液體穩定的家禽病毒疫苗的制作方法

液體穩定的家禽病毒疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明涉及包含禽類病毒的液體穩定的家禽疫苗。本發明還涉及這樣的疫苗的制造和用這些疫苗接種動物主體的方法。
【專利說明】液體穩定的家禽病毒疫苗
[0001] 相關申請的交叉引用 本申請根據35 U.S.C. § 119(e)要求2014年2月17日提交的臨時申請美國序列號61/ 940,627的優先權，其內容在此處以其整體通過引用并入。 發明領域
[0002] 本發明涉及包含活禽類病毒的液體穩定的家禽疫苗。本發明還涉及這樣的疫苗的 制造和接種動物主體的方法。
[0003] 背景 存在大量可以感染家禽的病毒。這樣的病毒包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法 氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性喉氣管炎（ILTV)、馬立克氏病病毒(MDV)、火 雞皰疹病毒(HVT)(其也被稱為MDV3)和禽偏肺病毒(aMPV)。還存在許多可以感染家禽的細 菌，包括多殺巴斯德氏菌(Pasiet/reDa皿/_/iocic/a)、沙門氏菌屬種（^almoeDa SSjO.)、大 腸桿菌、支原體屬種(ifyc〇j〇_/as?a SSjO.)、副雞禽桿菌(driAacieri? paragaDifiarar腫）、 丹毒菌屬種(iiiysipeias sSj?.)、彎曲桿菌屬種（CafflAf_/o/7acier sSj?.)、弧菌屬種（Ki/^rio SSjO.)和產氣莢膜梭菌（C7osirit/iu? joer/ri/^aos)。寄生蟲，諸如艾美球蟲，也 可以感染家禽。
[0004] 目前廣泛接受的是，預防由于家禽中的細菌、寄生蟲或病毒感染導致的疾病的最 佳方式是針對這些生物體接種它們。此外，可以安全地施用多價活的減毒病毒或細菌疫苗， 其限制需要的疫苗注射次數。因此，存在許多商業可得的多價活病毒疫苗，其防御多種病原 體。然而，迄今為止，當儲存于液體溶液中時，活的減毒禽類病毒一直不穩定。因此，在其長 期儲存前，大多數活的減毒禽類病毒疫苗是凍干的，即冷凍干燥的或冷凍的。活的減毒禽類 病毒通常作為在水中的懸浮液與保護劑混合，冷凍，并且然后通過在凍干過程期間的升華 和二次干燥脫水。冷凍和通過升華干燥的低溫連同所涉及的低表面與體積比可需要長干燥 時間段，并且由此顯著增加制造時間和成本。
[0005] 此外，在大型商業干燥過程中存在固有矛盾，這是由于:不能跨越整個產物負荷調 整儲存溫度，跨越干燥器的可變冷凍速度，邊緣效應和輻射能效應。提高干燥溫度以減少干 燥時間通常不是選項，因為干燥溫度必須保持顯著低于保護性蛋白基質的玻璃轉化溫度。 而且，長的不一致的干燥時間和/或高干燥溫度通常導致對活的減毒病毒的結構性損傷，連 同其生物活性的顯著喪失。
[0006] 因此，為了補償功效的固有喪失，包含活的減毒病毒的凍干的家禽疫苗以增強的 滴度儲存。然而，如果凍干過程實際上導致的活性喪失比預料的更少，這樣的增加的滴度可 以導致顯著的不利事件。因此，需要非常小心地配制疫苗，以使含有的病毒滴度不僅安全地 低于導致不利事件的量，而且鑒于由于凍干和后續儲存的病毒滴度喪失而維持足夠功效。 [0007]此外，存在對凍干小瓶的大小和/或這樣的小瓶內含有的劑量數目的限制，這是由 于這些小瓶的頂部的標準塞子大小相對小。因此，大量液體變得難以通過相對小的開口升 華。因此，需要新的活的減毒禽類病毒疫苗，其可以使其病毒滴度可靠地保持在安全和有效 水平。
[0008] 此外，可用于大多數家禽疫苗的最小小瓶大小為1000個劑量。凍干疫苗的小瓶必 須在冷凍干燥餅的再水化之后以其整體使用。這對于必須購買大劑量大小來接種僅少量禽 類的越來越多的小家禽養殖戶而言變得困難。因此需要其中可以經多天、多周或者甚至多 個月使用單一小瓶的家禽疫苗，由此降低成本且鼓勵接種較小禽群(smaller flocks)。
[0009] 最終，可以用多達25,000個劑量/小瓶包裝禽類疫苗，其隨后由用戶混合并置于飲 用水中或噴霧在禽群上。這要求用戶去除金屬密封環和塞子，通過將小瓶浸沒于大桶水中、 然后將溶液用大攪拌器或槳葉混合而沖出凍干疫苗。這對于用戶或疫苗旨在用于的家禽物 種都不衛生。事實上，處理凍干小瓶在疫苗受體(例如，禽類)居住的商業環境中是特別令人 煩惱的。
[0010] 本文任何參考文獻的引用不應解釋為承認此參考文獻可用作本申請的"現有技 術"。
[0011] 發明概述 為了克服現有疫苗的缺陷，本發明提供新穎的液體穩定的活家禽病毒疫苗以及其相應 的免疫原性組合物。本發明的液體穩定的活家禽病毒疫苗可以持續長時間諸如6、7、9個月 或更長(例如，約1直至3年)保持有效。本發明還提供了將這樣的疫苗施用于禽類的方法。本 發明進一步提供了通過施用本發明的疫苗來預防動物(例如，禽類)中的疾病的方法。
[0012] 因此，本發明提供了包含活病毒的液體穩定的疫苗，包括多價疫苗。在某些實施方 案中，所述活病毒是減毒病毒。在其他實施方案中，所述活病毒是重組病毒。在具體實施方 案中，所述活病毒是既減毒、又重組的。本發明的重組病毒還可以編碼異源蛋白。在該類型 的具體實施方案中，所述異源蛋白是病毒或細菌抗原。
[0013] 在具體實施方案中，所述疫苗包含作為糖醇的糖添加劑和/或氨基酸。在某些實施 方案中，所述疫苗包含5至40% (w/v)的糖醇。在具體實施方案中，所述疫苗包含10至30% (w/v)的糖醇。在具體實施方案中，所述疫苗包含15至25% (w/v)的糖醇。在相關實施方案 中，所述疫苗包含10至20% (w/v)的糖醇。在其他實施方案中，所述疫苗包含20至25% (w/v) 的糖醇。在還有其他實施方案中，所述疫苗包含25至40% (w/v)的糖醇。在更具體實施方案 中，所述疫苗包含12至18% (w/v)的糖醇。在甚至更具體實施方案中，所述疫苗包含約15% (w/v)的糖醇。在相關實施方案中，所述疫苗包含約23% (w/v)的糖醇。在某些實施方案中， 本發明的液體穩定的病毒疫苗包含兩種或更多種糖醇，其中液體穩定的疫苗中的糖醇的總 量為5-40% (w/v)。在其他這樣的實施方案中，本發明的液體穩定的病毒疫苗包含兩種或更 多種糖醇，其中液體穩定的疫苗中的糖醇的總量為25-40% (w/v)。
[0014] 在本發明的液體穩定的病毒疫苗的具體實施方案中，所述糖醇是山梨糖醇。在該 類型的一個替代實施方案中，所述糖添加劑是甘露醇。在相關實施方案中，所述液體穩定的 疫苗進一步包含作為非糖醇的糖添加劑，其中液體穩定的疫苗中的糖醇和非糖醇的總量為 15-40% (w/v)。在其他實施方案中，所述液體穩定的疫苗進一步包含作為非糖醇的糖添加 劑，其中液體穩定的疫苗中的糖醇和非糖醇的總量為25-40% (w/v)。在具體實施方案中，所 述非糖醇、糖添加劑是海藻糖。在還有其他實施方案中，所述非糖醇、糖添加劑是右旋糖。在 還有其他實施方案中，所述非糖醇、糖添加劑是蔗糖。在該類型的一個具體實施方案中，所 述糖添加劑是蔗糖（非糖醇）和山梨糖醇（糖醇）的組合。在該類型的一個更具體實施方案 中，所述糖添加劑是10-25%山梨糖醇和5-20%蔗糖的組合。在該類型的其他實施方案中， 所述糖添加劑是15-30%山梨糖醇和10-25%蔗糖的組合。在該類型的一個仍更具體實施方案 中，所述糖添加劑是15 %山梨糖醇和10 %蔗糖的組合。在具體實施方案中，所述非糖醇、糖 添加劑實際上是兩種或更多種非糖醇、糖添加劑的組合。
[0015] 本發明的液體穩定的疫苗的pH范圍可以為pH 6.0至pH 8.0。在某些實施方案中， pH范圍為pH 6.5至pH 7.8。在具體實施方案中，pH范圍為pH 6.8至pH 7.5。在其他具體實施 方案中，pH范圍為pH 6.6至pH 7.4。在更具體實施方案中，pH范圍為pH 7.0至pH 7.4。在一 個甚至更具體實施方案中，pH為7.2。
