術語"免疫球蛋白"包括可在生物化學上區分的各種類型多膚。本領域技 術人員應理解，重鏈分為伽馬、繆、阿爾法、德爾塔或伊普西龍（丫，μ，α，δ，ε)，其中還有一些 亞類(如丫 1-丫 4)。該鏈的特性決定抗體"類則'分別為1邑6、1邑1、1邑4成6或1邑6。免疫球蛋白 亞類（同種型）如1邑61成62成63成64、1邑41、1邑42等已被充分表征，且已知賦予功能特化。 根據本文公開內容，本領域技術人員不難區分運些類別和同種型的修飾形式，因此，它們涵 蓋在本發明范圍內。所有免疫球蛋白類別明顯屬于本發明范圍，W下討論通常針對免疫球 蛋白分子的IgG類。在IgG中，標準的免疫球蛋白分子包括分子量約為23,000道爾頓的兩條 相同輕鏈多膚和分子量為53,000-70,000的兩條相同重鏈多膚。運四條鏈通常在?'構型中 由二硫鍵連接起來，其中輕鏈從Y的口部開始托起重鏈，并延續通過可變區。
[0056] 輕鏈分類為K或λ。各重鏈類可與K或λ輕鏈結合。通常，輕鏈和重鏈互相共價結合， 并且當由雜交瘤、Β細胞或遺傳工程改造的宿主細胞生成免疫球蛋白時，兩條重鏈的"尾"部 分通過共價二硫鍵或非共價連接結合在一起。在重鏈中，氨基酸從Υ構型的分叉末端處的Ν- 端到各條鏈的底部處的C-端。
[0057] 輕鏈和重鏈都劃分成結構和功能同源性的區域。從功能角度使用術語"恒定"和 "可變"。在運方面，應理解輕鏈(WJ^VK)和重鏈(VH)部分的可變區決定抗原識別和特異性。 相反，輕鏈(化)和重鏈(一般為CHUCH2或C冊）的恒定區產生重要的生物學特性，例如分泌、 跨胎盤移動、Fc受體結合、補體結合等。按照習慣，恒定區結構域的編號隨著遠離抗原結合 位點或抗體的氨基端而增加。N-端區是可變氣并且C-端區是恒定區；C冊和化結構域一般分 別包括重鏈和輕鏈的簇基端。
[0058] 如上所述，可變區允許抗體選擇性識別并特異性結合抗原上的表位。也就是說，抗 體的化和VH結構域、或運些可變區內的互補決定區（CDR)亞組組合形成確定Ξ維抗原結合 位點的可變區。運種四聯抗體結構形成在Y的每條臂末端存在的抗原結合位點。更具體地， 所述抗原結合位點由各VH和化鏈上的Ξ個CDR確定。在一些情況下，例如在衍生自羊駝種類 或根據羊駝免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可僅由 重鏈構成而不含輕鏈。參見例如，Hamers-hsterman等，Na1:ure 363:446-448 (1993)。
[0059] 在天然產生的抗體中，每個抗原結合結構域上出現的六個"互補決定區"或乂DR" 是短的非郵連氨基酸序列，隨著抗體在水性情況中確定其Ξ維構型時，它們特別定位W形 成抗原結合結構域。抗原結合結構域中的其余氨基酸稱為"構架"區，顯示較小的分子間差 異。構架區主要采用β-片層構象，CDR形成連接β-片層結構和某些情況下形成部分β-片層結 構的環。因此，構架區用于通過鏈間非共價相互作用形成為CD財是供正確方向位置的支架。 定位的CDR形成的抗原結合結構域確定了與免疫反應性抗原上的表位互補的表面。運種互 補表面促進了抗體與其互補表位的非共價結合。對于任何給定的重鏈或輕鏈可變區，本領 域普通技術人員能容易地鑒定分別包含CDR和構架區的氨基酸，因為它們已被精確定義(見 下文）。
[0060] 除非明確表述為相反的含義，否則在本領域內所使用和/或接受的某一術語有兩 種或多種定義的情況下，本文所用的術語定義應包括所有運些含義。具體示例是使用術語 "互補決定區"rCDR")描述在重鏈和輕鏈多膚的可變區內發現的非郵連抗原結合位點。運 一特定區域的描述可參見Kabat等（1983)美國健康和公共服務部（U.S.Dept.of Health and Human Services)，"Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫 學重要性的蛋白質序列Γ W及Chothia和LeskJ.Mol .Biol. 196:901-917(1987)(上述文獻 通過引用全文納入本文），互相比較時所述定義包括重疊的氨基酸殘基或氨基酸殘基亞組。 盡管如此，應用任一定義指抗體或其變體的CDR均應落入本文所定義和使用的術語范圍。合 適氨基酸殘基包括上文引用的各參考文獻中定義的CDR，所述氨基酸殘基列于下表1W作比 較。包括特定CDR的準確殘基編號根據CDR的序列和大小而變化。在抗體的可變區氨基酸序 列給定的情況下，本領域技術人員可常規確定哪些殘基包含具體CDR。
[0061] 表 1.CDR 定義 1
[0062]
[0063] ~1表1中所有CDR定義的編號均按照Kabat等所述的編號規則(見下文）。
[0064] Kabat等還定義了適用于任何抗體的可變區序列的編號系統。本領域普通技術人 員能明確地將所述"Kabat編號"系統應用于任何可變區序列，而不依賴序列本身外的任何 實驗數據。本文所用的"Kabat編號"指Kabat等（1983)美國衛生與公眾服務部，"Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學上感興趣的蛋白質序列）中所述的編號 系統。"除非另有說明，提到本發明的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物中具 體氨基酸殘基位置的編號時，均按照Kabat編號系統。
[0065] 本發明的抗體或抗原結合片段、變體、或其衍生物包括但不限于:多克隆、單克隆、 多特異性和雙特異性(其中至少一個臂對SEMA4D有特異性）、人、人源化、靈長類化或嵌合抗 體，單鏈抗體，表位結合片段如化bJal/和F(ab/ )2少(1、。乂、單鏈。乂(3〇。乂）、二硫鍵連接的尸乂 (sdFv)、包含化或VH結構域的片段、Fab表達文庫產生的片段和抗獨特型(抗-Id)抗體(包括 例如，本文所述抗-SEMA4D抗體的抗-Id抗體）。ScFv分子為本領域已知，描述于例如美國專 利號5,892,019。本發明的免疫球蛋白或抗體分子可^是任何類型（如1邑6、1邑6、1邑1、1曲、 IgA和IgY)、類(如1邑61、1邑62、1邑63、1邑64、1邑41和1邑42等)或小類的免疫球蛋白分子。
[0066] 本文所用的術語"重鏈部分"包括衍生自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。在某些實 施方式中，多膚包含包括W下至少一種的重鏈部分:VH結構域、CH1結構域、較鏈(例如，上、 中、和/或下較鏈區）結構域、C肥結構域、C冊結構域或其變體或片段。例如，本發明所用的結 合多膚可包括含有CH1結構域的多膚鏈;含有CH1結構域、至少一部分絞鏈區和CH2結構域的 多膚鏈;含有CH1結構域和C冊結構域的多膚鏈;含有CH1結構域、至少一部分絞鏈區和CH3結 構域的多膚鏈，或者含有CH1結構域、至少一部分絞鏈區、CH2結構域和CH3結構域的多膚鏈。 在另一實施方式中，本發明的多膚包括含有CH3結構域的多膚鏈。另外，本發明所用的結合 多膚可能缺少C肥結構域的至少一部分(例如，所有或部分C肥結構域）。如上所述，本領域普 通技術人員應理解，可修飾運些結構域(例如重鏈部分），從而其氨基酸序列不同于天然產 生的免疫球蛋白分子。
[0067] 在本文公開的某些抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合片段、變體或衍生物中，多聚體 的一條多膚鏈的重鏈部分與該多聚體的第二條多膚鏈相同。或者，本發明的含有重鏈部分 的單體是不同的。例如，各單體可包含不同的祀結合位點，形成例如雙特異性抗體。
[0068] 用于本文所述方法的結合分子的重鏈部分可衍生自不同的免疫球蛋白分子。例 如，多膚的重鏈部分可包含衍生自IgGl分子的CH1結構域和衍生自IgG3分子的較鏈區。在另 一個示例中，重鏈部分可包含部分衍生自IgGl分子、部分衍生自IgG3分子的絞鏈區。在另一 個示例中，重鏈部分可包含部分衍生自IgGl分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合較鏈。
[0069] 本文所用的術語"輕鏈部分"包括衍生自免疫球蛋白輕鏈，如K或λ輕鏈的氨基酸序 列。在一些方面中，輕鏈部分包含化或化結構域中的至少一種。
[0070] 本文所述的抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合片段、變體或衍生物可根據它們識別或 特異性結合的抗原如本文所述祀標多膚(如SEM4D)的表位或部分進行描述或說明。祀多膚 與抗體的抗原結合結構域特異性相互作用的部分是"表位"或"抗原決定簇"。祀多膚可包含 單個表位，但通常包含至少兩個表位，并可包括任意數量的表位，運取決于抗原的大小、構 象和類型。而且，應該注意到，祀標多膚上的"表位"可W是或可包括非多膚元件，例如表位 可包括糖側鏈。
[0071] 認為抗體的膚或多膚表位的最小尺寸是約4至5個氨基酸。膚或多膚表位可含有， 例如，至少7個，至少9個，或至少約15至約30個氨基酸。由于CDR能聯形式識別抗原性膚 或多膚，所W包含表位的氨基酸不必定是郵連的，可在分開的膚鏈上。本發明的抗-SEMA4D 抗體識別的膚或多膚表位可含有SEMA4D中至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、 至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、或約15-約30個郵連或非郵連的氨基 酸。
[0072] "特異性結合"通常指該抗體通過其抗原結合結構域結合于表位，并且該結合需要 抗原結合結構域和表位之間某種程度的互補。按照運一定義，當抗體通過其抗原結合結構 域與表位結合比與隨機無關的表位結合更容易時，稱該抗體"特異性結合"該表位。本文中 使用術語"特異性"定性分析某一抗體與某一表位結合的相對親和性。例如，抗體"Α"可被認 為比抗體"Β"對給定表位具有更高特異性，或者抗體"Α"據說可W比對相關表位"護的特異 性更高的特異性或親和性結合表位。
[0073] "優選結合"指與結合相關、相似、同源或類似的表位相比，該抗體更容易特異性結 合某表位。因此，與相關表位相比，"優選結合"給定表位的抗體更可能結合該表位，即便運 種抗體可能與相關表位發生交叉反應。
[0074] 作為非限制性示例，如果抗體與第一表位結合的解離常數化D)低于抗體與第二表 位的Kd，則可認為抗體優選結合第一表位。在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位 結合的親和性比抗體與第二表位的Kd低至少一個數量級，則可認為抗體優選結合第一抗 原。在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位結合的親和性比抗體與第二表位的Kd 低至少2個數量級，則可認為抗體優選結合第一表位。
[0075] 在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位結合的解離速率化(off))比抗體 與第二表位的k(off)低，則可認為抗體優選結合第一表位。在另一個非限制性示例中，如果 抗體與第一表位結合的親和性比抗體與第二表位的k(off)低至少1個數量級，則可認為抗 體優選結合第一表位。在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位結合的親和性比抗 體與第二表位的k(off)低至少2個數量級，則可認為抗體優選結合第一表位。可W說，本文 所述的抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物結合本文公開的祀多膚(例如，SEM4D，例如， 人、鼠或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或變體，其解離速率化(off))低于或等于5X l(T2s^、10 ΛΛ5Χ 1(tVi或ιοΛΛ在某些方面中，可W說，本發明的抗體結合本文公開的祀多膚(例 如，SEM4D，例如，人、鼠、或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或變體，其解離速率化(of f))低于或 等于5X ι〇-νι、ιο-νι、5Χ ιοΛΛ或i〇-5s-i、5X ιοΛ-ι、ιοΛ-ι、5Χ 10-V1 或 10-V1。
[0076] 可w說，本文所述的抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物結合本文公開的祀多 膚(例如，沈MA4D，例如，人、鼠或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或變體，其結合速率化(on))大 于或等于1〇3m-Vi，5X 1〇3m-Vi，1〇4m-Vi或5X 1〇4m-Vi。在一些實施方式中，可W說本發明 的抗體結合本文公開的祀多膚(如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的SEMA4D)或其片段或變體， 其結合速率化(on))大于或等于io5m-1s-i、5X io5m-1s-i、io6m-1s-i或5X io6m-1s-i或io7m-1s-i。
[0077] 如果抗體優先結合給定表位W至于在某種程度上阻斷參照抗體與該表位的結合， 則稱該抗體能競爭性抑制參照抗體與該表位的結合。可通過本領域已知的任意方法確定競 爭性抑制，例如，競爭化ISA試驗。可W說，抗體將參照抗體與給定表位的結合競爭性抑制至 少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
[0078] 本文所用的術語"親和性"指單獨表位與免疫球蛋白分子的CDR結合的強度量度。 參見例如，化rlow等（1988)《抗體：實驗室手冊》(Antibodies:A Laboratoiy Manual)(冷泉 港實驗室出版社(Cold Spring化rbor Laboratory Press),第2版），第27-28頁。本文所用 的術語"親合力"指免疫球蛋白群體和抗原間復合物的總體穩定性，即免疫球蛋白混合物與 抗原的功能性結合強度。參見，例如，化rlow，第29-34頁。親合力既與群體中單獨免疫球蛋 白分子與特定表位的親和性相關，也與免疫球蛋白分子和抗原的價態相關。例如，二價單克 隆抗體和具有高度重復表位結構的抗原例如多聚體之間的相互作用是具有高親合力的一 個例子。
[0079] 本發明的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、變體或其衍生物也可就其交叉反應 性方面進行描述或說明。本文所用的術語"交叉反應性"指抗體對某一種抗原具有特異性、 與第二種抗原發生反應的能力；它是兩種不同抗原性物質之間關聯性的量度。因此，如果抗 體與誘導其形成的表位W外的其他表位結合，則具有交叉反應性。交叉反應性表位通常含 有許多與誘導表位相同的互補結構特征，在某些情況下甚至比原始表位更匹配。
[0080] 例如，某些抗體具有一定程度的交叉反應性，因為它們結合相關但不相同的表位， 例如，與參照表位至少95 %、至少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少70 %、至少 65%、至少60%、至少55%和至少50%相同（按照本領域已知方法和本文所述方法計算）的 表位。如果抗體不結合與參照表位少于95 %、少于90 %、少于85 %、少于80 %、少于75 %、少 于70 %、少于65 %、少于60 %、少于55 %和少于50 %相同性(按照本領域已知方法和本文所 述方法計算)的表位，則可W說該抗體的交叉反應性很低或沒有交叉反應性。如果某抗體不 結合某表位的任何其它類似物、直系同源物或同源物，則可認為該抗體對該表位"高度特 芹'。
