一種攜氧增強光動力的光敏脂質體及制備與應用
【專利摘要】本發明提供一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，由磷脂、膽固醇、長循環材料和血紅蛋白，以及化療藥物和/或光敏劑組成，將各組分溶解于有機溶劑中，減壓旋蒸形成薄膜，再加入氧合血紅蛋白溶液，或光敏劑和/或化療藥物與氧合血紅蛋白的混合溶液，水合反應，得到多層脂質體溶液，經超聲、純化即得。本發明的脂質體可同時攜載氧、化療藥物和/或光敏劑到達腫瘤部位，緩解腫瘤細胞缺氧狀態，提高了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，抑制腫瘤的生長和轉移，也能在近紅外光的照射下，致使脂質體中光敏劑生成更多的單線態氧，產生增強的光動力治療作用，同時單線態氧還可破壞脂質體雙層膜結構，促發其包載的藥物分子釋放，實現藥物釋放的遠程控制。
【專利說明】
一種攜氧増強光動力的光敏脂質體及制備與應用
技術領域
[0001] 本發明屬于制藥領域，涉及一種新型的向腫瘤部位遞送氧分子及藥物分子的脂質 體給藥系統，尤其涉及一種攜氧增強光動力的光敏脂質體及制備與應用。
【背景技術】
[0002] 早在1955年，Thmolison等在研究中首次提出了腫瘤缺氧，經過60多年的臨床和實 驗證實，缺氧廣泛存在于宮頸癌、乳腺癌、陰道癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌、直腸癌、肺癌、腦 部腫瘤、軟組織肉瘤等腫瘤中。并且研究發現，體積大于lcm 3的腫瘤中即存在缺氧。腫瘤組 織內，腫瘤細胞失控性生長和增殖消耗大量的營養和氧氣，其內部不能及時、有效的建立新 生血管網，或新生血管網的結構和功能異常，存在暫時性封閉或"盲端"，并且通透性較高， 液體外滲至組織間隙導致血流粘滯阻力增加。這些因素使腫瘤內部血流減少，氧的供應遠 少于氧的需求，腫瘤細胞處于急性(灌注缺乏)或慢性(彌散障礙)缺氧狀態。此外，惡性腫瘤 的自身進程以及抗腫瘤治療所造成的貧血亦加劇了腫瘤的缺氧，腫瘤內部缺氧微環境由此 生成。
[0003] 光動力療法(photodynamic，PDT)是光動力反應應用于臨床治療腫瘤和其他疾病 的一種非侵蝕性并具有一定靶向性的腫瘤治療新方法，是一種新的兩步法治療手段。即首 先給予一種能在腫瘤部位相對富集的光敏藥物(又稱光敏劑），然后利用特定波長的激光激 活光敏劑，發生一系列光化學和光生物學反應。反應機理主要有2種:其一，三重激發態的光 敏劑可以直接與細胞膜或一些生物大分子等底物發生反應，轉移一個氫原子(電子)而形成 自由基。自由基與組織氧相互作用生成可以殺傷目標細胞的活性氧（reactive oxygen speCieS，R0S)。其二，三重激發態的光敏劑也能夠把能量直接轉移到蛋白亞基，形成一種高 效的R0S-一單線態氧來殺傷目標細胞。兩種反應可同時發生，兩者的比率取決于使用的光 敏劑類型、底物和組織氧的濃度及光敏劑與底物結合的緊密性。在整個過程中，光敏劑從基 態到激發態又回到基態，起催化劑的作用。足夠濃度的組織氧和適當劑量的光照是TOT所必 需的，光敏作用很難在組織缺氧的區域發生。光敏劑、與光敏劑相匹配的激光、基質氧是PDT 的三要素，三者缺一不可。傳統的光動力治療旨在將光敏劑與激光結合實現光動力治療，忽 略腫瘤缺氧環境，從而無法達到理想的治療效果。
[0004] 腫瘤的化療中，缺氧的腫瘤細胞對化療藥物存在耐藥性。一方面，許多化療藥物， 如環磷酰胺、鉑類、多柔比星等是氧依賴性的化療藥物，其在細胞內生成自由基，自由基從 細胞的其他生化物質奪獲電子然后傳遞給氧，從而對細胞起到殺傷作用。這些藥物藥效的 發揮有賴于細胞的氧環境，當細胞局部缺氧，其對腫瘤細胞殺傷作用減弱。另一方面，缺氧 通過對細胞基因組和蛋白組表達的調控，導致腫瘤耐藥。缺氧可以激活HIF(hyp 〇xia inducer factors)家族活性，進而與下游調控基因的缺氧敏感元件(hypoxia-response-e 1 emen t HRE) 結合 ，啟 動下游MDR轉錄 ，翻 譯生產 p -gp ， 將藥物 由細胞 內栗出 ，降低 藥物濃 度。此外，缺氧誘導P27產生，細胞分裂受阻于G1/S，使作用于細胞周期性的化療藥失效;缺 氧也可以上調VEGF表達進而誘導Bcl-2升高，最終抑制細胞凋亡。
[0005] 在光動力治療和化療中，現存的最大問題即腫瘤局部乏氧。而腫瘤乏氧微環境激 發腫瘤細胞一系列適應性反應的同時會增加其侵襲力及遠處轉移機會，增強放化療抵抗。 近年來，選擇一種方式克服腫瘤低氧條件成為該領域一個亟須解決的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，包括磷脂、膽固醇、長循 環材料和血紅蛋白，以及化療藥物和/或光敏劑，其摩爾比10:1~5:0.1~0.8:0.01~1:0.5 ~2〇