[0016] 本發明的液體穩定的疫苗可以包含緩沖液。在該類型的一個具體實施方案中，所 述緩沖液包含2.5至50 mM磷酸鹽，例如磷酸鈉(NaPHOS)或磷酸鉀(KPHOS)。在一個相關實施 方案中，所述緩沖液包含5至25 mM磷酸鹽。在具體實施方案中，所述緩沖液包含10至20 mM 磷酸鹽。
[0017] 在還有其他實施方案中，所述緩沖液（即，緩沖溶液)可以進一步包含0.15至0.75 M精氨酸。在具體實施方案中，所述緩沖液包含2.5至50 mM磷酸鹽和0.15至0.75 M精氨酸。 在更具體實施方案中，所述緩沖液包含5至25 mM磷酸鹽和0.15至0.75 M精氨酸。在仍更具 體實施方案中，所述緩沖液包含10至20 mM磷酸鹽和0.3至0.5 M精氨酸。在其他實施方案 中，所述緩沖液包含2.5至50 mM磷酸鹽。在一個相關實施方案中，所述緩沖液包含5至25 mM Tris。在具體實施方案中，所述緩沖液包含10至20 mM Tris。在相關實施方案中，Tris緩沖 液包含組氨酸。
[0018] 本發明的液體穩定的疫苗可以包含氨基酸。在如上面詳述的某些實施方案中，所 述氨基酸是精氨酸。在其他實施方案中，所述氨基酸是甲硫氨酸。在還有其他實施方案中， 所述氨基酸是甘氨酸。在還有其他實施方案中，所述氨基酸是谷氨酸。在相關實施方案中， 所述液體穩定的疫苗包含精氨酸和甲硫氨酸兩者。在其他實施方案中，所述液體穩定的疫 苗包含精氨酸和甘氨酸兩者。在還有其他實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含甘氨酸和 甲硫氨酸兩者。在相關實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含谷氨酸和甲硫氨酸兩者。在其 他實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含谷氨酸和甘氨酸兩者。在還有其他實施方案中，所 述液體穩定的疫苗包含谷氨酸和精氨酸兩者。
[0019] 在相關實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在其他 實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甘氨酸。在還有其他實施方案中， 所述液體穩定的疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在還有其他實施方案中，所述液體穩 定的疫苗包含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在還有其他實施方案中，所述液體穩定的疫苗包 含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含精氨酸、甘氨 酸、甲硫氨酸和谷氨酸。
[0020] 在具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最終濃 度為0.15至0.75 M。在相關實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨 酸的最終濃度為0.25至0.75 M。在更具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸或 谷氨酸或甘氨酸的最終濃度為〇. 2至0.6 M。在更具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中 的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最終濃度為〇. 2至0.5 M。在還有其他實施方案中，所述液體 穩定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最終濃度為〇. 25至0.45 M。在甚至更具體實施 方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最終濃度為約0.45 Μ。在其 他具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最終濃度為約 0.3 M0
[0021]在具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸連同谷氨酸和/或甘氨酸的 最終組合濃度為0.15至0.75 M。在相關實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸連同 谷氨酸和/或甘氨酸的最終濃度為0.25至0.75 M。在其他實施方案中，所述液體穩定的疫苗 中的精氨酸連同谷氨酸和/或甘氨酸的最終組合濃度為0.2至0.6 M。在更具體實施方案中， 所述液體穩定的疫苗中的精氨酸連同谷氨酸和/或甘氨酸的最終組合濃度為〇. 3至0.5 M。 在還有其他實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸和谷氨酸或甘氨酸的最終濃度為 0.25至0.45 M。在甚至更具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的精氨酸連同谷氨酸和/ 或甘氨酸的最終組合濃度為約0.45 M。在其他具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的 精氨酸連同谷氨酸和/或甘氨酸的最終濃度為約0.3 M。
[0022]在具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的甲硫氨酸的最終濃度為0.025至0.3 M。在相關實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的甲硫氨酸的最終濃度為0.04至0.15 M。在 更具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的甲硫氨酸的最終濃度為〇. 06至0.09 M。在甚 至更具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗中的甲硫氨酸的最終濃度為約0.07 M。
[0023] 本發明的液體穩定的疫苗還可以包含穩定劑蛋白。所述穩定劑蛋白可以是完整蛋 白和/或蛋白水解物。在具體實施方案中，所述穩定劑蛋白是明膠。在更具體實施方案中，由 本發明的液體穩定的疫苗含有的穩定劑蛋白是0.4至1.6%明膠。在替代實施方案中，所述穩 定劑蛋白是完整酪蛋白的水解物。在該類型的具體實施方案中，由本發明的液體穩定疫苗 含有的穩定劑蛋白是〇. 5-2.0%的完整酪蛋白的水解物。在某些實施方案中，所述完整酪蛋 白的水解物是完整酪蛋白的蛋白水解的水解物。在還有其他實施方案中，本發明的液體穩 定的疫苗含有的穩定劑蛋白是乳球蛋白或乳清蛋白水解物。
[0024] 此外，本發明的液體穩定的疫苗還可以進一步包含螯合劑。這樣的螯合劑可以包 括、但不限于：乙二胺四乙酸（EDTA)、1，2-雙（鄰氨基苯氧基）乙烷-Ν,Ν,Ν'，Ν'-四乙酸 (BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巰基琥珀酸(DMSA)、二乙烯三胺五乙酸（DTPA)和2，3_二 巰基-1 -丙磺酸(DMPS)。本發明的液體疫苗中的這樣的螯合劑濃度可以從約50 μΜ至10 mM 變化。
[0025]在具體實施方案中，所述螯合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)。在該類型的某些實施方 案中，所述液體穩定的疫苗包含0.050至I mM EDTA。在具體實施方案中，所述液體穩定的疫 苗包含0.25至0.75 mM EDTA。在更具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含約0.5 mM EDTA。