[0081] 本發明的抗-SEMA4D結合分子如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可根據與 本發明多膚的結合親和性進行描述或說明，所述多膚例如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的 SEMA4D。在某些方面中，結合親和性包括解離常數或Kd低于5x 1〇-2M、1〇-2M、5x 10-3M、10-3M、 5x 10-4m、10-4m、5x 10-5m、10-5m、5x 10-6m、10-6m、5x 10-7m、10-7m、5x 10-8m、10-8m、5x 10-9m、 10-9m、5x 10-i〇M、io-i〇M、5x 10-iiM、5x 10-i2m、10-i2m、5x 10-i3m、10-i3m、5x 10-i4m、io -i4M、5x 1〇-i5M或1〇-i5M的那些。在某些實施方式中，抗-沈MA4D結合分子，例如，本發明的抗 體或其抗原結合片段W約5x 1〇-9至約6x 1〇-9的Kd結合人SEMA4D。在另一個實施方式中， 抗-沈MA4D結合分子，例如，本發明的抗體或其抗原結合片段W約lx 1〇-9至約2x 1〇-9的Kd 結合鼠沈MA4D。
[0082] 本文所用的術語"嵌合抗體"指其中免疫反應性區域或位點獲自或衍生自第一物 種，而恒定區（根據本發明，可能是完整、一部分或修飾的）獲自第二物種的任何抗體。在某 些實施方式中，祀標結合區或位點將來自非人來源(例如，小鼠或靈長類)并且恒定區是人 的。
[0083] 本文所用的術語"工程改造的抗體"指通過從具有已知特異性的抗體至少部分置 換一個或多個CDR和必要時通過部分構架區置換和序列變化，來改變重鏈或輕鏈或二者中 可變區的抗體。雖然CDR可衍生自與產生構架區的抗體屬于同一類或甚至亞類的抗體，但考 慮CDR衍生自不同類別的抗體或不同物種的抗體。將來自具有已知特異性的非人抗體的一 個或多個"供體"CDR移植到人重鏈或輕鏈構架區內形成的工程改造的抗體在本文中稱為 "人源化抗體"。不必總用來自供體可變區的完整CDR代替所有CDRW將一種可變區的抗原結 合能力轉移至另一可變區。相反，可僅僅轉移維持祀結合位點的活性所需的那些殘基。
[0084] 進一步認識到，人源化抗體的重鏈或輕鏈或二者中可變結構域內的構架區可僅包 含人來源的殘基，在運種情況下人源化抗體的運些構架區稱為"全人構架區"（例如，MAb 1515/2503或67,在美國專利申請公開號US 2010/0285036A1中為MAb 2503,其全文通過引 用納入本文）。或者，如果需要維持與SEMA4D抗原的適當結合或提高結合，可W在人源化抗 體的重鏈或輕鏈或二者可變區中人框架區的相應位置內工程改造供體可變區中框架區的 一個或多個殘基。因此，W此方式工程改造的人構架區包含人和供體構架區殘基的混合物， 在本文中稱為"部分人構架區"。
[0085] 例如，抗-SEMA4D抗體的人源化過程可基本按照Winter和同事所述方法進行 (Jones等，Nature 321:522-525(1986);Riechmann等，Nature 332:323-327(1988); Verho巧en等，Science 239:1534-1536(1988))，即用曬齒動物或突變型曬齒動物CDR或CDR 序列取代人抗-SEMA4D抗體的相應序列。也參見美國專利號5，225，539; 5，585，089; 5，693， 761; 5，693，762; 5，859，205;其通過引用納入本文。所得的人源化抗-SEMA4D抗體將在人源 化抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的全人框架區內包含至少一個曬齒動物或突變型曬齒動物 CDR。在一些情況下，人源化抗-SEMA4D抗體的一個或多個可變區的構架區內殘基被相應非 人(例如，曬齒動物)殘基代替(參見例如，美國專利號5,585,089;5,693,761;5,693,762;和 6，180，370)，在運種情況下所得的人源化抗-SEMA4D抗體將在重鏈和/或輕鏈的可變區內包 含部分人框架區。
[0086] 而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。進行運些修飾 W進一步改善抗體性能(例如，獲得所需親和性）。通常，人源化抗體將包含幾乎所有的至少 一個、通常兩個可變區，其中全部或基本上全部的CDR對應于非人免疫球蛋白的CDR，全部或 基本上全部的構架區是人免疫球蛋白序列的構架區。人源化抗體還任選包含至少一部分免 疫球蛋白恒定區（Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。更多的細節參見化nes等，Nature,331: 522-525(1986) ;Riechmann等，Nature,332:323-329(1988);和Presta， Curr. Op. Struct. Biol .，2:593-596(1992);其通過引用全文納入本文。因此，所述"人源化' 抗體可包括其中明顯小于完整的人可變區被來自非人物種的相應序列所取代的抗體。在實 踐中，人源化抗體一般是一些CDR殘基，可能是一些框架殘基被曬齒動物抗體中相似位點的 殘基所取代的人抗體。參見，例如，美國專利號5，225，539; 5，585，089; 5，693，761; 5，693， 762;5,859,205。也參見美國專利號6，180,370和國際公開號胖0 01/27160，其中公開了人源 化抗體和用于產生對預定抗原的親和性提高的人源化抗體的技術。
[0087] 本文所用術語"醫療提供者"是指直接接觸或向活的對象(例如人類患者)給藥的 個人或機構。醫療提供者的非限制性示例包括醫生、護±、技師、治療師、藥師、顧問、替代醫 學從業者、醫學設備、醫生辦公室、醫院、急救室、診所、急救中屯、、替代醫學診所/設備、和提 供關于患者健康狀態的全部或任意部分的一般和/或特殊治療、評價、維持、療法、醫藥和/ 或建議的任意其他實體，包括但不限于一般醫學、特殊醫學、手術、和/或任何其他類型治 療、評價、維持、療法、醫藥和/或建議。
[0088] 本文所用術語"醫療福利提供者"包括整體或部分提供、贈予、供應、支付，或者與 給予患者一種或多種醫療福利、福利計劃、健康保險和/或醫療費用賬戶計劃的渠道的個體 部口、組織或集團。
[0089] 本文所用術語"臨床實驗室"是指檢驗或處理來自活對象(例如人）的材料或圖像 的設施。處理的非限制性示例包括生物學、生物化學、血清學、化學、免疫血液學、血液學、生 理學、細胞學、病理學、遺傳學，基于圖像或對來自人體或任意或全部人體的材料的其他檢 驗，用于提供例如診斷、預防、或治療活對象例如人的任何疾病或損傷，或評價活對象例如 人的健康的信息的目的。運些檢驗可包括收集或獲取圖像、樣品、制備、確定、測量或描述活 對象例如人體內或獲自活對象例如人體的樣品中是否存在各種物質的過程。
[0090] II.祀標多膚描述
[00川本文所用術語"腦信號蛋白4D"、"SEMA4D"和"SEMA4D多膚"可互換使用，如 "SEMA4護和"Sema4護。在某些實施方式中，SEM4D表達在細胞表面上或由細胞分泌。在另一 個實施方式中，SEMA4D是膜結合的。在另一個實施方式中，沈MA4D是可溶的，例如S沈MA4D。 在其他實施方式中，SEMA4D可包括完整大小的SEMA4D或其片段，或SEMA4D變體多膚，其中 SEMA4D或沈MA4D變體多膚的片段保留完整大小的沈MA4D的一些或全部功能性質。
[0092] 完整大小的人SEMA4D蛋白質是由2條150W)a的多膚鏈組成的同二聚體跨膜蛋白。 SEMA4D屬于腦信號蛋白家族細胞表面受體并且也稱為CD100。人和小鼠沈MA4D/Sema4D從其 跨膜形式經蛋白水解切割W形成120-kDa可溶性形式，表明存在2種Sema4D同種型 化umanogoh等，J.Cell Science 116(7):3464(2003))。腦信號蛋白由可溶性和膜結合蛋白 組成，其原始定義為發育期間的軸突引導因子，其在建立神經元與其合適祀標的精確連接 中起到重要作用。從結構上考慮，IV類腦信號蛋白，SEMA4D由氨基末端信號序列接著特征性 "Sema"結構域組成，其含有17個保守的半脫氨酸殘基、Ig-樣結構域、富賴氨酸伸長段、疏水 性跨膜結構域和胞質尾。
[0093] SEMA4D的多膚鏈可包含約13個氨基酸的信號序列，并且還包含約512個氨基酸的 腦信號蛋白結構域，約65個氨基酸的免疫球蛋白樣（Ig-樣)結構域，104個氨基酸的富賴氨 酸伸長段，約19個氨基酸的疏水性跨膜區，和110個氨基酸的胞質尾。胞質尾中酪氨酸憐酸 化的共有位點支持SEMA4D與酪氨酸激酶的預測結合（Schlossman等編，（1995化euco巧te Typing V(《白細胞分型V》）（牛津，牛津大學出版社（Oxford University Press， Oxford)))。
[0094] SEMA4D已知具有至少3個功能性受體，叢蛋白-Bl、叢蛋白-B2和CD72。受體之一，叢 蛋白-B1在非淋己組織中表達并且已經顯示為沈MA4D的高親和性（InM)受體(Tamagnone等， Cell 99:71-80(1999))。叢蛋白-B1信號轉導的SEMA4D刺激已經顯示出誘導神經元的生長 錐塌陷，并且誘導少突細胞的過程延伸塌陷（process extension collapse)和調亡 (Giraudon等，J.Immunol.172:1246-1255(2004);Giraudon等，NeuroMolecular Med.7: 207-216(2005))。在與沈MA4D結合之后，叢蛋白-B1信號轉導介導R-Ras的失活，導致整聯蛋 白介導的胞外基質粘附減少，W及化oA的激活，導致通過重組細胞骨架和細胞遷移。參見 Kruger等，Nature Rev.Mol.Cell Biol.6:789-800(2005);Pasterkamp，TRENDS in CellBiology 15:61-64(2005)。在另一個方面，叢蛋白-82對沈]^40有中等親和性，并且最 近的報道表明叢蛋白-B2調節成人室下區中皮層神經元的遷移W及成神經細胞的增殖和遷 移（Azzarelli等，化t Commun 2014爭2月27 日，5:3405，D01:10.1038/ncomms4405;和Saha 等，J.Neuroscience,2012年 11 月21 日，32(47) :16892-16905)。
[00巧]在淋己組織中，CD72用作低親和性（300nM)沈MA4D受體化umanogoh等，Immunity 13:621-631 (2000)) dB細胞和APC表達CD72，并且抗-CD72抗體具有許多與SSEMA4D相同的作 用，如增強CD40-誘導的B細胞應答和CD23的B細胞脫落。CD72被認為通過招募酪蛋白憐酸酶 SHP-1發揮B細胞應答的負調節物的作用，其可與許多抑制性受體聯合。SEMA4D與CD72的相 互作用導致甜P-1的解離，W及運種負激活信號的失去。沈MA4D已經報道促進T細胞刺激和B 細胞聚集W及體外存活。加入沈MA4D-表達細胞或SSEM4D在體外增強CD40-誘導的B細胞增 殖和免疫球蛋白產生，并且在體內加快抗體應答(Ishida等，Inter. Immunol. 15:1027-1034 (2003);Kumanogoh和Η. Κ址u化ni，Trends in Immunol. 22:670-676(2001))。SSEMA4D增強 CD40誘導的樹突細胞(DC)成熟，包括共刺激分子上調和增加的化-12分泌。另外，SSEM4D可 抑制免疫細胞遷移，其可通過加入阻斷抗-SEMA4D抗體來逆轉（Elhabazi等， J. Immunol. 166:似41-4347(2001) ;Delaire等，J. Immunol. 166:4348-4354(2001))。
[0096] Sema4D在包括脾臟、胸腺和淋己結的淋己器官中W及如腦、屯、臟和腎臟的非淋己 器官中W高水平表達。在淋己器官中，Sema4D在靜息T細胞上大量表達，但是僅在靜息B細胞 和抗原呈遞細胞（APC)如DC上弱表達。細胞激活增加了SEMA4D的表面表達W及可溶性 SEMA4D (S SEMA4D)的生成。
[0097] SEMA4D的表達特性表明其在免疫系統中起到重要的生理和病理作用。沈M4D已經 顯示促進B細胞激活、聚集和存活;增強CD40-誘導的增殖和抗體產生；增強對T細胞W來抗 原的抗體響應;增加 T細胞增殖;增強樹突細胞成熟和刺激T細胞的能力;和直接設及脫髓銷 和軸突變性（SM 等，Immunity 13:633-642(2000) ;Kumanogoh 等，J Immunol 169:1175- 1181(2002);和Wa化nabe等，J Immunol 167:4321-4328(2001))。
[009引 SEMA4D敲除（SEMA4D-/-)小鼠已經提供其他證據顯示SEM4D在體液和細胞免疫應 答中起到重要作用。在SEMA4D-/-小鼠中沒有已知的非淋己組織主要異常。來自SEMA4D-/- 小鼠的DC具有弱刺激能力并且在共刺激分子的表達中顯示出缺陷，其可通過加入SSEMA4D 來捶救。SEMA4D缺陷（SEMA4D-/-)的小鼠無法發生由髓銷少突細胞糖蛋白膚誘導的實驗性 自身免疫脊髓炎，因為在缺少SEMA4D的情況下，髓銷少突細胞糖蛋白特異性T細胞生成微弱 化umanogoh等，J Immunol 169:1175-1181 (2002))。也在自身免疫傾向型MRL/lpr小鼠（全 身性自身免疫疾病如化E的模型）而不是正常小鼠的血清中檢測到顯著量的可溶性沈MA4D。 此外，SSEMA4D的水平與自身抗體的水平相關并且隨著年齡增加(Wang等，Blood 97:3498- 3504(2001))。可溶性SEMA4D也已經顯示在患有脫髓銷性疾病的患者的腦脊液和血清中累 積，并且SSEMA4D誘導人多潛能神經前體(Dev細胞）的調亡，并且在體外抑制過程擴展并誘 導大鼠少突細胞的調亡(Giraudon等，J Immunol 172(2) :1246-1255(2004))。由抗-SEMA4D MAb封閉運種調亡。
[0099] III.抗-SEMA4D抗體
[0100] 已經在本領域中描述了結合沈MA4D的抗體。參見，例如，美國專利號8，496，938、美 國公開號2008/0219971 A1、US 2010/0285036 A1 和US 2006/0233793 A1、國際專利申請W0 93/14125、W0 2008/100995和W0 2010/129917,W及Herold等，Int.Immunol.7(l):1-8 (1995)，其各自通過引用全文納入本文。
[0101] 本發明一般設及減輕患有神經炎性或神經變性疾病的對象，例如人患者的癥狀的 方法，包括給予特異性結合SEMA4D的抗體、或其抗原結合片段、變體或衍生物。在某些實施 方式中，該抗體阻斷SEMA4D與其受體中的一種或多種，例如叢蛋白-B1的相互作用。具有運 些性質的抗-SEM4D抗體可用于本文提供的方法。可使用的抗體包括，但不限于MAbs VX15/ 2503,67和76及其抗原結合片段、變體或衍生物，其全部描述于US 2010/0285036 A1。可用 于本文提供的方法的其他抗體包括US 2006/0233793 A1中所述的抓16和BB18抗體及其抗 原結合片段、變體或衍生物；或MAb 301、MAb 1893、MAb 657、MAb 1807、MAb 1656、MAb 1808、Mab 59、MAb 2191、MAb 2274、MAb 2275、MAb 2276、MAb 2277、MAb 2278、MAb 2279、 MAb 2280、MAb 2281、MAb 2282、MAb 2283、MAb 2284和MAb 2285中的任意種，及其任意片 段、變體或衍生物，如US 2008/0219971 A1所述。在某些實施方式中，用于本文提供的方法 的抗-沈MA4D抗體結合人、鼠、或人和鼠 SEMA4D。還可使用與任意前述抗體結合相同表位的 抗體和/或競爭性抑制任意前述抗體的抗體。
