抑制產氣莢膜梭菌感染的融合蛋白疫苗的制作方法

抑制產氣莢膜梭菌感染的融合蛋白疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明公開了抑制產氣莢膜梭菌感染的融合蛋白疫苗。該疫苗含有a)或b)或c)的蛋白質：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質；b)由SEQ ID No.2第51?937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；c)在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白。該疫苗免疫動物后可使動物產生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產氣莢膜梭菌的攻擊。該疫苗在抵抗A型、B型、C型和D型產氣莢膜梭菌攻擊時的7天內的免疫保護率為100％、100％、90％和100％。最高抗體效價達1：128000。
【專利說明】
抑制產氣芙膜梭菌感染的融合蛋白疫苗
技術領域
[0001] 本發明設及生物技術領域中抑制產氣芙膜梭菌感染的融合蛋白疫苗。
【背景技術】
[0002] 產氣芙膜梭菌(Clostridium化計ringens)也稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共 患病，該病原是創傷性氣性壞痘和人類食物中毒W及羊快疫、黑羊頻疾、牛羊壞死性腸炎、 牛羊腸毒血癥的主要病原之一，對畜牧業造成了巨大的經濟損失。產氣芙膜梭菌主要的致 病因素是其分泌的外毒素，種類多達13種，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根據產生外毒素 的種類不同，可將產氣芙膜梭菌分為4、8、(：、0、6運五個血清型。目前產氣芙膜梭菌病的免疫 主要通過傳統的經過滅活的單價苗、多聯苗或者類毒素疫苗而實現，運些傳統疫苗雖然能 夠誘導動物產生一定的保護性抗體，但是它們存在安全性不高、穩定性差、免疫后副反應大 等缺點，運些缺點大大限制了其應用，研發一種針對多種血清型的基因工程亞單位多價疫 苗因而成為了世界各國研究者的重點研究目標。由于基因工程亞單位多價疫苗含有產生保 護性免疫應答所必需的有效免疫成分，去除了與免疫無關的成分，因而相對于傳統疫苗而 言安全性、穩定性更好，同時也消除了傳統疫苗成分中的熱原與應激原、變應原等反應原， 很好的解決了傳統疫苗免疫后動物出現的副反應與炎性刺激反應等問題。
[0003] 宮旭穎等（宮旭穎等.產氣芙膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大腸桿菌中的表達及 免疫原性研究.中國預防獸醫學報.第37卷第2期2015年2月）利用PCR技術構建了含有α、β和 ε融合基因的重組質粒，并且進行了 α-的-ε融合蛋白的誘導表達，為進一步研制多價基因工 程亞單位苗提供了基因材料，為解決困擾我國畜牧業的動物壞死性腸炎和腸毒血癥提供了 一條新的途徑。但是該重組質粒表達出的α-β2-ε融合蛋白為包涵體結構，且α-β2-ε融合蛋 白的表達量占菌體總蛋白含量的18.4%。
[0004] 現有技術中對產氣芙膜梭菌主要外毒素蛋白的表達與純化方法相對復雜，表達產 物通常W不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達的報道在國內外非常少。因為包涵體 中的表達產物不具有生物學活性，因而需要進行變性與復性處理。蛋白的變性與復性是一 個極其復雜的過程，不同蛋白的復性條件各異，復性率往往很難提高。運是限制其應用的主 要制約因素。采用可溶性表達方式可很好的克服運一問題。如何構建可溶性表達載體并且 優化可溶性蛋白的高效表達方法，是本領域長期W來一直研究的熱點課題。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的一個技術問題是如何獲得抑制產氣芙膜梭菌感染的可溶性蛋 白質疫苗。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明提供了制備抑制產氣芙膜梭菌感染的可溶性蛋白質 疫苗的方法。
[0007] 本發明所提供的制備抗產氣芙膜梭菌疫苗的方法，包括使蛋白質的編碼基因在生 物中進行表達得到所述蛋白質，利用表達得到的所述蛋白質制備抗產氣芙膜梭菌疫苗(將 所述蛋白質作為抗產氣芙膜梭菌疫苗的活性成分）；所述蛋白質為a)或b)或c)或d):
[000引a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0009] b)由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0010] C)在a)或b)所示的蛋白質的簇基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白；
[0011] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質；
[0012] 所述生物為微生物、植物或非人動物。
[0013] 上述方法中，a)的蛋白質名稱為a-02-e-Ms，b)的蛋白質名稱為a-02-e"SEQ ID No. 2由937個氨基酸殘基組成。
[0014] 上述方法中，蛋白標簽是指利用DNA體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一 種多膚或者蛋白，W便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化等。
[0015] 上述方法中，使所述蛋白質的編碼基因在生物中進行表達包括將所述的蛋白質的 編碼基因導入受體微生物，得到表達所述蛋白質的重組微生物，培養所述重組微生物，表達 得到所述蛋白質。
[0016] 上述方法中，所述受體微生物可為Cl)-C4)中的任一種：
[0017] C1)原核微生物；
[001引 C2)革蘭氏陰性細菌；
[0019] C3)埃希氏菌屬細菌；
[0020] C4)大腸桿菌化 21(DE3)。
[0021] 上述方法中，所述蛋白質的編碼基因為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0022] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子(編碼a-02-e-his);
[0023] 2)編碼序列是沈Q ID No. 1的第151-2814位所示的DM分子(編碼α-β2-ε);
[0024] 3)與1)或2)限定的DM分子具有90% W上的同一性且編碼所述蛋白質的DM分子。
[00巧]其中，SEQ ID No.l由2820個核巧酸組成，其名稱為cH32-e-MsY基因，編碼氨基酸 序列是沈〇1〇齡.2的蛋白質〇-02-6-山3。沈9 1〇齡.1的第151-2814位所示的〇魁分子是 α-β2-ε-Υ基因，編碼由SEQ ID齡.2第51-937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質曰-02-6。 [00%] 上述方法中，所述重組微生物為將祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ導入大腸桿菌化2UDE3)得到 的表達氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白質的重組微生物，所述重組微生物命名為化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-Y，所述祀T30a-a-K-e-Y為將載體祀T30a( + )的Ba恤巧日趾〇1位點之 間的序列替換為SEQ ID No. 1第151-2814位(編碼α-β2-ε)所示的DNA片段得到的重組載體。
[0027] 上述方法中，所述表達為誘導表達，所述誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘導 13-16小時或13-24小時或13小時或16小時。
[0028] 所述蛋白質或與所述蛋白質相關的生物材料在制備抗產氣芙膜梭菌疫苗中的應 用也屬于本發明的保護范圍：
[00巧]所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種：
[0030] B1)編碼所述蛋白質的核酸分子；
[0031] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；
[0032] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；
[0033] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0034] B5)含有Bl)所述核酸分子的重組微生物；
