新型免疫治療組合物及其用圖

新型免疫治療組合物及其用圖
【專利摘要】本發明總體上涉及一種免疫治療組合物。更具體地說，本發明涉及一種與患有花生過敏或對其他樹堅果過敏的受試者中的T淋巴細胞發生免疫相互作用的免疫治療組合物。這種組合物優選地與患有對Ara h 1和/或Ara h 2過敏原的過敏癥的受試者中的T細胞發生免疫反應。本發明的組合物可用于治療性或預防性治療特征在于對花生、Ara h1和/或Ara h 2或其衍生物或同系物的異常、不當或其他方面不需要的免疫應答的病狀。
【專利說明】新型免疫治療組合物及其用途 發明領域
[0001] 本發明總體上涉及一種免疫治療組合物。更具體地說，本發明涉及一種與患有花 生過敏或對其他樹堅果過敏的受試者中的T淋巴細胞發生免疫相互作用的免疫治療組合 物。這種組合物優選地與對Ara h 1和/或Ara h 2過敏原過敏的受試者中的T細胞發生免疫 反應。本發明的組合物可用于治療性或預防性治療特征在于對花生、Ara hi和/或Ara h 2 或其衍生物或同系物的異常、不當或其他方面不需要的免疫應答的病狀。
[0002] 發明背景
[0003] 作者在此說明書中提及的出版物的書目細節按字母順序收集在本說明書的末尾。
[0004] 本說明書中對任何現有技術的提及不是、并且不應被當做是承認或任何形式的暗 示，即承認或暗示這樣的現有技術形成了普通公知常識的一部分。
[0005] 花生過敏是危及生命且不能治愈的病癥，影響大約1%的普通人群(侯賽因等人， 美國皮膚病學會雜志66(1) :136-43，2012,伯克斯，柳葉刀371(9623): 1538-46,2008 (Husain et al.J Am Acad Dermatol.66( I)：136-43,2012,Burks, Lancet.371(9623)： 1538-46，2008))。花生過敏的特征在于過敏反應的突然發作，其可能在暴露于微量花生蛋 白時發生(赫里哈尼等人，變態反應與臨床免疫學雜志100:596-600，1997;龐弗里，變態反 應和免疫學的研究現狀4(4): 285-90，2004(Hourihane et al ·，J Allergy Clin Immunol 100：596-600,1997；Pumphrey,Current Opinion in Allergy&Immunology.4(4):285-90, 2004))。花生誘導的過敏反應最常與死亡率或危及生命的特征相關聯(博克等人，變態反應 與臨床免疫學雜志 119(4):1016-8,2007;伯克斯 2008,同上（Bock et al J Allergy Clin Immunol. 119(4): 1016-8，2007 ;Burks 2008，supra))。花生蛋白經常隱藏在表面安全的食 物來源內，使得在5年時間內多達50%的患者與花生蛋白發生偶然接觸（西歇雷爾等人，兒 科學 102:e6，1998(Sicherer et al. ,Paediatrics 102:e6，1998))。并不意外的是，花生和 樹堅果過敏癥與受害者和看護者的重大心理發病率相關聯，這與患有諸如類風濕關節炎的 慢性衰弱疾病的患者所遭受的類似(普里米等人，臨床與實驗變態反應30:1135-43，2000; 肯普等人，澳大利亞醫學雜志 188(9) :503_4,2008(Primeau et al.，Clin Exp Allergy 30:1135-43，2000;Kemp et al .Med. J.Aust. 188(9):503-4,2008))。盡管治愈對于去除造 成死亡率的一個原因的花生和樹堅果過敏是迫切的，但也有必要消除花生過敏受試者所承 受的長期心理負擔。
[0006] 迄今為止，在針對花生過敏的免疫療法方面做出的努力成果極其有限。納爾遜等 人已經證明可使用利用未分級花生提取物的急速免疫療法方案來誘導花生的臨床脫敏，但 在維持給藥的過程中這種臨床脫敏作用在約一半的受試者中消失了，另外注射與建立期與 維持期過程中大部分受試者的過敏反應的頻繁發作相關聯(納爾遜等人，變態反應與臨床 免疫學雜志 99 : 744-51，1997 (Nelson et al ·，J Al lergy Cl in Immunol 99:744-51， 1997))。奧本海默(Oppenheimer)等人在他們的研究中證實了相似的發現，也顯示利用未分 級花生提取物的主動療法與全身性過敏反應的高發率相關聯。在將花生提取物給予安慰劑 隨機的受試者導致其死亡之后終止那項研究中的數據收集，這突出了這種病狀的危險性質 (奧本海默等人，變態反應與臨床免疫學雜志90:256-62，1992(0ppenheimer et al.，J Allergy Clin Immunol 90:256-62,1992))。使用完整花生粉的口服免疫療法的最近研究 鼓勵脫敏是可行的，但觀察到的不良反應突出了主要的安全隱患(霍夫曼等人，變態反應與 臨床免疫學雜志124，286，2009;瓊斯等人，變態反應與臨床免疫學雜志24，292，2009;克拉 克等人，變態反應64，1218,2009;瓦什尼等人，變態反應與臨床免疫學雜志127(3):654-60， 2011;瓦什尼等人，變態反應與臨床免疫學雜志124(6):1351-2,2009;安尼諾斯圖等人，臨 床與實驗變態反應41 (9): 1273-81，2011;艾倫和奧赫希爾，臨床與實驗變態反應41 (9): 1172-4,2011;于等人，變態反應與免疫學國際檔案159(2): 179-182,2012;斯亞咖依等人， 變態反應與臨床免疫學雜志126(1) :31-2,2010;布朗成等人，變態反應與臨床免疫學雜志 126(1):83-91,2010(Hofmann et al.J.Allergy Clin.Immunol.124,286,2009；Jones et al.J.Allergy Clin.Immunol.24,292,2009;Clark et al.Allergy 64，1218,2009; Varshney et al.J Allergy Cl in Immunol·127(3):654-60，2011;Varshney et al.J Allergy Clin Immunol·124(6):1351-2，2009;Anagnostou et al.Clin Exp Allergy.41 (9):1273-81,2011；Allen&0/Hehir.Clin Exp Allergy.41(9)：1172-4,2011；Yu et al.Int Arch Allergy Tmmunol.159(2)：179-182,2012；Thyagarajan et al.J Allergy Clin Tmmunol.126(1):31-2,2010；Blumchen et al.J Allergy Clin Tmmunol.126(1)： 83-91，2010))。即使排除有重度癥狀或哮喘傾向的兒童，但兩項研究報道了過敏發作，一個 病例在初始食物激發期間（克拉克等人，變態反應64,1218,2009(Clark et al.Allergy 64，1218,2009))，另一個病例在治療先前沒有經歷過敏反應的兒童期間（霍夫曼等人，變態 反應與臨床免疫學雜志 124,286,2009(Hofmann et al.J.Allergy Clin. Immunol .124， 286.2009) )。
[0007] 克服與過敏原免疫療法相關聯的發病率的新策略的發展取決于對成功免疫療法 的免疫學基礎及其副作用的準確理解。長久以來已經確立了過敏原免疫療法所引起的發病 率是由于IgE的交聯，而且這種作用不是這種治療起效所必需的（利特溫等人，變態反應與 免疫學國際檔案87:361-61，998(Litwin et al·，Int Arch Allergy Appl Immunol87: 361-61，998))。還已知的是，常規(皮下注射或舌下或口服未分級過敏原提取物)免疫療法 產生耐受性的關鍵作用之一是其能夠將主要的特異性T細胞表型從Th2變為調節性表型。這 些調節性T細胞通過產生抗炎細胞因子IL-10和/或TGF起作用β。（阿迪斯和阿迪斯，變態反 應與臨床免疫學雜志123 : 735-46，2009 ;阿迪斯和阿迪斯，自然綜述：藥物發現8 : 645-60.2009;阿迪斯和阿迪斯，變態反應與臨床免疫學雜志127 :18-27，2011 (Akdis&Akdis，J Allergy Clin ImmunoI·123:735-46，2009;Akdis&Akdis，Nature Reviews：Drug Discovery.8:645_60.2009;Akdis&Akdis，J Allergy Clin Immunol.l27:18_27,2011))。
[0008] 抗體應答和淋巴細胞應答的關鍵區別在于抗原識別，抗體依賴分子三級結構識別 構象B細胞表位，而⑶4+T細胞識別短的線性肽。抗原識別的這種差異是許多新免疫療法策 略的基礎，包括基于T細胞表位、B細胞表位突變體和改變肽配體來使用肽(羅蘭德等人，藥 理學與治療學121:273-284,2009(1?〇11311(16七31.?1^^^(3〇1(^7&1116瓜？6扯。8 121:273- 284.2009) )。此類方法均取決于分子三級結構的改變或缺失，這樣IgE交聯和效應細胞活化 消失。肽免疫療法是存在功效證據的方法，對于貓毛過敏與蜂毒過敏都有記錄。三項不同研 究顯示表明，在不存在任何系統性副作用的情況下，可使用含有T細胞表位的序列針對主要 蜂毒過敏原磷脂酶A2(PLA2)實現臨床和免疫耐受(穆勒等人，變態反應與臨床免疫學雜志 101:747-54，1998;塔爾齊等人，臨床與實驗變態反應36:465-74，2006;費爾拉斯等人，變態 反應與臨床免疫學雜志111 :854-61，2003(Muller et al. J Allergy Clin Immunol .101: 747-54,1998；Tarzi et al.Clin Exp Allergy.36：465-74,2006；Fellrath et al.J Allergy Clin Immunol · 111 :854-61，2003)，而一些研究已經證明，基于主要貓過敏原Fel dl的結構的肽可用于誘導減弱的臨床反應(諾曼等人，美國呼吸與重癥護理醫學154:1623-8，1996;馬克特等人，變態反應與臨床免疫學雜志101:506-13，1998;佩內等人，變態反應與 臨床免疫學雜志102:571-8，1998;奧德菲爾德等人，柳葉刀360:47-53，2002;亞歷山大等 人，臨床與實驗變態反應35:52-8，2004;亞歷山大等人，變態反應60:1269-74，2005 (Norman et al.,Am J Respir Crit Care Med 154：1623-8,1996；Marcotte et al.,J Allergy Clin Immunoll01:506_13，1998;Pene et al.，J Allergy Clin Immunoll02:571_8，1998; Oldfield et al.Lancet 360:47-53,2002；Alexander et al.Clin Exp Allergy 35:52-8,2004;Alexander et al.Allergy 60:1269_74,2005))。最近，IIa期試驗確認了來自Fel dl的七肽混合物（Toleromune貓.◎，英國牛津切爾卡西亞公司（Toleromune Cat?，Cicassia Ltd.，0xford，UK)的安全性、耐受性和潛在功效(沃爾姆等人，變態反應與臨床免疫學雜志 127:89-97,2011(Worm et al.J Allergy Clin Immunol.l27:89-97,2011))，同時IIb期試 驗正在進行中（莫達維爾和拉爾克，變態反應66:784-91，2011;沃爾姆等人，調研藥物專家 評論22(10) :1347-1357，2013(Moldaver&Larche. AlIergy .66 :784-91，2011; Worm et al .Expert Opin· Investig.Drugs.22( 10): 1347-1357,2013))。發展此類策略的關鍵是保 留T細胞表位，這樣可誘導T細胞表型改變。
[0009] 能夠直接結合到MHC II類分子上的能力使得肽可由非專業或不成熟的APC呈遞， 而無需促進誘導應答性T細胞（莫達維爾和拉爾克，變態反應66:784-91，2011 (Moldaver& Larche,Allergy 66:784-91，2011))和/或表達MHC II類的其他CD4+T細胞中的耐受性、無 反應性和/或抑制活性的促炎性和共同刺激性信號。這還允許肽以比從整個分子加工的肽 更高的頻率呈遞(圣安布羅焦等人，美國科學院院報，1999,96:15056-61(3 &1^&1111^(^丨〇6七 al.Proc Natl Acad Sci U S A，1999,96:15056-61))，并且因為它們還比整個過敏原更安 全，肽可以更高濃度提供，因此更有效地復極化T細胞應答。
[0010] 重要的是，靶向特異于主要過敏原的顯性T細胞表位的T細胞可改變對完整過敏原 提取物的應答(連鎖抑制）。報道在鼠過敏模型中獲得肽免疫療法成功的許多研究表明，給 予主要過敏原的顯性T細胞表位肽不僅誘導對這些肽的耐受性還誘導對純化過敏原和完整 過敏原提取物的耐受性(楊等人，臨床與實驗變態反應40(4):668-78,2010;吉富町等人，肽 科學雜志13(8) :499-503，2007;馬拉蘇埃拉等人，分子免疫學雜志45(2) :438-45，2008;魯 帕等人，變態反應67(1) :74-82,2012;霍因等人，實驗醫學雜志178(5): 1783-8,1993;哈勒 等人，疫苗21(5-6):549-61，2003(Yang et al.Clin Exp Allergy 40(4):668-78,2010; Yoshitomi et al.J Pept Sci.13(8):499-503,2007；Marazuela et al.Mol Tmmunol.45 (2):438-45,2008；Rupa et al.Allergy.67(I)：74-82,2012；Hoyne et al.J Exp Med.178 (5)：1783-8,1993；Ηβ11 et al.Vaccine.21(5-6)：549-61,2003))〇
[0011] 因此，存在鑒別主要花生過敏原，以及進一步地鑒別這些過敏原的T細胞表位兩者 的需要。這些T細胞表位的鑒別、表征和分析對于發展特定的免疫治療方法學或預防方法學 是關鍵的。為此，盡管Ara h 1和/或Ara h 2花生過敏原分子之前已成為分析的主題，但T細 胞核心表位區的鑒別是開發有效疫苗所必須的。
[0012] 在進行本發明的工作中，已鑒別出顯性HLA簡并Ara h 1和/或Ara h 2核心T細胞 表位區。這組核心T細胞表位區的獨特之處在于其高功效水平。不同于之前研究的僅基于其 表現一定T細胞反應性水平的能力而被鑒別的20mer Ara h 1和/或Ara h 2肽，已經鑒別出 一組選定的核心T細胞表位區，這組核心T細胞表位區相對于其他Ara h 1和/或Ara h 2肽 片段是免疫顯性的，并且由于其結合至兩種或更多種HLA類型也是HLA簡并的。再進一步，這 些T細胞表位核心區中的許多由HLA-DQ分子呈遞。HLA-DQ分子在混合種群中比HLA-DR分子 更保守。因此，在HLA-DQ上呈遞的肽實現更廣泛的群體覆蓋。
[0013] 在再進一步的研究中還確定的是，七個這些含有Ara h 1和Ara h 2T細胞表位兩 者的肽的特定亞組提供特別有效的免疫效果。因此，對這個獨特有效群組的肽的鑒別促進 了用于治療以下病狀的特別有效的治療性預防方法的發展，所述病狀特征在于對Ara hi 和/或Ara h 2或其衍生物或同系物、其他樹堅果過敏、或含有Ara h 1和/或Ara h 2分子的 組合物諸如食物中的過敏原的異常、不當或其他方面不需要的免疫應答。

【發明內容】

[0014] 貫穿本說明書及其后的權利要求書，除非上下文另有要求，否則詞語"包括 (comprise)"以及變型諸如"包括(comprises)"或"包括(comprising)"應當被理解成是指 包含一個提及的整體或步驟或者多個整體或步驟的組，但不排除任何其他整體或步驟或者 多個整體或步驟的組。
[0015] 如在此所使用的，術語"源自"應被理解為表示具體整體或整體組來源于指定物 種，但不一定直接獲自指定來源。此外，如在此使用的，單數形式"一種(a)"、"一種(an)"以 及"該"包括復數個指示物，除非上下文中另外明確指明。
[0016] 除非另外定義，在此所使用的全部技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域之 內的普通技術人員通常所理解的相同的意思。
[0017] 本說明書含有使用程序PatentIn版本3.5制作的氨基酸序列信息，該信息在此于 參考書目后示出。每個氨基酸序列在序列表中以數字指示符〈210>繼之以序列標識符（例 如，〈210>1、〈210>2等)來標識。每個序列的長度、序列類型(蛋白質等)生物體來源分別由數 字指示符字段〈211>、〈212>和〈213>中提供的信息來指示。說明書中所提及的氨基酸序列由 指示符SEQ ID NO:繼之以序列標識符(例如，SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2等)來標識。說明書 中所提及的序列標識符與序列表中數字指示符字段〈400>繼之以序列標識符(例如，〈400> 1、〈400>2等）中提供的信息相關聯。即，如在本說明書中所詳述的SEQ ID NO: 1與在序列表 中指不為〈400>1的序列相關。
[0018] 本發明的一個方面涉及一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含來自由以下 各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的至少五個：