[0026]在某些實施方案中，本發明的液體穩定的疫苗可以進一步包含一種或多種自由基 清除劑和/或抗氧化劑作為組分。在該類型的一個具體實施方案中，本發明的疫苗包含抗壞 血酸。在該類型的一個具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含約0.5 mM抗壞血酸。在一 個相關實施方案中，所述疫苗包含生育酚。在該類型的一個具體實施方案中，所述液體穩 定的疫苗包含約0.5 mM α-生育酚。在又另一個實施方案中，所述疫苗包含谷胱甘肽。在該 類型的一個具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含約3 mM谷胱甘肽。在又另一個實施 方案中，所述疫苗包含生育酚和抗壞血酸兩者。在又另一個實施方案中，所述疫苗包含α- 生育酚和谷胱甘肽兩者。在又另一個實施方案中，所述疫苗包含谷胱甘肽和抗壞血酸兩者。 在又另一個實施方案中，所述疫苗包含抗壞血酸、生育酚和谷胱甘肽。
[0027] 在相關實施方案中，本發明的液體穩定的疫苗被保持在密封容器中。在該類型的 具體實施方案中，本發明的液體穩定的疫苗保持在密封容器中，所述密封容器具有在液體 上的惰性氣體，諸如氬氣、氮氣或氦氣(例如已經用所述惰性氣體回填）。
[0028] 本發明的液體穩定的疫苗可以進一步包含佐劑。在該類型的具體實施方案中，所 述佐劑是磷酸鋁。在其他這樣的實施方案中，所述佐劑是氫氧化鋁。在還有其他實施方案 中，所述佐劑是低分子量共聚物佐劑，其可以在溶液中形成交聯以變成高分子量凝膠。在還 有其他實施方案中，所述佐劑由水中的丙烯酸鈉的凝膠顆粒構成。在還有其他實施方案中， 所述佐劑是兩種或更多種這樣的佐劑的組合。
[0029] 在具體實施方案中，本發明的液體穩定的疫苗可以進一步包含去污劑和/或表面 活性劑。在該類型的某些實施方案中，所述表面活性劑為聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。 在該類型的一個具體實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含約0.01%聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌 段共聚物。在該類型的一個具體實施方案中，所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物為 PLUR0NIC?F-68。
[0030] 本發明的液體穩定的疫苗可以包含活的減毒家禽病毒。在某些實施方案中，所述 活的減毒家禽病毒是傳染性支氣管炎病毒(IBV)。在其他實施方案中，所述活的減毒家禽病 毒是傳染性法氏囊病病毒（IBDV)。在其他實施方案中，所述活的減毒家禽病毒是新城疫病 毒(NDV)。在還有其他實施方案中，所述活的減毒家禽病毒是傳染性喉氣管炎（ILTV)。在還 有其他實施方案中，所述活的減毒家禽病毒是禽偏肺病毒(aMPV)。在還有其他實施方案中， 所述活的減毒家禽病毒是馬立克氏病病毒(MDV)。在還有其他實施方案中，所述活的家禽病 毒是火雞皰疹病毒(HVT) JHVT在雞中不致病。]。
[0031] 所述活的家禽病毒也可以是重組載體。這對于HVT和兩種其他MDV(即，MDVl和 MDV2)尤其如此。編碼來自新城疫病毒(例如，NDV"融合"蛋白或另外被稱為NDV F蛋白）或傳 染性喉氣管炎病毒(例如，ILTV gl和gD蛋白）的抗原的重組HVT載體已經是商業可得的。更 近地，已經描述了編碼來自NDV (NDV F蛋白）和ILTV (ILTV gl和gD蛋白）兩者的抗原的獨 特的重組HVT載體[參見，U.S. 8,932,604,其內容在此通過引用并入]。本發明的液體穩定 的疫苗可以包含任何如本文所述單獨或任意組合的這些重組家禽病毒載體。
[0032] 因此，本發明的液體穩定的疫苗可以進一步包含滅活的病毒和/或滅活的細菌(例 如菌苗)和/或菌苗的亞級分。因此，本發明的包含一種或多種活病毒疫苗的任何液體穩定 疫苗可以進一步包含滅活的病毒和/或滅活的細菌和/或菌苗的亞級分，或者甚至減毒或未 減毒的寄生蟲諸如活的艾美球蟲。
[0033]在某些實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含活的減毒IBV、活的減毒IBDVjgHVT 和活的減毒MDV。在其他實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含活的減毒禽偏肺病毒、活的 減毒IBDV、活的減毒NDV和活HVT。在還有其他實施方案中，所述液體穩定的疫苗包含活的減 毒IBV、活的減毒IBDV、活的減毒NDV、活的減毒MDV和活的減毒aMPV。在還有其他實施方案 中，所述液體穩定的疫苗包含活的減毒IBV、活的減毒IBDV、活的減毒NDV、活的減毒MDVjg aMPV和活的減毒禽痘病毒。在任何這些實施方案中，活家禽病毒可以是編碼異源抗原的重 組病毒載體。此外，本發明的任何液體穩定的疫苗還可以在施用前與一種或多種減毒或滅 活的細菌抗原諸如多殺巴斯德氏菌(/?*?iet/reDa iocic/a)、腸炎沙門氏菌（SahcMeDa enteritidis)、.掛\%%禽奸菌(Avibacterium paragallinarum)、產氣英攛^梭蔑(Clostridium perfriZ^efis)和雞敗血支原體dcOjC^as/sa gaDisepiict/ffi)組合。本發明的液體穩定的疫 苗中可以包括的含有抗原和抗原組合的家禽疫苗(一價和多價兩者）的實例可見于下表1A-IC中。
[0034] 本發明進一步提供了幫助保護禽類免于臨床疾病的方法，所述臨床疾病起因于禽 類病毒感染，所述方法包括將本發明的疫苗施用于動物。因此，本發明提供了包括向家禽施 用本發明的任何液體穩定的疫苗的方法。在某些實施方案中，所述施用經粘膜(通過滴眼或 飲用水)進行。在其他實施方案中，所述施用腸胃外進行。在還有其他實施方案中，所述施用 皮內進行。在還有其他實施方案中，所述施用經皮進行。在更具體實施方案中，本發明的疫 苗通過噴霧施用于動物。在還有其他實施方案中，所述施用通過卵內（i/3 ora)途徑進行。在 其他具體實施方案中，本發明的疫苗肌內施用于禽類。本發明還包括初始和/或加強疫苗的 使用。
[0035] 在具體實施方案中，所述方法包括向禽類施用包含活病毒(例如，活的減毒病毒） 的本發明的液體穩定的疫苗。因此，在具體實施方案中，提供了施用本發明的液體穩定的疫 苗的方法，所述液體穩定的疫苗可以包含一種或多種活家禽病毒，所述活家禽病毒選自活 的減毒IBV、活的減毒IBDV、活HVT、活的減毒MDV、活的減毒禽偏肺病毒和/或活的減毒NDV。 在任何這些實施方案中，所述疫苗中的活家禽病毒可以是編碼異源抗原的重組病毒載體。 此外，在施用本發明的任何液體穩定的疫苗之前、一起或之后，還可以施用一種或多種減毒 或滅活的細菌抗原諸如多殺巴斯德氏菌（/^asieureDa iocic/a)、腸炎沙門氏菌 (Salmonella enteritidis)、掛\雞禽奸.舊(Avibacterium paragallinanm)、產氣英鍛^梭蔑 (Clostridium perfringens)和%%敗in支爵、體（Mycoplasma gallisepticmi) 〇