[0007] 所述脂質體平均粒徑為50-500nm，作為優選，平均粒徑為100-250nm。
[0008] 所述磷脂選自大豆磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、腦磷脂、二肉 豆蔻酰卵磷脂、神經鞘磷脂、鞘髓磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿中、磷脂酰絲胺酸和硬脂酰胺 中的至少一種。
[0009] 所述長循環材料為聚乙二醇衍生化磷脂，選自DSro-PEG1000，DSPE-roG2000， DSPE-PEG3400，DSPE-PEG5000，DSPE-PEG10000中的至少一種。PEG化脂質體表面的分子可形 成空間立體位阻層，顯著減弱脂質體與蛋白的相互作用（即調理作用）從而降低其被識別攝 取的概率，體內表現為較低的清除速率和較長的循環時間。硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇(DSPE-PEG)修飾脂質體表面，由于DSPE-PEG是兩親線性聚合物，可形成一層致密的構象 云覆蓋在脂質體表面，這種立體位阻，可以阻礙單核-巨噬細胞系統(MPS)對脂質體的作用。
[0010] 所述血紅蛋白選自人血紅蛋白或牛血紅蛋白，并經氧飽和成為攜載氧的氧合血紅 蛋白，每l〇〇mg脂材中，加入10~500mg血紅蛋白。
[0011]所述光敏劑選自吲哚菁綠衍生物、二氫卟吩e6、酞菁、菌綠素 a中的至少一種。
[0012] 所述的化療藥物選自阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、p比柔比星、氨甲喋呤、長春新 堿、異長春花堿、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、環磷酰胺、紫杉醇、多西他賽、喜樹堿、吉西他濱、卡 培他濱、利妥昔單抗等抗腫瘤藥物中的至少一種。
[0013] 本發明的另一個目的是提供所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體的制備方 法，通過以下步驟實現：
[0014] (1)將磷脂，膽固醇，長循環材料，光敏劑和/或化療藥物，按摩爾比10:1~5:0.1~ 0.8:0.5~2溶解于有機溶劑中，減壓旋蒸發除去有機溶劑，形成薄膜，有機溶劑選用三氯甲 烷和二氯甲烷的一種或兩種混合溶劑；
[0015] (2)向薄膜中加入氧合血紅蛋白溶液，或光敏劑和/或化療藥物與氧合血紅蛋白的 混合溶液(其中磷脂:光敏劑和/或化療藥物:血紅蛋白=10:0.5~2:0.01~1 )，5~40 °C水 合1~2小時，得到多層脂質體溶液；
[0016] (3)該脂質體溶液經過超聲處理，過柱或超濾純化，得載藥的目的光敏脂質體。
[0017] 本發明的再一個目的是提供所述攜氧增強光動力的光敏脂質體在制備攜氧載藥 脂質體中的應用。本發明通過攜載氧到達腫瘤部位，實現以增強光動力治療和化療結合的 治療效果。
[0018] 本發明將傳統脂質體通過包裹抗腫瘤藥物和/或光敏劑，以及載氧血紅蛋白，組合 成全新的脂質體，累積至腫瘤部位，改變腫瘤的缺氧微環境，將乏氧腫瘤細胞轉變成為有氧 腫瘤細胞，可以實現增強的化療作用以及近紅外光介導下的、增強的光動力治療作用。腫瘤 微環境缺氧廣泛存在，而臨床上應用的光動力療法需要有氧的環境下才能發揮更理想的治 療效果，化療藥物的療效發揮也有賴于細胞有氧環境。
[0019] 本發明將Hb包于脂質體內，因脂質體不參與血型抗體反應，故可顯著延長其體內 循環時間，并能夠迅速完成氣體交換。此外，包裹血紅蛋白的脂質體屬于細胞型脂質體，不 僅無抗原性，而且其粒徑大小可以達到天然紅細胞體積的1~1/40倍，甚至可以通過天然紅 細胞無法到達的狹細血管。將Hb包載于脂質體內具有可降低無基質Hb輸入機體后產生的腎 毒性、避免Hb解聚、緩解交替滲透壓、有效延長循環時間等優點，同時脂質體中可以包載2， 3-DPG、天然紅細胞中的各種輔酶等，使其氧親和力和協同性與在紅細胞中的Hb基本保持一 致，并可以減少Hb的氧化，減少高鐵血紅蛋白的生成。氧飽和的Hb包裹在脂質體中，可以有 效的向腫瘤部位靶向遞送氧氣，增強腫瘤對光動力治療和化療的敏感性，達到更好的治療 效果，同時，抑制腫瘤生長和轉移。