[0019] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0020] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0021] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0022] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0023] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0024] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0025] (vii)LRPXEQHLM(SEQ ID NO：7)
[0026] (viii)ENNQRXMXEA(SEQ ID N0：8)
[0027] 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸，并且所述組合物包 含選自SEQ ID N0S: 1-6的至少一個T細胞表位區和選自SEQ ID N0S:7-8的至少一個T細胞 表位區。
[0028] 在另一個方面中，所述LRPXEQHLM為LRPSEQHLM(SEQ ID N0:137)。
[0029] 在又另一個方面中，所述ENNQRXMXEA為ENNQRSMSEA(SEQ ID N0:138)。
[0030] 根據本發明的這些方面和實施例，所述組合物包含所述T細胞表位區中的至少6 個。
[0031] 在另一個方面中，所述組合物包含所述T細胞表位區中的至少7個。
[0032] 在又另一個方面中，所述組合物包含所述8個T細胞表位區中的每個。
[0033] 在另一個方面中，在此提供一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含來自由 以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的每個：
[0034] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0035] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0036] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0037] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0038] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0039] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0040] (vii)LRPXEQHLM(SEQ ID NO：7)
[0041] (viii)ENNQRXMXEA(SEQ ID N0：8)
[0042] 或其功能性衍生物或同系物，其中所述殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。
[0043] 在又另一個方面中，在此提供一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含來自 由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的每個：
[0044] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0045] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0046] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0047] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0048] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0049] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0050] (vii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：137)
[0051 ] (viii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：138)
[0052] 或其功能性衍生物或同系物。
[0053] 在相關的方面中，本發明涉及一種包含一種或多種肽的免疫調節組合物，這些肽 中的每個的長度多達60個連續的氨基酸，并且這些肽包含上文所詳述的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區組合中的每個。
[0054]在另一個方面中，本發明涉及一種包含一種或多種肽的免疫調節組合物，這些肽 中的每個的長度多達60個連續的氨基酸，并且這些肽包含來自由以下各項組成的清單的 Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的每個：
[0055] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0056] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0057] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0058] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0059] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0060] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0061 ] (vii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0：7)
[0062] (viii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0：8)
[0063] 或其功能性衍生物或同系物。
[0064] 在又另一個方面中，所述肽或T細胞表位區當呈遞至從患有特征在于對Ara hi和/ 或Ara h 2或對存在于包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物諸如食物中的過敏原的異常、不 需要或其他方面不當的免疫應答的病狀的受試者分離的T細胞時能夠修飾T細胞功能，但這 些肽不能結合Ara h 1特異性和/或Ara h 2特異性IgE。
[0065] 根據這些方面，所述肽選自由以下各項組成的清單：
[0066] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTIV(SEQ ID NO：11)
[0067] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0068] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0069] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0070] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0071] (vi)ANLRPXEQHLM(SEQ ID NO：15)
[0072] (vii)EFENNQRXMXEALQ(SEQ ID NO：16)
[0073] (viii)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：17)
[0074] (ix)⑶VF頂PAAHPVAINASSE(SEQ ID N0:18)
[0075] (x)SQLERANLRPXEQHLM(SEQ ID NO：19)
[0076] (xi)ELNEFENNQRXMXEALQ(SEQ ID N0：20)
[0077] (xii)FQNLQNHRIV(SEQ ID N0：21)
[0078] (xiii)RIVQIEAKPNTLV(SEQ ID N0：22)
[0079] (xiv)ENNEGVIVKVSKE(SEQ ID N0：23)
[0080] (xv)EVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：24)
[0081] (xvi)EFENNQRXMXEALQQI(SEQ ID N0：25)
[0082] (xvii)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD(SEQ ID N0：26)
[0083] (xviii)ELNEFENNQRXMXEALQQI(SEQ ID N0：27)
[0084] (xx)WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID N0：28)
[0085] (xxi)⑶VF頂PAAHPVAINASS(SEQ ID N0:29)
[0086] 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。
[0087] 在一個實施例中，所述殘基X為絲氨酸。
[0088]在另一個方面中，所述肽選自：
[0089] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0090] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0091] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0092] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0093] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0094] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ ID N0：31)
[0095] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ ID N0：32)
[0096] (viii)EVKPDKKNPQLQD(SEQ ID N0：24)
[0097] (ix)EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0：33)
[0098] 或其功能性衍生物或同系物。
[0099] 在另一個方面中，所述免疫調節組合物包含來自由以下各項組成的清單的Ara hi 和Ara h 2T細胞肽中的每個：
[0100] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)；
[0101] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)；
[0102] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:34#P/SEVKPDKKNPQLQD(SEQIDN0 :24);
[0103] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID N0：13)；
[0104] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID N0：14)；
[0105] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ ID N0:31);以及
[0106] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ ID N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)。
[0107] 或其功能性衍生物或同系物。
[0108] 在又另一個方面中，本發明人已設計出一個優選的七種肽的組，這些肽中的五種 包含Ara h IT細胞表位且這些肽中的兩種包含Ara h 2T細胞表位，當一起給予時這些肽特 別有效地起作用從而誘導脫敏或耐受并且由此預防性地或有療效地治療對包含Ara h 1 和/或Ara h 2的組合物諸如食物的超敏反應。這些肽為：
[0109] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0110] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0111] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:4#P/SEVKPDKKNPQLQD(SEQIDN0:24)
[0112] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0113] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0114] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ NO：31)
[0115] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)
[0116] 在仍然又另一個方面中，在此提供一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含 來自由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞肽中的每個：
[0117] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0118] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0119] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:4#P/SEVKPDKKNPQLQD(SEQIDN0:24)
[0120] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0121] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0122] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ NO：31)
[0123] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)
[0124] 在仍然又另一個方面中，在此提供一種組合物，該組合物包含來自由以下各項組 成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞肽中的每個：
[0125] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTIV(SEQ ID NO：11)
[0126] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：30)
[0127] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:4#P/SEVKPDKKNPQLD(SEQIDN0:24)
[0128] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0129] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0130] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ NO：31)
[0131] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)
[0132] 當給予患有特征在于Ara h I和/或Ara h 2超敏或對包含Ara h I和/或Ara h2的 組合物超敏的病狀的受試者時，這些肽能夠減輕所述超敏。
[0133] 本發明涉及一種包含上文所定義的肽的組合物。但應當理解，主題組合物可包含 另外的組分，諸如另外的肽。可包含在組合物中的其他肽的實例包括但不限于：
[0134] (i)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：34)
[0135] (ii)NNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID N0：35)
[0136] (iii)SQLERANLRPXEQ(SEQ ID NO：36)
[0137] (iv)ELNEFENNQRXM(SEQ ID NO：37)
[0138] (v)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：38)
[0139] (vi)NNFGKLFEVKPDKKNPQL(SEQ ID N0：40)
[0140] (vii)SQLERANLRPXEQH(SEQ ID NO：41)
[0141] (viii)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：42)
[0142] (ix)RELRNLPQQXGLRA(SEQ ID N0：43)