[0036] 還提供了制備任何和所有本發明的液體穩定的疫苗的方法。在某些實施方案中， 該方法包括組合治療有效量的活的減毒的病毒與例如5-40%糖添加劑(例如，糖醇或糖醇與 非糖醇的組合）、氨基酸和pH 6.0-ρΗ 8.0的緩沖溶液，以形成液體穩定的疫苗。所述氨基酸 可以是精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸，或精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和/或甲硫氨酸的組 合。在具體實施方案中，精氨酸和/或甘氨酸和/或谷氨酸在液體穩定的疫苗中具有0.15-0.75 M的最終濃度。在某些實施方案中，所述疫苗進一步包含液體穩定的疫苗中的0.025-0.3 M的最終濃度的甲硫氨酸。在具體實施方案中，治療有效量的活的減毒病毒是治療有效 量的活的減毒禽類病毒。在該類型的具體實施方案中，治療有效量的活的減毒家禽病毒包 括治療有效量的活的減毒IBV、活的減毒IBDV、活的減毒新城疫病毒、活的減毒馬立克病病 毒和活的減毒禽偏肺病毒。在該類型的一個更具體實施方案中，治療有效量的活的減毒家 禽病毒包括治療有效量的活的減毒IBV、活的減毒IBDV、活的減毒新城疫病毒、活的減毒馬 立克病病毒、活的減毒禽偏肺病毒和活的減毒禽痘病毒。
[0037]本發明的這些和其他方面通過參考下述詳述將得到更好理解。
[0038] 發明詳述 因為本發明的液體穩定的家禽病毒疫苗包含活病毒，例如活的減毒病毒，所以迄今為 止，在配制所述疫苗過程中需要特別小心，以使減毒病毒的滴度維持在安全地低于可以導 致顯著不良事件的水平。事實上，大多數活的減毒家禽病毒疫苗是凍干的，并且凍干可以由 于凍干過程本身以及在長期儲存過程中隨時間的推移而導致活的減毒病毒疫苗功效的顯 著下降。
[0039] 本發明已經通過提供液體穩定的家禽疫苗來克服該問題，所述液體穩定的疫苗甚 至在儲存過程中也保持有效，而無需使活的減毒病毒抗原的初始滴度提高高于可靠的安全 水平。作為額外益處，本發明通過顯著減少制備這樣的安全且有效的疫苗所必需的活的減 毒家禽病毒的量而提供了用于降低所提供的疫苗的制造成本的方式。此外，本發明的活的 減毒家禽病毒疫苗比其凍干對應物更便于使用。因此，本發明提供了安全且有效的活的減 毒家禽病毒疫苗，其可以在冷藏溫度作為液體儲存，且仍保持穩定5至7個月、6至9個月、9至 12個月、12至18個月和/或18至24個月和/或甚至更長。不像其凍干的對應物，本發明的液體 穩定的疫苗不必一再水化就使用，因為它們總是水化的。由于家禽疫苗經常最少以1000劑 量小瓶呈現，具有較小農場的那些將僅使用他們購買的凍干疫苗中的一部分。用液體穩定 的家禽疫苗，較小農場可以繼續數周或數月使用相同的疫苗小瓶，只要正確處理且不污染 所述疫苗。這為較小農場打開了全新的獨占市場。
[0040] 而且，令人驚訝的是，本發明的液體穩定的活家禽病毒疫苗可以包括任何類型的 家禽病毒。因此，本發明的液體穩定的活病毒疫苗可以包括有包膜和無包膜的家禽病毒兩 者。此外，本發明的液體穩定的活病毒疫苗可以包括具有單鏈RNA基因組、單鏈DNA基因組或 雙鏈DNA基因組的活的減毒家禽病毒。
[0041] 為了方便起見在說明書中使用單數術語絕非期望是如此限制性的。因此，例如，除 非另有說明，提及"糖添加劑"包括提及這樣的糖添加劑中的一種或多種。除非另有說明，復 數術語的使用也不期望是限制性的。類似地，當在本文中指示為任一時，可以被稱為酸或其 相應堿的化合物意指該化合物的任一形式，除非另有說明。因此，術語谷氨酸的使用意欲包 括谷氨酸鹽，并且反之亦然。
[0042] 如本文所使用，術語"家禽"可以包括雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉和野雞。
[0043]如本文所使用的術語"禽類(avian)"和"禽類(fowl)"可以互換使用，其中兩個術 語均意欲包括如上所定義的家禽。
[0044] 如本文所使用，"疫苗"是適合于應用于動物(在某些實施方案中，包括人）的組合 物，在施用于動物后，所述組合物誘導免疫應答，其強度足以最低限度地幫助防御起因于由 野生型微生物感染的臨床疾病，即強度足以幫助預防臨床疾病，和/或預防、改善或治愈臨 床疾病。除非另有明確說明，術語疫苗的使用包括多價疫苗。
[0045] 如本文所使用，"多價疫苗"是包含兩種或更多種不同抗原的疫苗。在該類型的具 體實施方案中，所述多價疫苗刺激受體的免疫系統預防兩種或更多種不同病原體。
[0046] 如本文所使用，"液體穩定的"疫苗是作為液體維持的疫苗(包括液體多價疫苗）， 當儲存于或低于7°C(例如在標準冷藏庫中，和/或在(TC_7°C)時，所述疫苗持續至少六個月 保持有效。在具體實施方案中，當在7 °C或低于7 °C儲存至少9個月時，液體穩定的疫苗保持 有效。在更具體實施方案中，當在7 °C或低于7 °C儲存至少1年時，液體穩定的疫苗保持有效。 在甚至更具體實施方案中，當在7°C或低于7°C儲存至少1.5年時，液體穩定的疫苗保持有 效。在仍更具體的實施方案中，當在7°C或低于7°C儲存至少2.0-3年時，液體穩定的疫苗保 持有效。
[0047] 如本文所使用，術語"保護"（〃protect〃、〃protecting〃）、"提供保護"（"provide protection to〃、''providing protection to 〃）和"幫助保護"（〃a i ds in the protection")不要求免于任何感染指征的完全保護。例如，"幫助防御"可以意指保護是足 夠的，使得在攻擊之后，潛在感染的癥狀至少被減少，和/或引起癥狀的潛在細胞、生理學或 生物化學原因或機制中的一種或多種被減少和/或被消除。如本上下文中所使用，應當理解 "減少的"意指相對于感染狀態，包括感染的分子狀態，而不只是感染的生理學狀態。
[0048]術語"預防有效量"是指組合物的量，當施用于家禽時，所述量顯著降低由于給定 病原體導致的感染/侵染的可能性和/或程度。
[0049] "整體預防(Metaphylaxis)"是對整組動物及時群體用藥以消除或盡可能降低疾 病的預期爆發，例如在處于感染/侵染的高風險中的一個或多個動物中。
[0050] 術語"化學預防"是指施用藥物/治療，例如，一種或多種預防組合物，用于預防或 減少病毒、細菌和/或寄生蟲感染/侵染;和/或預防或降低與該感染/侵染相關的疾病和/或 癥狀的目的。
[0051] 術語"預防組合物"是指單獨或與其他藥劑組合使用的任何藥劑，其顯著降低家禽 中由于給定病原體導致的感染/侵染的可能性和/或程度。在一個這樣的實施方案中，所述 家禽處于在混雜(commingling)、天氣變化、營養變化和/或可以起始（由藥劑或藥劑的組合 靶向的）與通常與家禽相關的病毒、細菌或寄生蟲病原體的存在相關的癥狀和/或疾病的其 他應激源(stressor)之后發生家禽呼吸系統疾病的高風險中。
[0052]如本文所使用，術語"治療有效量"是給定抗原（例如活的減毒家禽病毒）的量，當 在單一施用中提供時和/或當預期，作為伴隨一個或多個后續加強施用的初始施用提供時， 所述量足以提供保護和/或幫助防御這樣的病原體，施用該抗原以針對所述病原體進行防 御。
[0053] 如本文所使用，"有效的"疫苗包含治療有效量的給定抗原。"有效的"疫苗對于給 定抗原保留足夠滴度以符合該抗原對于施用所述疫苗的管轄的法規要求，例如，在美國的 疫苗的施用由美國農業部(USDA)管理。
[0054] 如本文所使用，術語"藥學上可接受的"作為形容詞使用，以意指被修飾的名詞適 合于用于藥物產品中。當其例如用于描述藥物疫苗中的賦形劑時，其將賦形劑表征為與組 合物的其他成分相容，并且不對預期受體不利地有害。
[0055]術語"載體"是指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。藥學上可接 受的載體可以是無菌液體，諸如水和/或油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，諸如 花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水或水溶液鹽水溶液和糖(例如，右旋糖和/或甘油）水 溶液可以用作載體，特別是用于可注射溶液。此外，所述載體可以是和/或包含水膠體和/或 聚合物溶液，例如，以使待噴在禽類上的家禽疫苗變稠。
[0056]如本文所使用，"佐劑"是這樣的物質，其能夠有利于或放大免疫學事件級聯，最終 導致更好的免疫應答，即針對抗原的整合的身體應答。佐劑通常不是免疫應答發生所需的， 但有利于或放大該應答。