[0020] 本發明創造性地將血紅蛋白和抗腫瘤藥物(光敏劑、化療藥物)包裹于脂質體中， 組合成具有光動力效應和/或化療效應的脂質體，同時借助產生的單線態氧對脂質膜的結 構破壞，具有光敏感性的藥物控制釋放，因此在有光敏劑包封的情況下，該脂質體具有光敏 脂質體特征。本發明提供的脂質體具有如下應用優勢：
[0021] (1)增強光動力效應。本發明攜氧載藥光敏脂質體可提供光動力作用所必須的氧， 在近紅外光的照射下，與光敏劑生成對腫瘤強毒性作用的單線態氧，在原有基礎上增強光 動力效應的作用效果，達到更好的抑制或殺死腫瘤細胞的目的。
[0022] (2)增強化療藥物作用效果。所述攜氧載藥光敏脂質體通過攜載氧到達腫瘤部位， 緩解腫瘤缺氧微環境，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，從而增強化療藥物在腫瘤部位 的作用。
[0023] (3)光敏性藥物控制釋放。所述攜氧載藥光敏脂質體靶向到達腫瘤部位，在近紅外 光照射下，利用所產生的單線態氧破壞脂質體膜結構，實現包封藥物的遠程控制釋放。
[0024] (4)改善腫瘤厭氧環境。所述攜氧載藥光敏脂質體將氧攜載并靶向遞送至腫瘤部 位，改善腫瘤缺氧微環境、降低缺氧微環境誘導的腫瘤發生、增值、轉移和侵襲，促進腫瘤的 治療效果。
[0025]本發明涉及的專業術語：
[0026] "ICG-0DA"表示吲哚菁綠-硬脂胺，一種吲哚菁綠的衍生物
[0027] "S100"表示精制大豆磷脂
[0028] "HSPC"表示氫化大豆磷脂
[0029] "E80"表示蛋黃卵磷脂
[0030] "DPPC"表示二棕櫚酰磷脂酰膽堿
[0031] "DSPE-PEG2000"表示二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 [0032] "Cholesterol" 表示膽固醇 [0033] "PBS"表示磷酸鹽緩沖液
[0034] "Hb"表示血紅蛋白
[0035] "NIR"表示近紅外光
【附圖說明】
[0036]圖1為缺氧條件下產生單線態氧的檢測。
[0037]圖2為缺氧條件下，光動力作用生成R0S的檢測。
[0038] 圖3為光敏脂質體和載氧光敏脂質體對腫瘤內HIF-la表達的免疫組化結果。
[0039] 圖4為載氧光敏脂質體的活體分布成像。
[0040] 圖5為不同制劑給藥后小鼠體重變化。
[0041 ]圖6為不同制劑給藥后小鼠瘤體積變化。
[0042]圖7為給藥13天后各臟器組織及腫瘤的HE染色切片結果。
[0043]圖8為給藥13天后各組腫瘤內Ki67表達結果。
[0044] 圖9為給藥13天后各組腫瘤內Tunel表達結果。 圖10是D0X的釋放曲線。
【具體實施方式】
[0045] 本發明結合實施例和附圖作進一步的說明。應當指出，對于本技術領域的普通技 術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也視為本發明的保護范圍。
[0046] 實施例1
[0047] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表1)。
[0048] 表 1
[0049]
[0050] 處方量的E80、Cholesterol、DSPE-PEG2000、ICG-0DA，置于茄型瓶中，加入有機溶 劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中加入 氧飽和的Hb、鹽酸阿霉素混合溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭 超聲將其超聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋白和阿 霉素。最終收集為攜氧載阿霉素光敏脂質體。
[0051 ] 實施例2
[0052] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表2)。
[0053] 表 2
[0054]
[0055] 處方量的E80、Cholesterol、DSPE-PEG2000、ICG-0DA，置于茄型瓶中，加入有機溶 劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中 加入氧飽和的Hb溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其超聲 至所需粒徑。將所得脂質溶液過S印hdex G100柱，除去游離的血紅蛋白。最終收集為攜氧光 敏脂質體。
[0056] 考察本發明制備的載氧光敏脂質體，通過提供氧、改善腫瘤缺氧微環境，達到增強 光動力治療和/或化療作用的效果。以實施例2的載氧光敏脂質體為例進行以下方面考察。 [0057] 1、單線態氧產生的檢測