[0143] (x)KAMVIVVVNKG(SEQ ID N0：44)
[0144] (xi)AMVIVVVNKGTGNLELV(SEQ ID NO：45)
[0145] (xii)VVNKGTGNLELVAVRK(SEQ ID N0：46)
[0146] 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。
[0147] 在另一個方面中，本發明提供一種核酸分子組合物，該核酸分子組合物包含對編 碼上文所定義的T細胞表位和肽或其衍生物、同系物或類似物的序列進行編碼或與之互補 的一種或多種核酸分子。
[0148] 在另一個方面中，本發明提供一種用于治療和/或預防受試者的病狀的方法，該病 狀的特征在于對Ara h 1和/或Ara h 2或對包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物中的過敏 原的異常、不需要或其他方面不當的免疫應答，所述方法包括在足以消除或減少所述受試 者中針對所述Ara h 1和/或Ara h 2或其他過敏原的T細胞的存在或功能的條件下向所述 受試者給予有效量的如上文所定義的免疫調節組合物，持續一段時間。
[0149] 在又一個方面中，所述病狀是對花生或含有Ara h 1和Ara h 2或者Ara h ISAra h 2類似分子的樹堅果，諸如榛子、杏仁或巴西堅果超敏。
[0150]在另一個方面中，所述方法使得對Ara h 1和/或Ara h 2或所述組合物的其他過 敏原脫敏或誘導對這些的免疫耐受。
[0151]在另一個方面中，所述脫敏或耐受通過誘導T細胞無反應性或凋亡來實現。
[0152] 在又另一個方面中，所述脫敏或耐受通過誘導Ara h 1或Ara h 2特異性Treg細胞 來實現。
[0153] 本發明的另一個方面涵蓋如上文所定義的免疫調節組合物在制造用于治療哺乳 動物的病狀的藥物中的用途，該病狀特征在于對Ara h 1和/或Ara h 2的異常、不需要或其 他方面不當的免疫應答。
[0154] 優選地所述病狀是對花生或含有Ara h 1和/或Ara h 2或者Ara h 1和/或Ara h 2類似分子的樹堅果諸如榛子超敏。
[0155] 在又另一個方面中，本發明涵蓋一種包含如上文所定義的組合物以及一種或多種 藥學上可接受的載體和/或稀釋劑的疫苗。所述組合物被稱為活性成分。
[0156] 本發明的又一個方面涉及如上文所定義的當用于本發明的方法時的組合物。
[0157] 附圖簡要說明
[0158] 圖1是對肽特異性PBMC T細胞的CFSE篩選的圖形表示：（A)來自花生過敏受試者的 與完整花生提取物或Vax(7肽編譯)一起孵育的CFSE標記的PBMC。方框示出了活化增殖CD4+ T細胞(CD25+CFSE10)的百分比。SI指示相比無抗原對照的T細胞活化的成倍增加。（B)響應 于7名受試者（均具有陽性SI >2.5)中的Vax(7肽編譯）的花生過敏供體PBMC CD4+T細胞活 化和增殖的確認。
[0159] 圖2是嗜堿性粒細胞活化檢驗(BAT)的圖形表示：（A)示出來自花生過敏受試者的 與完整花生提取物或Vax(7肽編譯）一起孵育的血液的FACS圖。嗜堿性粒細胞被標識為 IgEhi細胞(方框，第一個圖）且活化嗜堿性粒細胞被標識為CD63hi (方框，第2-4個圖）。（B) BAT數據；以及(C)來自與增大濃度(μg/ml)的完整花生提取物或Vax-起孵育后的花生過敏 受試者的組胺釋放數據(通過商業試劑盒測量）。陽性對照是抗-IgE和fMLP。完整花生提取 物致使高水平的嗜堿性粒細胞活化和組胺釋放，但Vax不會。數據代表所測試的14名花生過 敏受試者。
[0160]圖3是用于鑒別主要花生過敏原Ara h 1和Ara h 2的顯性表位的方法的示意性表 不。
[0161] 圖4是設計用來檢測顯性20-mer肽誘導花生過敏供體的完整PBMC中的T細胞增殖 的能力的7天CFSE測定的圖形表示。方框中的數字指示分裂(CFSE-low)CD4+T細胞的％，SI =相比未刺激對照的分裂細胞的成倍增加。
[0162] 圖5是示出了T細胞系對Ara h 120-mer肽的應答頻率的圖形表示。方框指示最終 選擇(基于多項參數)的9種顯性20-mer。
[0163] 圖6是對顯性Ara h 120-mer的PBMC篩選的圖形表示。測試顯性20-mer靶向來自花 生過敏供體的PBMC中的特異性⑶4+T細胞的能力。
[0164] 圖7是示出了T細胞系對Ara h 220-mer肽的應答頻率以及每20-mer的特異性TCL 數目的圖形表示。方框指示基于多項參數而最終選擇的4種顯性20-mer肽。
[0165] 圖8是核心T細胞表位作圖結果的圖形表示。
[0166] 圖9是顯性Ara h 1和Ara h 2T細胞表位的HLA限制的圖形表示。
[0167] 圖10是其中所選半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基置換的肽的T細胞識別的圖形表示。 如通過3H胸苷攝取測定的響應于"親本"（含半胱氨酸的）或絲氨酸取代的Ara h 2肽的TCL 增殖。圖示出了針對各個表位的代表性TCL(平均cpm重復孔+SD) ^Ara h 2(32-44) ;B)Ara h 2(37-47);C)Ara h 2(91-102);D)Ara h 2(95-107);E)Ara h 2(128-141)。
[0168] 圖11是響應于其中所選半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基置換的肽的T細胞細胞因子產 生的圖形表示。通過ELISP0T測定的響應于"親本"或半胱氨酸取代的Ara h 2肽的細胞因子 分泌。圖示出了針對各個表位的代表性TCL(平均重復孔斑點+SD)。幾-4,黑條；IL-5,陰影 條；IFN-γ，白條；A)Ara h 2(32-44);B)Ara h 2(37-47);C)Ara h 2(91-102);D)Ara h 2 (95-107);E)Ara h 2(128-141)。
[0169] 圖12是對肽庫與完整花生的PBMC應答的圖形表示。各個庫中所包含的肽在表23中 示出。P值示出威爾科克森(Wilcoxon)配對符號秩檢驗(用于非參數數據）。
[0170] 圖13是對肽庫與完整花生的PBMC應答的圖形表示。各個庫中所包含的肽在表23中 示出。P值示出威爾科克森配對符號秩檢驗(用于非參數數據）。
[0171] 圖14是包括對優選的7肽庫的PBMC T細胞應答的圖形表示。統計:用于非參數數據 的克魯斯卡爾-瓦利斯二氏檢驗與用以測試多個組之間的差異的事后校正。*由于在針對不 同庫分析的不同群組中的不同受試者的應答量級的變化，而歸一化為對完整花生的應答％ 的數據。
[0172] 圖15是Ara h 2肽誘導的T細胞增殖抑制的圖形表示。
[0173] 圖16是Ara h 1肽誘導的抑制T細胞增殖的圖示。
[0174]發明的具體說明
[0175] 本發明部分依據Ara h 1和Ara h 2表位組的鑒別，當以至少5個一組一起給予時， 這些表位產生的免疫效果比任何這些表位單獨使用或與這些或其他Ara h 1或Ara h 2肽 的組合一起使用所產生的免疫效果更有效。具體地說，已確定的是，使用所有八個表位產生 特別且異常有效的功能結果，當這八個表位在此處例證的七肽背景下給予時尤其如此。這 種組合物的設計使得能夠開發相比迄今可用的顯著更有效的治療性和預防性組合物和治 療方法，用于諸如但不限于花生過敏的病狀。
[0176] 因此，本發明的一個方面涉及一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含來自 由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的至少五個：
[0177] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0178] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0179] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0180] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0181] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0182] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0183] (vii)LRPXEQHLM(SEQ ID NO：7)
[0184] (viii)ENNQRXMXEA(SEQ ID N0：8)
[0185] 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸，并且所述組合物包 含選自SEQ ID N0S: 1-6的至少一個T細胞表位區和選自SEQ ID N0S:7-8的至少一個T細胞 表位區。
[0186] 在一個實施例中，所述LRPXEQHLM為LRPSEQHLM(SEQ ID N0:137)。
[0187] 在另一個實施例中，所述ENNQRXMXEA為ENNQRSMSEA(SEQ ID N0:138)。
[0188] 根據本發明的這些方面和實施例，所述組合物包含所述T細胞表位區中的至少6 個。
[0189] 在另一個實施例中，所述組合物包含所述T細胞表位區中的至少7個。
[0190] 在又另一個實施例中，所述組合物包含所述8個T細胞表位區中的每個。
[0191]根據此實施例，由此提供一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含來自由以 下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的每個：
[0192] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0193] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0194] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0195] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0196] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0197] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0198] (vii)LRPXEQHLM(SEQ ID NO：7)
[0199] (viii)ENNQRXMXEA(SEQ ID N0：8)
[0200] 或其功能性衍生物或同系物，其中所述殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。
[0201] 在另一個實施例中，在此提供一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含來自 由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的每個：
[0202] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0203] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0204] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0205] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0206] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0207] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0208] (vii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：137)
[0209] (viii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：138)
[0210]或其功能性衍生物或同系物。
[0211] 在相關的方面中，本發明涉及一種包含一種或多種肽的免疫調節組合物，這些肽 中的每個的長度多達60個連續的氨基酸，并且這些肽包含上文所詳述的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區組合中的每個。
[0212] 根據此方面，本發明涉及一種包含一種或多種肽的免疫調節組合物，這些肽中的 每個的長度多達60個連續的氨基酸，并且這些肽包含來自由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的每個：
[0213] (i)FQNLQNHR(SEQ ID N0：1)
[0214] (ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
[0215] (iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
[0216] (iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0217] (v)EGALML(SEQ ID N0：5)
[0218] (vi)IMPAAHP(SEQ ID N0：6)
[0219] (vii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0：7)
[0220] (viii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0：8)
[0221] 或其功能性衍生物或同系物。
[0222] 在本發明前述方面的另一個實施例中，所述肽或T細胞表位區當呈遞至從患有特 征在于對Ara hi和/或Ara h 2或對存在于包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物諸如食物中 的過敏原的異常、不需要或其他方面不當的免疫應答的病狀的受試者分離的T細胞時能夠 修飾T細胞功能，但這些肽不能結合Ara h 1特異性和/或Ara h 2特異性IgE。
[0223] 不以任何方式限制本發明，花生含有許多蛋白質，其中在SDS-PAGE上可見的特征 帶的數目取決于所使用的方法。在高壓液相色譜法之后至多53個帶是可見的(德容等人，臨 床與實驗變態反應28:743-51，1998(de Jong et al.，Clin Exp Allergy 28:743-51， 1998))。這些蛋白質中僅兩種使用標準準則證實分類為主要過敏原，由此IgE反應性在超過 50%的花生過敏群體中出現;這些蛋白質被稱為Ara h 1和Ara h 2(伯克斯等人，變態反應 53:725-30，1998(Burks et al. ,Allergy 53:725-30,1998))。盡管許多研究表明這兩種過 敏原中Ara h 2是更強的（布蘭克等人，臨床與實驗變態反應2009;39(8) :1277-85;科佩爾 蒙等人，臨床與實驗變態反應2004; 34(4): 583-90;帕爾默等人，臨床免疫學2005; 115(3): 302-12(Blanc et al.Clin Exp Allergy.2009；39(8)：1277-85；Koppelman et al.Clin Exp Allergy.2004；34(4):583-90;Palmer et al.Clin Immunol.2005；115(3):302-12)), Ara h I也在花生過敏的發病機理中起到主要作用，其中大量研究報道了癥狀嚴重程度與 針對Ara h 1和Ara h 2兩者的IgE反應性之間的強關聯（古拉曼等人，變態反應2012;67 (2): 242-7;蔣等人，兒科變態反應和免疫學2009; 21 (2Pt 2): Θ429-38;阿斯蘭拿等人，變態 反應2010,65(9): 1189-95;木烏拉等人，變態反應與免疫學國際檔案2011; 156(3) :282-90; 林等人，微生物學和免疫學雜志2012;皮特斯等人，臨床與實驗變態反應2007;37(I): 108-15(Glaumann et al·AlIergy·2012;67(2):242-7;Chiang et al.Pediatr Allergy Immunol.2009;21(2Pt 2):e429_38;Asarnoj et al.Allergy.2010,65(9):1189_95; Moverare et al.Int Arch Allergy Immunol2011;156(3):282-90;Lin et al.J Microbiol Immunol Infect.2012；Peeters et al.Clin Exp Allergy.2007；37(1)：108-15)) Jra h I是花生中最豐富的主要過敏原，占總花生蛋白的12%-16%(科佩爾蒙等人， 變態反應2001; 56(2): 132-7(Koppelman et al .Allergy · 2001; 56(2): 132-7)) 〇
[0224] 仍然不以任何方式限制本發明，Ara h 1過敏原為7S種子貯藏糖蛋白或豌豆球蛋 白。花生中Ara h 1的濃度隨著核仁尺寸而增大(4-16mg提取的Ara hl/g花生），因此蛋白質 的表達與花生成熟度相關聯(波梅斯等人，2006,臨床與實驗變態反應36(6) :824-30(P〇m6s et al.2006，Clin.Exp.Allergy 36(6):824_30))。厶抑h 1是通過單體遠端處的疏水區保 持在一起的同源三聚體，其中定位有大多數IgE結合B細胞表位。每個64.5kD單體具有由兩 個核心β-桶組成的cup in基序，每個β-桶與α-螺旋的環結構域締合。