[0(X3日]B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0036] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0037] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0038] B9)含有B1)所述核酸分子的轉基因動物細胞系；
[0039] B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系；
[0040] B11)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0041 ] B12)含有B4)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0042] B13)含有B1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；
[0043] B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；
[0044] B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0045] B16)含有B4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。
[0046] 上述生物材料中，所述核酸分子可為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0047] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子(編碼a-02-e-his);
[004引 2)編碼序列是沈Q ID No.l的第151-2814位所示的DNA分子(編碼α-β2-ε);
[0049] 3)與1)或2)限定的DM分子具有90% W上的同一性且編碼所述蛋白質的DM分子。
[(K)加]上述生物材料中，所述重組載體可為所述祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ;
[0化1] 所述重組微生物可為Ε1)或Ε2):
[0052] Ε1)所述重組微生物為將所述的蛋白質的編碼基因導入受體微生物，得到表達所 述蛋白質的重組微生物，所述受體微生物為C1)-C4)中的任一種：
[0化3] C1)原核微生物；
[0054] C2)革蘭氏陰性細菌；
[0055] C3)埃希氏菌屬細菌；
[0化6] C4)大腸桿菌化21(DE3)。
[0057] E2)所述重組微生物為將所述祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ導入大腸桿菌化2UDE3)得到的表 達氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白質的重組微生物。
[0化引其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 W 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0059] 運里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。同一性可W用肉眼或 計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可W用百分比（％ ) 表示，其可W用來評價相關序列之間的同一性。
[0060] 上述應用中，所述蛋白質具體可為上述方法表達得到的所述蛋白質。
[0061] 本發明還提供了預防動物產氣芙膜梭菌感染的疫苗。
[0062] 本發明所提供的預防動物產氣芙膜梭菌感染的疫苗，其含有所述蛋白質或與所述 蛋白質相關的生物材料；
[0063] 上述預防動物產氣芙膜梭菌感染的疫苗中，所述蛋白質具體可為上述方法表達得 到的所述蛋白質。
[0064] 本發明中，所述產氣芙膜梭菌可為A、B、C、D和E運5種型產氣芙膜梭菌中的任5種、 任4種、任3種、任2種或任1種。
[0065] 本發明中，所述抗產氣芙膜梭菌疫苗具體可為上述預防動物產氣芙膜梭菌感染的 疫苗。
[0066] 在實際應用中，可W將本發明的所述蛋白質或其相關生物材料作為藥物直接給予 病人、或者與適宜的載體或賦形劑混合后給予病人，W達到治療產氣芙膜梭菌感染的目的。 運里的載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙締化咯燒酬、有機酸等）、 難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸醋等）、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素獻酸 醋和簇甲乙纖維素等）。其中優選的是水溶性載體材料。使用運些材料可W制成多種劑型， 包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質體、 透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等。可W是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給 藥系統。為了將單位給藥劑型制成片劑，可W廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的 例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸巧、乳糖、甘露醇、薦糖、氯化鋼、葡萄糖、 尿素、碳酸巧、白陶上、微晶纖維素、娃酸侶等;濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙 醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、簇甲基纖維素鋼、紫 膠、甲基纖維素、憐酸鐘、聚乙締化咯燒酬等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐 藻淀粉、碳酸氨鋼與構祿酸、碳酸巧、聚氧乙締、山梨糖醇脂肪酸醋、十二烷基橫酸鋼、甲基 纖維素、乙基纖維素等;崩解抑制劑，例如薦糖、Ξ硬脂酸甘油醋、可可脂、氨化油等;吸收促 進劑，例如季錠鹽、十二烷基硫酸鋼等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化娃、玉米淀粉、硬脂酸 鹽、棚酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可W將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包 衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可W廣泛使用本領 域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可 月旨、氨化植物油、聚乙締化咯燒酬、Gelucire、高嶺±、滑石粉等;粘合劑如阿拉伯膠、黃著 膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二燒 基橫酸鋼、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可W廣泛使用本領 域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵憐脂、可可脂、高級醇、高級醇的 醋、明膠、半合成甘油醋等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉 針劑和混懸劑，可W使用本領域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、 乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙締山梨醇脂肪酸醋等。另外，為了制備等 滲注射液，可W向注射用制劑中添加適量的氯化鋼、葡萄糖或甘油，此外，還可W添加常規 的助溶劑、緩沖劑、抑調節劑等。此外，如需要，也可W向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香 料、矯味劑、甜味劑或其它材料。使用上述劑型可W經注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、 肌肉注射和腔內注射等;腔道給藥，如經直腸和陰道;呼吸道給藥，如經鼻腔;粘膜給藥。上 述給藥途徑優選的是注射給藥。
