一種靈芝多糖脂質立方液晶及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明公開了一種靈芝多糖脂質立方液晶的制備方法，它是以雙蒸水為分散介質，采用前體?注入法制備得到。本發明還公開了制備得到的靈芝多糖脂質立方液晶在制備提高機體免疫力的藥物中的應用。與現有技術相比，本發明方法的包封率高，制備所得產品穩定性較好且免疫增強活性強，顯著提高了靈芝多糖的免疫增強活性。
【專利說明】
一種靈芝多糖脂質立方液晶及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發明屬于中獸藥領域，具體涉及一種靈芝多糖脂質立方液晶及其制備方法與應 用。
【背景技術】
[0002] 動物疫病主要靠疫苗來預防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱等缺點，需要免疫 增強劑輔助才能產生強大的免疫應答。現有的常用免疫增強劑如油佐劑、鋁膠佐劑等常存 在刺激性強、有殘留等缺點。由于中藥具有綠色安全的特點，從中藥中開發免疫增強劑已成 為熱點。
[0003] 靈芝多糖是靈芝中具有免疫增強活性的主要成分，靈芝多糖不僅具有提供糖原能 量，構成機體結構物質，而且在體內安全，組織相容性好，具有開發成佐劑的良好基礎。靈芝 多糖由很多單體組成，如D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等 單體是他的主要組成部分。靈芝多糖具有提高機體體液和免疫細胞免疫的功能同時也可以 激活機體補體系統，誘導抗原特異性CD4+、CD8+記憶性T細胞反應，提高I gG、細胞因子的水 平。但是多糖存在不穩定、容易發生聚集、體內代謝快、生物利用度低、用藥量大導致成本較 高，嚴重的限制了靈芝多糖在疫苗佐劑領域的使用。為了更好地開發利用靈芝多糖的藥理 作用，對靈芝多糖新劑型的研究逐漸成為熱點。
[0004] 脂質立方液晶納米粒是一定濃度的兩親性脂質分散在水溶液中自組裝成含雙連 續水區和脂質區的閉合脂質雙層"蜂窩狀(海綿狀)"結構，該獨特的內部雙水道結構和巨大 膜表面積(400m 2/g)使其能夠包封各種不同極性和劑量的藥物，具有多樣化的藥物包裹性。 如水溶性藥物可以包封在水道中，脂溶性藥物可以包裹在脂質雙分子層膜中。脂質立方液 晶納米粒具有良好的溫度穩定性、內表面積高及類似凝膠的黏度等獨特優點，具有很多應 用功能，如保護藥物活性、控制藥物釋放、靶向給藥以及阻止藥物分子間發生聚集和化學反 應等。同脂質體相比，脂質立方晶體納米粒不但具有普通脂質體的優越特性，如組織相容 性、靶向性、保護性、雙親性、緩釋性等，還具有其自身特殊的優點:①穩定性好，脂質立方液 晶是立體多層結構，類似多囊泡脂質體，可提高包封率和制得具有較高穩定性的制劑。②在 粒子體積等同時，脂質立方液晶納米粒較脂質體有更大的雙分子層面積，故具有對親脂性 和兩親性藥物相對更高的載藥量。③脂質立方液晶納米粒可以無限稀釋，稀釋穩定性好，而 脂質體稀釋后，藥物滲漏會顯著增加。因此脂質立方液晶納米粒在穩定性、載藥性能等方面 有較大的優勢。④相對于其他種類的佐劑，脂質立方液晶在較低的濃度即可明顯的產生佐 劑效應，并且脂質立方液晶對體液免疫與細胞免疫均有明顯的增強作用。
[0005] 本發明首次利用前體-注入法制備靈芝多糖脂質立方液晶混懸液，并對其制備工 藝進行優化比較，并將其和動物滅活PCV-2病毒一起應用免疫，建立了靈芝多糖脂質立方液 晶的制備方法，優化了制備條件，發現靈芝多糖脂質立方液晶能顯著提高靈芝多糖的免疫 增強作用，提高其生物利用度。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種靈芝多糖脂質立方液晶，以解決現有技術存 在的靈芝多糖不穩定、容易發生聚集、體內代謝快、生物利用度低和用藥量大等問題。
[0007] 本發明還要解決的技術問題是提供上述靈芝多糖脂質立方液晶的制備方法。
[0008] 本發明最后要解決的技術問題是提供上述靈芝多糖脂質立方液晶的應用。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0010] -種靈芝多糖脂質立方液晶的制備方法，它包括如下步驟：
