一種同時能rna干擾和mr成像的納米囊泡及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明屬于納米醫學與生物醫學工程領域，具體公開了一種同時能RNA干擾和MR成像的納米囊泡及其制備方法和應用。所述納米囊泡基于一種兩親性嵌段聚合物載體線性聚乙烯亞胺?聚乳酸。利用囊泡的疏水空腔對親水性磁納米粒子SPIO進行負載，表面PEI復合siRNA，體外高效標記神經干細胞、沉默抑制神經元分化基因，體內移植后，在實現干細胞實時定位的同時，促進其向神經元方向分化，提高腦梗死治療效果，應用前景廣闊。
【專利說明】
-種同時能RNA干擾和MR成像的納米囊泡及其制備方法和 應用
技術領域
[0001] 本發明設及納米醫學與生物醫學工程領域，更具體地，設及一種同時能RNA干擾和 MR成像的納米囊泡及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 腦梗死，即急性缺血性腦卒中（Acute Ischemic Stroke,AIS)，是由于腦動脈的閉 塞導致的腦組織的梗死，伴隨著神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞的損傷，導致神經元 回路破壞、肢體功能障礙，甚至殘疾或死亡，是現代社會中導致致死和致殘的最重要的中樞 神經系統血管事件。目前，臨床上最常用的治療方式是通過經美國FDA批準的臨床用藥重組 組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)進行血栓溶解再通腦梗塞區域的血管，如今世界各地雖仍 在用d-PA治療AIS，但其存在十分窄的時間窗限制（美國為發病3小時內，歐洲至多為發病 4.5小時)和并發癥可能（如出血），臨床上溶栓治療獲益病人非常少，運就要求一種不受時 間窗、更安全有效的治療方式。近年來，神經干細胞(NSCs)療法，作為一種治療中樞神經系 統疾病的潛在方式，具有非常大的應用前景。NSCs是一種具有活躍的自我更新能力及多向 分化能力的祖細胞，NSCs在體外培養后進行體內移植，可分化成神經元、膠質細胞，替代修 復神經元回路，促進腦梗死后神經功能的恢復。值得一提的是，移植的NSCs具有很強的受損 組織歸巢能力，即使在受損區的較遠處，也可表現出直接或間接的修復性能。然而其臨床應 用卻仍面臨著重大挑戰，主要歸因于體內長期治療下，難W實現對干細胞腦組織內遷移及 存活分布進行有效的定位。
[0003] 分子成像技術能對干細胞進行活體示蹤，用于連續、縱向監測干細胞在宿主組織 內的分布及遷移。理想的分子成像技術應具備W下優點：高空間分辨率、高靈敏度和特異 性、可量化并安全可靠，此外，具有非侵襲性，可實現臨床轉化。目前活體成像技術主要包括 放射性核素成像，巧光和生物發光，MR成像(MRI)。相對于核素成像的短半衰期與巧光成像 穿透深度有限及它們共同存在的問題一低空間分辨率，MRI因其具有極佳的分辨率(可對深 部組織進行精確定位和定量分析）、無創傷、可重復性強等優點，廣泛用于腫瘤、屯、血管和神 經損傷等疾病的檢測。然而，干細胞本身在MRI上并不具有特異性信號，給臨床檢測帶來了 相當程度的困難。為了提高MRI分辨對比度，臨床上常采用MRI造影劑來進行干細胞磁性標 記，使得干細胞出現特異性信號改變而被識別，而在眾多的磁共振成像造影劑中，SPI0W其 無毒、高生物相容性、高成像敏感性及表面易修飾等優點受到了廣大研究者的重視。