[0057]如本文所使用，"全身施用"是施用至身體的循環系統（包含心血管和淋巴系統） 內，因而影響作為整體的身體而不是特定部位，諸如胃腸道(經由例如口服，在其上噴霧)和 呼吸系統(經由例如滴眼施用）。全身施用可以例如通過施用到肌肉組織內（肌內）、真皮內 (皮內、經皮或真皮上（supradermal))、皮膚下方(皮下）、粘膜下方(粘膜下）、靜脈中（靜脈 內）等來進行。
[0058] "腸胃外施用"包括皮下注射、粘膜下注射、靜脈內注射、肌內注射、皮內注射和輸 注。
[0059] 如本文所使用，"卵內（i/2 〇ra)"是施用入禽類仍然在其內部生長的蛋中。該類型 的施用可以導致疫苗被同時在蛋中的禽類口服攝入，或者可以被意外地肌內注入，或者可 以通過卵黃囊被吸收。
[0060] 如本文所使用，"糖添加劑"是5-12碳糖(例如蔗糖、麥芽糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、 葡萄糖、果糖、半乳糖)或糖醇/多元醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、麥芽糖 醇、甘油）。除非另有具體相反說明，所述糖添加劑的百分比(％)被提供為疫苗中的糖添加劑 的重量(W)比疫苗體積(V)，(w/v)。
[0061 ]如本文所使用，"非還原糖"是糖添加劑，其在堿性含水介質中不生成含有醛基的 任何化合物。本發明的非還原糖的實例包括蔗糖和海藻糖。
[0062]如本文所使用，術語"非糖醇"和"非醇糖"可以互換使用。作為如本文所使用的"非 糖醇"（或"非醇糖"）的糖添加劑可以是不是糖醇的任何糖添加劑，例如，非還原糖。
[0063]如本文所使用，除非另有具體相反說明，疫苗中的固體添加劑(例如，糖添加劑或 明膠)的百分比(％)基于1%溶液，其為Ig固體/100 ml疫苗體積(w/v)。
[0064] 如本文所使用，除非另有具體相反說明，疫苗中的液體添加劑(例如，乙醇）的百分 比（％)基于1%溶液，其為I ml的液體添加劑/100 ml疫苗體積(v/v)。
[0065] 如本文所使用，術語"近似"與術語"約"可以互換使用，并且通常表示值在所示值 的25%之內，8卩"約"2 mM EDTA的濃度可以是1.5 mM至2.5 mM EDTA，除非另有說明。
[0066]如本文所使用，除非另有具體相反說明，提供的pH值是在25°C測定/測量的pH值。 [0067]因為本發明的液體穩定的疫苗理想的pH范圍為pH 6.0至pH 8.0,所以本發明的液 體穩定的疫苗可以包含緩沖液。用于本發明的液體穩定的疫苗中的緩沖液包括但不限于： 磷酸鉀、磷酸鈉、Tris、Tr is-組氨酸、BIS-Tri s、BI S-Tr is-丙烷、焦磷酸鈉或焦磷酸鉀、咪 唑、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、三（羥甲基）甲基甘氨酸、甘氨酰甘氨酸和HEPES。可 以使用任何合適的抗衡離子，使緩沖液達到期望的pH。
[0068] 可以用于本發明的液體穩定的疫苗中的全酪蛋白的水解物可以通過許多程序獲 得，包括例如作為酸性水解物或酶促水解物獲得。這樣的水解物含有混合的氨基酸和肽的 形式，其具有最初存在于酪蛋白中的所有氨基酸。可以用于本發明的液體穩定的疫苗中的 全酪蛋白的一種胰水解物作為CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC?由MP Biomedicals銷售。 相當產品以NZ-AMINE?、NZ-AMINE? A、NZ-AMINE? AS和NZ-AMINE? B以及Tryptone的名稱由 Sigma-Aldrich 銷售。
[0069] 本發明的疫苗可以包含的水膠體的實例包括：明膠、淀粉聚合物和樹膠，諸如黃原 膠、角叉菜膠和阿拉伯膠(阿拉伯樹膠）。
[0070] 多價疫藶本發明提供了液體穩定的多價疫苗。本發明的液體穩定的多價家禽疫 苗可以包括兩種或更多種抗原，其包括以下活的減毒家禽病毒中的一種或多種：IBV、IBDV、 NDV、MDV、ILTV、aMPV和/或編碼一種或多種異源抗原的重組HVT。如上所示，本發明的液體穩 定的多價家禽疫苗還可以包括以下活的減毒病毒中的一種或多種：IBV、IBDV、NDV、ILTV、 MDV、aMPV和/或編碼一種或多種異源抗原的重組HVT連同一種或多種滅活的家禽病毒。
[0071]此外，本發明的液體穩定的疫苗還可以隨后在施用前與一種或多種活的減毒或滅 活的細菌疫苗和/或未減毒或減毒的寄生蟲諸如艾美球蟲組合，所述細菌疫苗包含抗原諸 如多殺巴斯德氏菌(Pasiet/re_/_/a /Jiocic/a)、腸炎沙門氏菌（e/3ieriiic/is)、 爵\離禽奸菌（Avibacterium paragallinarimi)、產氣英膜梭麗（Clostridium perfringens) 和雞敗血支原體(#7c〇jC^as?a gaDisepiict/ffi)。本發明的液體穩定的疫苗中可以使用的一 價和多價疫苗的實例提供于下表1A-1C中： 表1A 活病毒疫苗
[0
[0073]表1C
[0074] 佐游本發明的疫苗可以含有佐劑，或可選地不含佐劑，其經常取決于疫苗含有的 一種或多種抗原。在具體實施方案中，所述佐劑包含鋁鹽。已經描述了結合使用鋁鹽和活病 毒疫苗。在具體實施方案中，所述鋁鹽選自磷酸鋁、磷酸鋁鉀和氫氧化鋁。一種磷酸鋁佐劑 是REHYDR0PH0S? (General Chemical, Parsippany,New Jersey)。氫氧化錯佐劑的實例包 括：REHYDR0GEL?、REHYDR0GEL? HPA或REHYDROGELeLV (General Chemical, Parsippany, New Jersey)。其他眾所周知的佐劑包括經油、聚合物、阜苷類和/或由水中的丙稀酸鈉的凝 膠顆粒構成的佐劑，例如，MONTANIDE? PET GEL A? (Seppic, Paris France)。一種低分 子量共聚物佐劑可以在溶液中形成交聯以變成高分子量凝膠，例如P〇LYGEN? (MVP Laboratories, Omaha)。當添加時，疫苗中的佐劑的量通常在約1%_20% (v/v)之間。在具體 實施方案中，所述佐劑的量在約2%_10% (v/v)之間。在更具體實施方案中，所述佐劑的量在 約3%-6% (v/v)之間。
[0075] 疫庶疏頌:本發明的液體穩定的病毒疫苗可以通過任何方便方式施用，例如通過 全身施用，包括通過腸胃外施用，諸如但不限于皮下或肌內施用。本發明的液體穩定的病毒 疫苗還可以通過粘膜施用，諸如通過在其上噴霧、經口、卵內和/或眼施用進行施用。或者， 所述疫苗可以經由皮膚貼劑、在延遲釋放植入物中、劃痕或局部施用進行施用。考慮本發明 的液體穩定的病毒疫苗還可以經由受體家禽的飲用水和/或食物進行施用。
[0076] 本發明的疫苗(包括多價疫苗)還可以作為組合療法的一部分施用，所述組合療法 即除了疫苗自身之外，還包括施用一種或多種額外的活性劑、療法等的療法。在該情況下， 應認識到構成"治療有效"量的疫苗量可以多于或少于疫苗單獨施用時將構成"治療有效" 量的疫苗量。其他療法可以包括本領域已知的那些，諸如，例如止痛藥、退燒藥、祛痰藥、抗 炎藥、抗組胺劑、和/或流體的施用。
[0077] 在本發明方法的某些實施方案中，適合于粘膜施用的本發明的病毒疫苗包含以下 中的一種或多種：活的減毒IBV、活的減毒IBDV、活的減毒MDV、活的減毒ILTV、活的減毒 aMPV、活的重組HVT病毒和活的減毒NDV。在更具體實施方案中，適合于粘膜施用的本發明的 病毒疫苗進一步包含活的減毒IBV和以下中的一種或多種:活的減毒IBDV、活的減毒MDVjg 的減毒ILTV、活的減毒aMPV、活的重組HVT病毒和活的減毒NDV。
[0078] 免疫原性水平可以通過本領域通常已知的疫苗劑量滴度和攻擊研究技術實驗測 定。這樣的技術通常包括用不同劑量的疫苗接種許多動物主體，并且然后用劇毒病毒攻擊 動物主體，以測定最低保護劑量。