[0067] 本發明將沈Q ID No.l的第151-2814位所示的DNA分子插入pET30a( + )的BamHI和 化〇1位點，得到表達沈0 10齡.2的重組蛋白日-的-6-山3的重組表達載體祀了30日-日-的-6- Y。將重組表達載體祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ導入大腸桿菌化2UDE3)獲得了可溶性的目的蛋白α-β 2-e-his。本發明優化了 a-02-e-his的表達條件，進一步提高了 a-02-e-his的表達量，用 〇.75111]\1的1口了6在16°(：誘導13-16小時，日-02-6-山3的含量達到菌體總蛋白的65%，表達的口- i32-e-Ms 92%可溶。a-02-e-MsY免疫動物后可使動物產生較高的血清抗體水平，并且可 抵抗產氣芙膜梭菌的攻擊。a-K-e-his在抵抗A型產氣芙膜梭菌攻擊時的7天內的免疫保護 率為100%，PBS對照組小鼠全部死亡;α-β2-ε-Μs在抵抗B型產氣芙膜梭菌攻擊時的免疫保 護率為l〇〇%，PBS對照組小鼠全部死亡;免疫a-02-e-Ms在抵抗C型產氣芙膜梭菌攻擊時的 免疫保護率為90%，PBS對照組小鼠全部死亡;a-02-e-Ms在抵抗D型產氣芙膜梭菌攻擊時 的免疫保護率為100%，而PBS對照組小鼠全部死亡。第Ξ次免疫α-β2-ε-Μ3后7-14天抗體 效價達到峰值，最高抗體效價達1:128000。
【附圖說明】
[006引圖1為各菌株表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0069] 圖中，Μ為Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、：34KD、 2服D;l、誘導表達的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導表達的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ全 菌蛋白液體，3、誘導表達的化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ全菌蛋白液體，4、誘導表達的化21 (DE3 )/pET3Oa-a-02-e-Y含蛋白上清液，5、誘導表達的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-Y含蛋白 沉淀，6、未誘導表達的化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液體，7、誘導表達的化21 (DE3)/pET3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液體，8、誘導表達的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W含蛋白 上清液，9、誘導表達的化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W含蛋白沉淀，10、未誘導表達的化21 (DE3)/祀 T3Oa-pma-02-e-W 全菌蛋白液體，11、誘導表達的化 21(DE3)/祀 T3Oa-pma-02-e-W 全菌蛋白液體，12、誘導表達的化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W含蛋白上清液，13、誘導表達 的化21(DE3)/pET30a-pmα-β2-e-W含蛋白沉淀。
[0070] 圖 2 為Western-blot 圖譜。
[0071] 圖中，1、誘導表達的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導表達的化2UDE3)/祀T30a-a- 的-ε-Υ全菌蛋白液體，3、誘導表達的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ全菌蛋白液體，4、誘導表 達的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-Y含蛋白上清液，5、誘導表達的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2- ε-Υ含蛋白沉淀，6、未誘導表達的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液體，7、誘導表達 的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液體，8、誘導表達的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W 含蛋白上清液，9、誘導表達的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W含蛋白沉淀，10、未誘導表達的 化21 (DE3) /祀T3Oa-pma-02-e -W 全菌蛋白液體，11、誘導表達的化21 (DE3) /祀 T3Oa-pma-02- ε-W全菌蛋白液體，12、誘導表達的化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W含蛋白上清液，13、誘導 表達的化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W含蛋白沉淀。
[0072] 圖3為重組蛋白a-02-e-his的AKTA純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。
[0073] 圖4為重組蛋白a-02-e-Ms的分子篩純化鑒定與結構初步判定。箭頭所指的為純 化的目的蛋白峰。
[0074] 圖5為純化的目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0075] 其中 1 是化 21 (DE3)/祀 T3Oa-a-02-e-Y 含蛋白沉淀；2 是化 21 (DE3)/祀 Τ3〇3-α-β2- ε -Υ全菌蛋白液體;Μ是Marker，從上到下分別為180邸、130邸、95邸、72邸、55邸、43邸、34邸、 26KD; 3是受體菌全菌蛋白液體;4是化21 (DE3) /祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ含蛋白上清液；5是儀柱純 化目的蛋白樣品；6是純化的cH32-e-his蛋白（分子篩純化目的蛋白樣品）。
[0076] 圖6為摸索化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ不同誘導溫度與時間點的對比電泳圖。箭 頭示目的條帶。
[0077] 其中 Μ是Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、：34KD、 26KD;1是37°C誘導化后的全菌蛋白液體;2是37°C誘導化的全菌蛋白液體;3是37°C誘導4h 的全菌蛋白液體;4是37°C誘導化的全菌蛋白液體;5是16°C誘導13h的全菌蛋白液體;6是16 °C誘導24h的全菌蛋白液體。箭頭示目的條帶。
[0078] 圖7為化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ不同IPTG濃度條件的對比電泳圖。箭頭示目的 條帶。
[0079] 其中Μ是Marker，從上到下分別為180邸、130邸、95邸、72邸、55邸、43邸、34邸、26邸 (扣L); 1是16°C、0.1 mM誘導后的全菌蛋白液體;2是16°C、0.3mM誘導后的全菌蛋白液體;3是 16 °C、0.5 mM誘導后的全菌蛋白液體;4是16 °C、0.7 5 mM誘導后的全菌蛋白液體;5是：16 °C、 ImM誘導后的全菌蛋白液體;6是無誘導劑空白對照。
[0080] 圖8為化21 (DE3) /祀T3Oa-a-02-e -Y不同誘導溫度的對比電泳圖。
[0081 ] 其中Μ是Marker，從上到下分別為180邸、130邸、95邸、72邸、55邸、43邸、34邸、26邸 (扣L);l是低溫16°C誘導1化后提取的含蛋白上清液;2是低溫16°C誘導1化后提取的含蛋白 上清液。
【具體實施方式】
[0082] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0083] pET30a (+)為No vagen公司產品。pET28a (+)為No vagen公司產品。
[0084] A型產氣芙膜梭菌強毒株巧7-10、B型產氣芙膜梭菌強毒株巧8-5、C型產氣芙膜梭 菌強毒株巧9-4、D型產氣芙膜梭菌強毒株C60-11均為中國獸醫藥品監察所產品。
[0085] 實施例1、可溶性表達a-02-e-his [00化]1、合成基因