[0102] 在某些實施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、 變體或衍生物具有與參照抗-SEMA4D抗體分子的氨基酸序列具有至少約80 %、約85 %、約 88%、約89%、約90%、約91 %、約92%、約93%、約94%或約95%序列相同性的氨基酸序列， 例如上述的那些。在另一個實施方式中，所述結合分子與參照抗體共有至少約96%、約 97%、約98%、約99%或100%的序列相同性。
[0103] 在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白重鏈可變區（VH結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述VH結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID N0:9或10的CDRUCDR2或CDR3至少約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0104] 在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白重鏈可變區（VH結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述VH結構域的至少一個CDR具有與沈Q ID N0:6、SEQ ID N0:7或沈Q ID N0:8至少約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99%相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0105] 在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白重鏈可變區（VH結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中除了 1、2、3、4或5個保守氨基酸取代W外，所述VH結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或沈Q ID NO:8相同的氨基酸序列。
[0106] 在另一個實施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片 段、變體或衍生物的包含VH結構域、基本由其組成或由其組成，該VH結構域具有與SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10至少約80%、約85%、約90%、約91 %、約92%、約93%、約94%、約 95 %、約96 %、約97 %、約98%、約99%或100 %相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗體包含 特異性或優先結合SEM4D的編碼VH結構域。
[0107] 在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白輕鏈可變區（wi吉構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述化結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID顯：17或18的〔0則、〔01?2或〔01?3至少約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0108] 在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白輕鏈可變區（wi吉構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述化結構域的至少一個CDR具有與沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15或SEQ ID NO: 16至 少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基 酸序列。
[0109] 在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白輕鏈可變區（wi吉構域）、基本由其組成或由其組成， 其中除了 1、2、3、4或5個保守氨基酸取代W外，所述化結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID N0:14、沈Q ID N0:15或沈Q ID N0:16相同的氨基酸序列。
[0110] 在另一個實施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片 段、變體或衍生物的包含化結構域、基本由其組成或由其組成，該化結構域具有與SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約 95 %、約96 %、約97 %、約98%、約99%或100 %相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗體包含 特異性或優先結合沈MA4D的編碼化結構域。
[0111] 本文提供的方法中使用的還包括編碼本文所述的抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合 片段、變體或衍生物的多膚，編碼運類多膚的多核巧酸，包含運類多核巧酸的載體，和包含 運類載體或多核巧酸的宿主細胞，全部用于產生用于本文所述方法的抗-SEMA4D抗體，或其 抗原結合片段、變體或衍生物。
[0112] 本發明抗-SEMA4D抗體的合適生物活性變體可用于本發明的方法。運種變體將保 持母體抗-SEMA4D抗體的所需結合性質。本領域中制備抗體變體的方法通常是可得的。
[0113] 誘變和改變核巧酸序列的方法本領域中熟知。參見例如，Walker和Gaastra編 (1983) techniques in Molecular Biology(《分子生物學技術》）（紐約麥克米蘭出版公司 (MacMillan Publishing Company));Kunkel，P;roc.化tl.Acad.Sci.USA 82:488-492 (1985) ;Kunkel 等，Methods En 巧 mol. 154:367-382( 1987); Sambrook 等（1989^分子克隆： 實驗室手冊KMolecular Cloning:A Laboratory Manual)(紐約州冷泉港（Cold Spring 化rbor，N.Y.));美國專利號4,873,192; W及其中引用的參考文獻;其通過引用納入本文。 有關不影響感興趣多膚生物學活性的合適氨基酸取代的指南可參見下述文獻中的模型： Dayhoff等（1978)，Atlas ofProtein Sequence and Shucture(《蛋白質序列和結構圖 冊》）（華盛頓特區的國家生物醫學研究基金會(Natl .Biomed.Res .Found.，Washington， D.C.))，第％5-352頁，通過引用全文納入本文。Dayhoff等的模型利用單點可接受突變 (Point Accepted Mutation,PAM)氨基酸相似矩陣(PAM 250矩陣）來確定合適的保守性氨 基酸取代。在某些實施方式中，可使用保守取代，如用一種氨基酸替換具有類似性質的另一 種氨基酸。Dayhoff等模型的PM250矩陣中教導的保守性氨基酸取代的示例包括但不限于： Gly一Ala、Val<->ne<->I eu、Asp一Glu、Lys<-?Arg、Asm-?Gln 和Phe一Trp一Tyr')
[0114] 構建所述抗-沈M4D結合分子的變體如抗體或其抗原結合片段、感興趣多膚時，生 成修飾，從而變體持續擁有所需屬性，如能特異性結合SEMA4D，如人、靈長動物、鼠、或者人 和鼠的SEMA4D，例如在表面上表達或由細胞分泌，并具有SEMA4D阻斷活性，如本文所述。顯 然，編碼變體多膚的DNA中產生的任何突變一定不能將序列置于閱讀框外，并且在某些實施 方式中不產生可生成二級mRNA結構的互補區。參見歐洲專利申請公開號75,444。
[0115] 測定抗-SEMA4D結合分子如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的結合特異性 的方法包括但不限于:標準競爭結合實驗、T細胞或B細胞的免疫球蛋白分泌的監測試驗、T 細胞增殖實驗、調亡實驗、ELISA實驗等。參見例如，W0 93/14125;Shi等，1臟1111117 73:633- 642(2000) ;Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002) ;Wa1:anabe等，J Immunol 167： 4321-4328(2001) ;Wang等，Blood 97::3498-3504(2001);和Giraudon等，J Immunol 772 (2): 1246-1255(2004)公開的實驗，其都通過引用納入本文。
[0116] 本文在討論本文公開的任何具體多膚(包括恒定區、CDR、VH結構域或化結構域)是 否與另一多膚至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91 %、約92%、約 93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或者甚至約100%相同時，相同性％ 可采用本領域已知的方法和計算機程序/軟件測定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星 序列分析軟件包，用于化ix系統的第8版，遺傳學計算機團隊(Genetics Computer Group)， 威斯康星州麥迪遜科學大道575大學研究園（University Research Park)，53711)。 53711). BESTFIT 利用Smith 和 Waterman( 1981 Mdv.Appl.Math. 2:482-489 的局部同源性算 法，W找到兩條序列之間的最佳同源性區段。使用BESTFIT或任何其它序列比對程序來確定 某具體序列是否與本發明所述參照序列(例如)95%相同時，當然要設定參數從而在參照多 膚序列的全長上計算相同性百分數，并且在參照序列的氨基酸總數中允許多至5%的同源 性缺口。
[0117] 出于本發明的目的，可采用史密斯-沃特曼（Smith-Waterman)同源性捜索算法測 定序列相同性百分數，該算法使用仿射缺口捜索，其中缺口開放罰12分，缺口延伸罰2分， 化 0SUM 矩陣計 62 分。Smith 和 Watermanα981)Adv.Appl.Math.2:482-489中公開了史密斯- 沃特曼同源性捜索算法。變體與參照抗CX化13抗體(例如，MAbVX15/2503、67或76)可W差 異例如，少至1-15個氨基酸殘基，少至1-10個氨基酸殘基，如6-10個，少至5個，少至4、3、2、 或者甚至1個氨基酸殘基。
[0118] "序列相同性"百分比也可通過比較對比窗中兩種最優比對序列來測定。為了最優 比對用于比較的序列，對比窗中多核巧酸或多膚序列的部分可包含稱為缺口的添加或缺 失，而參考序列保持不變。最優比對是即使有缺口仍在參考和比較序列之間產生最大可能 數目的"相同"位置的比對。兩種序列之間的"序列相同性'百分比可用程序"BLAST 2序列" 版本測定，所述程序2004年9月1日起可獲自國家生物技術信息中屯、(化tional Center for Biotechnology Information)，包括程序BLASTN(用于核巧酸序列比較)和BLASTP(用于多 膚序列比較），基于 Karlin 和 Altschul 的算法（Proc. rfetl.Acad.Sci.USA 90(12):5873- 5877，1993)。使用巧LAST 2序列"時，2004年9月1日起的標準參數可用于字長(3)、缺口開放 罰分(11)、延伸缺口罰分(1)、缺口降低巧0)、期望值(10)和任何其他需要的參數，包括但不 限于矩陣選擇。
[0119] 可W多種方式使抗-SEMA4D抗體的恒定區突變從而改變效應物功能。例如，參見美 國專利號6,737,056B1和美國專利申請公開號2004/013210IA1，其公開了優化抗體與化受 體結合的Fc突變。
[0120] 在可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其片段、變體或衍生物中，可使用本 領域已知的技術突變化部分W降低效應物功能。例如，恒定區結構域的缺失或失活(通過點 突變或其它方式)可降低循環的修飾抗體與Fc受體的結合，從而提高腫瘤定位。在其他情況 中，與本發明一致的恒定區修飾對互補結合進行調節并因此縮短血清半衰期。可利用恒定 區的其它修飾來改變二硫鍵連接或寡糖部分，能因抗原特異性或抗體靈活性提高而加強定 位。無需過多實驗，即可容易地利用熟知的免疫學技術測定或定量分析修飾所產生的生理 學概況、生物利用度和其它生化作用，如腫瘤定位、生物分布和血清半衰期。用于本文提供 的方法的抗-SEMA4D抗體包括修飾的衍生物，例如通過將任何類型的分子共價連接到抗體 上，從而該共價連接不會阻礙抗體特異性結合其關聯表位。例如但不限于，抗體衍生物包括 通過，例如糖基化、乙酷化、PEG化、憐酸化、酷胺化、由已知保護/阻斷基團衍生、蛋白水解切 害d、連接于細胞配體或其它蛋白質等方法修飾的抗體。通過已知技術可進行任意多種化學 修飾，包括但不限于:特異性化學切割、乙酷化、甲酯化等。此外，衍生物可包含一種或多種 非經典氨基酸。
[0121] "保守性氨基酸取代"是氨基酸殘基被具有帶相似電荷的側鏈的氨基酸殘基取代。 本領域已定義具有帶相似電荷的側鏈的氨基酸殘基家族。運些家族包括:具有堿性側鏈的 氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、具有酸性側鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸）、具有不 帶電極性側鏈的氨基酸（如甘氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半脫氨 酸）、具有非極性側鏈的氨基酸(如丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲 硫氨酸、色氨酸）、具有β-分支側鏈的氨基酸(如蘇氨酸、鄉氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側鏈 的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。或者，突變可沿著編碼序列的全部或部分 而隨機導入，如通過飽和突變，并且可篩選所得的突變體的生物活性W鑒定保持活性（例 如，在對象，例如癌癥患者中結合抗-SEM4D多膚，W阻斷沈MA4D與其受體的相互作用，或減 輕患者中與神經變性疾病相關的癥狀的能力）的突變體。