[0225] Ara h 2是已被鑒別為羽扇豆球蛋白種子貯藏家族成員的糖蛋白。Ara h 2的20% 分子量代表碳水化合物側鏈，并且其作為雙聯體在SDS-PAGE上迀移，平均分子量為17.5kDa (伯克斯等人，變態反應與免疫學國際檔案119:165-172，1992(Burks et al，Int Arch Allergy Immunolll9:165_172，1992))。基于Ara h 2與6/6測試血清的反應性，Ara h 2被 表征為主要過敏原(伯克斯等人，1992,同上(Burks et &1，1992,8卯瓜））。其他人也證實了 Ara h 2的重要性;克拉克(Clarke)證實，依據對粗花生提取物的蛋白質印跡法，71%的受 試者具有特異于Ara h 2的IgE。克勒貝爾-揚克(Kleber-Janke)等人已證實依據蛋白質印 跡法85 %的受試者具有針對其重組形式的IgE，而德容的小組已表明其小組中的約78 %表 現出特異于純化天然Ara h 2的IgE(克拉克等人，臨床與實驗變態反應28:1251-7,1998;德 容等人，1998同上；克勒貝爾-揚克等人，變態反應與免疫學國際檔案119: 265-274,1999 (Clarke et al·，Clin Exp Allergy28:1251-7,1998;de Jong et al,1998supra；Kleber-Janke et al·，Int Arch Allergy Immunolll9:265-274,1999))〇
[0226] 提及"Ara h Γ應當理解成提及此分子的所有形式，包括提及可由Ara h ImRNA的 選擇性剪接所產生的任何同工型，或Ara h 1的功能性突變體或多態形式。這應再進一步理 解為延伸至由Ara h 1基因編碼的任何蛋白質，任何亞單元多肽，諸如可能會產生的前體形 式，無論作為單體、多聚體還是融合蛋白存在。還包括提及Ara h 1類似物或等效物，這些可 能在出于生成諸如食品添加劑的產品的目的而合成生成天然包含Ara h 1的產品的情況下 出現。本發明因此提供T細胞表位和將其用于診斷和治療特征在于對Ara h 1或Ara h 1類 似分子超敏(諸如花生過敏或樹堅果過敏)或對存在于組合物諸如食物（該組合物也包含 Ara h 1)中的過敏原過敏的任何病狀的方法。優選地，所述Ara h 1包含以SEQ ID N0:9列 出的序列，并且Ara h 2包含以SEQ ID N0:10列出的序列。
[0227] 提及"T細胞"應當理解成提及包含T細胞受體的任何細胞。在此方面，T細胞受體可 包含α、β、γ或δ鏈中的任何一個或多個。本發明并不旨在局限于T細胞的任何具體功能性子 類，但在優選實施例中，主題T細胞為T輔助細胞并且仍然更優選地為Th2型細胞和/STreg 細胞。在此方面，提及"修飾T細胞功能"應當理解成提及修飾T細胞能夠執行的任何一種或 多種功能。例如，主題功能可以是增殖、分化或其他形式的細胞功能活動，諸如細胞因子產 生。在一個實施例中，主題功能活動是增殖。
[0228] 就從患有特征在于對Ara hi和/或Ara h 2或對包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合 物的異常、不需要或不當的免疫應答的病狀的受試者分離的T細胞"功能修飾"而言，應理解 這不一定是提及修飾給定的生物樣品中的全部T細胞的功能，而實際上可能是反映樣品中 僅一些T細胞的功能修飾。例如，給定T細胞樣品中僅一部分T輔助細胞可以在功能上響應于 與主題肽接觸。這種部分應答應理解成在本發明的范圍內。還應當理解，源自受試者的T細 胞可以是新鮮收獲的T細胞或它們可以在測試之前已經歷某種形式的體外或體內操作。例 如，T細胞系可以從細胞樣品中產生，并且正是這些T細胞系隨后形成根據本發明測試的源 自受試者的T細胞群。就主題功能活動是T細胞增殖來說，優選地如在此披露地進行T細胞增 殖測定。仍然更優選地，T細胞功能的主題修飾是誘導增殖。在此方面，提及"Ara h 1-反應 性"或"Arah 2-反應性"T細胞應當理解成提及在功能上分別響應于Ara h 1和/或Ara h 2T 細胞表位的HLA呈遞的T細胞。類似地，提及"Ara h 1特異性"或"Arab 2特異性" IgE應當理 解成提及分別針對Ara h 1或Ara h 2B細胞表位的IgE。
[0229] 提及"異常、不需要或其他方面不當的"免疫應答應當理解成提及任何形式的生理 活性，其涉及一種或多種免疫細胞的活化和/或功能化，免疫細胞的活性的不當之處在于其 為不當的類型或進展至不當的程度。異常之處可能在于，根據已知的免疫學原理，其在應該 發生時不發生，或者其在不應發生時發生。在另一個實例中，免疫應答的不當之處可能在于 其為生理上正常的應答，但是不必要的和/或不需要的，諸如關于對無害的過敏原的I型超 敏反應所發生的。在本發明的上下文中，這種免疫應答可針對Ara h 1和/或Ara h 2或它可 針對與Ara h 1和/或Ara h 2-起存在于組合物中的不同過敏原。在不將本發明限于任一 種理論或作用模式的情況下，已確定的是，甚至在超敏反應針對Ara h 1和/或Ara h 2以外 的過敏原時，該過敏原存在于仍然包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物中，經由針對Ara h 1和/或Ara h 2的本發明方法的治療仍然誘導Th2和Treg功能性的有益調節，使得所存在的 對無關過敏原的超敏仍然被減少。優選地所述免疫應答為花生超敏。
[0230] "花生超敏"意指誘導IgE介導的花生超敏的臨床癥狀。然而，應當理解雖然臨床癥 狀可能是明顯的，但不是所有這樣的個體必定會表現出使用Kallestad Allercoat EAST系 統（美國賽諾菲巴斯德公司（Sanofi-Pasteur Diagnostics，USA))測量的可檢測水平的花 生特異性血清IgE，，不過這樣的個體仍然應理解為落在表現出"花生超敏"的那些人的定義 的范圍內。可替代地，試驗可利用任何EAST、Pharmacia或UniCap系統或過敏原皮刺試驗來 進行。提及"Ara h 1和/或Ara h 2超每女"應當理解成具有在對Ara h 1和/或Ara h 2蛋白質 的反應性的情形中相對應的含義。
[0231] 根據前述方面，所述肽選自由以下各項組成的清單：
[0232] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0233] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0234] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0235] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0236] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0237] (vi)ANLRPXEQHLM(SEQ ID NO：15)
[0238] (vii)EFENNQRXMXEALQ(SEQ ID NO：16)
[0239] (viii)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：17)
[0240] (ix)⑶VF頂PAAHPVAINASSE(SEQ ID N0:18)
[0241] (x)SQLERANLRPXEQHLM(SEQ ID NO：19)
[0242] (xi)ELNEFENNQRXMXEALQ(SEQ ID N0：20)
[0243] (xii)FQNLQNHRIV(SEQ ID N0：21)
[0244] (xiii)RIVQIEAKPNTLV(SEQ ID N0：22)
[0245] (xiv)ENNEGVIVKVSKE(SEQ ID N0：23)
[0246] (xv)EVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：24)
[0247] (xvi)EFENNQRXMXEALQQI(SEQ ID N0：25)
[0248] (xvii)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD(SEQ ID N0：26)
[0249] (xviii)ELNEFENNQRXMXEALQQI(SEQ ID N0：27)
[0250] (xx)WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID N0：28)
[0251] (xxi)⑶VF頂PAAHPVAINASS(SEQ ID N0:29)
[0252] 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。
[0253] 在一個實施例中，所述殘基X為絲氨酸。
[0254] 優選地，所述肽選自：
[0255] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0256] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0257] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：4)
[0258] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0259] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0260] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ ID N0：31)
[0261] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ ID N0：32)
[0262] (viii)EVKPDKKNPQLQD(SEQ ID N0：24)
[0263] (ix)EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0：33)
[0264] 或其功能性衍生物或同系物。
[0265] 在另一個實施例中，所述免疫調節組合物包含來自由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞肽中的每個：
[0266] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)；
[0267] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)；
[0268] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:34#P/SEVKPDKKNPQLQD(SEQIDN0 :24);
[0269] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID N0：13)；
[0270] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID N0：14)；
[0271] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ ID N0:31);以及
[0272] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ ID N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)。
[0273] 或其功能性衍生物或同系物。
[0274] 花生、Ara h 1和Ara h 2超敏(更一般地說，過敏原超敏）的減輕在下文將更加詳 細地討論。簡單地說，然而，這可以采取使個體特異性地對Ara h 1和Ara h 2或更一般地說 對花生或其他蛋白質部分或完全脫敏或耐受的形式。
[0275] 提及"肽"包括提及肽、多肽或蛋白質或其部分。肽可以是糖基化的或非糖基化的 并且/或者可以含有一系列與蛋白質融合、連接、結合或以其他方式締合的其他分子，諸如 氨基酸、脂質、碳水化合物或其他肽、多肽或蛋白質。下文中提及"肽"包括包含氨基酸序列 的肽以及與其他分子(諸如氨基酸、脂質、碳水化合物或其他肽、多肽或蛋白質)締合的肽。
[0276] "衍生物"包括來自天然、合成或重組來源的片段、部分(part/portion)以及變體， 包括融合蛋白。部分或片段包括例如主題肽的活性區。衍生物可源自氨基酸的插入、缺失或 取代。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基端融合以及單個或多個氨基酸的序列內插入。 插入型氨基酸序列變體是將一個或多個氨基酸殘基引入蛋白質中的預定位點的變體，不過 在所得產物的適合篩選下隨機插入也是可能的。缺失型變體的特征在于將一個或多個氨基 酸從序列中去除。
[0277] 取代型氨基酸變體是序列中的至少一個殘基已被移除并且在其位置處插入不同 殘基的變體。取代型氨基酸變體的實例是保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代典型地包 括在下組內的取代:甘氨酸和丙氨酸;纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬 酰胺和谷氨酰胺;絲氨酸和蘇氨酸;賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。對氨基酸序 列的添加包括用其他肽、多肽或蛋白質融合。在一個實施例中，如在此所例證，半胱氨酸殘 基被絲氨酸取代。
[0278] 主題肽的化學和功能性等效物應當理解為表現出這些分子的功能活性中的任何 一個或多個的分子并且可以源自任何來源，諸如以化學方式合成或經由諸如天然產物篩選 的篩選過程來鑒別。
[0279] 同系物包括源自除花生之外的品種的肽，諸如源自其他樹堅果的肽。
[0280] 在此涵蓋的類似物包括但不限于，對側鏈的修飾，在肽、多肽、或蛋白質合成期間 并入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用對蛋白質性分子或其類似物施加構象限制的 交聯劑和其它方法。突變體包括表現出經過修飾的功能活性的分子(例如，表達一個或多個 T細胞表位但缺乏B細胞反應性的Ara h 1肽）。
[0281] 本發明所涵蓋的側鏈修飾的實例包括諸如通過以下方式修飾氨基：通過與醛反 應，接下來用NaBH4還原進行還原烷基化;用乙酰亞氨酸甲酯進行脒化；用乙酸酐進行酰化； 用氰酸酯對氨基進行氨甲酰化；用2,4,6_三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基進行三硝基芐基化； 用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基進行酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸酯對賴氨酸磷酸 進行吡哆醛化，隨后用NaBH 4還原。
[0282] 精氨酸殘基的胍基可通過與諸如2,3_ 丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛的試劑形成雜 環縮合產物來修飾。羧基可通過經由形成〇-酰基異脲隨后衍生成例如相應的酰胺進行碳二 亞胺活化來修飾。巰基可以通過以下方法來修飾:諸如用碘乙酸或碘乙酰胺進行羧甲基化； 過甲酸氧化成磺基丙氨酸;與其他巰基化合物形成混合二硫化物;與馬來酰亞胺、馬來酸酐 或其他取代的馬來酰亞胺反應;使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸酸、氯化苯汞、2-氯汞 基-4-硝基酚和其他汞劑形成汞衍生物;在堿性pH下用氰酸酯進行氨甲酰化。色氨酸殘基可 通過例如，用N-溴代琥珀酰亞胺進行氧化或用2-羥基-5-硝基芐基溴或硫苯氯化物對吲哚 環進行烷基化來修飾。另一方面，酪氨酸可通過用四硝基甲烷進行硝化以形成3-硝基酪氨 酸衍生物來改變。
[0283] 組氨酸殘基的咪唑環的修飾可通過用碘乙酸衍生物進行烷基化或用焦碳酸二乙 酯進行N-羧甲基化來實現。
[0284] 在蛋白質合成過程中并入非天然氨基酸和衍生物的實例包括但不限于，使用正亮 氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基已酸、叔丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯 基甘氨酸、烏氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異 構體。在此涵蓋的非天然氨基酸的清單在表1中示出。
[0285] 表 1



[0290] 可以使用例如交聯劑來穩定3D構象，使用諸如具有(CH2)n間隔基團（其中η= 1至η =6)的雙官能亞氨酸酯、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯的同雙功能交聯劑和通常含有諸如 N-羥基琥珀酰亞胺的氨基反應性部分以及另一種基團特異性反應性部分的異雙功能試劑。
[0291] 有可能修飾根據本發明的肽的結構用于達成各種目的，諸如用于增大溶解度、提 高治療或預防效果、增強穩定性或增加對蛋白質降解的抗性。可通過諸如氨基酸取代、缺失 或添加產生其中氨基酸序列被改變的經修飾的肽，從而修飾免疫原性和/或減少過敏原性。 類似地，可以將組分添加至本發明的肽中以產生相同結果。