[0087] 本申請設計了巧巾融合基因，分別為SEQ ID No.l所示的a-02-e-hisY基因、SEQ ID 齡.3所示的〇-02-6-]113胖基因、56〇1〇齡.4所示的口111〇-02-6-]113胖基因。
[008引 0-02-6-1113￥基因和日-的-6-1113胖基因均編碼沈9 10齡.2所示的蛋白質日-的-6- hisepma-02-e-hisW基因編碼SEQ ID No.5所示的蛋白質pma-02-e-hisWea-02-e-his是將 pma-02-e-MsW的第52-146位氨基酸殘基、464-492位氨基酸殘基和743-750位氨基酸殘基 缺失得到的蛋白質。
[0089] 用化學合成的方法合成出SEQ ID No.l的第151-2814位所示的α-β2-ε-Υ基因（編 碼SEQ ID No.2的第51-937位氨基酸殘基所示的蛋白質），SEQ ID No.3的第151-2814位所 示的〇-02-6-胖基因（編碼56〇1〇齡.2的第51-937位氨基酸殘基所示的蛋白質），56〇1〇 No.4的第151-3210位所示pma-02-e-W基因（編碼沈Q ID No.5的第51-1069位氨基酸殘基所 示的蛋白質pma-02-e-W)。
[0090] 2、重組表達載體和重組菌的構建
[0091 ] W α - β 2 - ε - Y基因作為模板，利用上游引物F 1 (序列為5 ' - g g a t C C atgttttgggacccggacaccgac-3'）和下游引 物 Rl(序列為5'- CTCGAGTCATTTGATGCCCGGTGCTTTGA-3'）進行 PCR 擴增，在 α-的-ε-Υ 基因的兩端加上 BamHI 位 點（帶下劃線的序列）和化01識別位點（帶下劃線的序列），得到SEQ ID No. 1的第145-2820 位所示的α-β2-ε-Υ基因 PCR產物。
[0092] Wa-02-e-W基因作為模板，利用上游引物F1和下游引物R2(序列為5'- CTCGAGTCATTTGATACCCGGCGCTTTGA-3'）進行 PCR 擴增，在 α-的-ε-W 基因的兩端加上 BamHI 和 化〇1識別位點，得到沈Q ID齡.3的第145-282〇位所示的〇-02-6-胖基因？〇?產物。
[009引 W P m曰-β 2 - ε - W基因作為模板，利用上游引物F 3 (序列為5 ' - ggatccatgaaacgcaaaatctgcaaagcc-3 '）和下游引物R2進行PCR擴增，在pma-02-e-W基因的 兩端加上BamHI和化01識別位點，得到沈Q ID齡.4的第145-3216位所示的91110-02-6-胖基因 PCR產物。
[0094] 將上述α-β2-ε-Υ基因 PCR產物用BamHI和趾〇1酶切，回收目的片段（α-β2-ε-Υ基 因）；同時用BamHI和Xhol酶切載體祀T30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收 的載體大片段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉化大腸桿菌化21 (DE3)感受態細胞。將其 均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，37Γ培養16小時。單菌落振蕩培養過夜，提取質粒用 BamHI和趾〇1進行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質粒進行測序，將測序結果表明是用SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的α-β2-ε-Υ基因替換祀T30a( + )的BamHI和化〇1識別位點間的 片段，保持pET30( + )的其它序列不變得到的重組表達載體，命名為ρΕΤ3〇3-α-β2-ε-Υ。 pET30a-a-f32-e-Y含有帶His標簽的a-f32-e-MsY基因，a-f32-e-MsY基因的核巧酸序列是 沈Q ID No.l，編碼沈Q ID齡.2所示的蛋白質〇-02-6-山3。將含有祀了3〇曰-〇-02-6-￥的重組 大腸桿菌命名為化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ。
[00巧]將上述a-02-e-W基因 PCR產物用BamHI和趾〇1酶切，回收目的片段（a-02-e-W基 因）；同時用BamHI和Xhol酶切載體祀T30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收 的載體大片段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉化大腸桿菌化21 (DE3)感受態細胞。將其 均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，37Γ培養16小時。單菌落振蕩培養過夜，提取質粒用 BamHI和趾〇1進行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質粒進行測序，將測序結果表明是用SEQ ID齡.3的第151-2814位所示的〇-02-6-胖基因替換祀了3〇曰(+ )的8曰恤1和化〇1識別位點間的 片段，保持pET30a( + )的其它序列不變得到的重組表達載體，命名為pET3Oa-a-02-e-W。 pET30a-a-的-e-W含有Hi S標簽融合蛋白α-β2-Ε -hi sW基因，α-β2-Ε -Μ sW基因的核巧酸序列 是沈9 1〇齡.3，編碼沈9 1〇齡.2所示的蛋白質〇-02-6-山3。將含有祀了3〇曰-〇-02-6-胖的重 組大腸桿菌命名為化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W。
[0096] 將上述pma-02-e-W基因 PCR產物用BamH巧日趾〇1酶切，回收目的片段(pma-02-e-W 基因）；同時用BamHI和化〇1酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回 收的載體大片段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉化大腸桿菌化21郵3)感受態細胞。將 其均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，37Γ培養16小時。單菌落振蕩培養過夜，提取質粒用 BamHI和趾〇1進行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質粒進行測序，將測序結果表明是用SEQ ID No.4的第151-3210位所示的pmα-β2-ε-W基因替換祀T30a( + )的BamH巧肋hoI識別位點間 的片段，保持祀Τ30( + )的其它序列不變得到的重組表達載體，命名為祀T3Oa-pma-02-e-W。 pET3Oa-pma-02-e-W 含有帶 His 標簽的 pma-02-e-hisW 基因，pma-02-e-hisW 基因的核巧酸序 列是沈9 1〇齡.4，編碼沈9 1〇齡.5所示的蛋白質口111日-02-6-山3胖。將含有祀了3〇日-口111日-的- ε-W的重組大腸桿菌命名為化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W。
[0097] 3、蛋白表達形式的分析與鑒定
[009 引 將化 21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y、化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W、^21(DE3)/ pET3Oa-pma-02-e-W和大腸桿菌化21(DE3)(簡稱受體菌)運四個菌株分別單獨接種于含50μ g/ml卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μ g/ml得到的培養基）中，37°C，采用化ermo MaxQ6000型全溫振蕩器20化pm振蕩培養至OD600 值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基為空白對照)達到0.6時，取出1 mL菌液作為未誘 導表達的菌液(對照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)進行誘導表達。上 述四株菌的誘導表達均是用0.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。