[0122] 例如，可能僅在抗體分子的構架區內或僅在CDR區內引入突變。導入的突變可W是 沉默或天然錯義突變，即對抗體結合抗原的能力沒有或有很少的影響。可使用運些突變類 型來優化密碼子使用，或提高雜交瘤的抗體生成。或者，非天然錯義突變可改變抗體結合抗 原的能力。本領域技術人員將能夠設計并測試具有所需性質的突變體分子，如沒有抗原結 合活性或結合活性的變化(例如，改善抗原結合活性或改變抗體特異性）。誘變之后，編碼的 蛋白質可經常規表達并且能使用本文所述的技術或者通過本領域已知的常規修飾技術來 確定編碼的蛋白質的功能和/或生物活性(例如，免疫特異性結合SEMA4D多膚的至少一個表 位的能力）。
[0123] 在某些實施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體包含至少一個優化的 互補決定區（CDR)。優化的乂 DR"指該CDR已經修飾并且經優化W提高包含優化的CDR的抗- SEMA4D抗體的結合親和性和/或抗-SEMA4D活性/'抗-SEMA4D活伴'或"SEMA4D阻斷活伴'可 包括調節下列一種或多種沈MA4D相關活性的活性:B細胞活性、聚集和存活;CD40-誘導的增 殖和抗體產生;對T細胞依賴抗原的抗體應答;T細胞或其他免疫細胞增殖;樹突細胞成熟； 脫髓銷和軸突變性;多潛能神經前體和/或少突細胞的調亡;誘導內皮細胞遷移;抑制自發 性單核細胞遷移;與細胞表面叢蛋白B1或其他受體結合，或者與可溶性SEMA4D或SEMA4D+細 胞表面上表達的SEMA4D相關的任意其他活性。抗-沈MA4D活性也可導致與SEMA4D表達相關 的疾病的發病或嚴重性降低，包括但不限于某些類型的癌癥包括淋己瘤，自身免疫疾病，炎 性疾病包括中樞神經系統(CNS)和外周神經系統(PNS)炎性疾病，移植排斥和侵入性血管生 成。基于鼠抗-SEMA4D MAb抓16和BB18的優化的抗體的示例描述于美國專利公開號2008/ 0219971 A1、國際專利申請號W0 93/14125和Herold等，Int. Immunol.7(1) :1-8( 1995)，其 各自通過引用全文納入本文。修飾可包括取代CDR內的氨基酸殘基，使得抗-SEMA4D抗體保 留對沈MA4D抗原的特異性并且具有改善的結合親和性和/或改善的抗-SEMA4D活性。
[0124] IV.星形膠質細胞
[0125] 星形膠質細胞是特殊的神經膠質細胞，其在健康CNS中發揮許多必要的復雜功能， 包括調節血流、流體/離子/pH/神經遞質內穩態、突觸形成/功能、能量和代謝、和維持血腦 屏障（Barres BA(2008)The mystery and magic of glia：a perspective on their roles in health and disease(神經膠質細胞的謎和魔法：其在健康和疾病中作用的透 視）.化uron 60:430-440)。重要的是，星形膠質細胞通過稱為活性星形膠質細胞增生的過 程響應CNS損傷，其是神經炎性和神經變性疾病的主要病理特點。越來越多的證據指向活性 星形膠質細胞在CNS疾病中通過喪失正常星形膠質細胞功能或獲得異常活性而起到主要或 促進作用的潛力。考慮到它們在許多CNS疾病中的核屯、作用，明顯需要鑒定并嚴格測試恢復 正常星形膠質細胞功能W有效減慢或者甚至逆轉疾病進展的新分子祀標。存在幾條星形膠 質細胞可影響CNS疾病的潛在途徑。
[0126] 星形膠質細胞和0PC支持。發生在神經炎性疾病（如多發性硬化）中的脫髓銷與包 含少±膠質細胞系的細胞明顯破壞和喪失相關（Ozawa K等，Patterns of oligoden化oglia pathology in multiple sclerosis(多發性硬化中少±膠質細胞病變 特征）.化ain. 1994; 117:1311-1322)。內源性髓銷再生機制在恢復階段中失敗，部分是由于 0PC不能完成分化成成熟的髓銷性少±膠質細胞（Wo Iswijk G. Oligodendrocyte survival，loss and birth in lesions of chronic-stage multiple sclerosis(慢性多 發性硬化的損傷中少±膠質細胞的存活、損失和產生）.化ain. 2000:123:105-115)。獲自其 他實驗性誘導的脫髓銷模型的數據表明，與存活成熟少±膠質細胞相反，需要新的成熟0PC 用于在恢復階段期間使髓銷再生化evine JM，Reynolds R.Activation and proliferation of endogenous oligodendrocyte precursor cells during ethidium bromide-induced demyelination(內源性少±膠質細胞前體細胞在漠化乙晚誘導的脫髓 銷期間的活化和增殖）.Exp Neurol. 1999; 160:333-347)。星形膠質細胞已經顯示在支持少 ±膠質細胞系的功能和活力中起顯著作用。例如，Ta化ott和同事顯示在漠化乙晚誘導的脫 髓銷損傷中，Nkx2.化/01ig2+0PC需要星形膠質細胞來完全分化成少±膠質細胞并且進行 髓銷再生化xp Neurol. 2005年3 月；192(1) : 11-24. Endogenous Nkx2.2+/01ig2 + oligodendrocyte precursor cells fail to remyelinate the demyelinated adult rat spinal cord in the absence of astro巧tes(內源性Nkx2.2+/01 ig化少±膠質細胞 前體細胞在沒有星形膠質細胞的情況下無法使脫髓銷的成體大鼠脊髓髓銷再生）.化化ott JF，Loy DN，Liu Y，Qiu MS，Bunge MB，Rao MS，Whittemore SR)eAra巧化0在體外證明星形 膠質細胞向OPC提供可溶營養因子支持，保護運些細胞免受增加的氧化應激(Arai，K.和Lo， E.H.(2010),Astrocytes protect oligodendrocyte precursor cells via MEK/ERK and PI3K/Akt signaling(星形膠質細胞通過MEK/E服和PI3K/Akt信號轉導保護少±膠質細胞 前體細胞）.J.化 urosci. Res. ,88:758-763. doi :10.1002/lnr. 22256)。其他已經顯示在實 驗性自身免疫腦脊髓炎、實驗性視神經炎、和脊髓損傷情況中抑制星形膠質細胞活化使得 髓銷再生特征和功能性結果測量得到改善(Brambilla R，Persaud T，Hu XJarmally S， Shestopalov VI，Dvoriantchikova G，Ivanov D，Nathanson L，Barnum SR,Bethea JR.2009.Transgenic inhibition of astroglial NF-kappa B improves functional outcome in experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing chronic central nervous system inflammation(轉基因抑制星形膠質細胞瘤NF-kB通過抑制慢性 中樞神經細胞炎癥改善實驗性自身免疫腦脊髓炎中的功能性結果）.111111111111〇1 182:2628- 2640；Brambi11a R,Dvoriantchikova G，Barakat D,Ivanov D,Bethea JR，Shestopalov VI. 2012.Transgenic inhibition of astroglial NF-kappaB protects from optic nerve d曰m曰ge 曰nd retin曰1 g曰nglion cell loss in experiment曰1 optic neuritis(牽專 基因抑制星形膠質細胞瘤NF-kB在實驗性視神經炎中保護免受視神經破壞和視網膜神經節 細胞損失）.J Neuroinflammation 9:213;&rambilla R，&racchi-Ricard V，Hu WH，Rrydel B，Bramwell A，Karmally S,Green EJ,Bethea JR.2005. Inhibition of astroglial nuclear factor k曰卵曰B reduces infl曰mm曰tion 曰nd improves function曰 1 recovery after spinal cord iniury(抑制星形膠質細胞瘤核因子kB在脊髓損傷后減少炎癥并且改 善功能恢復）.J Exp Med 202:145-156)。
[0127]考慮到星形膠質細胞在促進OPC存活和功能中起到的作用，本文鑒定的SEM4D-表 達0PC和SEMA4D受體表達星形膠質細胞的并置表明星形膠質細胞的疾病相關激活和叢蛋 白-B受體及沈MA4D信號轉導的相關上調對0PC功能有顯著影響。
[01%]星形膠質細胞和神經元支持。越來越多的證據表明，星形膠質細胞通過調節釋放 突觸活性分子，包括谷氨酸、嚷嶺(ATP和腺巧）、GABA、和D-絲氨酸在突觸傳遞中起到直接作 用化 alassa MM，Fellin T，化 ydon PG 的綜述（2007)，The bipartite synapsejoles for gliotransmission in health and disease(S聯突觸：健康和疾病中囊泡膠質傳遞的作 用）.Trends Mol Med 13:54-63;化de;rgaard M，Ransom B，Goldman SA(2003)New roles for 曰strocytes:redefining the functional architecture of the br曰in(星形膠質細 胞的新作用：重新定義大腦功能結構）.化ends Neurosci 26:523-530)。運類囊泡膠質遞質 的釋放響應神經元突觸活性發生，設及由星形膠質細胞巧信號轉導增加反映的星形膠質細 胞興奮性，并且可改變神經元興奮性（Halassa MM，Fellin T，Haydon PG(2007)，The tripartite synapse:roles for gliotransmission in health and diseaseG耳關突角蟲： 健康和疾病中囊泡膠質傳遞的作用）.化611(13 Mol Med 13:54-63;Nedergaard Μ,Ransom Β,Goldman SA(2003)New roles for astrocytes：redefining the functional architecture of the brain(星形膠質細胞的新作用：重新定義大腦功能結構）.化ends 化urosci 26:523-530)。除了通過釋放囊泡膠質遞質對突觸活性有直接影響W外，星形膠 質細胞具有通過釋放生長因子和相關的分子對突觸功能發揮強力和長期影響的潛力 (Barres BA(2008)The mystery and magic of glia：a perspective on their roles in health and disease(神經膠質細胞的謎和魔法:其在健康和疾病中作用的透視）.化uron 60：430-440)〇
[0129] 星形膠質細胞和BBB完整性。星形膠質細胞在形成血腦屏障（BBB)和調節通過BBB 的轉運(對于合適的神經元功能而言關鍵的內穩態過程）中起到重要作用。BBB是高度復雜 的神經血管系統的大腦內皮結構，其包含周細胞、星形膠質細胞和內皮細胞。BBB損壞已知 設及多種神經變性疾病，包括腦膜炎、腦水腫、癒痛、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、中 風、肌萎縮側索硬化（ALS)、和多發性硬化（MS，Zlokovie BV的綜述.Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders(阿爾 茨海默病和其他病癥中導致神經變性的神經血管通路）.化t Rev化urosci.2011:12:723- 738) ο
[0130] 星形膠質細胞是"極化的"細胞，其中它們延伸特殊的膜過程，包括與特定細胞類 型相互作用的膜組分和獨特細胞器。例如，靠近腦微血管或軟膜的星形膠質細胞過程的特 征是高密度的水通道，水通道蛋白4(Aqp4)(化ely JD，Amiry-Moghaddam M，0ttersen 0Ρ， Froehner SC，Agre P,Adams ME(2001)Syntrophin-dependent expression and localization of Aquaporin-4water channel protein冰通道蛋白47jC通道蛋白的肌養 蛋白結合蛋白-依賴性表達和定位）.Proc化tl Acad Sci U S A 98，14108-14113;Ami巧- Moghaddam M，0tsuka T，Hurn PD，Traystman RJ，Haug FM，Froehner SC,Adams ME,Neely JD，Agre P，0ttersen 0P，Bhardwaj A(2003)An alpha-syntrophin-dependent pool of AQP4in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain(星形膠質細胞瘤末端-足中AQP4的a-肌養蛋白結合蛋白-依賴性集合賦予血液和大 腦之間的雙向水流）.Pr〇c Natl Acad Sci U S A 100,2106-2111)。相反，面對突觸區的星 形膠質細胞過程在谷氨酸轉運蛋白中富集，同時Aqp4的密度較低（Nielsen S，化ge化US EA，Amiry-Moghaddam Μ，Bourque C，Agre P，0ttersen 0P(1997)Specialized membrane domains for water transport in glial cells：High-resolution immunogold (：ytochemis1:ry of aquapo;rin-4in rat brain(在神經膠質細胞中水轉運的特殊膜結構 域：大鼠大腦中水通道蛋白-4的高分辨免疫金細胞化學）.J Neurosci 17,171-180; Chaudhry FA，Lehre ΚΡ,van Lookeren Campagne M，0ttersen 0P，Danbolt NC，Storm- Mathisen J(1995)Glutamate transporters in glial plasma membranes:Highly different!曰ted loc曰1iz曰tions reve曰led bv qu曰ntit曰tive ultr曰structur曰1 immunocytochemistry (神經膠質質膜中的谷氨酸轉運蛋白：通過定量超結構免疫細胞化學 掲示的高度分化的定位）.化uron 15,711-720)。有趣的是，星形膠質細胞極化在經歷神經 變性的大腦中被破壞。例如，在AD情況中，Aqp4染色強度在有明顯淀粉樣斑塊負擔的區域中 明顯降低。事實上，Yang和同事證明，tg-AreSwe AD小鼠中的淀粉樣病變的積累與星形膠質 細胞極化的損失在時間和空間上偶聯（J Alzheimer's Dis. 2011:27(4) :711-22. doi: 10.3233/JAD-2011-110725；Loss of astrocyte polarization in the tg-ArcSwe mouse model of Alzheimer's disease(在阿爾茨海默病的tg-ArcSwe小鼠模型中星形膠質細胞 極化損失）.Yan邑 JL，Lunde LK，Nunta邑ij P，0邑uchi Τ,Camassa LM,Nilsson LN，Lannfelt L，XuY，Amiry-MoghaddamM，OttersenOP.To^R)。