[0058] 將單線態氧檢測探針S0SG稀釋為1.2yg/mL溶液，通Arl5min除盡溶液中溶解的氧 氣后密封于密閉容器中備用。分別將25yL氧氣飽和的PBS、空白脂質體、空白光敏脂質體和 載Hb的光敏脂質體注射入密封容器中，檢測近紅外照射前后的525nm處熒光吸收值。結果如 圖1，證明在缺氧狀態下，近紅外激光照射不能產生單線態氧，而載有Hb的光敏脂質體可有 效攜載氧氣，使光敏劑發揮光動力作用，產生大量單線態氧。
[0059] 2、活性氧(R0S)的檢測
[0060]將CT-26細胞以105個/ml，lmL/孔的濃度接種于24孔板中，并在低氧下培養(02濃度 <0.5 % )，待細胞貼壁后，在Ar保護下將無 Hb光敏脂質體和載Hb光敏脂質體分別加入24孔 板中，37°C下孵育4h后將上清液洗凈，加入R0S檢測探針DCFH-DA于24孔板中，再孵育30min， PBS洗三遍后，每孔照射近紅外激光（lW，lmin)，在熒光倒置顯微鏡下檢測熒光信號。結果如 圖2，充分證明缺氧條件下，無 Hb敏脂質體在近紅外激光照射后無法產生活性氧，而包載Hb 光敏脂質體經近紅外激光照射后可產生大量R0S。
[0061] 3、藥物體內分布實驗
[0062] ICR小鼠右腋皮下接種腹水150yL，獲得S180荷瘤小鼠模型。當腫瘤體積約為 150mm3，小鼠尾靜脈注射光敏脂質體。并在211、611、1211、2411、3611、4811拍攝活體熒光成像，結 果見圖3。分布結果顯示，載Hb的脂質體可以大量進入腫瘤，有很好的腫瘤靶向效果。
[0063] 4、藥效實驗
[0064]每只ICR小鼠右腋皮下接種腹水150ul，獲得S180荷瘤小鼠模型。當腫瘤體積約為 100mm3隨機分為生理鹽水+激光組、lip〇-ICG+激光組和lip〇-ICG-Hb+激光組。每組均在第 1，3,5天給藥或生理鹽水，并在2,4,6,天給與近紅外激光照射(2W，3min)結果見圖4和圖5。 小鼠體重無下降，藥物對小鼠無明顯毒副作用，載Hb組的抗腫瘤效果優于其他組，說明載有 Hb的脂質體有效為腫瘤提供氧氣，增強光動力治療作用。分別取每組1只小鼠，取其心、肝、 脾、肺、腎制作HE染色切片，取腫瘤制作HE、Tunel、Ki67染色切片。結果如圖6-圖8。說明攜氧 光敏脂質體對心、肝、脾、肺、腎等器官無毒性，并證實攜氧光敏脂質體抑制腫瘤增殖和促進 腫瘤凋亡效果優于未攜氧光敏脂質體。
[0065] 實施例3
[0066] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的應用，能攜載氧成份，改善腫 瘤缺氧微環境。
[0067]取三只ICR小鼠右腋皮下接種腹水150yL，獲得S180荷瘤小鼠模型。當腫瘤體積約 為150mm3隨機分為生理鹽水組、lipo-ICG(載ICG的脂質體)組和實施例2中脂質體(載ICG-0DA和Hb的脂質體)組，分別尾靜脈給藥三次，1次/天。三次給藥結束后，解剖腫瘤免疫組化 染色。結果如圖9,證實載Hb的脂質體可以有效降低腫瘤中低氧誘導因子HIF-1以的表達，這 說明說明實施例2脂質體可以向腫瘤攜載氧氣，緩解腫瘤缺氧狀態。
[0068] 實施例4
[0069] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的應用，在外界光介導下，實現 控制藥物的釋放。
[0070] 取適量實施例1脂質體溶液，用PBS稀釋至lmg/ml，分別取0.5ml放入透析袋 (MWC03500DA)中，以5ml PBS為釋放介質，置于在恒溫震蕩儀中。在2h時用近紅外激光儀 (800nm)照射脂質體溶液。在特定的時間點（0，1，2，4，6h)用熒光分光光度儀測定釋放介質 中阿霉素(D0X)的熒光值。繪制D0X的釋放曲線。結果見圖10,在近紅外光照后，D0X明顯從脂 質體中釋放加速，這說明該脂質體藥物實現了近紅外光的遠程控制釋放。
[0071] 實施例5
[0072] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表3)。
[0073] 表 3
[0074]
[0075] 處方量的E80、Cholesterol、DSPE-PEG1000、二氫卟吩e6，置于茄型瓶中，加入有機 溶劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶 中加入氧飽和的Hb溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其超 聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋白。最終收集為攜氧 光敏脂質體。