[0004] NSCs具有分化為神經神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的多向分化能力，但在 腦梗死中只有分化成神經元才能替代損傷、丟失的神經元，重建神經元回路，修復組織損 傷。而多數研究報道表明，移植到體內的NSCs大多數會分化成膠質細胞，而非神經元，運大 大限制了其修復能力。因此，定向誘導更多的NSCs向神經元分化有望提高干細胞治療效果。 大量研究表明，Nogo-66受體(N排)存在于神經元細胞及其軸突上，腦梗死組織釋放的髓銷 相關抑制因子與過表達的N排相互作用，可抑制NSCs向神經元分化、神經再生。因此，抑制 N排的表達可促進NSCs向神經元的分化。RNA干擾為特異性祀向基因沉默技術，可利用NgR- siRNA( siNgR)下調N曲的表達，促進NSCs分化為神經元細胞，提高干細胞移植腦梗死后分化 的神經元有效數量，促進干細胞重建神經元回路，讓干細胞治療應用前景更加矚目。
【發明內容】
[0005] 本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一種能自組裝共同負載SPI0和siRNA 的兩親性嵌段聚合物。
[0006] 本發明的另一個目的是提供上述兩親性嵌段聚合物的制備方法。
[0007] 本發明的另一個目的是提供上述兩親性嵌段聚合物在制備能同時RNA干擾和MR成 像的納米囊泡中的應用。
[0008] 本發明的另一個目的是提供一種能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡。所述納米 囊泡能促進神經干細胞向神經元的分化，達到提高治療腦梗死療效的目的；同時引入高靈 敏磁造影劑，就干細胞治療中對其遷移及分布進行有效的、實時的定位監測。
[0009] 本發明的另一個目的是提供上述納米囊泡在制備促進神經性干細胞定向分化治 療腦梗死藥物中的應用。
[0010] 為了實現上述目的，本發明是通過W下技術方案予W實現的：
[0011] 一種能共同負載SPI0和SiRNA的兩親性嵌段聚合物，所述聚合物由聚乙締亞胺親 水段和聚乳酸疏水段兩嵌段共聚物構成;所述聚乙締亞胺親水段分子量為900Da，聚乳酸疏 水段分子量為8000~1 OOOODa。
[0012] 本發明為了實現NSCs體外培養時SiRNA藥物能被細胞高效攝取，選取經典的基因 載體聚乙締亞胺(PEI)作為親水段，負載SiRNA;另一方面，為降低載體毒性，選取生物相容 的可降解材料聚乳酸作疏水段，同時也有利于SPI0在細胞內的再聚集，可滿足高靈敏度MRI 造影劑的要求。
[0013] 優選地，所述聚乙締亞胺親水段分子量為900Da，聚乳酸疏水段分子量為9000化。 更優選地，所述聚乙締亞胺親水段與聚乳酸疏水段的質量比為1:10。
[0014] 如上所述能共同負載SPI0和SiRNA的兩親性嵌段聚合物的制備方法，由W下方法 制備得到：
[0015] S1.2-乙基-挫嘟的開環聚合合成聚（2-乙基-挫嘟）（陽0X);再用鹽酸脫去保護基 可得到線性聚乙締亞胺(PEI);
[0016] S2. W十二醇作引發劑，辛酸亞錫作催化劑，引發丙交醋開環聚合得到聚丙交醋/ 聚乳酸(PDLLA);再用幾基二咪挫(CDI)將其末端徑基活化得PDLLA-CDI;
[0017] S3.活化后的聚乳酸(PDLLA-CDI)直接與陽I對接得到目標嵌段聚合物陽I-PDLLA。
[0018] 如上所述兩親性嵌段聚合物在制備能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡中的應 用。一種能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡，所述納米囊泡由如上所述的兩親性嵌段聚合 物自組裝后，將親水磁性納米粒子SPI0負載于其親水空腔內，并利用其表面PEI實現對 S iRNA的負載，得到能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡。