[0131] SEMA4D信號轉導在促進星形膠質細胞活化中的作用。考慮到沈MA4D受體表達和星 形膠質細胞活化標志物GFAP的相關性，存在SEMA4D信號轉導可增強星形膠質細胞活化的可 能，從而在疾病階段期間提供"前饋"機制。為了檢驗SEMA4D對星形膠質細胞活化的影響，生 成大鼠星形膠質細胞的原代培養物并單獨用SEMA4D或與硫代乙酷胺(TAA)聯合處理（下文 的實施例6和圖18A)，TAA是已經顯示在體內誘導叢蛋白-B1表達的熟知的肝毒性和致肝癌 試劑化imJ.S.，Jeong，S.Y.，Hwang，J.Y.，化rk，H.J.，化o，J.w.和化on，S.(2006)，或前列 腺素 D2(下文的實施例6和圖18B)，一種在CNS中由小膠質細胞產生的已知活化因子， Toxicogenomics Analysis on Thioacetamide-induced Hepatotoxicity in Mice(對小 鼠中硫代乙酷胺-誘導的肝臟毒性的毒理基因組學分析）.MOLECULAR&CELLULAR TOXICOLOGY,2(2) a26-133) ο
[0132] V.使用治療性抗-SEMA4D抗體的治療方法
[0133] 本發明的方法設及抗-SEMA4D結合分子治療患有神經變性疾病的對象的用途，所 述結合分子例如抗體，包括其抗原結合片段、變體和衍生物。在某些實施方式中，內皮細胞 表達SEMA4D受體，在其他實施方式中，神經細胞表達SEMA4D受體，并且在其他實施方式中， 內皮細胞和神經細胞都表達SEMA4D受體。在某些實施方式中，受體是叢蛋白-B1。雖然W下 說明設及給予抗-SEMA4D抗體，本文所述的方法也適用于保留本發明抗-SEMA4D抗體的所需 性質的運些抗體的抗原結合片段、變體和衍生物或其他生物或小分子，所述性質例如，能夠 特異性結合SEMA4D，例如，人、小鼠、或人和小鼠 SEMA4D，具有SEMA4D中和活性，和/或阻斷 SEMA4D與其受體，例如叢蛋白-B1的相互作用。在另一個實施方式中，該方法指給予抗- SEMA4D抗體，本文所述的方法也可指給予抗-叢蛋白-B1或抗-叢蛋白-B2結合分子，其能夠 特異性結合叢蛋白-B1和/或叢蛋白-B2并且阻斷SEM-4DW其叢蛋白受體中的一個或兩個， 例如，叢蛋白-B1和/或叢蛋白-B2的相互作用。
[0134] 在一個實施方式中，治療包括向患者施加或給予本文所述的抗-SEMA4D結合分子， 例如結合并中和SEMA4D的抗體或其抗原結合片段或其他生物或小分子，其中該患者患有， 或處于發展神經變性疾病的風險中。在另一個實施方式中，治療也包括向患者施加或給予 包含抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片段的組合物，其中該患者患有，或處于 發展神經變性疾病的風險中。
[0135] 本文所述的抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片段可用于治療各種神 經變性疾病。在一些實施方式中，治療神經變性疾病旨在誘導與該疾病相關癥狀的改善。在 其他實施方式中，治療神經變性疾病旨在減少、延緩或停止癥狀表現的增加。在其他實施方 式中，治療神經變性疾病旨在抑制，例如，阻止、延緩、防止、停止、或逆轉癥狀表現。在其他 實施方式中，治療神經變性疾病旨在一定程度上緩解與該疾病相關的一個或多個癥狀。在 運些情況中，癥狀可W是神經精神癥狀、認知癥狀和/或運動功能障礙。在其他實施方式中， 治療神經變性疾病旨在降低發病率和死亡率。在其他實施方式中，治療神經變性疾病旨在 改善生活質量。
[0136] 在一個實施方式中，本發明設及抗-SEMA4D結合分子，例如其抗體或抗原結合片 段、變體或衍生物作為藥物在用于治療神經變性疾病W改善與該疾病相關的癥狀中的用 途。
[0137] 按照本發明的方法，對于神經變性疾病，利用至少一種抗-SEMA4D結合分子，例如 本文另述的抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物或其他生物或小分子提高積極治療響 應。對于神經變性疾病，"積極治療響應"旨在包括與該疾病相關癥狀的改善。運種積極治療 響應不僅限于給藥途徑，可包括給予供體、供體組織(如器官灌注）、宿主、其任何組合等。具 體地，本文提供的方法設及抑制、防止、減少、緩解或減弱患者中神經變性疾病的發展。因 此，例如，疾病改善的特征可W是沒有臨床上可觀察到的癥狀、臨床上可觀察到的癥狀的頻 率降低，或臨床上可觀察到的癥狀的變化。
[0138] 改變與神經變性疾病相關的癥狀的活性可使用體內小鼠模型檢測并測量。在某些 實施方式中，可采用CVN小鼠模型。CVN小鼠包括Αβ前體蛋白質的突變(其為3個獨立譜系中 家族性阿爾茨海默病(AD)的特征及復現AD相關大腦炎癥的一些病癥的突變(Colton等， J Alzheimer's Dis.15:571-587,2008;VanNostrand等，Stroke 41:S135-S138,2010)oCVN 模型顯示出與阿爾茨海默病相關的主要病變中的一些:Αβ斑塊、導致神經纖維纏結和細胞 死亡(神經元損失）的過度憐酸化tau、和一致的空間記憶缺損和神經血管缺陷。與用于對阿 爾茨海默病建模的其他小鼠突變體相比，CVN小鼠在更早的年齡顯示出更多阿爾茨海默相 關病變。在其他實施方式中，可采用亨廷頓氏病化D)的YAC128小鼠模型。YAC128小鼠表達全 長突變人亨廷頓蛋白基因(mHTT)并且準確涵蓋了許多皿癥狀和跡象。應理解，本領域技術 人員會認識到在文獻中已經描述其他模型并可用于研究神經變性疾病的癥狀的治療和疾 病機制，并且本發明不用限制于任意特定模型。
[0139] 抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物或其他生物或 小分子可與至少一種或多種其他神經變性疾病的治療聯用；其中其他療法在抗-SEMA4D結 合分子，例如，抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物療法之前、期間或之后給予。因此，在 組合療法包括給予抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物與給 予另一種治療的情況中，本發明的方法包括共同給予、使用單獨制劑或單一藥物制劑，同時 或W任意順序連續給予。
[0140] 為了應用某些實施方式中本發明的方法和系統，可在向確定患有神經變性疾病的 對象，或疑似患有神經變性疾病的對象給予包含有效量的特異性結合腦信號蛋白-4D (SEMA4D)的分離的結合分子的治療之前、或之后、或之前和之后同時從患者獲得樣品或圖 像。在一些情況中，可在已經開始治療之后或已經停止治療之后、或在治療之前和之后從患 者獲得連續樣品或圖像。樣品或圖像可W是，例如，由醫療提供者(例如，醫生)或醫療益處 提供者所需要，由相同或不同醫療提供者(例如，護±，醫院)或臨床實驗室獲得和/或處理， 并且在處理之后，可將結果轉送至另一個提供者、醫療益處提供者或患者。類似地，可由一 個或多個醫療提供者、醫療益處提供者和/或臨床實驗室進行一個或多個分數的測量/確 定、分數之間的比較、分數的評價和治療決定。
[0141 ]在任意前述過程的某些方面中，神經變性疾病選自下組：阿爾茨海默病、帕金森 病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟失調、肌萎縮側索硬化(ALS)、額顛性癡呆(FTD)、HIV-相 關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障礙、或其組合。在任意前述過程的某些方面中，神經變性 疾病是阿爾茨海默病或亨延頓氏病。
[0142] 在一些方面中，醫療提供者可給予或指示其他醫療提供者給予包括有效量的特異 性結合腦信號蛋白-4D (SEMA4D)的分離的結合分子的治療，其中該對象患有、確定患有、或 疑似患有神經變性疾病。醫療提供者可執行或指示其他醫療提供者或患者進行W下動作： 獲取樣品或圖像、處理樣品或圖像、提交樣品或圖像、接收樣品或圖像、轉移樣品或圖像、分 析或測量樣品或圖像、定量樣品或圖像、提供在分析/測量/定量樣品或圖像之后得到的結 果、接收在分析/測量/定量樣品或圖像之后得到的結果、比較/評分在分析/測量/定量一個 或多個樣品或圖像之后得到的結果、提供來自一個或多個樣品的比較/分數、獲取來自一個 或多個樣品或圖像的比較/分數、給予治療（例如，有效量的特異性結合腦信號蛋白-4D (SEMA4D)的分離的結合分子），開始給予治療、停止給予治療、繼續給予治療、暫時中斷給予 治療、增加給予的治療劑的量、減少給予的治療劑的量、繼續給予一定量的治療劑、增加給 予治療劑的頻率、降低給予治療劑的頻率、保持治療劑的相同給藥頻率、由至少一種其他治 療或治療劑取代治療或治療劑、將治療或治療劑與至少一種其他治療或治療劑組合。
[0143] 在一些方面中，醫療提供者可授權或拒絕例如，收集樣品、處理樣品、提交樣品、接 收樣品、轉移樣品、分析或測量樣品、定量樣品、提供在分析/測量/定量樣品之后得到的結 果、轉移在分析/測量/定量樣品之后得到的結果、比較/評分在分析/測量/定量一個或多個 樣品之后得到的結果、轉移來自一個或多個樣品的比較/分數、給予治療或治療劑、開始給 予治療或治療劑、停止給予治療或治療劑、持續給予治療或治療劑、暫時中斷給予治療或治 療劑、增加給予的治療劑的量、減少給予的治療劑的量、繼續給予一定量的治療劑、增加給 予治療劑的頻率、降低給予治療劑的頻率、維持治療劑的相同給藥頻率、由至少一種其他治 療或治療劑取代治療或治療劑、或將治療或治療劑與至少一種其他治療或治療劑組合。
[0144] 在任意前述過程的某些方面中，神經變性疾病選自下組：阿爾茨海默病、帕金森 病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟失調、肌萎縮側索硬化(ALS)、額顛性癡呆(FTD)、HIV-相 關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障礙、或其組合。在任意前述過程的某些方面中，神經變性 疾病是阿爾茨海默病或亨延頓氏病。
[0145] 另外，醫療益處提供者可W，例如授權或拒絕治療處方，授權或拒絕治療覆蓋范 圍，授權或拒絕治療成本的退還，確定或拒絕治療合格性等。
[0146] 在一些方面中，臨床實驗室可W，例如，收集或獲取樣品、處理樣品、提交樣品、接 收樣品、轉移樣品、分析或測量樣品、定量樣品、提供在分析/測量/定量樣品之后得到的結 果、接收在分析/測量/定量樣品之后得到的結果、比較/評分在分析/測量/定量一個或多個 樣品之后得到的結果、提供來自一個或多個樣品的比較/分數、獲取來自一個或多個樣品的 比較/分數、或其他相關活動。
[0147] 在任意前述過程的某些方面中，神經變性疾病選自下組：阿爾茨海默病、帕金森 病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟失調、肌萎縮側索硬化(ALS)、額顛性癡呆(FTD)、HIV-相 關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障礙、或其組合。在任意前述過程的某些方面中，神經變性 疾病是阿爾茨海默病或亨延頓氏病。
[0148] 在某些方面中，可使用任意前述過程來確定對象是否患有神經變性疾病。在某些 方面中，神經變性疾病選自下組:阿爾茨海默病、帕金森病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟 失調、肌萎縮側索硬化(ALS)、額顛性癡呆(FTD)、HIV-相關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障 礙、或其組合。在任意前述過程的某些方面中，神經變性疾病是阿爾茨海默病或亨延頓氏 病。
[0149] 在一些方面中，醫療提供者、臨床實驗室、或其他實體可W，例如，收集或獲取圖 像、處理圖像、提交圖像、接收圖像、轉移圖像、分析或測量圖像、定量圖像、提供在分析/測 量/定量圖像之后得到的結果、接收在分析/測量/定量圖像之后得到的結果、比較/評分在 分析/測量/定量一個或多個圖像之后得到的結果、提供來自一個或多個圖像的比較/分數、 獲取來自一個或多個圖像的比較/分數、或其他相關活動。可用于運些方面的圖像包括但不 限于通過血管造影、超聲、計算機斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層成像 (PET)、光學相干斷層成像(0CT)、近紅外光譜(NIRS)、和NIR巧光獲得的圖像。在某些實施方 式中，可使用已經在文獻中描述的成像技術(Tardif等，Circ Cardiovasc Imaging 4:319- 333(2011))0
[0150] VI.藥物組合物和給藥方法
[0151] 本領域技術人員熟知或不難確定制備和給予抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗 原結合片段、變體或衍生物的方法。抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或 衍生物的給藥途徑可W是，例如，口服、胃腸道外、吸入或外用。本文所用的術語胃腸道外包 括例如，靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道給藥。雖然所有運些給藥形式均 明確認為在本發明范圍內，但給藥形式的例子是注射液，特別是用于靜脈內或動脈內注射 或滴注。合適的注射用藥物組合物可包含緩沖劑(如乙酸鹽、憐酸鹽或巧樣酸鹽緩沖劑）、表 面活性劑(如聚山梨醋），W及任選的穩定劑(如人白蛋白）等。然而，在與本文所教授內容相 符的其它方法中，抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可直接遞 送到不良細胞群的位點，從而提高患病組織與治療劑的接觸。
[0152] 如本文所述，可W藥學有效量給予抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物用于體內治療神經變性疾病。在運方面，應理解，將配制本發明公開的 結合分子W利于給藥并提高活性物質的穩定性。在某些實施方式中，本發明的藥物組合物 包含藥學上可接受的無毒無菌運載體，如生理鹽水、無毒緩沖液、防腐劑等。出于本申請目 的，抗-SEMA4D結合分子如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的藥學有效量應認為指足 W實現有效結合祀標和足W實現某一益處，例如，改善與神經變性疾病相關的癥狀。
[0153] 本發明所用的藥物組合物包含藥學上可接受的運載體，包括例如，離子交換劑、氧 化侶、硬脂酸侶、卵憐脂，血清蛋白質如人血清白蛋白，緩沖物質如憐酸鹽、甘氨酸、山梨酸、 山梨酸鐘、飽和植物脂肪酸的部分甘油醋混合物、水、鹽或電解質，如硫酸魚精蛋白、憐酸氨 二鋼、憐酸氨鐘、氯化鋼、鋒鹽、膠體二氧化娃、Ξ娃酸儀、聚乙締化咯燒酬、纖維素基物質、 聚乙二醇、簇甲基纖維素鋼、聚丙締酸醋、蠟、聚乙締-聚氧丙締-段聚合物、聚乙二醇和羊毛 脂。