[0099] 取未誘導表達的菌液和誘導表達菌液用于蛋白表達形式分析。具體步驟為，取Im L菌液置于1.5m L離屯、管中，做好標記，4°C條件下8000巧m/min離屯、30min，棄掉上清液，收 集菌體沉淀。加入Im L PBS重懸沉淀，800化pm/min離屯、5min，棄掉上清液。向洗涂好的菌體 沉淀中加入20化L PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋 白液體于4 °C離屯、機中1600化pm/min離屯、30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液)和 沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50化PBS重懸洗涂沉淀。向全菌蛋白液體、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10化5 XSDS-PAGE loading Buffer,充分混勻后，置沸 水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離屯、機瞬離。取化L用于SDS-PAGE電泳分析，并且結 合蛋白灰度分析軟件初步分析蛋白含量。將電泳后的凝膠轉印于NC膜，W抗化S標簽的羊抗 鼠抗體為結合抗體DAB顯色，進行Western-blot鑒定。將上述全菌蛋白液體和含蛋白上清液 用0.22皿濾膜過濾后上樣至預先用溶液1(溶質及其濃度如下：20mM化is、150mM化C1，溶 劑是水，P冊.0的溶液)平衡好的儀柱。將儀柱接入AKTA機器上，分別用10個柱體積的溶液1 與10個柱體積的溶液2(溶質及其濃度如下：20mM化is、150mM化Cl、50mM咪挫，溶劑是水， P冊.0的溶液)清洗儀柱中的雜質蛋白，并在AKTA機器上監測蛋白峰。用溶液3(溶質及其濃 度如下：20mM Tris、150mM化C1、300mM咪挫，溶劑是水，P冊.0的溶液)沖洗儀柱掛在儀柱上 的目的蛋白，并使用AKTA收集出現目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為儀柱純化目的蛋 白樣品。
[0100] 將儀柱純化的目的蛋白樣品用GE公司生產的Superdex200凝膠柱通過分子篩進一 步純化。流動相使用溶液1。通過分子篩純化后可W除去樣品中的含有的大量咪挫，收集洗 脫峰，得到分子篩純化的目的蛋白樣品，使用化no化OP2000超微量分光光度計(ND2000)對 得到的分子篩純化的目的蛋白樣品中蛋白（即可溶性目的蛋白）的含量進行定量分析。并用 Nano化OP2000超微量分光光度計(ND2000)測定全菌蛋白液體中的蛋白質含量，得到菌體總 蛋白含量。將含蛋白沉淀用尿素溶解后，用化no化OP2000超微量分光光度計(ND2000)測定 含蛋白沉淀中的蛋白質的含量。
[0101] 結果表明誘導表達的化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液體、含蛋白上清 液和含蛋白沉淀中均含有大小為10化D的目的蛋白a-02-e-his，未誘導表達的化2UDE3)/ 祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液體中不含有大小為105kD的目的蛋白a-02-e-his;誘導表達 的化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液體中的目的蛋白a-02-e-his占菌體總蛋白 (全菌總蛋白）的65%，誘導表達的化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y的含蛋白上清液中的目的 蛋白a-02-e-his占誘導表達的化2UDE3)/祀T30a-a-i32-e-Y的全菌蛋白液體中目的蛋白α- f32-e-his的92%，該92%的目的蛋白a-02-e-his為可溶性蛋白；誘導表達的化21(DE3)/ ρΕΤ3〇3-α-β2-ε-Υ的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-02-e-his占誘導表達的化21(DE3)/ 祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液體中目的蛋白a-02-e-his的8%，該8%的目的蛋白α-β2-ε- his為不溶性包涵體蛋白；說明誘導表達的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的目的蛋白α-β2- ε-Ms占菌體總蛋白的65%，BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y表達的目的蛋白a-02-e-his中 92%為可溶性蛋白，8%為不溶性包涵體蛋白。誘導表達的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的 全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小為10化D的目的蛋白a-02-e-his， 未誘導表達的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液體中不含有大小為10化D的目的 蛋白a-02-e-his;誘導表達的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液體中的目的蛋白 a-02-e-Ms占菌體總蛋白的65%，誘導表達的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的含蛋白上清 液中的目的蛋白曰-02-e-his占誘導表達的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液體中 目的蛋白日-的-e-his的8%，該8%的目的蛋白a-02-e-his為可溶性蛋白；誘導表達的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-02-e-his占誘導表達的化2UDE3)/ 祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液體中目的蛋白a-02-e-his的92%，該92%的目的蛋白α-β2- ε-Ms為不溶性包涵體蛋白；說明誘導表達的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的目的蛋白α-β 2-e-Ms占菌體總蛋白的65%，BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W表達的目的蛋白a-02-e-his中 8%為可溶性蛋白，92%為不溶性包涵體蛋白。未誘導表達的化2UDE3)/祀T3Oa-pma-02-e- W的全菌蛋白液體和誘導表達的化2UDE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W的全菌蛋白液體、含蛋白上 清液和含蛋白沉淀中均不含有大小為120KD的目的蛋白pma-02-e-Ms;說明化2UDE3)/ pET3Oa-pma-02-e-W沒有表達目的蛋白ρπια-β2-ε-hiS。誘導表達的大腸桿菌化21 (DE3)的全 菌蛋白液體不含有大小為105kD的目的蛋白a-02-e-Ms;說明大腸桿菌化2UDE3)沒有表達 目的蛋白日-的-e-Ms。菌落形成單位（CFU)數量相同的誘導表達的化2UDE3)/祀T30a-a-e 2-ε-Υ和誘導表達的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W表達的菌體總蛋白質量相同（圖1和圖2)。
[0102] 4、a-02-e-his 的純化
[0103] 將化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基（在LB 液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養基為空白對照)達到0.6時，加入IPTG進行誘導表達。該誘導表達用0.75mM的IPTG在16 °C誘導13h。取IPTG誘導表達13h后的菌液收集菌體沉淀。加入PBS重懸沉淀，80(K)rpm/min離 屯、5min，棄掉上清液。向洗涂好的菌體沉淀中加入PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘 稠，于4°C離屯、機中1600化pm/min離屯、30min，收集上清液(命名為含蛋白上清液），棄沉淀。 將含蛋白上清液用〇.22μπι濾膜過濾后上樣至預先用溶液1(溶質及其濃度如下：20mM Tris、 150mM化Cl，溶劑是水，p冊.0的溶液)平衡好的儀柱。將儀柱接入AKTA機器上，分別用10個 柱體積的溶液1與10個柱體積的溶液2(溶質及其濃度如下：20mM化is、150mM NaCl、50mM咪 挫，溶劑是水，P冊.0的溶液)清洗儀柱中的雜質蛋白，并在AKTA機器上監測蛋白峰。用溶液3 (溶質及其濃度如下：20mM化is、150mM化Cl、300mM咪挫，溶劑是水，P冊.0的溶液)沖洗儀 柱掛在儀柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為儀 柱純化的a-K-e-his蛋白（儀柱純化目的蛋白樣品）（圖3)。