[0076] 實施例6
[0077] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表4)。
[0078] 表 4
[0079]
[0080] 處方量的S100、Cholesterol、DSPE-PEG3400、酞菁，置于茄型瓶中，加入有機溶劑， 使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中加入 氧飽和的Hb溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其超聲至所 需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋白。最終收集為攜氧光敏脂 質體。
[0081 ] 實施例7
[0082] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表5)。
[0083] 表 5
[0084]
[0085] 處方量的HSPC、Cholesterol、DSPE-PEG1000、菌綠素 a，置于茄型瓶中，加入有機溶 劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中 加入氧飽和的Hb溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其超聲 至所需粒徑。將所得脂質溶液過S印hdex G100柱，除去游離的血紅蛋白。最終收集為攜氧光 敏脂質體。
[0086] 實施例8
[0087] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表6)。
[0088] 表 6
[0089]
[0090] 處方量的DPPC、Cholesterol、DSPE-PEG2000、ICG-0DA，置于茄型瓶中，加入有機溶 劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中 加入氧飽和的Hb溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其超聲 至所需粒徑。將所得脂質溶液過S印hdex G100柱，除去游離的血紅蛋白。最終收集為攜氧光 敏脂質體。
[0091] 實施例9
[0092] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表7)。
[0093] 表 7
[0094]
[0095] 處方量的DPPC、Cholesterol、DSPE-PEG1000,置于茄型瓶中，加入有機溶劑，使其 充分溶解混勻，45 °C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中加入氧飽 和的Hb和鹽酸阿霉素混合溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲 將其超聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋白和藥物。最 終收集為攜氧載阿霉素脂質體。
[0096] 實施例10
[0097] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表8)。
[0098] 表 8
[0099]
[0100] 處方量的HSPC、Cholesterol、DSPE-PEG3400、多西他賽，置于茄型瓶中，加入有機 溶劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶 中加入氧飽和的Hb溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其超 聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋白。最終收集為攜氧 載多西他賽脂質體。
[0101] 實施例11
[0102] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表9)。
[0103] 表9
[0104]
[0105] 處方量的S100、Cholesterol、DSPE-PEG5000、喜樹堿，置于茄型瓶中，加入有機溶 劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中 加入氧飽和的Hb溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其超聲 至所需粒徑。將所得脂質溶液過S印hdex G100柱，除去游離的血紅蛋白。最終收集為攜氧載 喜樹堿脂質體。