[0011] (1)取植烷三醇和丙二醇溶于乙醇中備用；
[0012] (2)取ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物和靈芝多糖溶于水中備用；
[0013] (3)將步驟（1)中所得的混合體系滴加至步驟(2)中所得的混合體系中并攪拌，旋 轉蒸發除去乙醇后，經超聲處理得到靈芝多糖脂質立方液晶混懸液(Cub-PS)。
[0014] 步驟(1)中，所述的乙醇為無水乙醇。
[0015] 步驟(1)中，植烷三醇和丙二醇的質量比為1~2:1;優選質量比為4:3。
[0016] 步驟（1)中，植烷三醇和乙醇的固液比為30~100mg: lmL，優選50mg: lmL。
[0017] 步驟(2)中，所述的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物優選F127。
[0018]步驟(2)中，所述的水優選雙蒸水。
[0019] 步驟(2)中，ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物和靈芝多糖的質量比為1~2:1~2;優選用 量比為1:1。
[0020] 步驟(2)中，ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物和水的質量比為1:50~200。
[0021] 步驟(3)中，步驟(1)所得的混合體系和步驟(2)所得的混合體系的體積比為1:4~ 10。
[0022] 其中，所述的滴加，所述的滴加，滴加流速為1~2mL/min。
[0023] 步驟(3)中，攪拌方法為室溫下300~800r/min攪拌lh;其中，滴加開始時就開始攪 拌。
[0024]步驟(3)中，旋轉蒸發的溫度為40~70°C。
[0025] 步驟(3)中，超聲處理的方法為:使用細胞超聲粉碎儀，在300W功率下超聲20~30 次，每次3~5min，兩次超聲間隔2~5s。
[0026] 上述任意一項制備得到的靈芝多糖脂質立方液晶也在本發明的保護范圍之內。
[0027] 上述的靈芝多糖脂質立方液晶在制備提高機體免疫力的藥物中的應用。
[0028]上述的靈芝多糖脂質立方液晶能夠顯著提高豬圓環病毒(PCV-2滅活病毒）的特異 性抗體水平、不同亞型抗體的含量和細胞因子含量，且能夠促進抗原轉運到附近淋巴結，同 時提高淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例，促進記憶細胞的分化，具有較好的免疫增強功能。 [0029] 有益效果：
[0030] 與現有技術相比，本發明具有如下優勢：
[0031] 1、靈芝多糖脂質立方液晶的制備國內外未見報道，本發明提供了一種靈芝多糖脂 質立方液晶的制備方法及其優化的條件，填補了國內外研究的空白；且本發明方法操作簡 單，易于推廣。
[0032] 2、靈芝多糖脂質立方液晶的免疫增強活性未見報道。通過本發明的實施，證明靈 芝多糖通過制備成靈芝多糖脂質立方液晶后能夠顯著提高其免疫增強活性，表現為提高小 鼠血清PCV-2特異性IgG抗體效價、不同亞型抗體水平和細胞因子含量，同時發現靈芝多糖 脂質立方液晶能夠促進抗原轉運到附近淋巴結，同時提高淋巴結中成熟樹突狀細胞的比 例，與靈芝多糖相比，能夠誘導機體記憶細胞的分化，從而長時間增強動物免疫功能。因此， 靈芝多糖脂質立方液晶可以作為研制新型免疫增強劑的材料，為研制新型免疫增強劑提供 了材料和示范。
[0033] 3、本發明方法制備得到的靈芝多糖脂質立方液晶，利用馬爾文粒度分析儀對靈芝 多糖脂質立方液晶的粒徑、多分散系數(PDI)及表面電勢進行了分析，并通過冷凍掃描電鏡 和小角度X射線散射試驗(SAXS)對靈芝多糖脂質立方液晶的內部結構進行了研究，發現靈 芝多糖脂質立方液晶呈均一的納米分散體系。
[0034] 4、本發明采用前體-注入法將靈芝多糖制備成靈芝多糖脂質立方液晶，所得立方 液晶包封率高（平均包封率為89.5 ± 3.51 % )，不僅可以解決靈芝多糖成分易氧化、不易制 劑等問題，而且便于藥物的吸收，可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長藥效，能顯著提高 動物免疫功能，對抵抗疫病有重要意義。同時，本發明作為一種新型中獸藥，沒有副作用。