[0079] 影響優選劑量方案的因素可以包括例如主體的物種或品種(例如禽類的物種或品 種）、年齡、重量、飲食、活動、肺大小，和狀況;施用途徑;使用的特定疫苗的功效、安全性和 免疫持續時間概況;是否使用遞送系統；以及疫苗是否作為藥物和/或疫苗組合的一部分施 用。因此，實際上采用的劑量可以對于特定動物不同，并且因此可以偏離上文所述的典型劑 量。這樣的劑量調整的確定通常在使用常規方法的疫苗開發領域技術人員的技術內。
[0080] 類似地，可以與這樣的劑量一起施用的體積通常在0.01 mL(滴眼應用）至2.0 mL 之間。對于肌內施用，施用體積的典型范圍在0.03至1.0 mL之間，并且為約0.1至0.5 mL。
[0081] 關于向禽類主體施用給定疫苗的次數的決定中將包括所述禽類主體是否飼養用 于肉、用于產蛋或作為寵物。因此，考慮疫苗可以單次施用，或替代地經數天、數周、數月或 數年兩次或更多次施用于疫苗受體。在一些實施方案中，所述疫苗施用至少兩次。在某些這 樣的實施方案中，例如，所述疫苗施用兩次，其中第二劑量(例如加強劑量)在第一劑量后至 少2周施用。在具體實施方案中，所述疫苗施用兩次，其中第二劑量在第一劑量后不長于8周 施用。在其他實施方案中，第二劑量在第一劑量后1周至2年、在第一劑量后1.5周至8周、或 在第一劑量后2周至4周施用。在其他實施方案中，第二劑量在第一劑量后約3周施用。
[0082] 在上述實施方案中，第一和后續劑量可以諸如在量和/或形式方面不同。然而，通 常，劑量在量和形式方面是相同的。當僅施用單一劑量時，該單獨劑量中的疫苗量通常包含 治療有效量的疫苗。然而，當施用超過一個劑量時，那些劑量中的疫苗量一起可以構成治療 有效量。此外，可以初始施用疫苗，并且然后2至12周之后可以施用加強劑量，如上文所討 論。然而，疫苗的后續施用可以在每年（1年)或每兩年(2年)基礎上進行，無論是否施用加強 劑量。
[0083]本發明的疫苗還可以含有抗菌劑，諸如抗生素。這樣的抗生素的實例可以包括： 10-1000 yg/mL慶大霉素、0.5-5.0 ug/mL兩性霉素 B、10-100 ug/mL四環素、10-100單位/mL 制霉素(制霉菌素）、10-100單位/mL青霉素、10-100 yg鏈霉素、10-100 yg多粘菌素 B和10-100 yg新霉素。
[0084]通過參考以下非限制性實施例，本發明可以得到更好理解，所述實施例作為本發 明的示例提供。呈現以下實施例以便更完全地說明本發明的實施方案。然而，其決不應解釋 為限制本發明的寬范圍。 實施例
[0085] 液體家禽病毒疫苗的穩定性 材料和方法 原料(bulk)抗原制備:冷凍原料IBV病毒抗原從生產獲得并保持在〈-60°C，直到共混疫 苗時。IBV原料抗原具有約9.1 Iog1O(EID5Q)的滴度。
[0086]材料：細胞培養或更高級的鹿糖和山梨糖醇購自Fisher Scientific。具有高于 98%的純度的分子生物學級L-精氨酸單鹽酸鹽購自Sigma13NZ胺(bloom 250)溶液從最好可 用的商業試劑制備。已經制備并通過高壓滅菌或0.2 um過濾而滅菌以下溶液:80% (w/v)蔗 糖，70% (w/v)山梨糖醇，1.2 M L-精氨酸單鹽酸鹽，1.0 M磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)，胰蛋白 君系磷酸鹽培養液(TPB)溶液和250 mg/mL慶大霉素。
[0087] 禮定系/溶液肩/疫鹿共凝游冰源苷最終疫苗共混物的pH可對于液體中的病毒的穩 定性是至關重要的。使用非常靈敏的PH探頭和儀表測量pH。所述儀表顯示pH至小數點右側 的3個有效數字。存在分開的具有儀表的溫度探頭，且兩者均必須在溶液中，并且是穩定的。 該pH儀表能夠生成5點校準曲線，其中3點是絕對最小值。在疫苗共混物制備過程中，在添加 病毒抗原前將穩定劑溶液的pH調節至目標pH，并且在混合穩定劑溶液和病毒抗原之后再次 測量pH。
[0088] 穩定系/溶液游歲播廠旦已經進行初始pH調節，使用0.2 μΜ過濾器過濾滅菌所有 制劑(僅僅由于改進的過濾器容量，PES是優選的過濾器基質）。目前使用真空進行過濾。真 空過濾的第二個益處是制劑的額外脫氣。制劑已經過濾滅菌之后，將其用氬氣鼓泡以增加 O2的耗竭，希望這將隨時間得到制劑的較低反應性。一旦鼓泡完成，在儲存前放置氬氣覆蓋 (argon overlay)，并進行緊密密封。制備制劑之后，在期望的溫度(例如，4°C、15°C或25°C) 將pH證實/調節至pH 7.2, 即，對于本文進行的許多實驗，期望的溫度為4°C。如果已經正確 地進行配制和先前的程序，則pH應當接近于目標pH。在過夜孵育下，pH可能由于完成與較早 的PH調節和進一步脫氣相關的化學反應而略微偏移。
[0089] 靜凍病毒原料貧展在室溫（15-30°C )或在冷藏溫度（2-8°C )緩慢解凍冷凍的抗 原。解凍的抗原應當在使用前在2_8°C保持不超過8小時。
[0090] 疫房龍凝游游歡備為了制備200mL疫苗共混物，首先將如表3中所列的所示體積 的各儲備溶液添加至滅菌的容器，并且使用攪拌棒混合穩定劑和賦形劑。充分混合穩定劑 溶液和所有賦形劑之后，將所示體積的病毒抗原添加入容器并充分混合。在該混合步驟過 程中避免氣泡和泡沫的生成。當在非常短時間段(幾分鐘）內添加病毒時，則可以添加病毒， 而沒有任何進一步問題。當不立即添加病毒時，將氬氣覆蓋實施到位，以替代殘余的〇 2。一 旦已經添加病毒，則在混合前將新的氬氣覆蓋實施到位。使用低流速將氬氣添加至瓶中。疫 苗共混完成之后，將疫苗共混物保持在2-8°C，直至分配成小等分試樣。
[0091] _#充疫潰將疫苗共混物以1.8 mL/小瓶分配入玻璃安瓿小瓶中。然后用氬氣回填 并覆蓋各小瓶。將安瓿小瓶火焰密封、標記，然后轉移入盒，并在指定溫度儲存于培養箱中。 [0092] 在身溫肩/其廣# M禮定倥漱試將安瓿小瓶中的液體IBV疫苗分別在15°C和4 °(：儲存于相應的培養箱中。在指定時間點，從各制劑取回2個或更多小瓶，并且各抗原的滴 度通過基于蛋的滴定測定進行測量，且被報道為平均蛋感染劑量(EID 50)。
[0093] 分析方法 在干凈細胞環境中進行所有胚胎感染劑量測定。在II類生物安全柜中在無菌條件下進 行操作和稀釋。在任何操作前將蛋表面消毒，并且所有瓶、吸管、吸頭和稀釋管在使用前必 須消毒。所有培養基和相關成分必須是無菌的。
[0094] 效汾/麗定:用于測定給定傳染性支氣管炎病毒儲備物的效價的優選方 法是測定在含胚、無特定病原體的雞蛋中的感染性。通過用含有29 yg/mL慶大霉素的胰蛋 白1:1磷酸鹽培養液(TPB)中稀釋的0.1 ml病毒流體將9至11日齡胚胎接種于尿囊腔中而測 定病毒儲備物的幾何平均滴度(GMT)。每次測試應當使用四個和六個之間的稀釋度(不超過 十倍），并且每次稀釋應當接種最少五個胚胎。將蛋在38 - 39°C和60-70%的相對濕度下孵 育七天，并且每天對光檢查。應當忽視前24小時過程中發生的死亡，但接種后第2天和第7天 之間的死亡率被認為是病毒特異性的。各稀釋度中至少四個活胚胎應當活過24小時的有效 測試。7天孵育之后，針對典型IBV感染的證據，諸如腎臟的中腎中的下沉積物或尿酸鹽沉積 物（down or urate deposits)的萎縮（stunting)、卷曲（curling)、形成 t午狀（clubbing)， 檢查胚胎。為了比較目的，用充當陰性對照的TPB稀釋劑接種最少六個蛋，并且測定制備的 具有已知滴度的IBV DE-072的參考，并將其用作陽性對照。令人滿意的滴定應當具有至少 一個具有50%至100%陽性率的稀釋度和至少一個具有50%至0%陽性率的稀釋度。可以使用 Reed和Muench或Spearman-KSrber方法計算平均胚胎感染劑量(EID5Q)。為了更準確，推薦每 個測試的樣品儲備物進行至少3次重復滴定，并測定平均GMT。