[0154] 胃腸道外給藥制劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸液和乳液。非水性溶劑的示 例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄攬油，和可注射有機醋如油酸乙醋。水性運載體包括例 如，水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質。在本發明中，藥學上可接受的運載體 包括但不限于:0.01-0.1M，例如，約0.05M的憐酸鹽緩沖液或0.8 %鹽水。其它常見的胃腸道 外載劑包括憐酸鋼溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化鋼、乳酸林格溶液或固定油。靜脈內載 劑包括液體和營養補充劑、電解質補充劑，例如基于林格右旋糖的那些物質等。也可存在防 腐劑和其它添加劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、馨合劑和惰性氣體等。
[0155] 更具體地，適于注射應用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性時）或分散液，W 及用于臨時制備無菌注射液或分散液的無菌粉末。在運種情況下，該組合物必須無菌，并應 該是達到存在注射容易性(easy 371'；[]1旨曰13；[1;^7)程度的流體。它應該在制造和儲存條件下 穩定，并且應該在保存過程中能夠抵抗微生物如細菌和真菌的污染作用。運載體可W是包 含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑或分散 介質。可維持合適的流動性，例如通過使用諸如卵憐脂的涂料、分散液情況下通過保持所需 粒度W及通過使用表面活性劑。適用于本文所述治療方法的制劑可參見《雷明頓藥物科學》 (Remington's Pharmaceutical SciencesK馬克出版公司(Mack Publishing Co.))第16 版(1980)。
[0156] 也可通過各種抗菌劑和抗真菌劑(如對徑基苯甲酸醋類、氯下醇、苯酪、抗壞血酸、 硫柳隸等)實現防止微生物的作用。在許多情況中，可包含等滲劑，例如，糖、多元醇，如甘露 醇、山梨醇或氯化鋼。可在組合物中包含延遲吸收的試劑（如單硬脂酸侶和明膠）W延長可 注射組合物的吸收。
[0157] 在任何情況下，制備無菌注射溶液可通過將所需量的活性化合物(如抗-SEMA4D抗 體或其抗原結合片段、變體或衍生物，本身或與其它活性劑聯合)滲入含有本文所列一種成 分或多種成分組合的合適溶劑，然后如需要進行過濾除菌。通常，將活性活化物滲入含有堿 性分散介質和上述其它所需成分的無菌載劑中制備分散液。在制備無菌注射液所需的無菌 粉末時，制備方法包括真空干燥和冷凍干燥，由之前無菌過濾的溶液產生活性組分和任何 其它所需組分的粉末。注射制劑在無菌條件下按照本領域已知方法加工，裝入容器（如安 飯、袋、瓶、注射器或小管）中，并密封。此外，可W試劑盒的形式包裝并銷售制劑。運類制品 可具有標簽或藥品說明書，表明相關組合物可用于治療患有或傾向于患有疾病或病癥的對 象。
[0158] 胃腸道外制劑可W是單次推注劑量，輸注或負荷推注劑量，隨后是維持劑量。可在 具體固定或可變的間隔處給予運些組合物，例如，每天一次或者"按需"基礎。
[0159] 本發明所用的某些藥物組合物可W可接受的劑型口服給予，包括例如，膠囊、片 劑、水性懸液或溶液。也可通過鼻氣溶膠或吸入來給予某些藥物組合物。運類組合物可采用 苯甲醇或其他合適的防腐劑，吸收促經濟W增強生物可及性，和/或其他常規增溶劑或分散 劑制備成鹽水溶液。
[0160] 與載體材料組合產生單一劑型的抗-沈M4D結合分子，如抗體或其片段、變體或衍 生物的量可W根據治療宿主W及具體的給藥模式而變化。可W單劑型、多劑型或在確立的 時間段內的輸注中給予組合物。也可調整給藥方案，W提供最優所需響應(例如，治療或預 防性響應)。
[0161] 在本發明范圍內，抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可按照上述治 療方法給予人或其它動物，其給予量足W產生療效。本發明抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合 片段、變體或衍生物可W常規劑型給予所述人或其它動物，該劑型根據已知技術將本發明 抗體與常規的藥學上可接受運載體或稀釋劑混合來制備。本領域技術人員應認識到，藥學 上可接受運載體或稀釋劑的形式和特點由混合的活性成分含量、給藥途徑和其它熟知變量 決定。本領域技術人員還將理解，可使用包含一種或多種抗-SEMA4D結合分子，如本發明的 抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的混合物。
[0162] "治療有效劑量或治療有效量"或者"有效量"指給予時，在患有待治療疾病患者的 治療方面帶來陽性治療響應的抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生 物的用量。在神經變性疾病的情況中，積極治療響應可減輕疾病的癥狀;減少、降低、延緩或 停止癥狀出現;減少、降低、延緩癥狀的嚴重性;抑制，例如，阻止、延緩、防止、停止或逆轉癥 狀的表現;一定程度上緩解與該疾病相關的一個或多個癥狀;降低發病率和死亡率;改善生 活質量;或運類影響的組合。
[0163] 用于減少癥狀發生的本發明的藥物制劑的治療有效的劑量可根據許多不同的因 素變化，包括給藥方式、目標位點、患者的生理狀態、患者是人還是動物、給予的其他藥物和 治療是預防性還是治療性。在某些實施方式中，患者是人，但也可治療非人哺乳動物，包括 轉基因哺乳動物。可使用本領域技術人員已知的常規方法對治療劑量進行滴定W優化安全 性和功效。
[0164] 鑒于本發明的公開內容，本領域普通技術人員無需過多實驗即可確定至少一種 抗-SEMA4D結合分子如抗體或其結合片段、變體或衍生物的給予量。影響給藥方式W及至少 一種抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物各自用量的因素包括但 不限于:接受治療的個體的疾病嚴重程度、病史、年齡、身高、重量、健康和身體狀況。類似 地，抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其片段、變體或衍生物的給予量取決于給藥方式、對象是 否接受單一劑量或多劑量的此種藥劑。
[0165] 本發明還提供抗-SEMA4D結合分子，例如本發明的抗體，或其抗原結合片段、變體 或衍生物在制備用于治療對象的神經變性疾病的藥物中的用途，其中該藥物用于已經用至 少一種其他治療預治療的對象。"預治療"或"預處理"是指對象在接受包含抗-SEMA4D結合 分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的藥物之前已經接受了一種或多種其他治 療（例如，已經用至少一種其他神經變性治療進行治療）。"預治療"或"預處理"包括在開始 用包含抗-SEMA4D結合分子，例如本文公開的單克隆抗體VX15/2503、67或76、或其抗原結合 片段、變體或衍生物的藥物治療開始2年內、18個月內、1年內、6個月內、2個月內、6周內、1個 月內、4周內、3周內、2周內、1周內、6天內、5天內、4天內、3天內、2天內、或者甚至1天內已經 用至少一種其他治療進行治療的對象。對象不必對用之前的一種或多種治療進行的預治療 有響應。因此，接受包含抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的 藥物的對象可能已經響應或可能沒有響應用先前治療的預治療，或先前治療中的一種或多 種，其中預治療包括多種治療。
[0166] 除非另有說明，本發明的實施將采用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因 生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，它們均在本領域技術范圍內。運些技術在 文獻中已有充分描述。參見例如，Sambrook等編（1989)Molecular Cloning A LaboratoiT Manual (《分子克隆：實驗室手冊》）（第2版；冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)); Sambrook等編（1992)Molecular Cloning： A Laboratory Manual (《分子克隆：實驗室手冊》），（紐約州的冷泉港實驗室出版社（Cold Springs Harbor Laborato巧，NY));D.N.Glover編，（1985)DNACloning(《DNA克隆》），第I和II卷；Gait編 (1984)01 igonucleotide Synthesis(《寡核巧酸合成》）；Mullis等，美國專利號4,683,195; Hames和Higgins編（1984)Nucleic Acid Hy虹idization(《核酸雜交〉〉）；Hames和Higgins編 (1984)Transcription And Translation(《轉錄和翻譯〉〉）；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《動物細胞培養〉〉）（AI?L公司（Alan R丄iss，Inc.));Immobilized Cells And Enzymes(《固定的細胞和酶〉〉）（IRL出版社）（1986) ;Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆實踐指南〉〉）；論文，Methods In Enzymology(《酶學方法〉〉） (學術出版社公司（Academic Press，Inc ·)，紐約州）；Miller和Calos編（1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳動物細胞的轉基因載體〉〉）（冷泉港實驗室 出版社（Cold Spring Harbor Laboratory) );Wu等編，Methods In Enzymology(《酶學方 法〉〉），第 154和 155卷；Mayer和Walker編（1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Bio logy (《細胞和分子生物學中的免疫化學方法〉〉）（學術出版社（Academic Press),倫敦）；Weir和Blackwell編（1986)Handbook Of Experimental Immunology(《實驗 免疫學手冊〉〉），第I-IV卷;Manipulating化Θ Mouse Embryo(《小贏胚胎操作〉〉），紐約州冷 泉港的冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N.Y.) ,(1986);和Ausubel等（1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新編分 子生物學實驗指南〉〉）（馬里蘭州己爾的摩的約翰韋利父子公司（John Wiley&Sons， Baltimore，Md.))D
[0167] 抗體工程的一般原理可參見Borrebaeck編（1995)Antibody Engineering(《抗體 工程〉〉）（第2版；牛津大學出版社（OxfordUniv.Press))。蛋白質工程的一般原理可參見 民ickwood等編（1995)F*rotein Engineei'ing，A Practical Approach(《蛋白質工程，實踐方 法〉〉），（英國牛津的牛津大學出版社的IRL出版公司（I化Press at Oxford Univ.化ess， 0xford，Eng.))。抗體和抗體-半抗原結合的一般原理可參見：Nisonoff (1984)Molecular Immunology U分子免疫學〉〉）（第2版；馬薩諸塞州桑德蘭的辛奧爾聯合公司（Sinauer Associates，Sunderland，Mass.));和Steward(1984)Antibodies，Their Structure and F'unction(《抗體的結構和功能〉〉）（Chapman和Hall，紐約州紐約市）。此外，本領域已知且沒 有具體描述的免疫學標準方法通常按照下述文獻所述進行：Current Protocols in Immunology(《新編免疫學實驗指南〉〉），紐約州的約翰韋利父子公司（John Wiley&Sons); Stites等編（1994)Basic and Clinical Immunology(《基礎和臨床免疫學〉〉）（第8版； Apple ton 和 Lange,康涅狄格州的諾沃克(Norwalk, Conn.))和Mishel 巧日Shi igi (編）（1980) Selected Methods in Cellular Immunology(《細胞免疫學的選用方法〉〉）（w.H.弗里曼公 司（W-H.^Freeman and Co),紐約州）。
[0168] 列出免疫學通用原理的標準參考文獻包括：Current Protocols in Immunology (《新編免疫學實驗指南〉〉），約翰韋利父子公司（John Wiley&Sons)，紐約州;Klein(1982) J.，Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(《免疫學：自身一非自身 區別的科學〉〉）（約翰韋利父子公司，紐約州）；Kennett等編（1980)Monoclonal Antibodies， Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(《單克隆抗體，雜交瘤：生物學分 析的新領域〉〉）（普萊努公司（Plenum Press)，紐約州）；Campbell (1984)"Monoclonal Antibody Technology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology"(《生化和分子生物學實驗室技術〉〉中的"單克隆抗體技術"），Burden等編（的埃爾 斯威爾公司化Isevere)，阿姆斯特丹）；Goldsby等編（2000化uby Immunnology(《庫比免疫 學》）（第4版;Η.弗里曼公司（H.Freemand&Co.)) ;Roitt等（2001)Immunology(《免疫學》）（第 6版；倫敦：摩茲比公司（Mosby));At)bas等（2005)Cellular and Molecular Immunology (《細胞和分子免疫學》）（第5版;埃爾斯威爾健康科學分公司化Isevier化alth Sciences Division)) ;Konte;rmann和Dubel(2001 )Antibody Engineering(《抗體工程》）（施普林格公 司（Springer Verlan));Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual (《分子克隆：實驗室手冊》）（冷泉港出版社（Cold Spring化rbor Press) );Lewin (2003)Gene VIII(《基因 VIII》）（普倫蒂斯霍爾出版社(Prentice化11)2003);化rlow和 Lane( 1988)Antibodies :A LaboratoiT Manual (《抗體：實驗室手冊》）（冷泉港出版社）； Di ef f enbach和Dveks 1 er (2003) PCR Pr imer (《PCR 引物》）（冷泉港出版社）。