【附圖說明】
[0035] 圖1為實施例1中靈芝多糖脂質立方液晶的冷凍掃描電鏡圖；
[0036]圖2A為實施例1中靈芝多糖脂質立方液晶的粒徑圖；
[0037]圖2B為實施例1中靈芝多糖脂質立方液晶的SAXS分析圖；
[0038]圖3A為實施例2中不同劑量的靈芝多糖脂質立方液晶對血清抗體水平的影響示意 圖；
[0039]圖3B為實施例2中各對照組對血清抗體水平的影響示意圖；
[0040]圖3C為實施例2中各對照組的IgGl和IgG2a抗體水平示意圖；
[00411圖3D為為實施例2中各對照組的IgG2b和IgG3抗體水平示意圖；
[0042]圖4A為實施例2中各對照組中血清中細胞因子IL-4的變化示意圖；
[0043]圖4B為實施例2中各對照組中血清中細胞因子IL-12p70的變化示意圖；
[0044]圖4C為實施例2中各對照組中血清中細胞因子IFN- γ的變化示意圖；
[0045] 圖4D為實施例2中各對照組中血清中細胞因子TNF-α的變化示意圖；
[0046] 圖4E為實施例2中各對照組中血清中細胞因子IL-17的變化示意圖；
[0047]圖5A為實施例2中首免24h之后，各對照組淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例示意 圖；
[0048]圖5B為實施例2中首免48h之后，各對照組淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例示意 圖；
[0049] 圖6為實施例2中各對照組對小鼠淋巴結中抗原轉運的影響示意圖；
[0050] 圖7為實施例2中各對照組對小鼠淋巴結中記憶細胞的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0051] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0052]實施例1靈芝多糖脂質立方液晶的制備
[0053] (1)方法的篩選
[0054]方法l"Buk"相自發乳化法：
[0055] 稱取0 . lg植烷三醇、0.0 lg F127，丙二醇0.075g置于20ml西林瓶中，加入10mL氯 仿，超聲使其充分溶解。置于50mL旋蒸瓶中，45 °C減壓蒸發除去有機溶劑，當圓底燒瓶中溶 液無明顯減少時時，導入10uL含10mg靈芝多糖的水溶液，超聲使其充分混勻，之后將其分散 至5mL雙蒸水中，攪拌5~lOmin，即的靈芝多糖脂質立方液晶混懸液，置于4°C保存。
[0056]方法2前體-注入法：
[0057] 稱取脂質材料植烷三醇O.lg與丙二醇0.075g，于20ml西林瓶中，再加入無水乙醇 1.5ml，超聲處理20min，使其充分溶解，作為A相;稱取F127 10mg和靈芝多糖10mg于100ml燒 杯中，加入20ml雙蒸水，于水浴60 °C上加熱使溶解，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，以 500r/min室溫下攪拌lh，旋轉蒸發以充分除去乙醇，再于細胞超聲粉碎儀上300W冰浴超聲 處理5min，超聲30次（問隔5s)，即得大小均一的靈芝多糖脂質立方液晶混懸液(Cub-PS)。
[0058] 上述兩種方法制備得到的Cub-PS的包封率見表1。
[0059] 表1兩種不同方法制備Cub-PS包封率
[0060]
[0061]根據表1的結果分析，利用前體-注入法制備的靈芝多糖立方液晶表現出了更高的 包封率，因此后續實驗選用前體-注入法來制備靈芝多糖脂質立方液晶。
[0062] (2)分散介質的選擇
[0063]制備脂質立方液晶的過程中，分散介質的種類對脂質立方液晶的成型、包封率和 穩定性有明顯的影響。故本文比較分析了蒸餾水、雙蒸水和磷酸鹽緩沖液(PBS)三種分散介 質對靈芝多糖脂質立方液晶的包封率和穩定性的影響作用。
[0064]表2不同分散介質的處方組成
[0065]
[0066] 將按照上述處方制備的靈芝多糖脂質立方液晶放置于4°C保存，每天觀察樣品的 團聚情況，結果見表3。
[0067] 表3不同分散介質對芝多糖脂質立方液晶的影響
