一種復合醫用生物蛋白膠的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種復合醫用生物蛋白膠的制備方法，屬于生物膠制備技術領域。本發明取豬胎衣處理，干燥后與甘草混合碾磨，加入胰蛋白酶等酶解后，濃縮得濃縮液，與胰蛋白胨等混合殺菌消毒得培養基，接種枯草芽孢桿菌培養，再發酵后過濾得濾液，與山梨糖醇混合，經紫外線照射，加入氯化鈣等微波反應，與無水乙醇混合過濾得濾渣，冷凍干燥制得復合醫用生物蛋白膠。本發明的有益效果是：本發明制備步驟簡單，所得產品降解性好，在組織內2～3個月完全吸收降解；所制得的凝膠液粘度高，與組織粘附性好，具有與組織相近似的韌性，組織變動時不易脫落，可有效防止細菌感染。
【專利說明】
一種復合醫用生物蛋白膠的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種復合醫用生物蛋白膠的制備方法，屬于生物膠制備技術領域。
【背景技術】
[0002]醫用粘合劑在外科上的應用日益廣泛，目前在臨床上應用的粘合劑都存在著一定的局限性。醫用化學粘合劑具有良好的粘合性能，但由于在體內不可降解，生物相容性差，部分患者存在著不適應，應用收到限制;醫用生物粘合劑具有良好的生物相容性，在體內可降解，與患者的適應性也比較好，是今后醫用粘合劑開發的方向。目前在臨床上應用的生物粘合劑-纖維蛋白膠已經取得了較好的效果。
[0003]纖維蛋白膠在外科中的應用日益廣泛，包括組織粘附、止血、以及封堵氣漏和體液泄漏等，但其在臨床應用中存在著不足，它的組成成分纖維蛋白原和凝血酶都是從人類血液中提取的，用做外科粘附劑，存在著傳染疾病的危險，并且粘附特性較差，應用也收到了限制。因此研究一種可用于人類的粘附能力強的生物膠是很有必要的。C-聚谷氨酸是一種由微生物大量生物合成的、具有優良生物相容性、生物降解性及無毒無污染性的氨基酸聚合物，已廣泛用做藥用載體材料。聚谷氨酸-明膠生物膠的粘連強度優于纖維蛋白膠。但是使用的交聯劑的濃度較高，膠凝時間還比纖維蛋白膠膠凝時間稍長，對組織的粘附特性也不是十分優越。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題:針對醫用生物蛋白膠降解性差，粘度低，凝膠時間長，導致其粘附性差，組織變動時易脫落的弊端，提供了一種取豬胎衣處理，干燥后與甘草混合碾磨，加入胰蛋白酶等酶解后，濃縮得濃縮液，與胰蛋白胨等混合殺菌消毒得培養基，接種枯草芽孢桿菌培養，再發酵后過濾得濾液，與山梨糖醇混合，經紫外線照射，加入氯化鈣等微波反應，與無水乙醇混合過濾得濾渣，冷凍干燥制得復合醫用生物蛋白膠的方法。本發明制備步驟簡單，所得產品降解性好，制備的凝膠液粘度高，使用后其粘附性好，組織變動時無脫落現象發生。
[0005]為解決上述技術問題，本發明采用如下所述的技術方案是:
(1)使用水將豬胎衣表面血漬洗凈，按固液比1:3，浸泡于pH為6.5磷酸鹽緩沖液中，并置于超聲振蕩器中，在30?35KHz下振蕩30?40min，再進行過濾，使用蒸餾水沖洗過濾后的豬胎衣，直至沖洗液呈中性，隨后置于70°C烘箱中干燥5?6h;
(2)按質量比1:1?2，取甘草及上述干燥后的豬胎衣放入碾磨機中進行碾磨，過200目篩，將過篩顆粒與其質量1.0?1.2 %胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入過篩顆粒質量2?4倍的質量分數為5%碳酸氫銨溶液，設定溫度為35?380C，酶解4?6h;
(3)在上述酶解結束后將酶解罐中的酶解混合物移入真空濃縮罐中，濃縮至原體積的55?65 %，得濃縮液，按重量份數計，取45?55份濃縮液、28?32份胰蛋白胨、34?36份酵母浸膏、10?15份血粉、2?4份異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I?2份磷酸二氫鉀及1.2?1.8份磷酸氫二鉀，攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基；
(4)按接種量10?15%，將枯草芽孢桿菌接種至上述培養基中，并置于恒溫箱中，設定溫度為36?38°C，培養14?16h，待培養結束后將上述制備的培養基倒入玻璃發酵罐中，設定溫度為37 °C，以120r/min攪拌發酵，待發酵罐中發酵物顏色不變時，對發酵罐內的發酵混合物進行減壓過濾，收集過濾液；