[0292] 例如，可以對肽進行修飾以使其表現誘導T細胞無反應性的能力。在這種情況下， 可使用已知技術(例如取代每個殘基并且確定T細胞反應性的存在與否）來確定用于T細胞 受體的關鍵結合殘基。在一個實例中，顯示對與T細胞受體反應所必需的那些殘基可通過用 另一個氨基酸殘基、優選類似的氨基酸殘基置換必需氨基酸(保守取代)來修飾，這個氨基 酸殘基的存在顯示可改變T細胞反應性或T細胞功能。此外，對于T細胞受體相互作用并非必 需的那些氨基酸殘基可以通過用另一個氨基酸置換來修飾，這另一個氨基酸的并入然后可 以改變T細胞反應性或T細胞功能，但不會例如消除與相關MHC蛋白質的結合。在又一個實例 中，可以產生表現正常T細胞結合但消除IgE結合的突變體肽。 「02931 元仿IlW俁奪袢取代詿怵干下丟2由.并日鈕栝.

[0296] 此類修飾將促使產生落入如在此所定義的主題肽的"突變體"范圍內的分子。"突 變體"應當理解為提及表現出一種或多種不同于非突變的肽對應物所表現的結構特征或功 能活動的妝。
[0297] 還可以對本發明的肽進行修飾以并入一種或多種由天然等位基因變異產生的多 態現象，并且可將非天然氨基酸或氨基酸類似物取代至這些肽內以產生落入本發明范圍內 的修飾的肽。還可以通過已知技術與聚乙二醇(PEG)綴合來對肽進行修飾。還可以添加報道 基團以促進純化并潛在地增加根據本發明的肽的溶解度。還可以使用其他熟知類型的修 飾，包括插入特異性內切蛋白酶切割位點、添加官能團或用疏水性更小的殘基置換疏水性 殘基，以及對編碼本發明的肽的DNA的定點誘變，以引入可用于大范圍的目的的修飾。以上 提及的對根據本發明的肽的各種修飾僅通過舉例的方式提及并且僅旨在表示可以實現的 大范圍的修飾。
[0298] 如上文所詳述的，本發明提供保留與T細胞相互作用的全部或一些能力但表現出 部分或完全抑制、消除或以其他方式下調抗體反應性的肽。可通過任何適合的方法實現抗 體反應性的下調，這些方法將為本領域技術人員所熟知。例如，在B細胞表位由其線性氨基 酸序列定義的情況下，可以添加、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基以使得突變的線性序 列不同于天然存在的序列。在表位可另外地、或可替代地由構象表位定義的情況下，可以設 法通過破壞肽的2°結構或在同源二聚體或異源二聚體存在的情況下破壞肽的3°結構來破 壞那種構象。這可以例如通過破壞據知穩定2°和/或3°結構的鍵諸如二硫鍵的形成來實現。 就上文定義的T細胞表位來說，這些T細胞表位區不包含B細胞表位。
[0299] 在相關方面中，本發明人已設計出一個優選的七種肽的組，這些肽中的五種包含 Ara h IT細胞表位且這些肽中的兩種包含Ara h 2T細胞表位，當一起給予時這些肽特別有 效地起作用從而誘導脫敏或耐受并且由此預防性地或有療效地治療對包含Ara h 1和/或 Ara h 2的組合物諸如食物的超敏反應。這些肽為：
[0300] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0301] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0302] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:4#P/SEVKPDKKNPQLQD(SEQIDN0:24)
[0303] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0304] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0305] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ NO：31)
[0306] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)
[0307] 因此，在優選的實施例中，在此提供一種免疫調節組合物，該免疫調節組合物包含 來自由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞肽中的每個：
[0308] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0309] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0310] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:4#P/SEVKPDKKNPQLQD(SEQIDN0:24)
[0311] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0312] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0313] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ NO：31)
[0314] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)
[0315] 在另一個方面中，在此提供一種組合物，該組合物包含來自由以下各項組成的清 單的Ara h 1和Ara h 2T細胞肽中的每個：
[0316] (i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)
[0317] (ii)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)
[0318] (iii)EVKPDKKNPQLQ(SEQIDN0:4#P/SEVKPDKKNPQLQD(SEQIDN0:24)
[0319] (iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)
[0320] (v)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)
[0321] (vi)ANLRPSEQHLM(SEQ NO：31)
[0322] (vii)EFENNQRSMSEALQ(SEQ N0:32)和/或EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID N0:33)
[0323] 當給予患有特征在于Ara h I和/或Ara h 2超敏或對包含Ara h I和/或Ara h 2 的組合物超敏的病狀的受試者時，這些肽能夠減輕所述超敏。
[0324] 本發明的肽可以通過重組或化學合成方式來制備。根據本發明的優選方面，在此 提供一種優先與來自患有花生超敏的個體的T細胞發生免疫反應的重組肽或其突變體，其 通過被編碼本發明肽序列的載體轉化的宿主細胞的表達來表達。可將肽與另一種肽、多肽 或蛋白質融合。可替代地，可通過化學合成技術，諸如通過梅里菲爾德(Merrifield)固相合 成程序來制備肽。此外，盡管以上所給出的序列的合成肽代表優選的實施例，但本發明還延 伸至天然存在的肽及其片段的生物上純的制劑。"生物上純的"意指如通過重量、活性或其 他適合的方式所確定的包含至少約60%、優選至少約70%、或優選至少約80%并且仍然更 優選至少約90 %或更多的制劑。
[0325] 因此本發明應當理解為涵蓋包含如上文所定義的Ara h 1和/或Ara h 2的至少一 個T細胞核心表位區，連同其他氨基酸(可能是也可能不是天然存在的）或其他化學物質的 肽。在本發明的優選方面中，此類肽可包含Ara h 1和/或Ara h 2的一個或多個表位，這些 表位是T細胞核心表位區。具有Ara h 1和/或Ara h 2的一個或多個T細胞表位的肽是增加 治療有效性所需要的。
[0326]如上文所詳述的，本發明涉及一種包含上文所定義的肽的組合物。但應當理解，主 題組合物可包含另外的組分，諸如另外的肽。這些肽可涵蓋例如核心最小表位的部分區域。 可替代地，它們可不包括如在此披露的T細胞表位的任何部分但可出于其他原因被并入。可 包含在組合物中的其他肽的實例包括但不限于：
[0327] (i)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：34)
[0328] (ii)NNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID N0：35)
[0329] (iii)SQLERANLRPXEQ(SEQ ID NO：36)
[0330] (iv)ELNEFENNQRXM(SEQ ID NO：37)
[0331] (v)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：38)
[0332] (vi)NNFGKLFEVKPDKKNPQL(SEQ ID N0：40)
[0333] (vii)SQLERANLRPXEQH(SEQ ID NO：41)
[0334] (viii)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：42)
[0335] (ix)RELRNLPQQXGLRA(SEQ ID N0：43)
[0336] (x)KAMVIVVVNKG(SEQ ID N0：44)
[0337] (xi)AMVIVVVNKGTGNLELV(SEQ ID NO：45)
[0338] (xii)VVNKGTGNLELVAVRK(SEQ ID N0：46)
[0339] 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。
[0340]考慮到具體情況的細節，還可包括可能有利的其他肽或分子。
[0341]在另一個方面中，本發明提供一種核酸分子組合物，該核酸分子組合物包含對編 碼上文所定義的T細胞表位和肽或其衍生物、同系物或類似物的序列進行編碼或與之互補 的一種或多種核酸分子。
[0342]應當理解，提及"肽"包括提及包含一個或多個T細胞表位的肽。編碼主題肽的核酸 分子優選地是脫氧核糖核酸(諸如cDNA)的序列或基因組序列。基因組序列可包含外顯子和 內含子。基因組序列還可包含啟動區或其他調節區。
[0343] 核酸分子可以接合至能夠在原核細胞(例如，大腸桿菌)或真核細胞(例如，酵母細 胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或植物細胞）中表達的表達載體。核酸分子可以與編 碼另一個實體(諸如，例如信號肽）的核酸分子接合或融合或以其他方式締合。核酸分子還 可以包含在3'或5'末端部分或在3'和5'末端部分與其融合、接合或以其它方式締合的另外 的核苷酸序列信息。核酸分子還可以是載體諸如表達載體的一部分。后一實施例有助于產 生重組形式的主題肽，這些形式被本發明所涵蓋。
[0344] 此類核酸可用于通過插入適當載體中并且轉染到適合的細胞系內來重組產生Ara h 1和/或Ara h 2或包含它們的蛋白質的T細胞表位。此類表達載體和宿主細胞系也形成本 發明的一個方面。
[0345] 在通過重組技術產生肽的過程中，將用具有編碼根據本發明的肽的序列的核酸或 核酸序列的功能性等效物轉化的宿主細胞在適合于相關特定細胞的培養基中培養。然后可 使用本領域眾所周知的技術，諸如離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法、超濾、電泳或使用特 異于肽的抗體的免疫純化將肽從細胞培養基、宿主細胞或兩者中純化。
[0346] 編碼Ara h 1和/或Ara h 2的核酸或包含Ara h 1和/或Ara h 2的T細胞核心表位 區的肽可在細菌細胞(諸如大腸桿菌）、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢 細胞(CHO))中表達。適合的表達載體、啟動子、增強子和其他表達控制元件在山姆布魯克等 人(Sambruck et al(1989))中有所提及。其他適合的表達載體、啟動子、增強子和其他表達 控制元件是本領域技術人員熟知的。酵母中適合的表達載體的實例包括Y印Sec 1(巴爾德 里等人，1987,歐洲分子生物學組織雜志，6:229-234(Balderi et al.，1987，Embo J.，6: 229-234));pMFa(庫簡和赫斯科威茨，1982，細胞，30:933-943(Kurjan and Herskowitz ·， 1982，Cell.，30:933-943));JRY88(舒爾茨等人，1987,基因，54:113-123(Schultz et al.， 1987，Gene·，54:113-123))以及pYES2(美國圣地亞哥英杰公司（Invitrogen Corporation， San Diego，CA))。這些載體可隨意地用作桿狀病毒和哺乳動物表達系統。例如，桿狀病毒系 統是可商購獲得的（美國圣地亞哥的帕明根公司（ParMingen，San Diego,CA))用于在昆蟲 細胞中表達的，而PMsg載體是可商購獲得的（新澤西皮斯卡塔韋的法瑪西亞公司 (Pharmac ia，P i s cataway，NJ))用于在哺乳動物細胞中表達。
[0347] 對于在大腸桿菌中表達，適合的表達載體尤其包括pTrc(阿曼等人，1998,基因， 69:301-315(Amann et al.，1998，Gene.，69:301-315));pGex(澳大利亞墨爾本的阿瑪蘭德 公司（Amrad Corporation ,Melbourne ,Australia)) ;pMal (馬薩諸塞州貝弗利的N. E ·生物 實驗室(N.E. Bio labs，Beverley，MA)) ;pRit5(新澤西皮斯卡塔韋的法瑪西亞公司）；pEt-1 Id (威斯康辛州麥迪遜的諾維信公司(Novagen，Maddi son，WI))(賈米勒等人，1990,病毒學 雜志，64:3963-3966( Jameel et al.，1990, J. Virol. ,64:3963-3966))以及 pSem(納普等 人，1990,生物技術，8:280-281(Knapp et al.，1990，Bio Techniques.，8:280-281))。口丁此 和pEt-lld的使用例如將導致非融合蛋白質表達。。1&11^1^5^361]1和?661的使用將使得融 合至麥芽糖E結合蛋白（pMal)、蛋白質A(pRit5)、截短的半乳糖苷酶(PSEM)或谷胱甘肽S-轉 移酶(PGex)的過敏原表達。當Ara h 1的T細胞表位或包含其的肽以融合蛋白形式表達時， 在載體蛋白與相關肽之間的融合接點處引入酶裂解位點將是特別有利的。然后可以通過在 酶位點處的酶促裂解并且使用純化蛋白質和肽的常規技術進行生化凈化，將本發明的肽從 融合蛋白中回收。不同的載體還具有不同的啟動區，從而允許組成型或誘導型表達或溫度 誘導。另外在不同大腸桿菌宿主中表達重組肽可能是適當的，這些宿主具有使重組表達的 蛋白質降解的改變的能力。可替代地，改變核酸序列以使用由大腸桿菌優先利用的密碼子 可能是有利的，其中這種核酸改變將不會影響表達的蛋白質的氨基酸序列。
[0348] 可使用諸如磷酸鈣或氯化鈣共同沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染或電穿孔的常規 技術轉化宿主細胞以表達本發明的核酸。用于轉化宿主細胞的適合方法可以見于山姆布魯 克等人（1989)和其他實驗室文本。本發明的核酸序列還可以使用標準技術以化學方式合 成。
[0349] 除重組產生根據本發明的肽之外，核酸可以用作探針用于實驗或純化目的。
[0350] 如在此披露的肽的鑒別和合成現在有助于開發一系列預防性和治療性治療方案 用于花生相關的免疫病狀。還有助于開發其中所使用的試劑。因此，本發明應當理解為延伸 至肽或其功能性衍生物、同系物或類似物在治療性和/或預防性治療患者中的用途。此類治 療方法包括但不限于：
[0351] (i)將主題肽給予受試者，作為對花生、Ara h 1和/或Ara h 2或者Ara h 1和/或 Ara h 2類似分子脫敏或誘導對這些的免疫耐受的方式。這可通過例如誘導Ara h 1和/或 Ara h 2定向的Th2無反應性或細胞凋亡來實現。在優選實施例中，這樣的結果通過使用保 持T細胞表位反應性但無法經受IgE結合的肽來獲得。可替代地，可使用這樣的治療方案:其 基于根據特定方案給予特定濃度的給定肽，以便誘導耐受。這種方法可消除Ara h 1和/或 Ara h 2超敏或它可減輕Ara h 1和/或Ara h 2超敏或對存在于包含Ara h 1和/或Ara h 2 的組合物中的過敏原敏感(諸如花生過敏）的嚴重程度。在此提及Ara h 1和/或Ara h 2敏 感的治療應當理解為在其范圍內涵蓋特征在于對包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物(諸 如，一般為花生）敏感的過敏的病狀的治療，即使這種敏感是針對除Ara h 1和/或Ara h 2 之外的過敏原。
[0352]優選地此類治療方案能夠修飾相關個體的T細胞應答或B細胞和T細胞應答兩者。 如在此所使用的，對患有花生超敏的個體的過敏反應的修飾可以被定義為誘導對Ara h 1 分子的無反應性或減少癥狀，如通過標準臨床程序所測定的（瓦爾內等人，1991英國醫學雜 志302:265-269(Varney et al.l991British Medical Journal302:265-269))。癥狀減少 包括在完成治療方案后個體對Ara h 1的過敏反應的任何減少。這種減少可以是主觀的或 例如通過使用本領域已知的標準食物激發試驗或標準皮膚試驗在臨床上測定的。
[0353]個體暴露于本發明的肽可以耐受適當的T細胞亞群或使適當的T細胞亞群無反應 性，以使得其在這種暴露后對Ara h 1和/或Ara h 2無反應并且不參與刺激免疫應答。優選 地根據本發明的肽將保留免疫顯性T細胞表位但具有消除的IgE結合。再者，即使問題中的 過敏原不是Ara h 1和/或Ara h 2,而是針對同Ara h 1和/或Ara h 2-樣存在于相同組合 物中的不同過敏原(諸如不同的花生過敏原），用Ara h 1和/或Ara h 2免疫仍然可以誘導 旁觀抑制效應，其用以降低對那種過敏原超敏的程度。