[0019] 本發明所述的兩親性嵌段聚合物自組裝后能形成一種納米尺寸的正電荷囊泡，將 親水性的磁性納米顆粒(SPI0)負載在囊泡的水腔內，而負電SiRNA則通過聚電子作用被負 載在囊泡表面，得到同時負載MRI造影劑SPI0和SiRNA的納米囊泡，將運種納米囊泡與神經 干細胞在體外共同培養，可控標記NSC,下調NSCs的Nogo受體表達，促進其向神經元分化的 同時呈現干細胞體內移植的有效實時監測。
[0020] 優選地，所述的siRNA能下調神經干細胞療法的Nogo受體表達，促進神經干細胞向 神經元分化，提高干細胞移植腦梗死后分化的神經元有效數量，促進干細胞重建神經元回 路，讓干細胞治療應用前景更加矚目。本發明所述的SiRNA是指本技術領域已知的能下調神 經干細胞療法的Nogo受體表達的所有種類的S i RNA。
[0021] 優選地，所述能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡的具體制備方法為:將兩親性嵌 段聚合物PEI-PDLLA溶解在2mL的氯仿中，超聲乳化作用下加入溶有2mg SPI0的水溶液，得 到第一次乳化液;第一次乳化液在超聲作用下滴加到20mL水中，乳化均勻后旋蒸除去氯仿， 并通過磁鐵吸附作用分離出負載SPI0的納米囊泡(V-SPI0);得到V-SPI0后，將其與SiRNA按 特定的N作比復合30min，即得最終的多功能復合物(V-SPIO/siRNA)。
[0022] 如上所述的納米囊泡在制備促進神經性干細胞定向分化治療腦梗死藥物中的應 用。
[0023] 與現有技術相比，本發明具有W下有益效果：
[0024] 本發明提供了一種多功能納米復合物的制備及應用方法，針對現有神經干細胞療 法中治療修復效果差的缺陷，利用RNA干擾技術，促進神經干細胞(NSCs)向神經元的分化， 達到提高療效的目的；同時引入高靈敏磁造影劑，就干細胞治療中對其遷移及分布進行有 效的、實時的定位監測。有望在干細胞療法的應用方面提供一個新的思路。
【附圖說明】
[0025] 圖1為復合物的制備示意圖。
[0026] 圖2為凝膠阻滯電泳驗證囊泡對SiRNA的復合能力圖。
[0027] 圖3為負載SiRNA前(A，C)后(B，D)納米粒子的粒徑和TEM圖。
[00%]圖4為水溶SPI0及囊泡負載SiRNA前后的T2曲線。
[0029] 圖5為復合物的細胞毒性測試:（A)流式細胞計數法；（B)CCK騎去。
[0030] 圖6為mRNA水平(A)和蛋白水平(B，C)評價S iRNA復合物的干擾效果。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。運些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 本領域常規條件或按照制造廠商建議的條件。本領域的技術人員在本發明的基礎上所做的 任何非實質性的變化及替換均屬于本發明所要求保護的范圍。實施例中所述SiRNA的序列 為：正義鏈5'AGC ACG CUU UCC GUG GCU UTT3'，反義鏈5'AAG CCA CGG AAA GCG UGC CTT3/。實施例中SiRNA的種類并不能限定本發明的保護范圍，本技術領域已知的能下調神 經干細胞療法的Nogo受體表達的所有種類的siRNA都在本發明的保護范圍之內。
[0032] 實施例1兩親性嵌段聚合物的合成
[0033] (1)線性聚乙締亞胺(PEI)的合成，反應機理及過程如下：
[0034]
[0035] 先利用2-乙基-挫嘟的開環聚合合成聚(2-乙基-挫嘟）（陽OX)。稱取0.372g對甲苯 橫酸甲醋（2mmol)加入50mLS 口瓶中，常溫真空干燥化，加入20mL新蒸的乙臘溶解，再稱取 4.5g 2-乙基-挫嘟(45mmol)加入反應瓶中，80°C回流72h;冷卻后將反應瓶浸入冰水浴中， 通入干燥的氨氣(經過氧化巧和氨氧化鋼干燥塔）化終止聚合反應，旋蒸除去乙臘，用Ξ氯 甲燒溶解，再沉淀在大量乙酸中，離屯、、干燥得淡黃色聚(2-乙基-挫嘟）（陽0X)。