[0169] 將上文中引用的所有參考文獻W及其中引用的所有參考文獻通過引用全文納入 本文。
[0170] 通過說明的方式，而非限制性方式提供W下實施例。 實施例
[0171] 實施例1:測試CVN小鼠模型中抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合片段、 變體或衍生物，例如VX15/2503、67、或76對阿爾茨海默病(AD)的效果。
[01巧實驗設計。使用CVN模型來研究抗-SEMA4D抗體(例如，MAb 67)對與A時目關的病變 和癥狀的影響。CVN小鼠包括人Αβ前體蛋白的突變巧是3個獨立譜系中家族性阿爾茨海默 病(AD)的特征)和促進與AD相關的神經炎性機制的基因刪除(一氧化氮合酶-2)(Colton等， J Alzheimer's Dis.15:571-587,2008;化nNostrand等，Stroke 41:S135-S138,2010)。
[0173] 基本實驗設計示于圖1。使用阿爾茨海默病傾向CVN小鼠（獲自查爾斯河公司 (化arles River))來測試抗-SEMA4D結合分子對AD的效果。在10周齡時，對小鼠采血W獲得 基線血清學水平。在10-12周齡之間，小鼠經過行為預測試W確保它們能夠參與研究。在隨 機化之后，從第26周至第38周，每周用抗-SEMA4D(Mab-67)或同種型對照（MAb 2B8)抗體 (30mg/kg，靜脈內）處理CVN小鼠，期間它們給予幾次行為測試。行為測試是曠場測試和放射 臂水迷宮。
[0174] 曠場測試-在10和38周齡時在曠場中研究動物的探索活性，針對可能的治療誘導 的活性過低或活性過高(對照測試)或其他效果。在測試之前，小鼠被帶到實驗室持續至少 30分鐘適應實驗室條件。活性腔室(佛蒙特州圣奧爾本斯的醫學聯營公司(Med Associates Inc，St A化ans，VT);27x 27x 20.3畑1)裝備紅外光束。小鼠放在腔室中央并且^5-分鐘箱 (bins)記錄它們的行為持續30分鐘。在W下5個依賴性測量上進行定量分析:總移動、曠場 中央的移動、中央的抬頭(rearing)率、總抬頭頻率和速度。動物在低應激條件下測試，其中 光降低至大約10-301UX的紅光。
[0175] 放射臂水迷宮-測試之前，11和39周齡的小鼠被帶到實驗室持續至少30分鐘適應 實驗室條件。在之前已經詳細描述了 2天放射臂水迷宮(Alamed等，2006)。簡言之，將6臂迷 宮浸沒在水池中，并且在一個臂的末端放置平臺。小鼠每天接受15次試驗持續2天，并且每 次試驗在不同的臂中開始，而含有平臺的臂對于各小鼠而言保持相同。平臺位置在2天中對 給定周齡的各小鼠保持恒定，但是該位置對11和40周齡測試點之間的各小鼠改變。在室周 圍使用視覺暗號，小鼠學習逃離平臺的位置。前十次試驗被認為是訓練并且在可視和隱藏 平臺之間交替。第1天的最后試驗和第2天的所有試驗使用隱藏平臺。在1分鐘的周期中計算 錯誤(不正確臂進入)數量。對導致2天周期的10個段的3次試驗取所述錯誤的平均。
[0176] 在行為測試結束之后，處死小鼠，并且對大腦組織進行處理用于甲醒固定的石蠟 包埋(FFPE)的免疫組化。鑒于SEMA4D在誘導抑制性GABA能突觸中的作用的報告化uzirian 等，J Neuroscience，33:8961-8973 · 8961，2013)在處理的CVN小鼠的齒狀回中確定囊泡 GABA轉運蛋白（VGAT)的表達強度和囊泡密度。齒狀回是成人CNS中連續神經發生的幾個主 要中屯、之一，并且被認為在記憶信息和保存中其作用。對于所有的測試，使用雙因素 AN0VA 檢驗來進行統計學分析。
[0177] 抗-SEMA4D減少焦慮狀行為。在12只用抗-SEMA4D或同種型對照處理的AD傾向CVN 小鼠的組中研究探索活性。在38周齡時針對可能的藥物誘導的對移動活性和焦慮狀行為的 效果給予曠場測試。小鼠放在亮腔室中央并且W5-分鐘時間箱記錄它們的行為持續30分 鐘。針對總移動（圖2A)和曠場中央的移動（圖2B)進行定量分析，運是對焦慮相關行為的測 量(如本領域所示）。
[017引結果顯示每周用抗-SEMA4D抗體AD傾向的CVN小鼠比用對照MAb2B8處理的小鼠表 現出更大的曠場探索和更少的焦慮狀行為(侵占場中央）。結果見圖2。
[0179] 抗-SEM4D改善空間記憶。在39周齡，用抗-SEM4D或2B8同種型對照(n = 9-13/組） 處理的CVN小鼠在放射臂水迷宮中測試2天(Alamed等，2006，示于圖3A)。簡言之，各小鼠在 連續的2天中每天接受15次試驗(每段3次試驗）。各試驗從不同的臂開始，而含有平臺的臂 對于各試驗保持相同。第1天的試驗段在可見和隱藏平臺之間交替用于訓練目的。第2天的 所有試驗用隱藏平臺進行W評價空間記憶。第1天是訓練/學習期，并且在第2天，記錄發現 平臺的延遲。
[0180] 結果顯示，給予抗-SEMA4D抗體(Mb 67)產生可測量的延遲減少，表明與對照(MAb 2B8-處理)組相比改善的空間記憶。結果示于圖3B。
[0181] 抗-SEMA4D減少GABA能突觸。來自Mab-67或MAb-2B8處理的CVN和WT小鼠 （n = 9-13/ 組）的FF陽大腦組織切片用抗-VGAT抗體染色來檢測GABA能突觸囊泡。VGAT-陽性囊泡信號 百分比和每個囊泡的VGAT信號強度在所有動物的齒狀回內定量并且標準化至掃描的總齒 狀回。
[0182] 結果顯示CVN AD小鼠的抗-SEMA4D抗體治療導致VGAT陽性囊泡的密度降低（圖4A) 和每個囊泡的VGAT染色強度水平的統計學顯著增加（圖4B)的趨勢，運一發現表明SEM4D在 調節體內GABA能信號轉導中的作用并且可提供對MAb 67處理的CVN小鼠中觀察到的行為影 響的機制的認識。GABA能信號轉導與異質類別的抑制性神經元相關。如下文實施例6的圖15 所示，當分析聚焦于生長激素抑制素 -、NPY-、或NPY2R-陽性神經元的亞組時，觀察到用抗- SEMA4D抗體治療對抑制性神經元的更顯著影響。
[0183] 實施例2:測試YAC128小鼠模型中抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合片 段、變體或衍生物，例如MAb VX15/2503或67對亨廷頓氏病化D)的效果。
[0184] 實驗設計。進行采用體內YAC128的第二實驗W研究抗-SEMA4D抗體對與皿相關的 病變和癥狀的影響。基本實驗設計與上述實施例1，和圖1所示的相似，除了該情況中MAb(抗 體)劑量是在每組13至22只YAC128或WT小鼠中從第6周至第47周每周進行。YAC128小鼠在英 屬哥倫比亞大學分子醫學和治療中屯、培養并維持。
[0185] 抗-SEMA4D減少了 YAC128小鼠模型中的焦慮狀行為。為了評價曠場探索期間的焦 慮，在由巧光天花板燈照亮的室內，MAb-處理的小鼠置于具有20cm高側壁的50 X 50cm開放 灰色丙締盒的左下角內。由固定在天花板上的攝像機記錄10分鐘的曠場活性。對進入（圖 5A)和場中屯、中耗費的時間（圖5B)進行評分作為焦慮狀行為的測量。
[0186] 與對照處理的動物(其中YAC128小鼠在曠場探索中顯示出比野生型(WT)小鼠更大 的焦慮狀行為）相反，用抗-SEMA4D抗體(MAb 67)處理的WT和YAC128小鼠之間沒有顯著差 異，表明Mb-67在YAC128小鼠中緩解焦慮狀行為。結果見圖5。
[0187] 抗-SEMA4D在YAC128小鼠模型中改善空間記憶。為了評價對新位置上的已知物體 的偏好，將2個不同的新物體放在曠場盒的左上角和右上角。將抗-沈M4D-處理的小鼠在左 下角引入盒中并由天花板固定的攝像機記錄5分鐘(min),期間對于對2個新物體調查的次 數進行評分(試驗1，圖6A)。小鼠然后從盒中移開5分鐘，并且盒的右上角處的物體移至盒的 右下角。將小鼠再引入盒中并且另外記錄5分鐘(試驗2,圖6B)。計算對目標物體(在新位置 上的物體)的調查或鼻子戳(nose pokes)相對于所有鼻子戳的百分比。
[0188] 與在試驗2中優先探索新位置上的物體的對照或Mab 67-處理的野生型(WT)動物 相反，對照處理的YAC128小鼠并沒有識別或顯示出對新位置上物體的偏好。用抗-沈M4D抗 體處理在YAC128小鼠中恢復了正常新物體偏好（p<0.01)。運表明Mab-67處理改善了 YAV128小鼠中的空間記憶，使得它們識別物體在新位置上。結果示于圖6。
[0189] 抗-SEMA4D在YAC128小鼠中防止皮質和脫服體變性。用抗-NeuN抗體對來自12月齡 MAb-處理的YAC128和WT小鼠（n=13-21/組）的自由漂浮的大腦組織切片進行染色。通過使 用Stereoinvestigator軟件(Microbrightfield公司）在連續切片中追蹤預定結構的外周 來確定皮質（圖7A)和脫服體(圖7B)體積并且使用卡瓦列里(化val i er i)原理來確定體積。
[0190] 結果顯示，用抗-SEMA4D抗體處理在12月齡的YAC128小鼠中抑制了皮質和脫服體 體積的正常疾病相關減小。結果示于圖7。
[0191] Mab 67在YAC128小鼠中防止睪丸變性。在男性皿患者中觀察到睪丸變性并且在雄 性YAC128小鼠中再現。如圖8所示，用抗-沈MA4D抗體處理防止12月齡YAC128小鼠中的睪丸 變性。疾病和抗-SEMA4D抗體對大腦和睪丸的影響可能反映了運些組織的正常功能共同依 賴于胞內肌動蛋白依賴性轉運機制。
[0192] 實施例3:在大鼠 CNS中檢驗沈MA4D、叢蛋白-B1、叢蛋白-B2和CD72的表達特征
[0193] 為了使得CNS中表達SEMA4D及其受體叢蛋白-B1、叢蛋白-B2和CD72的細胞類型可 視化，在來自天然大鼠的冠狀脊髓切片上進行共免疫組化（圖9A-P)。在來自天然大鼠的脊 髓切片上進行對少±膠質細胞前體細胞標志物Nkx2.2、和沈MA4D(圖9A-C)、叢蛋白-B巧口星 形膠質細胞標志物GFAP(圖9E-G)、叢蛋白-B1和CD72(圖9I-K)、W及叢蛋白-B1和小膠質細 胞標志物化al(圖9M-0)的共染色。另外，所有切片用DAPI染色W使細胞核可視化（圖9D、H、L 和P)。使用與Olympus 1x50顯微鏡禪合的EXi-Aqua-14位照相機在60倍放大下對載玻片進 行成像。
[0194] 圖9的結果顯示在正常CNS內，SEMA4D在Nkx2.2-陽性少±膠質細胞前體上表達，而 其受體，叢蛋白-B1、叢蛋白-B2(數據未顯示）和CD72在多種細胞類型上表達并且具體主要 在膠質細胞原纖維酸性蛋白（GFAP)-陽性星形膠質細胞上。
[0195] 實施例4:表征CVN阿爾茨海默病小鼠模型中叢蛋白-B1和叢蛋白-B2受體的表達特 征
[0196] 與周齡匹配的野生型小鼠相比，純合雙源CVN AD小鼠顯示出下托中典型的淀粉樣 病變和神經膠質活化。在阿爾茨海默病的CVN小鼠模型中檢驗叢蛋白-B1的表達特征。CVN (也稱為APPSWDI/N0S2-/-)雙源小鼠攜帶淀粉樣前體蛋白Swedish-Dutch-Iowa突變體 (APPSwDI)轉基因和一氧化氮合酶2(Nos2,或誘導型N0S，iN0S)基因座的祀向"無效"突變。 在41周齡時，處死CVN和野生型對照小鼠并處理用于DAB免疫組化。結果示于圖10，頂部組圖 是野生型小鼠切片而底部組圖是CVN小鼠切片。就淀粉樣m-42膚（左側頂部和底部組圖）、 小膠質細胞標志物化al (中間頂部和底部組圖）、或星形膠質細胞標志物GFAP(右側頂部和 底部組圖）對切片分開染色。使用與Olympus 1x50禪合的Retiga QICAM-12位照相機在20倍 放大下對載玻片進行成像。
[0197] 圖10中的結果顯示，純合雙源CVN小鼠（APPSWDI/N0S2-/-)發展典型淀粉樣病變， 小膠質細胞活化W及星形膠質細胞增生(底部組圖）。
[019引與周齡匹配的野生型小鼠相比，CVN AD小鼠中活化的星形膠質細胞顯示增強的叢 蛋白-B1表達。在41周齡時，處死CVN和野生型對照小鼠并處理用于巧光共免疫組化（圖 11A)。就SEM4D受體叢蛋白-B1和星形膠質細胞標志物GFAP、W及DAPI將切片分開染色W使 細胞核可視化。在最左側的組圖中顯示復合圖像。使用與Olympus 1x50顯微鏡禪合的EXi- Aqua-14位照相機在60倍放大下對載玻片進行成像。
[0199] 如圖11A所示，CVN和周齡匹配的野生型小鼠的大腦內叢蛋白-B1 (左側第二組圖） 和GFAP-陽性星形膠質細胞(左邊第Ξ組圖）的共免疫組化分析證明，如增加的GFAP標志物 染色所示，星形膠質細胞活化與配準（co-registered)的叢蛋白-B1的增強表達正相關，表 明SEMA4D/叢蛋白信號轉導參與了星形膠質細胞活化的過程。
[0200] 與周齡匹配的野生型小鼠相比，CVN AD小鼠中對沈MA4D信號轉導的抑制恢復了叢 蛋白-B2表達。為了確定在CVN AD小鼠中阻斷SEMA4D信號轉導是否會影響AD病變中早期受 影響的大腦區域中叢蛋白-B1和/或其替代性關聯受體叢蛋白-B2的表達，每周用30mg/kg 抗-SEM4D單克隆抗體(67-2)或對照IgG( 2B8)靜脈內注射26周齡的CVN和野生型對照小鼠， 持續13周。在41周齡時，處死小鼠并且來自MAb-處理的小鼠的大腦組織切片用抗-叢蛋白- B1或抗-叢蛋白-B2染色W檢測抗-SEMA4D處理是否改變了正在進行的AD-相關病變情況中 的關聯受體表達。在所有動物的下托內定量叢蛋白-B1和叢蛋白-B2-陽性信號的百分比并 且標準化至總掃描下托面積。
[0201] 如圖11B所示，對CVN AD小鼠的抗-SEMA4D抗體處理導致叢蛋白-B2(右圖）染色強 度水平恢復至WT對照小鼠中定量的那些水平，但是叢蛋白-B1水平（左圖）相對于周齡匹配 的CVN AD對照小鼠沒有顯著變化。運些結果表明抗體-介導的SEMA4D抑制選擇性導致叢蛋 白-B2的去穩定化和/或阻止沈MA4D-驅動的前饋機制，其選擇性促進叢蛋白-B2表達。
[0202] 實施例5:表征YAC128亨廷頓氏病小鼠模型中叢蛋白-B2受體的表達特征
[0203] YAC128小鼠表達全長突變人亨廷頓蛋白基因（mHTT)并且準確涵蓋了許多皿癥狀 和跡象(也參見實施例2)。與周齡匹配的野生型小鼠相比，YAC128亨廷頓氏病小鼠中活化的 星形膠質細胞顯示增強的叢蛋白-B2表達。在12月齡時，處死YAC128小鼠和野生型對照小鼠 并處理用于巧光共免疫組化（圖12)。就叢蛋白-B2(叢蛋白-B2,左側第Ξ組圖）、星形膠質細 胞GFAP(左側第二組圖）和DAPI對切片共染色W使細胞核可視化。在最左側的組圖中顯示復 合圖像。使用與Olympus 1x50顯微鏡禪合的EXi-Aqua-14位照相機在60倍放大下對載玻片 進行成像。
[0204] 如圖12所示，YAC128和野生型小鼠的大腦內叢蛋白-B2和GFAP-陽性星形膠質細胞 的共免疫組化分析證明星形膠質細胞活化，如增加的GFAP標志物染色所示，同樣與配準的 SEMA4D受體表達正相關。其最佳表征的配體是SEMA4C的叢蛋白-B2也具有對SEMA4D的中等 親和性（Azzarelli R等，An antagonistic interaction between PlexinB2and foidScontrols MioA activity and co;rtical neuron migration(叢蛋白B2和化d3之間的 括抗相互作用控制RhoA活性和皮質神經元遷移）.化ture Commun . 2014;D01:10.1038/ ncomms4405)。
[0205] 實施例6:檢驗SEMA4D信號轉導可調節星形膠質細胞功能的機制