[0068]
[0069] 由表3的實驗結果可以分析得出選用雙蒸水作為分散介質能夠獲得更好的包封 率，并且穩定性顯著高于PBS和去離子水組。
[0070] (3)粒徑電位檢測及冷凍掃描電鏡觀察
[0071] 用雙蒸水將Cub-PS(靈芝多糖脂質立方液晶）稀釋到一定濃度，于冷凍臺制備樣 品，透射電鏡下觀察Cub-PS(脂質立方液晶）的形態并拍攝照片（圖1)。利用馬爾文粒度分析 儀測定Cub-PS的粒徑分布及表面電位(圖2)。
[0072]
[0073] 注:Cub:空白脂質立方液晶Cub-PS:靈芝多糖脂質立方液晶
[0074] 由掃描電鏡圖片可知，靈芝多糖立方液晶納米粒在水中分散較好，且粒徑大小差 異較小，外觀呈立方狀態;從粒徑大小分析可知立方液晶包封靈芝多糖之后粒徑出現了稍 微的增大（圖2A)，同時SAXS顯示各散射峰對應的散射矢量的比為: : Vi (圖2B)，表明 其為Pn3m晶型結構，Cub與Cub-PS的表面電位分別為-14.33 ± 0.75和-16.13 ±0.42。電鏡及 粒徑、電勢分析表明靈芝多糖脂質立方液晶立方液晶具有優良的物理化學性質。實施例2靈 芝多糖脂質立方液晶免疫增強活性比較
[0075] 以實施例1中制備得到的靈芝多糖脂質立方液晶（Cub-PS)為研究對象，以靈芝多 糖(PS)和空白脂質立方液晶（Cub)作為對照，ISA206佐劑作為陽性對照，測定了它們對豬圓 環病毒(PCV-2)滅活病毒免疫后機體IgG抗體水平、抗體亞型、淋巴結樹突狀細胞的活化、淋 巴結中PCV-2抗原及細胞因子IFN-γ、了陬-€[、幾-12?70、11^-4和11^-17含量的影響。
[0076] (1)動物分組及處理
[0077] 60只6-8周齡的Blab/c小鼠隨機均分為5組，分別為靈芝多糖脂質立方液晶組 (Cub-PS-Ag)、靈芝多糖組（PS-Ag)、靈芝多糖脂質立方液晶組（Cub-Ag)、陽性對照組 (ISA206)和PBS對照組(PBS)。皮下免疫小鼠2次，每次免疫間隔1周。分別于首免后7、14、21 天檢測機體IgG抗體水平、抗體亞型、淋巴結樹突狀細胞的活化、淋巴結中PCV-2抗原及血清 中細胞因子IFN-γ、了陬-€[、幾-12口70、幾-4和幾-17含量變化。
[0078] (2)靈芝多糖脂質立方液晶對抗體水平及抗體亞型水平的影響
[0079] 通過對比3中不同劑量的靈芝多糖脂質立方液晶（Cub-PSdXCub-PSdXCub-pS)，發現低劑量組 (Cub-PS) 產生了最高的抗體水平 （圖 3A)， 因此，后續試驗對低劑量的靈 芝多糖脂質立方液晶組進行了著重的免疫分析。首免后第7天，各組之間的抗體水平并沒有 明顯的差異;然而在首免后第14、21天，(]1113-?3-48組的抗體水平顯著高于?3-48組和(]1113-八區 組(P〈0·05)(圖3B);另外，在首免后第21天Cub-PS-Ag組的IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3是所有 組中最高的，且顯著高于其他各組(P〈〇. 05)(圖3C和D)。
[0080] 注:*ρ<0· 05表示Cub-PS-Ag組與PS-Ag組對比，#ρ<0· 05表示Cub-PS-Ag組與Cub-Ag組對比。
[0081 ] (3)靈芝多糖脂質立方液晶對血清中細胞因子的影響
[0082] 首免后第7天至21天，Cub-PS-Ag組的IL-4濃度是最高的，顯著高于PS-Ag組和Cub- Ag組(P〈0.05)(圖4A);首免后第7天至21天，Cub-PS-Ag組IFN- γ的濃度是最高的，且顯著高 于卩3-六8組和(：1*48組(？〈0.05)，同時在第14、21天，(：1113-?348組正1丫的濃度已經高于陽 性對照組（圖4C);首免后第7天至21天，Cub-PS-Ag組TNF-α和IL-17的濃度均顯著高于PS-Ag 組和Cub-Ag組。
[0083] 注:*ρ<〇·05表示Cub-PS-Ag組與PS-Ag組對比，#ρ<0·05表示Cub-PS-Ag組與Cub-Ag 組對比。
[0084] (3)靈芝多糖脂質立方液晶對小鼠淋巴結中成熟樹突狀細胞比例的影響