[0104] 將儀柱純化的a-i32-e-his蛋白用GE公司生產的Superdex200凝膠柱通過分子篩進 一步純化。流動相使用溶液1。通過分子篩純化后可W除去樣品中的含有的大量咪挫，α-的- ε-Ms蛋白的結構為單體與二聚體共存結構。收集單體與二聚體結構的洗脫峰，得到分子篩 純化的a-02-e-his蛋白（分子篩純化目的蛋白樣品），使用化no化op2000超微量分光光度計 (ND2000)對得到的蛋白的純度進行定量分析。
[0105] 將分子篩純化的α-β2-ε-Μ3蛋白進行質譜分析其氨基酸序列，結果表明α-β2-ε- 1113的氨基酸序列如56〇10齡.2所示。
[0106] 將化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ和大腸桿菌化21(DE3)(簡稱受體菌）運兩個菌株 分別單獨接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體培養基中加入卡那霉素至 卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用化ermo MaxQ6000型全溫振蕩器 200巧m振蕩培養至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基為空白對照)達到0.6時， 加入異丙基硫代-0-D-半乳糖巧（IPTG)進行誘導表達。上述兩株菌的誘導表達均是用 0.75mM的IPTG在16 °C誘導13小時。
[0107] 取IPTG誘導表達13h后的菌液用于蛋白表達形式分析。具體步驟為，取Im L誘導后 的重組菌液置于1.5m L離屯、管中，做好標記，4°C條件下8000巧m/min離屯、30min，棄掉上清 液，收集菌體沉淀。加入Im L PBS重懸沉淀，800化pm/min離屯、5min，棄掉上清液。向洗涂好 的菌體沉淀中加入20化1 PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將 全菌蛋白液體于4 °C離屯、機中1600化pm/min離屯、30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上 清液)和沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50化PBS重懸洗涂沉淀。向全菌蛋 白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10化5 XSDS-PAGE loading Buffer,充分混勻 后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離屯、機瞬離。取6化用于SDS-PAGE電泳分 析。同時將上述儀柱純化目的蛋白樣品和上述純化的曰-的-ε-Ms蛋白（分子篩純化目的蛋 白樣品)進行SDS-PAGE電泳分析。
[0108] 結果表明化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ表達的目的蛋白a-02-e-MsW可溶性的形 式存在于細菌破碎菌體的上清液中，可溶性蛋白目的條帶表達明顯，上清液中雜質較少。通 過對AKTA機器純化洗脫條件的優化，可W得到純度更好的可溶性目的蛋白條帶，進一步通 過分子篩的純化后，可W除去蛋白樣品中的含有的大量咪挫（圖5)，并且首次發現了該融合 重組蛋白的結構為單體與二聚體共存結構。通過分子篩的純化后的可溶性蛋白可W作為診 斷抗原、制備成單克隆抗體或進一步對蛋白功能與構象關系進行研究。
[0109] 另外，按照上述方法，將祀T28a( + )的限制性內切酶化el和Notl位點之間的序列替 換為SEQ ID No.l第151-2814位所示的α-β2-ε-Υ基因，保持祀T28a( + )的其它序列不變，得 到含有α-β2-ε-Υ基因的重組表達載體，將該重組表達載體命名為pET28a-a-02-e-Y。將 祀T28a-a-02-e-Y轉入大腸桿菌化2UDE3)感受態細胞，將得到的重組大腸桿菌命名為化21 (DE3)/祀 T28a-a-02-e-Y。將化 21(DE3)/祀 T28a-a-02-e-Y 接種于含 50μg/ml 卡那霉素的 LB 液體培養基(在LB液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基） 中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200巧m振蕩培養至ODsqq值（W含50μg/ml卡那 霉素的LB液體培養基為空白對照）達到0.6時，取出1 mL菌液作為未誘導表達的菌液（對 照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)進行誘導表達。該誘導表達是用 0.75mM的IPTG在16 °C誘導13小時。取誘導表達的菌液和未誘導表達的菌液按照上述方法進 行蛋白表達形式分析。結果表明，未誘導表達的化2UDE3)/祀T28a-a-02-e-Y全菌蛋白液 體、誘導表達的化21(〇63)/96了28曰-〇-02-6-￥全菌蛋白液體、誘導表達的化21(〇63)/ pET28a-a-02-e-Y含蛋白上清液和誘導表達的化2UDE3)/祀T28a-a-02-e-Y含蛋白沉淀中 均沒有目的蛋白的表達。可見，雖然采用同一種外源目的基因（α-β2-ε-Υ基因），在不同的 BL2UDE3)表達載體-pET28a( + )和祀T30a( + )中，外源目的基因的表達情況相差很大，將α-β 2-ε-Υ基因通過pET30a( + )導入大腸桿菌化21(DE3)可獲得α-β2-ε-Υ基因的高效可溶性表 達，將α-β2-ε-Υ基因通過祀T28a( + )導入大腸桿菌化2UDE3)中，α-β2-ε-Υ基因卻沒有表達。
[0110] 實施例2、α-β2-ε -hi S的動物免疫保護性試驗
[0111] 1、抗產氣芙膜梭菌疫苗的制備
[0112] 將實施例1中分子篩純化的a-02-e-his蛋白用無菌PBS溶解，得到cH32-e-Ms濃度 為lOOOyg/mL的a-02-e-Ms溶液，用于免疫。將a-02-e-Ms溶液與弗氏佐劑按1:1等體積混 合，乳化制備油乳劑疫苗，將其命名為首免疫苗。將a-e2-e-his溶液與不完全弗氏佐劑按1: 1等體積混合，乳化制備油乳劑疫苗，將其命名為二免疫苗。
[0113] 取出從中國獸醫藥品監察所購買到的A型產氣芙膜梭菌強毒株巧7-10、B型產氣芙 膜梭菌強毒株巧8-5、C型產氣芙膜梭菌強毒株巧9-4、D型產氣芙膜梭菌強毒株C60-11。在超 凈工作臺中，用75%酒精棉球仔細擦拭保存菌種的安飯瓶外壁，然后用砂輪在安瓶的上Ξ 分之一處做一劃痕，再用干燥的無菌紗布包裹安瓶將其斑開。吸取4(Κ)化厭氧肉肝湯液體培 養基反復吹打安瓶中的菌種，使凍干菌種溶解菌懸液。按照1:100的比例將菌懸液接種到含 有牛肉膏的厭氧肉肝湯的試管中，并在試管上層加蓋l-2cm的液體石蠟隔絕空氣。將接好菌 的試管放入厭氧培養箱，置37Γ恒溫培養箱中，培養16-24h后，觀察細菌的生長情況。復蘇 后的菌種經過涂片、染色、鏡檢，確認無誤后傳1-2代后使用，并將一部分菌種用30%的甘油 鹽水-80°C冰箱保存。
[0114] 2、A型產氣芙膜梭菌攻毒試驗
[0115] 按照如下方法測試a-02-e-his對A型產氣芙膜梭菌強毒株巧7-10的抗性試驗：
[0116] 將30只體重在18-22g的雌性昆明小鼠，隨機分成2組(攻毒劑量組20只，并設10只 小鼠的PBS對照組）。攻毒劑量組，首次免疫、第二次免疫與第Ξ次免疫均采用皮下注射的方 法進行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫與第Ξ次免疫用二免疫苗，每次免疫劑量均 為0.2mL/只（a-02-e-Ms免疫劑量為l(K)yg/只）；PBS對照組中的每只小鼠首次免疫、第二次 免疫與第Ξ次免疫，皮下注射0.2mL PBS。首次免疫之前，先對小鼠進行一次割尾采血，分離 血清，用作陰性對照血清。首次免疫后，間隔14d進行第二次免疫，二免后14d進行第Ξ次免 疫。第Ξ次免疫兩周后每只攻毒劑量組小鼠和每只PBS對照組小鼠腹腔注射1.5 X 109c化的 A型產氣芙膜梭菌強毒株巧7-10進行攻毒試驗。自一免后開始，每組小鼠每周采血一次，每 組采5只，分離血清，于-80°C冰箱保存，用于檢測抗體。采用間接化ISA檢測免疫動物抗體水 平，具體方法如下：
[0117] 1)包被:將實施例1中分子篩純化的a-02-e-his蛋白用0.05mol/L P Η 9.0的碳酸 鹽包被緩沖液進行稀釋，然后按10化L/孔逐一加入化ISA板中，將加好的化ISA板置4°C冰箱 中過夜；