(5)將上述所得的過濾液與其質量16?23%山梨糖醇混合均勻，并放入紫外線下進行照射2?3h，再分別向其中加入過濾液質量0.9?1.2%乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及過濾液質量30?40 %氯化鈣，攪拌均勻，并放入微波反應器中，在功率200?300W下反應4?6h，隨后再加入無水乙醇直至無沉淀產生，過濾收集濾渣，并使用無菌水沖洗直至沖洗液呈中性，將濾渣冷凍干燥，即可得復合醫用生物蛋白膠。
[0006]本發明的應用方法:將本發明制得的復合醫用生物蛋白膠與無菌水按固液比1:2?3，混合形成凝膠液，用于小腸手術切口粘合，16?21天后，檢測吻合口愈合良好，無滲漏，吻合部位水腫均已消退，腸壁光滑。該復合醫用生物蛋白膠可在組織表面8?1s聚合固化成膜，粘接強度高，具有與組織相近似的韌性，組織變動時不易脫落，無細胞毒性，可有效防止細菌感染，在2?3個月完全吸收降解。
[0007]本發明與其他方法相比，有益技術效果是:
(1)本發明制備步驟簡單，所得產品降解性好，在組織內2?3個月完全吸收降解；
(2)所制得的凝膠液粘度高，與組織粘附性好，具有與組織相近似的韌性，組織變動時不易脫落，可有效防止細菌感染。
【具體實施方式】
[0008]首先使用水將豬胎衣表面血漬洗凈，按固液比1:3，浸泡于pH為6.5磷酸鹽緩沖液中，并置于超聲振蕩器中，在30?35KHz下振蕩30?40min，再進行過濾，使用蒸餾水沖洗過濾后的豬胎衣，直至沖洗液呈中性，隨后置于70°C烘箱中干燥5?6h;再按質量比1:1?2，取甘草及上述干燥后的豬胎衣放入碾磨機中進行碾磨，過200目篩，將過篩顆粒與其質量1.0?1.2%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入過篩顆粒質量2?4倍的質量分數為5 %碳酸氫銨溶液，設定溫度為35?38°C，酶解4?6h;接著在上述酶解結束后將酶解罐中的酶解混合物移入真空濃縮罐中，濃縮至原體積的55?65 %，得濃縮液，按重量份數計，取45?55份濃縮液、28?32份胰蛋白胨、34?36份酵母浸膏、10?15份血粉、2?4份異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I?2份磷酸二氫鉀及1.2?1.8份磷酸氫二鉀，攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基;再按接種量10?15%，將枯草芽孢桿菌接種至上述培養基中，并置于恒溫箱中，設定溫度為36?380C，培養14?16h，待培養結束后將上述制備的培養基倒入玻璃發酵罐中，設定溫度為37°C，以120r/min攪拌發酵，待發酵罐中發酵物顏色不變時，對發酵罐內的發酵混合物進行減壓過濾，收集過濾液;最后將上述所得的過濾液與其質量16?23 %山梨糖醇混合均勻，并放入紫外線下進行照射2?3h，再分別向其中加入過濾液質量0.9?1.2%乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及過濾液質量30?40 %氯化鈣，攪拌均勻，并放入微波反應器中，在功率200?300W下反應4?6h，隨后再加入無水乙醇直至無沉淀產生，過濾收集濾渣，并使用無菌水沖洗直至沖洗液呈中性，將濾渣冷凍干燥，即可得復合醫用生物蛋白膠。
[0009]實例I 首先使用水將豬胎衣表面血漬洗凈，按固液比1:3，浸泡于pH為6.5磷酸鹽緩沖液中，并置于超聲振蕩器中，在30KHz下振蕩30min，再進行過濾，使用蒸餾水沖洗過濾后的豬胎衣，直至沖洗液呈中性，隨后置于70°C烘箱中干燥5h;再按質量比1:1，取甘草及上述干燥后的豬胎衣放入碾磨機中進行碾磨，過200目篩，將過篩顆粒與其質量1.0%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入過篩顆粒質量2倍的質量分數為5%碳酸氫銨溶液，設定溫度為35°C，酶解4h;接著在上述酶解結束后將酶解罐中的酶解混合物移入真空濃縮罐中，濃縮至原體積的55%,得濃縮液，按重量份數計，取45份濃縮液、28份胰蛋白胨、34份酵母浸膏、10份血粉、2份異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I份磷酸二氫鉀及1.2份磷酸氫二鉀，攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基;再按接種量10 %，將枯草芽孢桿菌接種至上述培養基中，并置于恒溫箱中，設定溫度為36°C，培養14h，待培養結束后將上述制備的培養基倒入玻璃發酵罐中，設定溫度為37 °C，以120r/min攪拌發酵，待發酵罐中發酵物顏色不變時，對發酵罐內的發酵混合物進行減壓過濾，收集過濾液;最后將上述所得的過濾液與其質量16 %山梨糖醇混合均勻，并放入紫外線下進行照射2h，再分別向其中加入過濾液質量0.9 %乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及過濾液質量30 %氯化鈣，攪拌均勻，并放入微波反應器中，在功率200W下反應4h，隨后再加入無水乙醇直至無沉淀產生，過濾收集濾渣，并使用無菌水沖洗直至沖洗液呈中性，將濾渣冷凍干燥，即可得復合醫用生物蛋白膠。
[0010]將本發明制得的復合醫用生物蛋白膠與無菌水按固液比1:2，混合形成凝膠液，用于小腸手術切口粘合，16天后，檢測吻合口愈合良好，無滲漏，吻合部位水腫均已消退，腸壁光滑。該復合醫用生物蛋白膠可在組織表面8s聚合固化成膜，粘接強度高，具有與組織相近似的韌性，組織變動時不易脫落，無細胞毒性，可有效防止細菌感染，在2個月完全吸收降解。
[0011]實例2
首先使用水將豬胎衣表面血漬洗凈，按固液比1:3，浸泡于pH為6.5磷酸鹽緩沖液中，并置于超聲振蕩器中，在32KHz下振蕩35min，再進行過濾，使用蒸餾水沖洗過濾后的豬胎衣，直至沖洗液呈中性，隨后置于70°C烘箱中干燥5h;再按質量比1:1，取甘草及上述干燥后的豬胎衣放入碾磨機中進行碾磨，過200目篩，將過篩顆粒與其質量1.1%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入過篩顆粒質量3倍的質量分數為5 %碳酸氫銨溶液，設定溫度為37 °C，酶解5h;接著在上述酶解結束后將酶解罐中的酶解混合物移入真空濃縮罐中，濃縮至原體積的60 %，得濃縮液，按重量份數計，取50份濃縮液、30份胰蛋白胨、35份酵母浸膏、12份血粉、3份異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I份磷酸二氫鉀及1.5份磷酸氫二鉀，攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基;再按接種量12 %，將枯草芽孢桿菌接種至上述培養基中，并置于恒溫箱中，設定溫度為37°C，培養15h，待培養結束后將上述制備的培養基倒入玻璃發酵罐中，設定溫度為37 °C，以120r/min攪拌發酵，待發酵罐中發酵物顏色不變時，對發酵罐內的發酵混合物進行減壓過濾，收集過濾液;最后將上述所得的過濾液與其質量20 %山梨糖醇混合均勻，并放入紫外線下進行照射3h，再分別向其中加入過濾液質量1.0 %乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及過濾液質量30 %氯化鈣，攪拌均勻，并放入微波反應器中，在功率250W下反應5h，隨后再加入無水乙醇直至無沉淀產生，過濾收集濾渣，并使用無菌水沖洗直至沖洗液呈中性，將濾渣冷凍干燥，即可得復合醫用生物蛋白膠。
[0012]將本發明制得的復合醫用生物蛋白膠與無菌水按固液比1:3，混合形成凝膠液，用于小腸手術切口粘合，19天后，檢測吻合口愈合良好，無滲漏，吻合部位水腫均已消退，腸壁光滑。該復合醫用生物蛋白膠可在組織表面9s聚合固化成膜，粘接強度高，具有與組織相近似的韌性，組織變動時不易脫落，無細胞毒性，可有效防止細菌感染，在3個月完全吸收降解。
[0013]實例3