[0036] PE0X經鹽酸脫去保護基可得到線性聚乙締亞胺。簡單地，在25mL反應瓶中加入 4.2g陽0X(2mmol)，加入15mL 10%的鹽酸，100°C回流反應12h，冷卻后反應體系變為乳白 色，用氨氧化鋼溶液調節pH值至12，當抑值為5-卵寸溶液澄清，當9形卵寸又恢復成乳白色渾 濁。離屯、取下層沉淀，用去離子水洗涂Ξ次后凍干，得淡黃色粉末端氨基線性聚乙締亞胺
[0037] (2)聚乳酸的合成及其端徑基的活化，反應機理及過程如下：
[00；3 引
[0039] 聚乳酸（PDLLA)由十二醇引發丙交醋開環聚合而成。將135化正十二燒醇 (0. eOmmol)加入干燥的100血反應瓶中，65 °C下真空除水化，冷至室溫后，加入5.76g新重結 晶的D，k丙交醋(40mmol)和少量辛酸亞錫(丙交醋質量的0.5 % )，室溫真空干燥4h，加入新 蒸的無水甲苯20mL溶解后，120°C下進行回流12h，可觀察到溶液由清液變成白色濁液。冷卻 后用大量無水乙醇沉淀，冷凍、離屯、、干燥后，用二氯甲燒溶解，再次用無水乙醇沉淀，抽濾， 干燥后得白色產物PDLLA-OH。
[0040] TOLLA末端徑基可經幾基二咪挫(CDI)活化后與陽I的伯胺基反應。于lOOmL反應瓶 中加入3 . Og PDLLA-OH(0.32mmol)，65°C下真空干燥化除水后，加入20mL新蒸四氨巧喃溶 解，氣氣保護下，將聚合物溶液慢慢滴加到CDI的四氨巧喃溶液(0.52g，lOeq.)中，室溫反應 24h后沉淀在大量無水乙醇中，冷凍、分離、真空干燥后用二氯甲燒溶解，再次用無水乙醇沉 淀，冷凍、分離、干燥得PDLLA-CDI。
[0041] (3)兩親性嵌段聚合物PEI-P化LA的合成，反應機理及過程如下：
[0042]
[0043] 在50mL反應瓶中加入0.45g PEI (5mmol，2.5eq.)，用lOmL新蒸Ξ氯甲燒溶解。1.9g TOLLA-CDI (0.2mmol，leq.)溶于20mL新蒸Ξ氯甲燒后，在氣氣保護下，逐滴加入到PEI溶液 中，在室溫下攬拌反應24h。反應液用透析袋(MW=3.化化)在Ξ氯甲燒中透析除去過量的 1PEI，然后沉淀在無水乙醇中，冷凍、分離、干燥后得到淡黃色產物PEI-P化LA。
[0044] 實施例2納米復合物的制備及表征
[0045] 取實施例1制備得到的兩親性嵌段聚合物按納米復合物制備方法準備V-SPIO,如 圖1所示。然后通過凝膠阻滯電泳實驗驗證其負載siRNA的能力，具體地，先配置Ig/L的瓊脂 糖溶液，倒入平板后加1.扣L漠化乙錠巧B)，并攬勻。按N作比為0.5、1、2、4、6、8、10準備好復 合物樣品，待凝膠完全凝固，拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳液沒過凝膠，每個樣 品中加入化L50 %甘油，混合均勻后將加到上樣孔中，恒壓100V電泳40min后停止電泳儀，取 出凝膠，置于凝膠成像系統中，紫外燈下觀察電泳條帶并拍照。結果如圖2所示，當N作比（聚 合物的氮和SiRNA中憐的摩爾比）較低時，聚合物不足W將SiRNA完全封裝復合，游離的 SiRNA向陽極移動，形成亮的條帶，隨著N/P比的增大，條帶逐漸減弱，至N/巧k足夠大能將 SiRNA完全復合，條帶消失。圖中結果顯示，當N作比大于4時，SiRNA能被完全復合。
[0046] 選取N/P比為別寸的復合物作為細胞實驗時復合點，測定其水力學直徑及形貌結 構，結果如圖3所示。復合SiRNA前后，粒徑沒有明顯的變化，均在150nm左右。電鏡結果表明， 納米粒子呈均勻的球形結構，復合SiRNA后，SPI0聚集結構外圈出現明顯的復合物層，證明 其對SiRNA的有效負載。