[0354]與暴露于天然存在的Ara h 1和或Ara h 2過敏原相比，給予本發明的肽可修飾細 胞因子分泌型態。這種暴露還可能影響通常參與過敏反應的T細胞亞群，以遠離正常暴露于 過敏原的位點并且朝向治療性給藥的位點迀移。T細胞亞群的這種再分布可改善或降低個 體的免疫系統在正常暴露于過敏原的位點處刺激普通免疫應答的能力，從而導致減少過敏 癥狀。
[0355] 如上文所詳述，B細胞應答的修飾可以例如經由調節由T細胞產生的細胞因子型態 來實現。具體地說，減少源自T細胞的IL-4和IL-13產生，從而減少I gE合成。
[0356] (ii)本發明的肽可以用于吸附劑從生物樣品或從患者中去除Ara h 1和/或Ara h 2定向的T細胞的能力中。
[0357] 因此，在另一個方面中，本發明提供一種用于治療和/或預防受試者的病狀的方 法，該病狀的特征在于對Ara h 1和/或Ara h 2或對包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物中 的過敏原的異常、不需要或其他方面不當的免疫應答，所述方法包括在足以消除或減少所 述受試者中針對所述Ara h 1和/或Ara h 2或其他過敏原的T細胞的存在或功能的條件下 向所述受試者給予有效量的如上文所定義的免疫調節組合物，持續一段時間。
[0358] 優選地，所述病狀是對花生或含有Ara h 1和Ara h 2或者Ara h 1或Ara h 2類似 分子的樹堅果，諸如榛子、杏仁或巴西堅果超敏。
[0359] 在一個實施例中，所述方法使得對Ara h 1和/或Ara h 2或所述組合物的其他過 敏原脫敏或誘導對這些的免疫耐受。
[0360] 在另一個實施例中，所述脫敏或耐受通過誘導T細胞無反應性或凋亡來實現。
[0361]在又另一個實施例中，所述脫敏或耐受通過誘導Ara h 1或Ara h 2特異性Treg細 胞來實現。
[0362] "有效量"意指至少部分地達到所希望的免疫應答或延遲待治療的特定病狀的發 作或抑制其進展或完全停止其發作或進展所必需的量。該量取決于待治療個體的健康和身 體狀況、待治療的個體的分類群、所希望的防護等級、組合物的配方、醫療情況的評估以及 其他相關因素而改變。所預期的是該量將在可通過常規試驗確定的相對寬的范圍內。
[0363] 治療或預防的受試者通常為哺乳動物，諸如但不限于人類、靈長類動物、牲畜動物 (例如綿羊、母牛、馬、驢、豬）、伴侶動物(例如狗、貓）、實驗室試驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、 豚鼠、倉鼠）、圈養野生動物(例如狐貍、鹿）。優選地，哺乳動物是人類或靈長類動物。最優選 地，哺乳動物是人類。
[0364] 在此提及"治療"和"預防"應被認為處于其最寬泛的情形中。術語"治療"不一定意 味著治療受試者直至完全恢復。類似地，"預防"不一定意指受試者最終將不會染上疾病病 狀。因此，治療和預防包括改善特定病狀的癥狀或預防或以其他方式降低發展特定病狀的 風險。術語"預防"可被認為是降低特定病狀的嚴重程度或發作。"治療"也降低現有病狀的 嚴重程度。
[0365] 以藥用組合物的形式給予本發明的組合物(在此被稱為"藥劑"）可通過任何便利 的方式來進行。可預期的是當以根據具體情況的量給藥時，藥用組合物的藥劑表現出治療 活性。變化取決于例如所選的人類或動物和藥劑。寬范圍的劑量可能是適用的。考慮到患 者，例如，可給予每劑量約〇. Olyg至約Img的藥劑。可以對給藥方案進行調節以提供最適宜 的治療反應。例如，每天、每周、每個月或其他適合的時間間隔可服用幾個分開劑量，或可以 按狀況的緊急程度按比例地減少劑量。在另一個實例中，最初就給予所述組合物以誘導耐 受，并且隨后如果必要的話，加強組合物給予以保持耐受。例如可每個月給予這些加強物， 并且可給予持續任何時段，包括患者的一生。
[0366] 藥劑可以方便的方式來給予，諸如通過：口服、靜脈內（可溶于水時）、腹膜內、肌肉 內、皮下、真皮內（使用或不使用傳統針刺或其他經皮遞送設備）、經皮、鼻內、舌下或栓劑途 徑或植入(例如，使用緩釋分子）。優選地，將所述組合物經真皮內給予。藥劑可以按以下形 式給予:藥學上可接受的無毒鹽，諸如酸加成鹽或例如與鋅、鐵等形成的金屬絡合物（出于 本申請的目的，其被視為鹽）。此類酸加成鹽的示例為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、馬 來酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、抗壞血酸鹽、酒石酸鹽等。如果 活性成分以片劑形式給藥，則該片劑可以含有粘合劑，諸如黃芪膠、玉米淀粉或明膠；崩解 劑，諸如藻酸；以及潤滑劑，諸如硬脂酸鎂。
[0367] 根據這些方法，根據本發明定義的藥劑可與一種或多種其他化合物或分子一起給 予。"共同給予"意指在相同配制品中或在兩種不同配制品中經由相同或不同途徑同時給 予，或通過相同或不同途徑依序給予。"依序"給予意指在給予兩種類型的分子之間存在幾 秒、幾分鐘、幾小時或幾天的時差。這些分子可以任何順序來給予。還應當理解，本發明的肽 本身可同時或依序給予。它們可作為一種或多種組合物同時或依序給予。例如，可將這些肽 中的一些配制到一種配制品中并且將其他肽配制到另一種單獨的配制品中；其中這兩種配 制品每個手臂上給予一種。可替代地，可產生另外單獨的配制品并且同時給予至不同位點 或依序給予。設計并產生適當配制品或配制品混合物的產品完全在本領域技術人員的能力 范圍之內。
[0368] 本發明的另一個方面涵蓋如上文所定義的免疫調節組合物在制造用于治療哺乳 動物的病狀的藥物中的用途，該病狀特征在于對Ara h 1和/或Ara h 2的異常、不需要或其 他方面不當的免疫應答。
[0369] 優選地所述病狀是對花生或含有Ara h 1和/或Ara h 2或者Ara h 1和/或Ara h2 類似分子的樹堅果諸如榛子超敏。
[0370] 在又另一個方面中，本發明涵蓋一種包含如上文所定義的組合物以及一種或多種 藥學上可接受的載體和/或稀釋劑的疫苗。所述組合物被稱為活性成分。
[0371] 適合于注射使用的藥物形式包括無菌水溶液(可溶于水時）或分散體和用于臨時 制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末，或者可以呈乳膏的形式或適于局部應用的其他 形式。此類藥物形式在制造和儲存條件下必須穩定并且必須被保存以防諸如細菌和真菌的 微生物污染作用。該載體可以是包含以下物質的一種溶劑或分散介質:例如，水、乙醇、多元 醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）、其適合的混合物、以及植物油。適當流動性可以 例如通過使用諸如卵磷脂的涂層、在分散體的情況下通過維持所要求的顆粒大小、以及通 過使用表面活性劑來維持。可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、 苯酚、山梨酸等來防止微生物的作用。張力調節劑可用于保持制劑與人血漿的等滲并且由 此避免組織損傷。常用的張度劑包括右旋糖、海藻糖、甘油和甘露醇。甘油和氯化鈉是其他 選擇但通常較少使用。在許多情況下，優選地包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可通過使用延 遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)的組合物來實現可注射組合物的延長的吸收。
[0372] 通過以下方式制備無菌可注射溶液:將活性化合物以所需的量根據需要與以上枚 舉的各種其他成分摻入適當的溶劑中，然后過濾滅菌。總體上，通過將各種滅菌的活性成分 摻入無菌載體中來制備分散體，該無菌載體含有基礎分散介質以及來自以上枚舉的那些的 所需其他成分。就用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，優選制備方法為真空干燥和 冷凍干燥技術，這些方法產生活性成分的粉末以及來自其以前的無菌過濾溶液的任何另外 的所需成分。
[0373] 當活性成分被適當保護時，它們可以例如與惰性稀釋劑或與可吸收的可食用載體 一起口服給予，或可以封閉在硬殼或軟殼膠囊中，或可以壓縮成片劑，或可以直接摻入飲食 的食物中。對于口服治療性給藥，可將活性化合物與賦形劑結合并且以可攝入片劑、口含片 劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等形式使用。此類組合物和制劑應含有至 少1重量％的活性化合物。當然，組合物和制劑的百分比可改變并且可優選地在單元重量的 約5%至約80%之間。此類治療有用的組合物中活性化合物的量，應使得能夠獲得適當的劑 量。制備根據本發明的優選的組合物或制劑，使得口服單位劑型含有在約〇. Iyg與1000 yg之 間的活性化合物。
[0374] 片劑、口含片劑、丸劑、膠囊等還可以含有如下所列出的組分:粘合劑，諸如樹膠、 阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠;賦形劑，諸如磷酸氫鈣;崩解劑，諸如玉米淀粉、馬鈴著淀粉、藻 酸等;滑潤劑，諸如硬脂酸鎂;并且可以添加甜味劑，諸如蔗糖、乳糖或糖精;或調味劑，諸如 薄荷、冬青油或櫻桃香料。當單位劑型為膠囊時，除上述類型的材料之外，它可含有液體載 體。各種其他材料可作為涂層存在或以其他方式修飾劑量單位的物理形式。例如，可用紫 膠、糖或兩者包覆片劑、丸劑或膠囊。糖漿劑或酏劑可含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、 作為防腐劑的對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯、染料以及諸如櫻桃或橙香料的調味劑。 當然，制備任何單位劑型中所使用的任何材料應為藥用純的并且當以大量使用時基本上無 毒。此外，可將活性化合物摻入緩釋制劑和配制品中。
[0375] 藥用組合物還可包含基因分子，諸如能夠轉染靶細胞的載體，其中該載體帶有編 碼調節劑的核酸分子。例如，該載體可為病毒載體。
[0376] 給藥途徑包括但不限于:呼吸(例如，通過氣溶膠的鼻內或口服）、氣管內、鼻咽、靜 脈內、腹膜內、皮下、顱內、真皮內、經皮、肌內、眼內、鞘內、大腦內、鼻內、輸注、口服、經直 腸、經由IV滴注、植入以及舌下。優選地，所述給藥路徑為皮下、真皮內、經皮或鼻內。
[0377] 本發明的又一個方面涉及如上文所定義的當用于本發明的方法時的組合物。
[0378] 參考以下非限制性實例對本發明來進一步描述本發明。
[0379] 實例 1
[0380] Ara h 1和Ara h 2是花生中最易引起過敏且最豐富的蛋白質，使得在治療中包含 含有其顯性T細胞表位的肽是必要的。選擇用于免疫療法的肽時的另一個重要考慮是，它們 是否可由不同MHC II類分子(人類中的HLA分子)呈遞并且因此適用于治療遺傳多樣性人類 種群。使用封閉抗體和HLA基因分型來測試肽呈遞至T細胞的HLA限制，并且顯示鑒別出的每 個T細胞表位可在兩個或更多個不同HLA分子上呈遞。此外，已證實鑒別出的T細胞表位總體 在HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP分子的組合上呈遞(表2)。包含HLA-DQ和HLA-DP限制性T細胞表 位對治療特別有利，因為這些HLA類型在混合種群中比HLA-DR分子更加保守，使得能夠以更 少的T細胞表位序列實現更廣泛的種群覆蓋。
[0381] 將相鄰的或重疊的T細胞表位組合成單肽(長度<20aa)以最小化最終治療組中肽 的數量，得到來自Ara h 2的三個候選肽和來自Ara h 1的七個候選肽。由于半胱氨酸殘基 在肽穩定性和生物活性方面可能稱問題，所以用結構保守但反應性較低的絲氨酸殘基替代 半胱氨酸殘基。還對兩種Ara h 1肽進行小改變以提高穩定性和/或溶解度(表2)。在所有情 況下，已確認針對變體肽的T-細胞反應性已被保留。
[0382] 表2:Ara h 1和Ara h 2的治療候選肽
L0384」Ara h 1肽，有陰影的；Ara h 2肽，無陰影的。HLA列示出已知呈遞肽內T細胞表位 的HLA類型。*改變肽以提高性能;hW'，從N-端省略的;2?'（來自自然序列)添加到C-端。3粗 體，絲氨酸置換半胱氨酸。
[0385] 這些肽的臨床篩選證實了PBMC T-細胞反應性（圖1)，炎性細胞活化的缺乏（圖2) 以及在另外的花生過敏組群組中的血清穩定性(η = 40)。已確認，PBMC T細胞識別了在所分 析的100 %受試者(η = 20)中的這十種肽中的一個或多個，其中50 % -90 %響應于各肽。至今 的數據清楚地表明，以上表2中的十種肽，提供了充分的、可行的且適合的混合物。
[0386] 實例2
[0387] 步驟的簡要概述
[0390] 材料與方法
[0391] 受試者：花生過敏成人受試者從澳大利亞墨爾本的阿爾弗雷德過敏診所（The Alfred Allergy Clinic ,Melbourne ,Australia)招募。花生過敏受試者具有IgE介導的花 生過敏的臨床癥狀并且花生特異性IgE CAP分數2 2Ul.l6kUA/l;Pharmacia CAP SystemTM，瑞典烏普薩拉市法瑪西亞診斷公司（Pharmacia Diagnostics，Uppsala， Sweden))并且許多受試者具有過敏反應的歷史。由維多利亞式移植和免疫遺傳學服務 (Victorian Transplantation and Immunogenetics Service)對一些受試者進行基因分 型(HLA-DRB1、HLA-DQB1和HLA-DI3Bl,外顯子2)。這項研究經阿爾弗雷德和莫納什大學倫理 委員會（The Alfred and Monash University Ethics Committees)批準并且通報從各受 試者獲得的書面同意書。
[0392] 抗原:粗的花生提取物(CPE)由如別處所述的商業的未加鹽的干烤花生制備(德萊 昂等人，臨床與實驗變態反應2003;33(9):1273-80(de Leon et al.Clin Exp Allergy. 2003;33(9): 1273-80))，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)透析且無菌過濾(0.2μπι)。基于 公開的方法從CPE富集天然Ara h 1和Ara h 2。（德容EC等人，臨床與實驗變態反應1998;28 (6):743-51(de Jong EC et al.Clin Exp Allergy.l998;28(6):743-51))簡言之，使用 Vivaspin柱（法國歐巴涅的賽多利斯斯泰迪生物技術有限公司（Sartorius Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France))將CPE的緩沖液交換成20mM TRIS-Ms-丙烷（TBP)(pH 7.2)，并且施加到用TBP平衡的5mL Mono-Q 10/10柱(Pharmacia FPLC系統，英國圣奧爾本 斯）上。在用TBP洗滌后，應用30mL O-IM NaCl/TBP的線性梯度以洗脫結合蛋白質（ImL/ min)。通過SDS-PAGE分析0.5mL級分，并且將含有Ara h 1或Ara h 2與最小量其他蛋白質的 級分匯集，并用PBS透析。CPE、Ara h 1和Ara h 2的內毒素含量分別為1.7、4.(^P78.0EU/mg (Endpoint Chromogenic LAL檢驗，美國沃克斯維爾隆薩公司（Lonza，Walkersvi IIe， USA))。按照說明將肽(澳大利亞維多利亞州的邁拓公司和美國新澤西州的金思特美國公司 (Mimotopes,Victoria,Australia and GenScript USA Inc，New Jersey，USA))以l-4mg/ ml在10%二甲亞砜/PBS(20-mer和截短的肽組)或PBS、I 乙酸或0.1 M碳酸氫銨緩沖液 中重構（定制合成的核心表位肽）。如所描述的確認所有抗原既不會致有絲分裂，也沒有毒 性(尤西比烏斯即等人，變態反應與免疫學國際檔案2002;127(3):234-44化11861^1^即6七 al·，Int Arch Allergy Immunol.2002;127(3):234-44))〇
[0393] 產生Ara h 1和Ara h 2特異性⑶4+T細胞系（TCL):使用基于5,6_羧基熒光素二乙 酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)的方法由花生過敏受試者的外周血單核細胞(PBMC)生成Ara h 1或 Ara h 2特異性寡克隆TCLJ曼納林SI等人，免疫學方法雜志2005;298(1-2):83-92 (Mannering SI et al.，J Immunol Methods.2005;298(l-2):83-92));普里克特SR等人， 變態反應與臨床免疫學雜志2011; 127(3) :608-15el-5(Prickett SR，et al.，J Allergy Clin Immunol .2011; 127(3) :608-15el-5)。簡而言之，在含有2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青 霉素-鏈霉素以及5%人AB血清的RPMI-1640(美國圣路易斯市的西格瑪奧德里奇（5丨8111 &-Aldrich，St Louis，USA)) (cRPMI)中進行培養。PBMC用0. ΙμΜ CFSE(美國尤金分子探針公司 (Molecular Probes，Eugene，USA))標記并且在37C下與單獨的cRPMI、CPE(100yg/mL)、Ara h 1 或Ara h 2(10yg/mL)、Ara h 1 或Ara h 2 2〇-mer肽庫（10yg/mL/肽）或作為對照的破傷 風類毒素（TT;10LfU/mL;丹麥哥本哈根國家血清研究所（Statens Serum Institute， Copenhagen，Denmark)) -起培養（2 · 5 X 106/mL)7天。在用CD4-PE和7AAD(美國圣地亞哥市 的BD Pharmingen公司（BD Pharmingen，San Diego，USA))染色后，如所述地將CD4+ CFSEdim7AAD細胞分選（10個細胞/孔）到含有輻照的同種異體飼養細胞、抗CD3(0KT-3)、 rIL-2(美國埃默里維爾市的Cetus公司（Cetus，Emeryville，USA))和二性霉素 B(美國卡爾 斯巴德市的英杰公司（Invitrogen，Carlsbad，USA))的96-U-孔板內。根據需要用rIL-2飼養 細胞，并且在10-14天后，將細胞轉移到48孔板并且測試對Ara h 1或Ara h 2(10yg/mL)的 增殖。用抗⑶3和rIL-2將Ara h 1或Ara h 2-陽性TCL在T25培養瓶(美國富蘭克林湖的BD公 司（BD，Franklin 1^1?58，1^4))中擴增1〇-12天，然后測試對跨越相應序列的重疊2〇1^^肽 (10yg/mL)的特異性（增殖）。如所述的使用從20-mer的N-或C-端截短的肽組在選定20-mer 內對核心表位序列作圖（普里克特SR等人，變態反應與臨床免疫學雜志2011;127(3):608_ 15el_5(Prickett SR，et alc.J Allergy Clin Immunol.2011;127(3):608-15el-5))〇