[0106] 實施例12
[0107] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表10)。
[0108] 表10
[0109]
[0110] 處方量的E80、Cholesterol、DSPE-PEG2000,置于茄型瓶中，加入有機溶劑，使其充 分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中加入氧飽和 的Hb和長春新堿混合溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超聲將其 超聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的長春新堿和血紅蛋白。最 終收集為攜氧載長春新堿脂質體。
[0川]實施例13
[0112] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表11)。
[0113] 表11
[0114]
[0115] 處方量的DPPC、Cholesterol、DSPE-PEG3400、二氫卟吩e6，置于茄型瓶中，加入有 機溶劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型 瓶中加入氧飽和的Hb、柔紅霉素混合溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使 用探頭超聲將其超聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋 白和阿霉素。最終收集為攜氧載柔紅霉素光敏脂質體。
[0116] 實施例14
[0117] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表12)。
[0118] 表12
[0119]
[0120] 處方量的HSPC、Cholesterol、DSPE-PEG1000、二氫卟吩e6，置于茄型瓶中，加入有 機溶劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型 瓶中加入氧飽和的Hb、奧沙利鉑混合溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使 用探頭超聲將其超聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋 白和阿霉素。最終收集為攜氧載奧沙利鉑光敏脂質體。
[0121] 實施例15
[0122] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表13)。
[0123] 表13
[0124]
[0125] 處方量的E80、Cholesterol、DSPE-PEG5000、酞菁，置于茄型瓶中，加入有機溶劑， 使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中加入 氧飽和的Hb、長春新堿混合溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探頭超 聲將其超聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋白和阿霉 素。最終收集為攜氧載長春新堿光敏脂質體。
[0126] 實施例16
[0127] -種本發明提供的攜氧增強光動力的光敏脂質體的組成(見表14)。
[0128] 表14
[0129]
[0130] 處方量的S100、Cholesterol、DSPE-PEG2000、ICG-0DA，置于茄型瓶中，加入有機溶 劑，使其充分溶解混勻，45°C水浴真空減壓旋轉蒸發過夜，瓶壁形成均勻薄膜。向茄型瓶中 加入氧飽和的Hb、表阿霉素混合溶液，充分水化，薄膜脫落并形成多層脂質體溶液。使用探 頭超聲將其超聲至所需粒徑。將所得脂質溶液過Sephdex G100柱，除去游離的血紅蛋白和 阿霉素。最終收集為有攜氧載表阿霉素光敏脂質體。
[0131 ]本發明以血紅蛋白為載體，將氧運載到腫瘤部位，緩解腫瘤部位缺氧狀態，從而為 光動力作用提供充足的氧，提高腫瘤對光動力治療和化療的敏感性，增強光動力作用和化 療對腫瘤的治療效果。