[0047] 實施例3納米粒子弛豫率的MRI檢測
[004引將水溶性SPI0、V-SPI0及V-SPIO/siN排納米粒子于96孔板內按濃度梯度逐級稀 釋，進行MRI(化ilips Inter，1.5T)體外測試。MRI掃描參數如下：快速自旋回波T1加權圖 像：TR/TE，500/20ms，層厚，1.5mm，F0V，90 X 60mm，矩陣，256 X 256 ; T2加權圖像：TR/TE， 2600/100ms，層厚，1.5mm，F0V，100 X 100mm，矩陣，384 X 256。獲取T2的弛豫時間。W鐵濃度 (ml)為橫坐標，T的倒數0-2)為縱坐標，采用線性最小二乘回歸分析，直線斜率即為T2的弛 豫度。圖4結果顯示，囊泡負載后，因 SPI0的團簇效應，T2弛豫率大大增強，而負載SiRNA前 后，其弛豫率并無明顯變化。
[0049] 實施例4嵌段聚合物及復合物的細胞毒性檢測
[0050] 我們采用CCK8法檢測了聚合物納米囊泡與NSCs解育后細胞的存活率，用流式細胞 計數儀定量檢測了解育后NSCs的調亡情況，綜合評價納米粒子對細胞的毒性，結果如圖5所 示，納米復合物顯示了極小的細胞毒性。運對于其應用于標記后NSCs的長期體內治療有明 顯的幫助。
[0051] 實施例5體外干擾效果研究
[0052] 我們通過實時PCR和Western blot實驗分別在mRNA水平和蛋白水平評估納米囊泡 負載NgR SiRNA在NSCs內沉默N曲基因的效果，如圖6所示。在實時PCR實驗中，經納米復合物 治療后，N排的mRNA表達水平與對照組相比有明顯的降低。Western blot實驗也得到了類似 的結果，即相對于空白組和使用scrambled RNA解育的細胞，攜帶NgR-siRNA復合物解育細 胞的N曲蛋白有明顯下調表達，定量結果有統計學意義。
【主權項】
1. 一種可自組裝成納米囊泡且共同負載SPIO和siRNA的兩親性嵌段聚合物，其特征在 于，所述聚合物由聚乙烯亞胺親水段和聚乳酸疏水段兩嵌段共聚物構成。2. 根據權利要求1所述的兩親性嵌段聚合物，其特征在于，所述聚乙烯亞胺親水段分子 量為900 Da，聚乳酸疏水段分子量為8000~10000 Da。3. 權利要求1或2所述的兩親性嵌段聚合物的制備方法，其特征在于，由以下方法制備 得到： 51. 2-乙基-唑啉的開環聚合合成聚（2-乙基-唑啉）；再用鹽酸脫去保護基得到線性聚 乙烯亞胺；52. 以十二醇作引發劑，辛酸亞錫作催化劑，引發丙交酯開環聚合得到聚丙交酯/聚乳 酸;再用羰基二咪唑將其末端羥基活化得TOLLA-⑶I; 53. PDLLA-⑶I直接與線性聚乙烯亞胺對接得到目標兩親性嵌段聚合物PEI-PDLLA。4. 權利要求1或2所述兩親性嵌段聚合物在制備能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡中 的應用。5. -種能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡，其特征在于，由權利要求1或2所述的兩親 性嵌段聚合物自組裝后，將親水磁性納米粒子SPI0負載于其親水空腔內，并利用其表面PEI 實現對s iRNA的負載，得到能同時RNA干擾和MR成像的納米囊泡。6. 權利要求5所述的納米囊泡在制備促進神經性干細胞定向分化治療腦梗死藥物中的 應用。
【文檔編號】C08G63/08GK105999310SQ201610446882
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】沈君, 盧烈靜, 帥心濤, 王勇
【申請人】中山大學