首先使用水將豬胎衣表面血漬洗凈，按固液比1:3，浸泡于pH為6.5磷酸鹽緩沖液中，并置于超聲振蕩器中，在35KHz下振蕩40min，再進行過濾，使用蒸餾水沖洗過濾后的豬胎衣，直至沖洗液呈中性，隨后置于70°C烘箱中干燥6h;再按質量比1:2，取甘草及上述干燥后的豬胎衣放入碾磨機中進行碾磨，過200目篩，將過篩顆粒與其質量1.2%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入過篩顆粒質量4倍的質量分數為5%碳酸氫銨溶液，設定溫度為38°C，酶解6h;接著在上述酶解結束后將酶解罐中的酶解混合物移入真空濃縮罐中，濃縮至原體積的65%,得濃縮液，按重量份數計，取55份濃縮液、32份胰蛋白胨、36份酵母浸膏、15份血粉、4份異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、2份磷酸二氫鉀及1.8份磷酸氫二鉀，攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基;再按接種量15 %，將枯草芽孢桿菌接種至上述培養基中，并置于恒溫箱中，設定溫度為38°C，培養16h，待培養結束后將上述制備的培養基倒入玻璃發酵罐中，設定溫度為37 °C，以120r/min攪拌發酵，待發酵罐中發酵物顏色不變時，對發酵罐內的發酵混合物進行減壓過濾，收集過濾液;最后將上述所得的過濾液與其質量23 %山梨糖醇混合均勻，并放入紫外線下進行照射3h，再分別向其中加入過濾液質量1.2 %乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及過濾液質量40 %氯化鈣，攪拌均勻，并放入微波反應器中，在功率300W下反應6h，隨后再加入無水乙醇直至無沉淀產生，過濾收集濾渣，并使用無菌水沖洗直至沖洗液呈中性，將濾渣冷凍干燥，即可得復合醫用生物蛋白膠。
[0014]將本發明制得的復合醫用生物蛋白膠與無菌水按固液比1:2.5，混合形成凝膠液，用于小腸手術切口粘合，21天后，檢測吻合口愈合良好，無滲漏，吻合部位水腫均已消退，腸壁光滑。該復合醫用生物蛋白膠可在組織表面1s聚合固化成膜，粘接強度高，具有與組織相近似的韌性，組織變動時不易脫落，無細胞毒性，可有效防止細菌感染，在3個月完全吸收降解。
【主權項】
1.一種復合醫用生物蛋白膠的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)使用水將豬胎衣表面血漬洗凈，按固液比1:3，浸泡于pH為6.5磷酸鹽緩沖液中，并置于超聲振蕩器中，在30?35KHz下振蕩30?40min，再進行過濾，使用蒸餾水沖洗過濾后的豬胎衣，直至沖洗液呈中性，隨后置于70°C烘箱中干燥5?6h; (2)按質量比1:1?2，取甘草及上述干燥后的豬胎衣放入碾磨機中進行碾磨，過200目篩，將過篩顆粒與其質量1.0?1.2 %胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入過篩顆粒質量2?4倍的質量分數為5%碳酸氫銨溶液，設定溫度為35?380C，酶解4?6h; (3)在上述酶解結束后將酶解罐中的酶解混合物移入真空濃縮罐中，濃縮至原體積的55?65 %，得濃縮液，按重量份數計，取45?55份濃縮液、28?32份胰蛋白胨、34?36份酵母浸膏、10?15份血粉、2?4份異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I?2份磷酸二氫鉀及1.2?1.8份磷酸氫二鉀，攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養基； (4)按接種量10?15%，將枯草芽孢桿菌接種至上述培養基中，并置于恒溫箱中，設定溫度為36?38°C，培養14?16h，待培養結束后將上述制備的培養基倒入玻璃發酵罐中，設定溫度為37 °C，以120r/min攪拌發酵，待發酵罐中發酵物顏色不變時，對發酵罐內的發酵混合物進行減壓過濾，收集過濾液； (5)將上述所得的過濾液與其質量16?23%山梨糖醇混合均勻，并放入紫外線下進行照射2?3h，再分別向其中加入過濾液質量0.9?1.2%乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及過濾液質量30?40 %氯化鈣，攪拌均勻，并放入微波反應器中，在功率200?300W下反應4?6h，隨后再加入無水乙醇直至無沉淀產生，過濾收集濾渣，并使用無菌水沖洗直至沖洗液呈中性，將濾渣冷凍干燥，即可得復合醫用生物蛋白膠。
【文檔編號】A61L24/00GK105999381SQ201610508842
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月2日
【發明人】陳毅忠, 盛海豐, 宋奇
【申請人】陳毅忠