[0394] T細胞測定:在含有2mM L-谷氨酰胺、lOOIU/mL青霉素-鏈霉素以及5%熱滅活的人 AB血清的RPMI-1640(美國圣路易斯市的西格瑪奧德里奇）（cRPMI)中進行全部培養。如下通 過3H-胸苷(3H-TdR)攝取測定如下評估抗原誘導的TCL增殖:在96-U-孔板中對72小時一式 兩份或一式三份培養基進行測定，該96-U-孔板含有I X IO4個T細胞/孔、作為抗原呈遞細胞 的I X IO4個輻照的（5000拉德）自體EBV轉化的PBMC(EBV-B細胞）以及指定抗原。負對照為單 獨的cRPMI。在最后16個小時用 3H-胸苷(3H-TdR; 0.5yCi/孔)對細胞進行脈沖并且攝取記錄 為復制培養物的每分鐘平均計數(cpm)。刺激指數(SI; cpm抗原刺激的T細胞/cpm未受刺激 的T細胞)2.5被認為是陽性的并且在2 2個測定中確認所有陽性應答。為了允許檢測在整個 PBMC內肽誘導的⑶4+T細胞增殖，如對于TCL產生所描述的建立CFSE標記的PBMC的7天培養， 其中添加抗CD25抗體(BD)以除了增殖之外評估T細胞活化。每個樣品至少分析10,000個CD4 +T細胞，并且SI以含有抗原的CD4+CFSElo(增殖的）、CD4+CD25+(活化的）或CD4+CD25+ CFSElo(活化和增殖的）細胞的百分比/不含抗原的相同種群(背景）的百分比計算。分析CD4 +CD25+CFSE10(活化的和增殖的）細胞提供了用于檢測T細胞應答的最靈敏的方法，其中指 定SI 1.5為陽性。
[0395] HLA II類阻斷測定:將T細胞與輻照的EBV-B細胞(各I X IO4個)與抗HLA-DR(L243， BD Pharminge)、HLA-DQ(SVP-L3)或HLA-DP(B7/21)的0.1-10yg/mL阻斷單克隆抗體(mAb)S 同種型對照抗體（IgG2a: BD Pharmingen公司；IgGl:美國圣地亞哥市BioLegend公司 (BioLegencUSan Diego，USA))在37°C下孵育 1 小時，隨后添加肽（2-10yg/mL)或CPE(H)Oyg/ mL)并且如上測試增殖反應。
[0396] 細胞因子ELISP0T測定：用在PBS中的10yg/mL IL-4、IFN-y或IL-5抗體（美國圣地 亞哥市eBioscience公司（eBioscience，San Diego，USA))將MAIPELISPOT板（美國比勒利卡 的密理博公司(Millipore ,Billerica，USA))在4°C下涂覆過夜。將孔阻斷（CRPMlPjWt 37C)然后將roMC(3.5X IO5個）或T細胞和輻照的EBV-B細胞(各IX 104個)添加到具有CPE (100yg/mL)、nAra h 2(10yg/mL)或肽（10yg/mL)的IOOyL重復培養物中。對照為單獨的 cRPMI、TT( lOlfU/ml)和植物凝集素（lyg/mL;西格瑪奧德里奇）。在37°C下培養48小時后，將 板與生物素化的IL-4、IL-5或IFN-γ抗體(eBioscience)-起孵育（lμg/ml PBS，2小時），隨 后與ExtrAvidin?-堿性磷酸酶(西格瑪奧德里奇）（1/3，OOOPBS，2小時)孵育，然后用堿性磷 酸酶底物（Bio-Rad)發展。當點在陽性對照孔中出現時，將板洗滌、風干并讀取（AID ELISP0T 4.0h讀取儀，德國施特拉斯貝格的艾迪公司（Autoimmun Diagnostika， Strassberg，Germany))〇
[0397] 嗜堿性粒細胞活化測試:如所述的由通過流式細胞術檢測的CD63上調來評估嗜堿 性粒細胞活化（德魯4(：等人，免疫學雜志2004 ;173(9):5872-9(0^￥厶(：，6丨31.，了 Immunol .2004; 173(9) :5872-9))。陽性對照是兔抗人IgE抗體(7.5yg/mL;美國加州的DAKO 公司（DAK0 Corporation，CA，USA))、N-甲酰基-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP) (0.4yg/ mL;西格瑪）以及CPE。在3log濃度范圍（50、5和0.5yg/mL)上測試CPE并且在4-log濃度范圍 (50、5、0.5和0.05μg/mL)上測試肽庫。使用組胺釋放和組胺ELISA試劑盒(德國漢堡市的IBL 國際有限公司（IBL International GmbH，Hamburg，Germany))按照制造商的指示來評估組 胺釋放。
[0398] 莖里
[0399] 在顯性20-mer選擇中考慮的因素包括：
[0400] ?應答頻率
[04011 ?每個患者產生的特異性TCL的數目/患者PBMC中特異性T細胞的發生率
[0402] · T細胞應答的量級
[0403] · T細胞應答的模式(在受試者內或受試者之間識別的肽組合）
[0404] ?用肽直接靶向整個PBMC群中的特異性T細胞的能力(CFSE篩選）
[0405] · T細胞應答的一致性
[0406] · 20-mer肽內的核心T細胞表位的鑒別
[0407] Ara h 1 顯性2〇-mer選擇
[0408] 從18名花生過敏供體產生145個Ara h 1特異性T細胞系（TCL)，并且跨越Ara h 1 的65/69重疊20-mer肽被這些TCL識別（參見表3和圖5)。這65種20-mer中的14種被選為最常 識別的（18名中4-6名應答者;22%-33%)(肽編號23、24、26、38、40、44-51和57)。在這14種 肽中選擇9種用于進一步分析(肽編號23、24、40、46、47、49、50、51和57)(表4)。
[0409] 基于每個受試者特異性TCL的數目、TCL應答的量級、TCL應答的可再現性以及靶向 PBMC中特異性T細胞的能力來進行這些選擇。所選擇的9種20-mer:
[0410] ?由這個組群中18名受試者中的16名(89%)的TCL共同識別
[0411] ?典型地在特異性TCL中誘導強烈且一致的應答
[0412] ?各自由來自許多應答者的多個TCL識別
[0413] ?各自能夠靶向供體PBMC中的特異性T細胞(在18/20名另外的受試者中共同誘導 可檢測的PBMC T細胞應答，其中每種20-mer中8-16名應答者(40-80%))。
[0414] 在通過TCL分離和/或CFSE篩選進行分析的38名受試者中的35名（92%)中，T細胞 識別九種20-mer中的一種或多種(表3)。
[0415] 表3:
[0416] TCL對Ara h 120-mer肽的增殖應答(胸苷攝取）。表格示出SI值（=存在肽的TCL增 殖相比未受刺激的TCL增殖的成倍增加）。僅示出2 2.5的刺激指數(SI)。針對具有特異于給 定20-mer的多種TCL的受試者，示出最高SI。深灰色，SI 2 2.5<5.0;SI 2 5.0。最終選擇的9 種顯性肽在表4中示出。
[0417] 表3:

[0422] 顯性Ara h I 20-mer的PBMC篩選
[0423] 表5示出，2 1的顯性20-mer肽由18/20(或全部數據的22/24)識別。每種20-mer肽 被至少7名受試者識別。組合的CFSE和TCL數據:在43/45名受試者中確認的識別。
[0424] 表5:
[0425] 24名受試者的肽誘導增殖的SI。上部分示出了新的花生過敏供體組群(與用于TCL 的組群不同）。下圖示出了來自用于TCL產生的組群的4名受試者，以及上部分和下部分的總 數。
[0426] CPE，粗的花生提取物;+ve，陽性;nt，未測試(肽儲備物在測試時不可用）；灰色，刺 激指數2 1.1 < 2.5;黑色，刺激指數2 2.5。
[0428] Ara h 2顯性2〇-mer選擇
[0429] 從16名花生過敏供體產生69個Ara h 2特異性T細胞系(TCL)，并且跨越Ara h 2的 16/17重疊 20-mer肽被這些TCL識別（表6)。這16種20-mer中的4種被選為最常識別的（各自 情況為16名中7-9名應答者;44 % -46 % )(肽編號4、5、11、15)(圖7)。基于每個受試者特異性 TCL的數目、TCL應答的量級、TCL應答的可再現性以及靶向PBMC中特異性T細胞的能力來進 行這些選擇。所選擇的4種20-mer肽：
[0430] ?由這個組群中全部16名受試者（100%)的TCL共同識別
[0431 ] ?典型地在特異性TCL中誘導強烈且一致的應答
[0432] ?各自由來自許多應答者的多個TCL識別
[0433] ?由全部69個TCL中的約80%共同識別
[0434] ?能夠靶向供體PBMC中的特異性T細胞(可檢測的PBMC T細胞應答在所測試的6名 受試者中證實）。
[0435] 在通過TCL分離和/或CFSE篩選進行分析的受試者中的16/16(100%)中，T細胞識 別四種20-mer中的一種或多種(表6)。
[0436] 表6:
[0437] TCL對Ara h 2 20-mer肽的增殖應答(胸苷攝取）。表格示出SI值（=存在肽的TCL 增殖相比未受刺激的TCL增殖的成倍增加）。僅示出陽性刺激指數U 2.5):灰色，2 2.5 < 5.0;黑色，> 5.0 過敏原驅動的TCL; B)肽驅動的TCL。顯性20-mer在表7中示出。
[0438] 表6:

[0443] 核心T細胞表位作圖
[0444] 技術方法
[0445] 使用來自不同受試者的TCL對各核心T細胞表位進行作圖。確切T細胞表位在TCL與 受試者之間變化。通過測試來自不同受試者的反應性TCL針對截短的肽組的增殖（圖8)來在 每種所選的20-mer內的最小T細胞刺激序列(核心表位）。誘導最大T細胞增殖所需要的殘基 的數目在不同TCL和/或受試者之間從6至19aa變化(表8和9)。歸因于最佳表位識別所需的 側接殘基的數目的變化，如果含有共同核心序列的肽誘導識別，那么就認為TCL識別相同的 表位。基于這個準則，鑒別十個不同的Ara h 1和5個不同的Ara h 2CD4+T細胞表位（"統一 表位"，表8和9)，其中共同"最小核心表位"序列從5至12aa變化(加下劃線的序列，表8和9)。 "統一表位"序列是涵蓋跨越不同受試者的最佳T細胞反應性所需的所有殘基來確保最廣泛 可能的識別的最小序列。
[0446] ⑴在顯性Ara h I 20_mer中發現的核心T細胞表位
[0447] 對顯性Ara h 120-mer肽內的核心T細胞表位序列作圖。鑒別出10個Ara h IT細胞 表位（"統一T細胞表位"），包括4對重疊的T細胞表位。（表8)
[0448] 表8:
[0450] (ii)在顯性Ara h 2 20-mer中發現的核心T細胞表位
[0451 ] 在顯性Ara h 2 20-mer肽內對核心T細胞表位序列作圖。鑒別出5個Ara h 2T細胞 表位（"統一T細胞表位"），包括2對重疊的T細胞表位(表9)
[0452]表9:
[0454] Ara h 1和Ara h 2T細胞表位的HLA限制
[0455] 使用抗HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR的單克隆抗體阻斷顯性T細胞表位的T細胞識別 (圖9)。當T細胞表位在HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR上共同呈遞時，一些T細胞表位在HLA-DR和 HLA-DQ分子兩者上呈遞(表10)。
[0456] 表1〇:
[0459] Ara h 1和Ara h 2T細胞表位呈遞的HLA限制
[0460] 通過TCL識別顯性T細胞表位對受試者進行HLA分型，以便評估潛在地能夠用于T細 胞呈遞表位的HLA亞型。用于受試者識別具有確認的HLA-DR/DQ/DP限制的T細胞表位的共用 HLA等位基因的不存在表明T細胞表位HLA-結合簡并性。Ara h 1結果在表11中示出并且Ara h 2結果在表12中不出。
[0461 ]表11:
[0462]灰色陰影指示當前7肽混合物中包含的T細胞表位
[0464] Nt = HLA限制未測試
[0465] Ara h 2表位呈遞的HLA限制
[0466] 表12:
[0468] 在其Ara h 2T細胞表位(95-107)識別被抗HLA-DQ阻斷的所有受試者之間的共用 HLA-DQBl等位基因的不存在表明，這種T細胞表位必須由多個HLA-DQBl分子呈遞。類似地， 在其Ara h 2Τ細胞表位（127-141)或（37-47)識別被抗HLA-DR阻斷的所有受試者之間的 HLA-DRBl等位基因中的多樣性表明用于多個HLA-DRBl分子的T細胞表位的結合簡并性。
[0469] 除了由至少2個HLA-DR分子呈遞之外，Ara h 2T細胞表位(37-47)還由HLA-DQB1* 06:09呈遞，原因在于在HLA-DQ的情況下識別這種T細胞表位的受試者具有這種等位基因， 并且對于受試者9,僅DQBl等位基因存在。
[0470] 由于DPB1*04:01或DRB1*15:01等位基因存在于分別識別Ara h 2T細胞表位（32-44)(被抗HLA-DP阻斷)或(95-107)(被抗HLA-DR阻斷）的所有受試者中，因此這些T細胞表位 的簡并性無法被確定。然而，由于DPB1*0401和DRB1*1501在全球種群中普遍存在，所以由這 些HLA分子呈遞的T細胞表位仍可被廣泛識別。
[0471 ] 在識別給定HLA類型上的顯性統一Ara h IT細胞表位的兩名或更多名受試者之間 不存在共用等位基因，由此表明所鑒別的Ara h IT細胞表位中的每個也由兩種或更多種不 同HLA分子呈遞。
[0472] 預測HLA結合基序:Ara h I 20-mer肽
[0473] 表13提供了用于顯性Ara h I 20-mer內的結合基序的HLA-DR預測算法的結果概 述。
[0474] 表13:
[0476] 預測HLA結合基序:Ara h 2 20-mer肽
[0477] 表14提供了用于3種顯性Ara h 2 20-mer內的結合基序的2HLA-DR預測算法的結 果概述(NB顯性'20-mer 5'未如預期示出并且實際表位與'20-mer 4'重疊）。
[0478]表14: LU^touj 衣丄0:
[0481 ]陰影指示在高加索人種群中特別常見的等位基因。
[0483] 用于治療遞送的精制肽
[0484] 用結構上保守但化學反應性較弱的絲氨酸殘基置換潛在有問題的半胱氨酸殘基。 確認保留的T細胞反應性（圖10和11)。含有絲氨酸的T細胞表位肽顯示出與天然的含有半胱 氨酸的肽相當的T細胞應答。
[0485] 將重疊的Ara h IT細胞表位組合成長度< 20aa的單個肽
[0486] 表16:
[0488] 灰色陰影指示組合成單肽的用于如本文中所述的進一步分析的重疊統一 T細胞表 位對。*星號和方框指示被建議用于治療劑的七種Ara h 1候選肽。
[0489] 將重疊的Ara h 2T細胞表位組合成長度< 20aa的單個肽
[0490] 表17:
[0492] Ara h 1和Ara h 2候選肽概述
[0493] 存在10種候選肽:7種來自Ara h 1并且3種來自Ara h 2(表18)
[0494] 表18:
[0496] 還設計了另外13種較短的肽變體(基于單個T細胞表位）用于比較。一些序列被延 長或縮短（依照天然序列和用于T細胞識別的關鍵性殘基）以提高肽的生產性能和溶解性。 這產生了一個23種候選肽的組用于比較。肽細節概述于表19中。
[0497] 表18中的所有肽均以95 %_99.9%的純度產生并測定了在溶液中的溶解性。然后 比較來自25名花生過敏受試者的PBMC中的對2劑量的這些肽中的每個的T細胞應答以便選 擇最終治療劑組合。
[0499] · NB緩沖液:首先將所有肽在I3BS中試驗;然后如果序列顯示偏好高pH則使用0.1 M NH4H⑶3，或如果偏好低pH則使用1 %乙酸；如果在1 %乙酸中不可溶，則增加至2 %、5 %、 10% 等。
[0500] ?從'肽2省略N-端'W'以提高穩定性并且易于合成
[0501] ?將C-端'E'添加到'肽7以提高溶解性(否則肽不可溶，除非在有毒緩沖液中） [0502]選擇最終肽的考慮
[0503] 目標:
[0504] 最大化種群覆蓋和/或T細胞反應性，同時最小化序列數目和/或長度。
[0505] 對于肽選擇的全面考慮:
[0506] · 23肽篩選中的T細胞應答比較
[0507] ?先前的T細胞反應性數據(針對個體T細胞表位/肽）
[0508] ?序列(生產便利性/溶解度）
[0509] · HLA限制(最簡并的且HLA-DQ限制的T細胞表位）
[0510] 基于來自23肽篩選的數據的選擇的考慮:
[0511] ?基于CD25+CFSE-l〇W細胞的SI值的主要評估準則
[0512] ?供體應答頻率/肽(一個或兩個濃度）
[0513] ?比較對長變體和短變體的應答
[0514] ?應答的強度/一致性（即，響應于兩個濃度的那些受試者與僅響應于一個濃度的 那些受試者）