[0118] 2)洗涂:從4°C冰箱中取出化ISA板，棄去板孔內的液體，并在濾紙上拍干，向每孔 加入20化L PBST置于洗板機中進行洗版，重復4次。
[0119] 3)封閉：向ELISA板的每個孔中加入100化含有5%脫脂乳的PBST溶液，放入37°C溫 箱解育化；
[0120] 4)洗涂：向每孔加入20化L PBST置于洗板機中進行洗版，重復4次；
[0121] 5)加待檢血清:將待檢血清按比例用滅菌PBS進行稀釋，每孔加10化L，同時設陰性 對照、陽性對照和空白對照孔，放入37°C溫箱解育化；
[0122] 6)洗涂：向每孔加入20化L PBST置于洗板機中進行洗版，重復4次；
[0123] 7)酶標二抗結合:將HRP標記的羊抗鼠二抗用含有5%脫脂乳的PBS封閉緩沖液按 1:20 000-1:40000濃度稀釋后，分別向每孔加入l(K)yL，放入37°C溫箱解育化；
[0124] 8)洗涂：向每孔加入20化L PBST置于洗板機中進行洗板，重復4次；
[0125] 9)顯色反應:將新鮮配制的TMB顯色液按10化L/孔加入到化ISA板的各個孔中，放 入37°C溫箱避光顯色15min;
[01%] 10)終止反應：向按照50化/孔加入2mol/L的濃出S〇4終止液，放入37°C溫箱反應 5min，終止顯色；
[0127] 11)讀數:將終止顯色的ELISA板放酶標儀中檢測OD450的值。
[0128] 12)判定檢測結果：用確定好的陰陽性臨界值來判定檢測結果。陽性臨界值=陰性 樣本的OD450平均值+3S(S為標準方差）。待檢血清的效價為待檢血清的00值> 陽性臨界值時 所對應的血清稀釋度。
[0129] 3、B型產氣芙膜梭菌攻毒試驗
[0130] 除了將A型產氣芙膜梭菌強毒株巧7-10替換為B型產氣芙膜梭菌強毒株巧8-5,攻 毒劑量調整為2 X 109c化外，其它操作完全相同。
[0131] 4、C型產氣芙膜梭菌攻毒試驗
[0132] 除了將A型產氣芙膜梭菌強毒株巧7-10替換為C型產氣芙膜梭菌強毒株巧9-4,攻 毒劑量調整為1.5 X 108c化外，其它操作完全相同。
[0133] 5、D型產氣芙膜梭菌攻毒試驗
[0134] 除了將A型產氣芙膜梭菌強毒株巧7-10替換為D型產氣芙膜梭菌強毒株C60-11，攻 毒劑量調整為1.8 X 109c化外，其它操作完全相同。
[0135] 攻毒劑量組和PBS對照組實驗小鼠在Ξ免二周后，分別使用各型產氣芙膜梭菌 1MLD 100的劑量對小鼠進行攻毒，并于一周內觀察和記錄小鼠發病死亡情況。攻毒結果表 明，攻毒劑量組(免疫a-02-e-his)對各型產氣芙膜梭菌的攻擊均具有一定的免疫保護效 果。攻毒劑量組(免疫α-02-ε-Μ S)在抵抗A型產氣芙膜梭菌攻擊時的7天內的免疫保護率為 1〇〇%(2〇只全部存活），？85對照組小鼠全部死亡;攻毒劑量組(免疫〇-02-6-山3)在抵抗8型 產氣芙膜梭菌攻擊時的免疫保護率為100% (20只全部存活），PBS對照組小鼠全部死亡;攻 毒劑量組(免疫a-02-e-Ms)在抵抗C型產氣芙膜梭菌攻擊時的免疫保護率為90% (18只存 活，2只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡;攻毒劑量組(免疫a-02-e-his)在抵抗D型產氣芙膜 梭菌攻擊時的免疫保護率為100% (20只全部存活），而PBS對照組小鼠全部死亡。將純化后 的曰-02-e-his作為診斷抗原包被酶標板檢測檢測小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗體，發 現曰-02-e-his作為診斷抗原建立的檢測方法均具有非常好的靈敏性與特異性。分別檢測各 實驗組中小鼠初免后0-6周的血清中抗體效價水平，結果表明a-02-e-Ms融合毒素蛋白免 疫組抗體效價有明顯升高，在二免后抗體效價快速上升，Ξ免后7-14天抗體效價達到峰值， 最高抗體效價達1:128000。
[0136] 實施例3、a-02-e-his誘導表達條件的優化
[0137] 1、誘導溫度和時間的優化
[0138] 將化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基（在LB 液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養基為空白對照)達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)分別進行下述6種誘 導表達。第一種誘導表達是用〇.75mM的IPTG在37°C誘導1小時。第二種誘導表達是用0.75mM 的IPTG在37°C誘導2小時。第Ξ種誘導表達是用0.75mM的IPTG在37°C誘導4小時。第四種誘 導表達是用〇.75mM的IPTG在37°C誘導5小時。第五種誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘 導13小時。第六種誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘導24小時。
[0139] 取Im L誘導后的重組菌液置于1.5m L離屯、管中，做好標記，4°C條件下8000巧m/ min離屯、30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入Im L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離屯、 5min，棄掉上清液。向洗涂好的菌體沉淀中加入20化1 PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。向全菌蛋白液體中加入10化5XSDS-PAGE loading Buffer,充 分混勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離屯、機瞬離。取化L用于SDS-PAGE電 泳分析。結果表明化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ在誘導溫度為37°C，誘導時間在l-4h的條件 下，α-02-ε-his蛋白表達量隨時間延長逐漸上升，化誘導條件下蛋白表達量有所下降。但是 隨著誘導溫度的降低，a-02-e-his表達量也有所增加，當誘導溫度降低至16°C，時間為誘導 1化時，a-02-e-Ms表達量達到最高，目的蛋白a-02-e-Ms占全菌總蛋白的65%。繼續培養 至2地，α-β2-ε-hiS的表達量略有下降，因此，通過實驗驗證化21 (DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Y的 最佳誘導溫度為16°C，誘導時間為13-24h(圖6)。
[0140] 2、IPTG濃度的優化
[0141] 將化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基（在LB 液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養基為空白對照)達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)分別進行下述6種誘 導表達。第一種誘導表達是用O.lmM的IPTG在16°C誘導13小時。第二種誘導表達是用0.3mM 的IPTG在16 °C誘導13小時。第Ξ種誘導表達是用0.5mM的IPTG在16 °C誘導13小時。第四種誘 導表達是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。第五種誘導表達是用ImM的IPTG在16°C誘導 13小時。第六種誘導表達是用OmM的IPTG在16 °C誘導13小時。
[0142] 取Im L誘導后的重組菌液置于1.5m L離屯、管中，做好標記，4°C條件下8000巧m/ min離屯、30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入Im L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離屯、 5min，棄掉上清液。向洗涂好的菌體沉淀中加入20化1 PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋白液體于4 °C離屯、機中1600化pm/min離屯、30min，收集上 清液(命名為含蛋白上清液），向含蛋白上清液中加入10化5XSDS-PAGE loading Buffer, 充分混勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離屯、機瞬離。取化L用于SDS-PAGE 電泳分析。結果表明a-f32-e-Ms在不同濃度的IPTG誘導下，表達量也有所不同。a-02-e-his 表達量與加入IPTG濃度在0.1-0.75mM之間呈遞增關系。當IPTG誘導濃度為ImM時，蛋白表達 量有所減少，運可能與IPTG本身的毒性有關。因此選擇IPTG濃度0.75mM為最佳誘導濃度(圖 7)。