[0095] 結果和結論 IBV的幾種潛在的液體穩定的制劑顯示于表2中。這些制劑用于評估不同的穩定劑和賦 形劑對于液體中的IBV穩定性的貢獻。穩定劑#17是由于低穩定性而在<-50°C冷凍銷售的商 業產品的制劑。穩定劑#17含有3.3% (w/v) NZ胺和3.3% (w/v)蔗糖作為穩定劑。制劑P-Ol、 P-02和P-03是三種含有糖添加劑（山梨糖醇和蔗糖)和L-精氨酸作為穩定劑的制劑。表2顯 示對于各制劑的最終疫苗共混物中的各穩定劑或賦形劑的最終濃度。所有制劑都使用1 〇 mM KP04作為緩沖液以提供約7.2的pH值，且所有四種制劑都含有1.0 mg/mL慶大霉素作為 防腐劑。所述制劑的目標pH為7.2，且與IBV抗原共混之后的實際pH為約pH 6.8至7.2。制劑 P-Ol含有15% (w/v)山梨糖醇和0.3 M L-精氨酸作為穩定劑。制劑P-02含有15% (w/v)山梨 糖醇和0.45 M L-精氨酸作為穩定劑。制劑P-03含有15% (w/v)山梨糖醇、10% (w/v)蔗糖和 0.3 M L-精氨酸作為穩定劑。TPB用作用于調節至最終目標體積的填料溶液。
[0096] 通過在清潔罩中將一起來自儲備溶液的穩定劑、賦形劑和防腐劑組合入無菌瓶中 而制備200 mL實驗性疫苗的批次。對于穩定劑#17,將67 mL 3X穩定劑#17 [10%蔗糖(w/v) 和10% NZ胺(w/v)]與65.2 mL ?ΤΒ溶液和0.8 mL 100-250 mg/mL慶大霉素溶液充分混合。 對于制劑P-0UP-02和P-03,以表3中所示的指定體積分配各穩定劑(蔗糖、山梨糖醇、L-精 氨酸）、賦形劑(KP04、TPB)與防腐劑(慶大霉素）。充分混合穩定劑、賦形劑和防腐劑之后;將 67 mL解凍的IBV抗原添加至各制劑并充分混合。然后將各疫苗共混物以1.8 mL/小瓶等分 入玻璃安瓿小瓶中。將疫苗小瓶用氬氣回填，火焰密封，然后進行在15 °C或4°C的穩定性測 試。
[0097] 在于15°C和4°C孵育之后的指定時間點，從培養箱取回最少各制劑兩個小瓶，并使 用基于EID5q的效價測定法測定IBV的滴度。表4和5分別顯示在15°C儲存長達17周和在4°C儲 存長達12個月之后各制劑中的IBV樣品的平均滴度。如表4中所示，在15°C儲存過程中，制劑 穩定劑#17中的IBV病毒滴度從第0天至第4.5周下降2.8 log。形成鮮明對比的是，當在15°C 儲存時，其他三種制劑(P-01、P_〇2和P-03)中的IBV相對于第0天都是穩定的。所有三種制劑 在15°C在第1周、第2周和4.5周相對于時間0的滴度變化都在效價測定變化(0.5 log)之內。 表4中的數據證實，在15°C，IBV在當前產品制劑(例如，穩定劑#17)中是不穩定的，但在制劑 ?-01、？-02和?-03中穩定長達4.5周。
[0098] 此外，還收集在4°C的實時穩定性數據[表5]。如15°C穩定性數據所見，在4°C，穩定 劑#17中的IBV顯示到第一時間點（3個月）的滴度的顯著損失，并且到第二時間點（即，在6個 月）基本上無活性，而所有三種制劑（即，P-0UP-02和P-03)均提供顯著改進的穩定性。4°C 穩定性數據表明，P-Ol、P_〇2和P-03提供了比目前制劑穩定劑#17改進的IBV穩定性，而制劑 P-03是三者中的最佳候選，顯示在4°C與第0天相比基本上沒有滴度變化，直到儲存7個月。
[0099] 基于表4中的15°C穩定性數據，使用第一階多項式回歸分析各制劑中的IBV的穩定 性。使用從回歸分析生成的方程，計算在15°C下降1.0 log滴度所需要的時間，并將其列于 表6的最下面一行。制劑穩定劑#17、？-01、？-02和?-03中，18￥下降1.0 1呢滴度所需要的時 間分別是1.6、16.6、22.7和49.8周。該分析表明，制劑P-Ol、P-02和P-03中的穩定劑作出不 同的貢獻。制劑P-ο 1和P-02的比較表明，將L-精氨酸的濃度從0.3M升高至0.45 M沒有顯著 改進IBV穩定性。制劑P-Ol和P-03的比較表明，額外的10 %蔗糖沒有顯著改進IBV穩定性。P-01、P-02和P-03制劑相對于穩定劑#17的顯著穩定效果表明山梨糖醇、蔗糖和L-精氨酸的組 合對于液體制劑中的IBV穩定性可以是有利的。表5中的在4°C的IBV實時穩定性數據與從15 °C穩定性數據生成的預計相對穩定性一致，并且進一步證實所有三種新制劑（即，P-OUP-02和P-03)表現比穩定劑# 17顯著更好。進一步，P-03制劑在標準冷藏溫度提供最好的穩定 性。
[0100] 表 2
注： ?對于各制劑(制劑)列出的濃度是疫苗共混物中的最終濃度。 ? KP04是磷酸鉀溶液，其含有產生7.2的pH的體積比中的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。 ?對于NZ胺、山梨糖醇和蔗糖，濃度單位是重量體積比(w/v);對于精氨酸和KP04,濃度 單位分別是摩爾濃度和毫摩爾濃度。 ?所有制劑都還在最終疫苗共混物中含有I mg/mL慶大霉素。
[0101] 表 3
注： ?為了制備制劑穩定劑#17,將67 mL穩定劑#17 (含有10% NZ胺和10%蔗糖）與65.2 mL TPB、0.8mL慶大霉素（250 mg/mL)和67 mL IBV原料病毒共混。 ?對于所有疫苗共混物，在將病毒添加至制劑之前首先共混穩定劑（山梨糖醇、蔗糖、 L-精氨酸）、賦形劑(TPB、KP04)和防腐劑(慶大霉素）。
[0102] 表 4 不同制劑中在15 °C儲存過程中的IBV疫苗的穩定性
注： ?各時間點的疫苗的滴度是來自各制劑的最少2個小瓶的樣品的平均值。 ?每次病毒滴定中總是包括IBV病毒陽性對照，并且其用于驗證各時間點的病毒效價 測定。 ?該基于EID5q的病毒效價測定的變化為0.5 log或更小。
[0103] 表 5
注： ?各時間點的疫苗的滴度是來自各制劑的最少2個小瓶的樣品的平均值，（除了*表示 僅一個小瓶用于專門測量穩定劑#17)。 ?每次病毒滴定中總是包括IBV病毒陽性對照，并且其用于驗證各時間點的病毒效價 測定。
[0104] 表 6 注：
?表4中的穩定性數用于預測不同制劑中的IBV穩定性。 ?非線性第一階多項式回歸用于從表4中的數據生成預測，其中IBV滴度作為y值且儲 存時間（周數)作為X值。 ? IBV穩定性斜率是每周的滴度變化[Log1O(EID5Q)]，且Y-截距是基于回歸方程的在時 間〇的滴度。 ?基于回歸方程（IBV滴度變化相對于儲存時間），對于各制劑計算從時間0下降1.0 log滴度所需要的預計時間，并將其列于的表格的最后一行。
[0105]本發明不應被本文所述的具體實施方案限制范圍。事實上，除了本文描述的那些 以外，本發明的各種改變對于本領域技術人員而言，從前面的描述中將變得顯而易見。這樣 的改變意欲落入所附權利要求的范圍之內。
【主權項】
1. 液體穩定的疫苗，其包含活家禽病毒、5-40% (w/v)糖醇和0.15至0.75 Μ的選自精 氨酸、谷氨酸和甘氨酸的氨基酸;其中所述液體穩定的疫苗具有6.0至8.0的pH;其中所述活 家禽病毒選自減毒病毒、重組家禽病毒載體和減毒家禽病毒的重組病毒載體;且其中所述 重組家禽病毒載體或減毒家禽病毒的重組病毒載體可以進一步編碼異源抗原。2. 權利要求1的液體穩定的疫苗，其中所述糖醇是山梨糖醇。3. 權利要求2的液體穩定的疫苗，其中所述氨基酸是精氨酸。4. 權利要求3的液體穩定的疫苗，其中所述活家禽病毒選自家禽傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、傳染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、馬立克氏病病毒(MDV)、禽偏肺病毒 (aMPV)、火雞皰疹病毒(HVT)及其任何組合。5. 權利要求1的液體穩定的疫苗，其進一步包含作為非糖醇的糖添加劑，其中所述液體 穩定的疫苗中的糖醇和非糖醇的總量為15-40% (w/v)。6. 權利要求5的液體穩定的疫苗，其中所述非糖醇選自蔗糖和海藻糖。7. 權利要求1的液體穩定的疫苗，其進一步包含緩沖液。