[0515] ?應答模式
[0516] 表20示出在34名花生過敏受試者中對全組23種候選肽的PBMC T細胞應答的分析。 這些數據示出存在肽的/未受刺激的％ra25+CFSElow⑶4+T細胞的SI值。
[0517] 將數據分組成各含有T細胞表位的區的長型式和短型式（參見列邊框；例如第一 "組"=肽1、23和24[肽1組合了重疊的肽23和24,它們各自含有單獨的T細胞表位])。各組底 部的總結評述了選自該組的最佳肽。（數據示出存在肽的/未受刺激的％ra25+CFSElow CD4 +T細胞的SI值）。
[0518] 通過對各肽"組"的長型式的50yg樣品（或IOyg樣品，如果應答好于這個劑量的話） 的值降序將數據分類。肽組內的每行示出單個受試者的數據，但各肽組中受試者的順序變 化。




有其他可行肽的組：
[0526]例如：
[0527] 1)肽3可置換肽15
[0528] 2)肽8可置換肽21
[0529] 3)肽9可置換肽23
[0531 ] 39組群中的對7肽混合物的每種肽的應答的概述
[0532] ?所有受試者識別1種或多種肽
[0533] · 13/39(33%)識別100% 的肽
[0534] · 21/39(54%)識別>85% (6種或更多種)肽
[0535] · 31/39(79%)識別>70% (5種或更多種）肽
[0536] ?每種肽被至少25/39名受試者(64%)識別
[0537] 在測試的74名受試者中，全部對7種所選肽中的至少1種肽反應。
[0538] 對不同肽庫的應答
[0539] 表23:
[0541] NB:表19提供了肽1-23各自的序列。
[0542] 庫1=7 X原始Ara h 1 "候選者"
[0543] 庫2 = 3 X原始Ara h 2"候選者"
[0544] 庫3 = 10X上述2個庫(Ara h 1和Ara h 2)的混合
[0545] 庫4 = 3 XAra h Γ候選者"+5 X較短變體(Ara h 1序列覆蓋率等于庫1)
[0546] 庫5 = 5XAra h 2候選者的較短(單表位)變體(Ara h 2序列覆蓋率等于庫2)
[0547] 表24:精制肽庫


L0551J 厙7a = 5XAra h l+3XAra h 2,用于"精制"厙（與最終厙相問但具有額外的Ara h 2T細胞表位）
[0552]庫7b = 5XAra h l+3XAra h 2,用于"精制"庫7 [0553]對7肽庫(庫7b)的嗜堿性粒細胞應答
[0554] 在與跨3-41og濃度范圍（g/ml)的花生(CPE)或7肽庫(庫7b)孵育后，從14名花生過 敏受試者收集嗜堿性粒細胞反應性數據（圖2)。在這些受試者中，嗜堿性粒細胞活化和組胺 釋放由完整花生和陽性對照誘導但不由7肽混合物誘導。
[0555] 在選擇庫7a和7b之前。隨后設計并測試庫7a和7b。
[0556] 比較對完整花生或表23的肽庫1-5的PBMC T細胞應答。（圖12和13)。相對于庫1-5， 這些庫中沒有一個能夠在所有測試的受試者中誘導陽性T細胞應答。幾乎所有對肽庫的應 答都顯著低于對完整花生（以測試濃度）的應答，并且庫2、3和4各自僅有一名受試者顯示出 大于或等于完整花生應答的肽應答。關于庫7a和7b，記錄了對庫7a和7b的100%應答(SI> 1.5)。庫7a和7b在許多受試者中誘導了相比完整花生而言相當的或更大的應答，6/30= 2 IOOCPE 應答，6/30 = 50%-80% CPE 應答。
[0557] 當比較對7肽庫的PBMC T細胞應答時（圖14)，庫7a與7b之間沒有顯著差異（比較配 對數據;n=15/組;添加第三Ara h 2肽沒有優勢）。當使用用于非參數數據的非配對曼惠特 尼檢驗比較庫7b(n = 30)的完整數據組與庫7a的組群時，仍沒有顯著差異;p = 0.9)。
[0558] 總之，庫7a和7b兩者都明顯好于所測試的其他5個庫。庫7a相比庫7b沒有顯著差 異。庫7b被100%的測試受試者識別并且在超過33%的受試者中誘導相比花生而言相當的 或更大的PBMC T細胞應答。庫1-5未被100%受試者識別并且很少誘導與完整花生相當的應 答。
[0559]表25:更詳細的步驟和數據概述

[0562] 實例3
[0563] Ara h 2表位特異性TCC中，Ara h 2肽誘導的T細胞無反應性（圖15)
[0564] 在以lOOμg/ml的Ara h 2肽(ANLRPSEQHLM(SEQ ID N0:31;標陰影的））存在下，在 缺乏輔助細胞的情況下或在單獨的完全培養基*(無 Ag)中，將Ara h 2肽特異性人類T細胞 克隆的T細胞（IXlO6Ail)培養16小時。然后將T細胞充分洗滌，并且在作為輔助細胞的輻照 自體PBMC(IO 5個/孔)存在下，用單獨的完全培養基（IL-2，50U/ml)或免疫原性濃度的Ara h 2肽（lOμg/ml)再次激發（104/孔）。在第72小時確定與氚標胸苷摻入相關的增殖。結果表示 為一式三份培養物的平均cpm+SD。*完全培養基:RPMI+5%AB血清+Pen/Str印/L-谷氨酰胺+ lOU/mL IL-2。
[0565] Ara h 1表位特異性TCC中，Ara h 1肽誘導的無反應性（圖16)
[0566]在以l〇〇yg/ml的Ara h 1肽（STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID N0:12;標陰影的））或 無關的Bahia grass Pas η 1肽（點畫的)存在下，在缺乏輔助細胞的情況下或在單獨的完 全培養基*(無 Ag)中，將Ara h 1肽特異性人類T細胞克隆的T細胞（I X 106/ml)培養16小時。 然后將T細胞充分洗滌，并且在作為輔助細胞的輻照自體PBMC(105個/孔)存在下，用單獨的 完全培養基（IL_2,50U/ml)或免疫原性濃度的Ara h I肽（10μg/ml)再次激發（104/孔）。在 第72小時確定與氚標胸苷摻入相關的增殖。結果表示為一式三份培養物的平均cpm。*完全 培養基:RPMI+5%AB血清+Pen/Str印/L-谷氨酰胺+lOU/mL IL-2。
[0567] 本領域的技術人員將會了解，可對在此描述的本發明加以除具體所描述的那些之 外的變化和修改。應理解的是，本發明包括所有這類變化和修改。本發明還包括在本說明書 中單獨地或共同地提及或指示的步驟、特征、組合物和化合物的全部，以及所述步驟或特征 中的任意兩個或更多個的任何組合。
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【主權項】
1. 一種免疫調節組合物，包含來自由以下各項組成的清單的Ara h 1和Ara h2T細胞表 位區中的至少五個： (i) FQNLQNHR(SEQ ID N0：1) (ii) IVQIEA(SEQ ID NO：2) (iii) NEGVIVKVXK(SEQ ID NO：3) (iv) EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0：4) (v) EGALML(SEQ ID NO：5) (vi) IMPAAHP(SEQ ID NO：6) (vii) LRPXEQHLM(SEQ ID NO：7) (viii) ENNQRXMXEA(SEQ ID NO：8) 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸，并且所述組合物包含選 自SEQ ID N0S:l-6的至少一個表位區和選自SEQ ID N0S:7-8的至少一個表位區。2. 根據權利要求1所述的組合物，其中表位區LRPXEQHLM是LRPSEQHLM(SEQ ID NO: 137)。3. 根據權利要求1或2所述的組合物，其中表位區ENNQRXMXEA是ENNQRSMSEA(SEQ ID NO：138)〇4. 根據權利要求1至4中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含所述表位區中的至 少6個。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含至少7個表位區。6. 根據權利要求1至4中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含所述8個表位區中 的每個。7. 根據權利要求1至6中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含一種或多種肽，這 些肽中的每個的長度多達60個連續的氨基酸，并且這些肽包含由SEQ ID N0S: 1-8定義的 Ara h 1和Ara h 2T細胞表位區中的一個或多個。8. 根據權利要求1至7中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含選自由以下各項組 成的清單的Ara h 1和Ara h 2T細胞肽： (i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11) (ii) STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12) (iii) EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0：4) (iv) VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13) (v) VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14) (vi) ANLRPXEQHLM(SEQ ID NO：15) (vii) EFENNQRXMXEALQ(SEQ ID NO：16) (viii) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：17) (ix) GDVFIMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：18) (x) SQLERANLRPXEQHLM(SEQ ID NO：19) (xi) ELNEFENNQRXMXEALQ(SEQ ID NO：20) (xii) FQNLQNHRIV(SEQ ID NO：21) (xiii) RIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：22) (xiv) ENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：23) (xv) EVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：24) (xvi) EFENNQRXMXEALQQI(SEQ ID NO：25) (xvii) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：26) (xviii) ELNEFENNQRXMXEALQQI(SEQ ID NO：27) (xx) WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：28) (xxi) GDVFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：29) 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。9. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述殘基X為絲氨酸。10. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述組合物包含選自由以下各項組成的清單的 Ara h 1和Ara h 2T細胞肽： (i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11) (ii) STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12) (iii) EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0：4) (iv) VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13) (v) VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14) (vi) ANLRPSEQHLM(SEQ ID NO：31) (vii) EFENNQRSMSEALQ(SEQ ID NO：32) (viii) EVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：24) (ix) EFENNQRSMSEALQQI(SEQ ID NO：33) 或其功能性衍生物或同系物。11. 根據權利要求10所述的組合物，其中所述組合物包含選自由以下各項組成的清單 的Ara h 1和Ara h 2T細胞肽中的每個： (i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：11)； (ii) STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：12)； (iii) EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID N0:4)和/或EVKPDKKNPQLQD(SEQ ID N0:24); (iv) VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：13)； (v) VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：14)； (vi) ANLRPSEQHLM(SEQ ID N0:31);以及 (vii) EFENNQRSMSEALQ(SEQIDN0:32WP/SEFENNQRSMSEALQQI(SEQIDN0:33) 或其功能性衍生物或同系物。12. 根據權利要求1至11中任一項所述的組合物，其中所述肽當給予患有特征在于Ara h 1和/或Ara h 2超敏或對包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物超敏的病狀的受試者時，能 夠減輕所述超敏。13. 根據權利要求1至12中任一項所述的組合物，所述組合物另外地包含選自由以下各 項組成的清單的一種或多種肽： (i) ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：34) (ii) NNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：35) (iii) SQLERANLRPXEQ(SEQ ID NO：36) (iv) ELNEFENNQRXM(SEQ ID NO：37) (v) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD(SEQ ID NO：38) (vi) NNFGKLFEVKPDKKNPQL(SEQ ID NO：40) (vii) SQLERANLRPXEQH(SEQ ID NO：41) (viii) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：42) (ix) RELRNLPQQXGLRA(SEQ ID N0：43) (x) KAMVIVVVNKG(SEQ ID N0：44) (xi) AMVIVVVNKGTGNLELV(SEQ ID NO：45) (xii) VVNKGTGNLELVAVRK(SEQ ID NO：46) 或其功能性衍生物或同系物，其中殘基X為半胱氨酸或絲氨酸。14. 一種組合物，包含對編碼根據權利要求1至10或13中任一項所述的表位和肽的序列 進行編碼或與之互補的一種或多種核酸分子。15. -種用于治療和/或預防受試者的病狀的方法，該病狀的特征在于對Arah 1和/或 Ara h 2或對包含Ara h 1和/或Ara h 2的組合物中的過敏原的異常、不需要或其他方面不 當的免疫應答，所述方法包括在足以消除或減少所述受試者中針對所述Ara h 1和/或Ara h 2或其他過敏原的T細胞的存在或功能的條件下向所述受試者給予有效量的根據權利要 求1至14中任一項所述的免疫調節組合物，持續一段時間。16. 根據權利要求1至14中任一項所述的免疫調節組合物在制造用于治療哺乳動物的 病狀的藥物中的用途，該病狀特征在于對Ara h 1和/或Ara h 2的異常、不需要或其他方面 不當的免疫應答。17. 根據權利要求15或16中任一項所述的方法或用途，其中病狀是對花生或含有Ara h 1和Ara h 2或者Ara h 1或Ara h 2類似分子的樹堅果超敏。18. 根據權利要求17所述的方法或用途，其中所述堅果為榛子、杏仁或巴西堅果。19. 根據權利要求15至18中任一項所述的方法或用途，其中所述方法使得對Ara h 1 和/或Ara h 2或所述組合物的其他過敏原脫敏或誘導對這些過敏原的免疫耐受。20. 根據權利要求19所述的方法或用途，其中所述脫敏或耐受通過誘導T細胞無反應性 或凋亡來實現。21. 根據權利要求19所述的方法或用途，其中所述脫敏或耐受通過誘導Ara hi或Ara h 2特異性Treg細胞來實現。22. 根據權利要求15至21中任一項所述的方法或用途，其中所述組合物皮內地或經皮 地給予。23. 根據權利要求15至22中任一項所述的方法或用途，其中所述受試者是人類。
【文檔編號】A61P37/00GK105992589SQ201480052398
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年9月25日
【發明人】羅賓·伊利莎白·奧赫爾, 薩拉·拉謝爾·普里克特, 珍妮弗·梅·羅蘭
【申請人】阿拉沃克斯有限公司