[0132] 血紅蛋白（Hb)作為一種結合蛋白，具有尚效載氧功能，人體內的血紅蛋白每天能 把600余升來自空氣的氧攜帶到身體的各個部分，血液中大約有97 %的氧是通過血紅蛋白 運輸的。可見，血紅蛋白具有良好的載氧能力。但是天然無基質的Hb溶液不能直接作為氧載 體，因為：1)脫離紅細胞的Hb失去2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的調節，氧親和能力升高，不 能向組織有效供氧。2)Hb在血漿中膠體滲透壓高，并在各種酶的作用下迅速解聚為αβ二聚 體。從腎濾過而產生強烈腎毒性。
[0133] 本發明的通過攜載氧到達腫瘤部位以增強光動力治療和化療效果的脂質體，將氧 攜載到腫瘤部位，使光敏劑和氧結合，在光照射下，破壞脂質體雙層膜的結構，使藥物迅速 釋放出來，從而提高藥物在腫瘤部位的局部濃度，降低抗腫瘤藥物對內皮網狀系統及正常 組織的毒性。
【主權項】
1. 一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述光敏脂質體由磷脂、膽固醇、 長循環材料和血紅蛋白，以及化療藥物和/或光敏劑組成，其摩爾比為10:1~5:0.1~0.8: 0 · 01 ~1:0 · 5~2〇2. 根據權利要求1所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述脂質體 平均粒徑為50-500nm。3. 根據權利要求1或2所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述脂 質體平均粒徑為100-250nm。4. 根據權利要求1所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述磷脂選 自大豆磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、腦磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、神經 鞘磷脂、鞘髓磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲胺酸和硬脂酰胺中的一種。5. 根據權利要求1所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述長循環 材料為聚乙二醇衍生化磷脂，選自DSPE-PEG1000，DSPE-PEG2000，DSPE-PEG3400，DSPE-PEG5000，DSPE-PEG 10000 中的一種。6. 根據權利要求1所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述血紅蛋 白選自人血紅蛋白或牛血紅蛋白，并經氧飽和成為攜載氧的氧合血紅蛋白，每l〇〇mg脂材 中，加入10~500mg血紅蛋白。7. 根據權利要求1所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述光敏劑 選自吲哚菁綠衍生物、二氫卟吩e6、酞菁、菌綠素 a中的一種。8. 根據權利要求1所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體，其特征在于，所述的化療 藥物選自阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、吡柔比星、氨甲喋呤、長春新堿、異長春花堿、順鉑、 卡鉑、奧沙利鉑、環磷酰胺、紫杉醇、多西他賽、喜樹堿、吉西他濱、卡培他濱、利妥昔單抗等 抗腫瘤藥物中的一種。9. 一種攜氧增強光動力的光敏脂質體的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實現： (1) 將磷脂，膽固醇，長循環材料，光敏劑和/或化療藥物，按摩爾比10:1~5:0.1~0.8: 0.5~2溶解于有機溶劑中，減壓旋蒸發除去有機溶劑，形成薄膜，有機溶劑選用三氯甲烷和 二氯甲烷的一種或兩種混合溶劑； (2) 向薄膜中加入氧合血紅蛋白溶液，或光敏劑和/或化療藥物與氧合血紅蛋白的混合 溶液，5~40°C水合1~2小時，得到多層脂質體溶液;每100mg脂材中，加入5~200mg血紅蛋 白；其中磷脂:光敏劑和/或化療藥物:血紅蛋白=10: 〇. 5~2:0.01~1; (3) 該脂質體溶液經過超聲處理，過柱或超濾純化，得載藥的目的光敏脂質體。10. 根據權利要求1所述的一種攜氧增強光動力的光敏脂質體在制備攜氧載藥脂質體 中的應用。
【文檔編號】A61K31/475GK105997877SQ201610390647
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】游劍, 曲佳鑫
【申請人】浙江大學