[0143] 3、誘導時間的優化
[0144] 將化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基（在LB 液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養基為空白對照)達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)分別進行下述巧中誘 導表達。第一種誘導表達是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。第二種誘導表達是用 0.75mM的IPTG在16 °C誘導16小時。
[0145] 取Im L誘導后的重組菌液置于1.5m L離屯、管中，做好標記，4°C條件下8000巧m/ min離屯、30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入Im L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離屯、 5min，棄掉上清液。向洗涂好的菌體沉淀中加入20化1 PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。
[0146] 向全菌蛋白液體中加入10化5 XSDS-PAGE loading Buffer,充分混勻后，置沸水 浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離屯、機瞬離。取化L用于SDS-PAGE電泳分析。
[0147] 結果表明化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y在誘導溫度為16°C，誘導時間在13h與16h 的條件下，目的蛋白a-K-e-his表達量變化不大，此時表達的蛋白幾乎均為可溶性蛋白，沉 淀中的不溶性包涵體蛋白幾乎沒有表達。當誘導溫度為16°C，誘導時間在13h與16h的條件 下表達的可溶性目的蛋白純度較高，表達量接近。因此，通過實驗驗證，進一步確定了重組 菌的最佳誘導溫度為16°C，誘導時間為13-1化(圖8)。
【主權項】
1. 制備抗產氣莢膜梭菌疫苗的方法，包括使蛋白質的編碼基因在生物中進行表達得到 所述蛋白質，利用表達得到的所述蛋白質制備抗產氣莢膜梭菌疫苗;所述蛋白質為a)或b) 或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質； b) 由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質； c) 在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質； 所述生物為微生物、植物或非人動物。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述使蛋白質的編碼基因在生物中進行表 達包括將所述蛋白質的編碼基因導入受體微生物，得到表達所述蛋白質的重組微生物，培 養所述重組微生物，表達得到所述蛋白質。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述受體微生物為Cl )-C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細菌； C3)埃希氏菌屬細菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3)。4. 根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白質的編碼基因為如下1) 或2)或3)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA 分子。5. 根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重組微生物為將pET30a-a-i3 2-ε-Y導入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表達氨基酸序列是SEQIDN 0.2的蛋白質的重組微生 物，所述重組微生物命名為BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y，所述ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ為將載體 pET30a( + )的BamHI和Xhol位點之間的序列替換為SEQ ID No.l第151-2814位所示的DNA片 段得到的重組載體。6. 根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述表達為誘導表達;所述誘導 表達是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導13-16小時或13-24小時或13小時或16小時。7. 權利要求1中所述蛋白質或與所述蛋白質相關的生物材料在制備抗產氣莢膜梭菌疫 苗中的應用； 所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種： B1)編碼所述蛋白質的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達盒的重組載體； B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉基因動物細胞系； Β10)含有Β2)所述表達盒的轉基因動物細胞系； Β11)含有Β3)所述重組載體的轉基因動物細胞系； Β12)含有Μ)所述重組載體的轉基因動物細胞系； Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系； Β14)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物細胞系； Β15)含有Β3)所述重組載體的轉基因植物細胞系； Β16)含有M)所述重組載體的轉基因植物細胞系。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基 因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA 分子； 所述重組載體為權利要求5中所述ρΕΤ30&-α-β2-ε ; 所述重組微生物為D1)或D2): D1)所述重組微生物為將權利要求1中所述的蛋白質的編碼基因導入受體微生物，得到 表達權利要求1中所述蛋白質的重組微生物，所述受體微生物為Cl)-C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細菌； C3)埃希氏菌屬細菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3)。9. 預防動物產氣莢膜梭菌感染的疫苗，其含有權利要求7或8中所述蛋白質或與所述蛋 白質相關的生物材料； 所述生物材料為下述Β1)至Β16)中的任一種： Β1)編碼權利要求1所述蛋白質的核酸分子； Β2)含有Β1)所述核酸分子的表達盒； Β3)含有Β1)所述核酸分子的重組載體； Β4)含有Β2)所述表達盒的重組載體； Β5)含有Β1)所述核酸分子的重組微生物； Β6)含有Β2)所述表達盒的重組微生物； Β7)含有Β3)所述重組載體的重組微生物； Β8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉基因動物細胞系； Β10)含有Β2)所述表達盒的轉基因動物細胞系； Β11)含有Β3)所述重組載體的轉基因動物細胞系； Β12)含有Μ)所述重組載體的轉基因動物細胞系； B13)含有B1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系； B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系； B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系； B16)含有M)所述重組載體的轉基因植物細胞系。10.根據權利要求7或8所述的應用或權利要求9所述的疫苗，其特征在于:所述產氣莢 膜梭菌為A、B、C、D和E這5種型產氣莢膜梭菌中的任5種、任4種、任3種、任2種或任1種。
【文檔編號】C07K14/33GK105999252SQ201610302594
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月9日
【發明人】宋曉暉, 孫雨, 翟新驗, 趙柏林
【申請人】中國動物疫病預防控制中心