[0085] 作為最主要初級免疫反應場所的淋巴結在疫苗免疫過程中發揮著及其重要的作 用。抗原在注射進動物機體后，其迀移至淋巴結的效率與誘導機體產生有效的免疫反應息 息相關。有效的疫苗遞載系統類佐劑能夠明顯的提高抗原遞呈細胞攝取抗原、運載抗原至 淋巴結及遞呈抗原到T淋巴細胞。首免后的24h、48h，PS-Ag組和Cub-Ag組顯著地促進了小鼠 淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例，Cub-PS-Ag組淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例顯著高于 PS-Ag組和Cub-Ag組（圖5 )，表明了PS-Ag組和Cub-Ag組能有有效的促進成熟樹突狀細胞的 歸巢從而更加有效的將抗原遞呈給淋巴細胞，進一步引起強烈的免疫反應。
[0086] 首免后的第七天，Cub-PS-Ag組小鼠淋巴結中的抗原明顯的多于PS-Ag組和Cub-Ag 組，表明Cub-PS-Ag組能夠產生一個持續的抗原釋放，從而不斷刺激機體的免疫系統，從而 增強機體的免疫應答。
[0087]圖6表明首免后的第7天，Cub-PS-Ag組小鼠淋巴結中分化的中心記憶細胞和效應 記憶細胞的比例均顯著高于PS-Ag組和Cub-Ag組，表明了Cub-PS-Ag組在引起長效的免疫應 答方面比PS-Ag組和Cub-Ag組具有更大的潛力。
[0088]根據上述動物試驗結果可以得出靈芝多糖脂質立方液晶可以提高小鼠機體IgG抗 體水平、不同亞型抗體含量、淋巴結樹突狀細胞的活化、淋巴結中PCV-2抗原及細胞因子 IFN-γ、TNF-a、IL-4和IL-17含量，從而提高機體免疫功能，說明本發明涉及的靈芝多糖脂 質立方液晶可用于提高動物機體免疫功能以達到抵抗疾病的目的。
【主權項】
1. 一種靈芝多糖脂質立方液晶的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟： (1) 取植烷三醇和丙二醇溶于乙醇中備用； (2) 取PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物和靈芝多糖溶于水中備用； (3) 將步驟（1)所得的混合體系滴加至步驟(2)所得的混合體系中并攪拌，旋轉蒸發除 去乙醇后，經超聲處理得到靈芝多糖脂質立方液晶混懸液。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，植烷三醇和丙二醇的質量 比為1~2:1，植烷三醇和乙醇的固液比為30~100mg:lmL;其中，所述的乙醇為無水乙醇。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，PEO-PPO-PEO三嵌段共聚 物和靈芝多糖的質量比為1~2:1~2，PE0-PP0-PE0三嵌段共聚物和水的質量比為1:50~ 200 〇4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，步驟（1)所得的混合體系 和步驟(2)所得的混合體系的體積比為1:4~10。5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的滴加，滴加流速為1~2mL/min。6. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，攪拌方法為室溫下300~ 800r/min 攬摔 lh。7. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，超聲處理的方法為:使用 細胞超聲粉碎儀，在300W功率下超聲20~30次，每次3~5min，兩次超聲間隔2~5s。8. 權利要求1~7中任意一項制備得到的靈芝多糖脂質立方液晶。9. 權利要求8中所述的靈芝多糖脂質立方液晶在制備提高機體免疫力的藥物中的應 用。
【文檔編號】A61P37/04GK105997865SQ201610328083
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】王德云, 劉振廣, 伯若楠, 胡元亮, 劉家國, 武毅
【申請人】南京農業大學