8. 權利要求7的液體穩定的疫苗，其中所述緩沖液包含2.5至50 mM磷酸鉀。9. 權利要求1的液體穩定的疫苗，其中所述氨基酸是精氨酸。10. 權利要求4的液體穩定的疫苗，其中所述活的減毒病毒是IBV。11. 權利要求10的液體穩定的疫苗，其中所述IBV選自Delaware毒株、Mass毒株、 Arkansas毒株、Connecticut毒株、Georgia毒株及其任何組合。12. 權利要求11的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒imw。13. 權利要求12的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒NDV。14. 權利要求13的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒MDV或編碼異源抗原的重組 減毒的MDV載體。15. 權利要求14的液體穩定的疫苗，其進一步包含活HVT或編碼異源抗原的重組HVT載 體。16. 權利要求15的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒aMPV。17. 權利要求4的液體穩定的疫苗，其進一步包含滅活的家禽病毒。18. 權利要求4的液體穩定的疫苗，其進一步包含細菌。19. 權利要求18的液體穩定的疫苗，其中所述細菌選自活的減毒多殺巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、活的減毒腸炎沙門氏菌（e/3ie_riiic/is)、活的減毒 副雞禽桿菌（cie_rij〇a_ragai/3a_rt/?)、活的減毒雞敗血支原體（ifyc〇j〇_/asffia gaDisejCiiic?)、活產氣莢膜梭菌（C7osiric/i? j〇er_fri/^e/3s)及其任何組合。20. 權利要求1 8的液體穩定的疫苗，其中所述細菌選自滅活多殺巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、滅活腸炎沙門氏菌e/3ie_riiic/is)、滅活副雞禽桿 菌(Avibacterium paragallinarum)、滅活%%敗版支原、體（Mycoplasma gallisepticum)、 產氣莢膜梭菌（C/osirit/it? joer/riog'aos)的滅活類毒素及其任何組合。21. 針對傳染性支氣管炎病毒（IBV)、傳染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、 馬立克氏病病毒(MDV)、禽偏肺病毒(aMPV)或火雞皰疹病毒(HVT)接種禽類的方法，其包括 向所述禽類施用權利要求17的液體穩定的疫苗。22. 權利要求21的方法，其中所述施用通過皮下注射進行。23. 針對家禽病毒接種禽類的方法，其包括向所述禽類施用權利要求1的液體穩定的疫 苗。24. 權利要求23的方法，其中所述施用通過噴霧或飼喂進行。25. 制備液體穩定的疫苗的方法，其包括組合治療有效量的活的減毒家禽病毒與5-40% (w/v)糖醇和0.15至0.75 Μ精氨酸;其中所述液體穩定的疫苗具有6.0至8.0的pH。26. 權利要求1或2的液體穩定的疫苗，其中所述氨基酸是精氨酸。27. 權利要求1、2或26的液體穩定的疫苗，其中糖醇的量為10-30% (w/v)。28. 權利要求1、2、26或27的液體穩定的疫苗，其中所述活的減毒家禽病毒選自傳染性 支氣管炎病毒（IBV)、傳染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、馬立克氏病病毒 (MDV)和火雞皰疹病毒(HVT)。29. 權利要求1、2、26、27或28的液體穩定的疫苗，其進一步包含作為非糖醇的糖添加 劑，其中所述液體穩定的疫苗中的糖醇和非糖醇的總量為15-40% (w/v)。30. 權利要求29的液體穩定的疫苗，其中所述液體穩定的疫苗中的糖醇和非糖醇的總 量為25-40% (w/v)。31. 權利要求29或30的液體穩定的疫苗，其中所述非糖醇選自蔗糖和海藻糖。32. 權利要求1、2、26-30或31的液體穩定的疫苗，其進一步包含緩沖液。33. 權利要求32的液體穩定的疫苗，其中所述緩沖液包含2.5至50 mM磷酸鉀。34. 權利要求1、2、27-32或33的液體穩定的疫苗，其中所述氨基酸是谷氨酸。35. 權利要求1、2、26-33或34的液體穩定的疫苗，其中所述活的減毒病毒是IBV。36. 權利要求35的液體穩定的疫苗，其中所述IBV選自由以下組成的類型：Delaware、 Massachusetts、Arkansas、Connecticut 和Georgia 毒株。37. 權利要求1、2、26-35或36的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒MDV。38. 權利要求1、2、26-36或37的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒NDV。39. 權利要求1、2、26-37或38的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒MDV或編碼異 源抗原的重組減毒的MDV載體。40. 權利要求1、2、26-38或39的液體穩定的疫苗，其進一步包含活HVT或編碼異源抗原 的重組HVT載體。41. 權利要求1、2、26-39或40的液體穩定的疫苗，其進一步包含活的減毒aMPV。42. 權利要求1、2、26-40或41的液體穩定的疫苗，其進一步包含滅活的家禽病毒。43. 權利要求1、2、26-41或42的液體穩定的疫苗，其進一步包含細菌。44. 權利要求43的液體穩定的疫苗，其中所述細菌選自活的減毒多殺巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、活的減毒腸炎沙門氏菌（e/3ie_riiic/is)、活的減毒 副雞禽桿菌、活的減毒雞敗血支原體(ifyc〇j〇_/as_ffla gaDisejCiiic?)、活的減毒產氣莢膜梭菌（C/osiric/i? jOer/riogaos)及其任何組合。45. 權利要求44的液體穩定的疫苗，其中所述細菌選自滅活多殺巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、滅活腸炎沙門氏菌e/3ie_riiic/is)、滅活副雞禽桿 菌（Avibacterium paragallinararimi)、滅活%%敗in支爵、體（Mycoplasma gallisepticimi)、 產氣莢膜梭菌（C/osirit/it? joer/riog'aos)的滅活類毒素及其任何組合。46. 權利要求1、2、26-44或45的液體穩定的疫苗，其進一步包含寄生蟲。47. 權利要求46的液體穩定的疫苗，其中所述寄生蟲是艾美球蟲。48. 接種傳染性支氣管炎病毒（IBV)、傳染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、 馬立克氏病病毒(MDV)、禽偏肺病毒(aMPV)和火雞皰疹病毒(HVT)或其任何組合的方法，其 包括向家禽施用權利要求1 -20、26-46或47的液體穩定的疫苗。49. 權利要求48的方法，其中所述施用通過噴霧、卵內、滴眼、經口或經鼻途徑進行。50. 制備權利要求1 -20、26-46或47的液體穩定的疫苗的方法，其包括組合治療有效量 的活的減毒家禽病毒與5-40% (w/v)糖添加劑。
【文檔編號】A61P31/04GK105992593SQ201580008951
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月16日
【發明人】喬志松, S.庫克, K.奧康內爾, I.塔佩伊
【申請人】英特維特國際股份有限公司