[0206] AD和皿神經變性疾病的情況中增強的SEMA4D受體表達與星形膠質細胞活化之間 的關系表明SEMA4D信號轉導在星形膠質細胞功能和/或功能障礙中起作用。不希望受到理 論限制，該實施例提供了證據證明SEMA4D信號轉導可在響應CNS損傷期間參與星形膠質細 胞功能調節，無論是來自急性或慢性刺激。得到數據支持的圖解模型示于圖13,其顯示 SEMA4D信號轉導可潛在調節星形膠質細胞功能的Ξ種機制。下文對運Ξ種機制進行討論。
[0207] 星形膠質細胞和0PC支持的作用。叢蛋白+星形膠質細胞過程在沈MA4D+NKX2.化少 ±膠質細胞前體細胞(0PC)之間交錯并且提供營養支持。在CNS疾病中，活化的星形膠質細 胞上調叢蛋白表達并且通過SEMA4D信號轉導縮回過程。局部地，運種星形膠質細胞:0PC附 近的缺失可導致降低的營養支持和增加的趨化性驅動的0PC向損傷區域的移動，同時在損 傷部位缺少星形膠質細胞支持可阻止0PC分化和突觸再發生。
[0208] 為了測試該假設，野生型對照大鼠被處死并且脊髓經處理用于巧光共免疫組化 (圖14)。就SEMA4D(左側第二組圖）、星形膠質細胞標志物GFAP(左側第Ξ組圖）和DAPI對切 片共染色W使細胞核可視化(右組圖）。復合圖像示于最左側的組圖并且下面是虛線框顯示 1.67倍放大的插圖。使用與Olympus 1x50顯微鏡禪合的EXi-Aqua-14位照相機在60倍放大 下對載玻片進行成像。
[0209] 如圖14所示，沈M4D-表達0PC取向為緊密靠近GFAP+星形膠質細胞過程。考慮到星 形膠質細胞在促進0PC存活和功能中起到的作用，SEMA4D-表達0PC和SEMA4D受體表達星形 膠質細胞的并置表明星形膠質細胞的疾病相關激活和叢蛋白-B受體及SEMA4D信號轉導的 相關上調可影響0PC功能。
[0210] 星形膠質細胞在神經元支持中的作用。在CNS疾病中，星形膠質細胞活化導致叢蛋 白表達上調，增加的沈MA4D信號轉導和過程回縮，其導致神經元軸突導向喪失、營養支持減 少、和/或谷氨酸攝入/釋放失調。最終，根據疾病刺激的嚴重性，可能發生突觸損失和之后 的興奮性神經元死亡。
[0211] 為了確定在CVN AD小鼠中阻斷SEMA4D信號轉導是否會影響AD病變中早期受影響 的大腦區域中突觸標志物的表達，每周用30mg/kg抗-SEMA4D單克隆抗體(67-2)或對照IgG (2B8)靜脈內注射26周齡的CVN和野生型對照小鼠，持續13周。在41周齡時，處死小鼠并且來 自Mb-處理的小鼠的大腦組織切片用抗-生長激素抑制素抗體、抗-神經膚-Y(NPY)、抗-NPY 受體I(NPYIR)、或抗-NPY受體2(NPY2R)來檢測在早期AD中變性的抑制性神經元的特定亞 組。對于所有動物，生長激素抑制素陽性信號的百分比在下托內定量，并且NPY-、NPY1R-、或 NPY2R-陽性信號在齒狀回內定量并分別標準化至總掃描的下托或齒狀回面積。結果示于圖 15A-D。
[0212] 圖15A-1抓顯示對CVN AD小鼠的抗-SEMA4D抗體治療導致生長激素抑審朦陽性(組 圖A)、NPY(組圖B)、和NPY2R(組圖D)的染色強度水平恢復至野生型小鼠的特征水平。有趣的 是，NPY1R的激動劑經報道減少緊張和焦慮，同時對NPY2R特異的括抗劑減少緊張和焦慮 (Markus Heilig.The NPY system in stress,anxiety and depression(緊張、焦慮和抑 郁中的NPY系統）.化uropeptides 38(2004)213-224)。如上述圖2所示，用抗-SEMA4D處理的 CVN小鼠在曠場測試中顯示出降低的焦慮嚴重性，運些發現與標準化的（較低)NPY2R水平相 關，同時通過抗-SEMA4D MAb治療使得NPY1R水平未發生變化并保持高于野生型小鼠。因此， NPY受體水平的運些變化與在抗-沈MA4D處理的CVN小鼠中觀察到的減少的焦慮行為一致， 運種發現還支持SEMA4D在調節體內神經傳遞中起到作用。值得注意的是，已經在患有阿爾 茨海默病的患者的大腦皮層中報告CVN AD模型中看到的抑制性NP巧申經遞質的下調(Beal 等，Ann.化urol. 20，282-288( 1986))。
[0213] 星形膠質細胞在維持血腦屏障完整性中的作用。如本文他處所述，靠近腦微血管 或軟膜的星形膠質細胞過程的特征是高密度的水通道，水通道蛋白4(Aqp4)。面對突觸區域 的星形膠質細胞過程在谷氨酸轉運蛋白中富集，其中Aqp4的密度相對低。CNS疾病誘導的星 形膠質細胞活化通過叢蛋白增加了SEMA4D信號轉導，運導致星形膠質細胞足過程的回縮， 如水通道蛋白-4的再分布所示。運導致了 BBB的失調和滲透，從而促進內皮細胞炎癥和之后 的白細胞進入CNS。在AD情況中，Aqp4染色強度在有明顯淀粉樣斑塊負擔的區域中明顯降 低。
[0214] 為了測量與周齡匹配的野生型小鼠比較的CVN AD小鼠中水通道蛋白-4表達特征， CVN和野生型對照小鼠在41周齡時處死并且處理用于巧光共免疫組化。結果示于圖16,野生 型小鼠在頂部組圖并且CVN小鼠在下部組圖。就水通道蛋白-4(左側第二組圖）、星形膠質細 胞標志物GFAP(左側第Ξ組圖）和DAPI對切片共染色W使細胞核可視化。在最左側的組圖中 顯示復合圖像。使用與Olympus 1x50顯微鏡禪合的EXi-Aqua-14位照相機在60倍放大下對 載玻片進行成像。
[0215] 如圖16所示，周齡匹配的CVN小鼠中的Aqp4染色掲示向彌散特征的明顯偏移。運與 在野生型小鼠的大腦內Aqp4和GFAP-陽性星形膠質細胞的共免疫組化分子相反，其證明下 托中的Aqp4染色特征限于微血管附近的區域。Aqp4分布的變化，或極性喪失，與高星形膠質 細胞活化相關，如GFAP染色中增加的強度所示。考慮到活化的星形膠質細胞中叢蛋白-B1染 色中的強配準（圖11) W及SEM4D/叢蛋白-B1信號轉導在細胞過程回縮中的作用，運些數據 表明沈MA4D信號轉導可能在疾病期間BBB界面處的星形膠質細胞極性變化中起到作用。 [0216] 為了分析沈MA4D對BBB的影響，采用動態體外血腦屏障(DIV-BBB)模型。簡言之，模 型由含有2-4μπι直徑孔的毛細管的中空聚丙締纖維組成。該纖維與脈沖累連接，其促進介質 的連續流動和實驗化合物通過纖維W及內皮流動受體的正常刺激。人腦內皮細胞接種至管 腔室中并且允許粘附至并包被纖維內壁，同時人星形膠質細胞接種至纖維的外表面浸泡的 近腔室中。內皮細胞和星形膠質細胞穿過膜相互作用W誘導形成具有內皮細胞之間緊密連 接的屏障。可通過測量跨內皮電阻(TEER)來連續監測該屏障的完整性。人腦內皮細胞接種 至管腔室并使其粘附至聚丙締纖維，并且人星形膠質細胞分開接種至纖維的近腔室表面。 在峰值TE邸(體外大約14天)處，W12小時間隔依次加入ο. 5、5、和50μg/ml的重組沈MA4D。在 初始SEMA4D接觸之后36小時時，加入250μg/ml對照IgG(MAb 2955;1DIV-BBB單位）或抗- SEMA4D(VX15/2503;2DIV-BBB單位)并且再測量TE邸持續132小時。結果示于圖17。誤差線代 表標準差。顯示的數據代表3個獨立實驗，其各自證明SEMA4D和抗體對DIV-BBB完整性的類 似效果。
[0217] 如圖17所示，BBB的破壞在加入抗-SEMA4D抗體(VX15/2503)24小時內逆轉。引入對 照重組蛋白質并不導致TE邸的降低(數據未顯示）。此外，引入對照IgG抗體(MAb 2955)并不 影響沈MA4D-誘導的BBB損害。
[0218] 運些數據表明CNS疾病誘導的星形膠質細胞活化通過叢蛋白-B1和/或叢蛋白-B2 上調增加了 SEMA4D信號轉導，運導致星形膠質細胞足過程的回縮，如水通道蛋白-4的再分 布所示。運導致了 BBB的失調和滲透，從而促進內皮細胞炎癥和之后的白細胞進入CNS。
[0219] SEMA4D信號轉導在促進星形膠質細胞活化中的作用。考慮到SEMA4D受體表達和星 形膠質細胞活化標志物GFAP的相關性，存在SEMA4D信號轉導可增強星形膠質細胞活化的可 能，從而在疾病階段期間提供"前饋"機制。為了檢驗SEMA4D對星形膠質細胞活化的效果，生 成大鼠膠質細胞的原代培養物并單獨用SEM4D處理或與硫代乙酷胺(TAA)預處理聯用，TAA 是已經顯示在體內誘導叢蛋白-B1表達的熟知的肝毒性和致肝癌試劑化等， (2006).Mol.Cell.Tox.，2(2)，126-133)。大鼠原代星形膠質細胞用TAA預處理4小時，之后 用可溶SEMA4D處理24小時。然后細胞固定并針對GFAP染色并W20倍放大掃描。誤差線代表 標準差。通過用Bonf erroni多重比較檢驗的單因素 AN0VA，"*" = P <0.05。
[0220] 如圖18A所示，在向用TAA預處理的細胞加入SEM4D之后觀察到星形膠質細胞的活 化標志物GFAP的顯著增強，表明沈MA4D信號轉導增強了星形膠質細胞活化。
[0221] 在第二組體外研究中，原代大鼠星形膠質細胞經培養并用或不用已知由CNS中的 小膠質細胞產生的活化因子前列腺素 D2處理，之后接觸重組沈MA4D蛋白8小時或24小時。細 胞經固定、處理用于鬼筆環膚(F-肌動蛋白）和DNA酶(G-肌動蛋白）組化，并且計算各處理條 件的F-肌動蛋白/G-肌動蛋白面積比。誤差線代表標準差。"**"=p<0.01，通過用 Bonf err on i多重比較檢驗的雙因素 AN0VA。
[0222] 如圖18B所示，接觸重組SEM4D的PGD2-活化的星形膠質細胞經歷其肌動蛋白細胞 骨架中球形向絲狀轉化，表明沈MA4D/叢蛋白-介導的信號轉導W及升高的星形膠質細胞活 化狀態。
[0223] 通過W上描述和相關圖所示內容中呈現的教導的益處，本發明相關領域技術人員 可W想到本發明的許多改良和其它實施方式。因此，應當理解本發明不僅限于所公開的具 體實施方式，所述改良和其它實施方式也包括在所附權利要求書和所列實施方式的范圍之 內。盡管在本發明中使用了具體的術語，但是運些術語僅W通用和描述性意義使用，而不用 于對本發明構成限制。
【主權項】
1. 一種減輕患有神經變性疾病的對象中的癥狀的方法，包括向所述對象給予有效量的 特異性結合腦信號蛋白-4D (SEMA4D)的分離的結合分子。2. -種防止患有、確定患有或疑似患有神經炎性或神經變性疾病的對象中星形膠質細 胞活化的方法，包括向所述對象給予有效量的特異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中 所述結合分子調節星形膠質細胞介導的血腦屏障的完整性維持。3. -種維持或恢復患有、確定患有或疑似患有神經炎性或神經變性疾病的對象中星形 膠質細胞介導的少土膠質細胞前體細胞(OPC)營養支持的方法，包括向所述對象給予有效 量的特異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中所述結合分子防止星形膠質細胞過程的回 縮以及OPC向損傷區域的趨化性移動。4. 一種治療患有神經變性疾病的對象的方法，包括向所述對象給予有效量的特異性結 合腦信號蛋白4D (SEMA4D)的分離的結合分子，其中與SEMA4D的結合作用是減輕與該疾病相 關的癥狀。5. -種減輕患有神經變性疾病的對象中癥狀的方法，包括向所述對象給予有效量的特 異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中所述結合分子競爭性抑制選自VX15/2503或67的 參照單克隆抗體與SEMA4D的特異性結合。6. -種促進患有神經變性疾病的對象中髓鞘形成的方法，包括向所述對象給予有效量 的特異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中所述結合分子調節星形膠質細胞介導的少土 膠質細胞-髓鞘功能活性。7. -種防止患有神經變性疾病的對象中神經細胞死亡的方法，包括向所述對象給予有 效量的特異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中所述結合分子調節星形膠質細胞介導的 突觸活性。8. -種防止患有神經炎性或神經變性疾病的對象中血腦屏障損傷的方法，包括向所述 對象給予有效量的特異性結合SEMA4D的分離的結合分子，其中所述結合分子調節星形膠質 細胞介導的血腦屏障的完整性維持。9. 一種保護抑制性神經元在早期阿爾茨海默病中免于變性的方法，包括向患有、確定 患有或疑似患有早期阿爾茨海默病的對象給予有效量的特異性結合SEMA4D的分離的結合 分子，其中所述結合分子恢復所述對象中NYP-陽性神經元、生長激素抑制素陽性神經元的 數量，或同時恢復兩者。10. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述結合分子抑制SEMA4D與其 受體或其受體的部分的相互作用。11. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述受體選自叢蛋白-B 1和叢 蛋白-B2。12. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述結合分子抑制SEMA4D-介導 的叢蛋白-B1信號轉導。13. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子與選自 VX15/2503或67的參照單克隆抗體特異性結合相同的SEMA4D表位。14. 如權利要求1-4或6-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子競爭 性抑制選自VX15/2503或67的參照單克隆抗體與SEMA4D的特異性結合。15. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，所述分離的結合分子包括抗體或其抗原結合 片段。16. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段是 單克隆抗體VX15/2503或67。17. 如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段的可變重鏈 (VH)含有VHCDR 1-3且可變輕鏈(VL)含有VLCDR 1-3,其中VHCDR 1-3分別包含SEQ ID NO: 6、7和8，VLCDR1-3分別包含SEQIDN0:14、15和16。18. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述VH和VL分別包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:18。19. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述神經變性疾病選自下組:阿 爾茨海默病、帕金森病、亨延頓氏病、唐氏綜合癥、共濟失調、肌萎縮側索硬化(ALS )、額顳性 癡呆(FTD)、HIV-相關認知障礙、CNS狼瘡、輕度認知障礙、或其組合。20. 如權利要求1、4或5中任一項所述的方法，其特征在于，所述癥狀選自下組:神經精 神癥狀、認知癥狀、運動功能障礙及其任意組合。21. 如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述神經精神癥狀選自下組:減少焦慮狀 行為、改善空間記憶、增加移動及其任意組合。
【文檔編號】A61K39/395GK106029093SQ201480070232
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年10月21日
【發明人】E·S·史密斯, M·左德勒, W·J·鮑爾斯, A·喬納森
【申請人】瓦西尼斯公司