具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物、制劑及其制備方法

具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物、制劑及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物，由下述重量份配比的原料藥制成：藁本2～6、當歸1～4、丹參1～4、肉桂1～3、藤茶1～3。本發明經實驗證實對肽類物質、維生素類、黃酮類及多糖類物質有很好的促透效果。本發明克服了現有技術中促透效果緩慢，持久性差的問題，本發明經實驗證實可以達到速效促透及長效促透的功效，對皮膚應急修復及持久保護提供有力的支持。經安全性實驗可以證實，本發明具有明顯的抗敏抗刺激功效，較之現有技術更安全、溫和選擇性促透。本發明原材料獲取容易、制備方法簡便，綠色安全，易于被過敏人群接受，具有很好的應用前景和市場前景。
【專利說明】
具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物、 制劑及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種外用中藥組合物，具體地說是一種具有促進皮膚活性物質運行吸 收功效的外用中藥組合物及由該外用中藥組合物制備得到的護膚制劑。
【背景技術】
[0002] 護膚品主要是以涂抹、噴灑的方式散布于人體皮膚表面，以起到清潔、保養、美容 的作用。此外，由于皮膚角質層的生理結構及功能決定，其具有屏障外源性分子的進入體內 的特性。這在抵御外源性物質侵襲能夠起到積極方面的作用。與此同時，強大的皮膚屏障 作用也同時阻礙了促進皮膚健康的外源性活性物質的進入。為了使得皮膚獲得更多的活性 物質，研究護膚品中促進活性成分透皮運行吸收機制及方法成為研究熱點的熱點之一。 [0003]目前，已出現不同類型的透皮吸收劑顯示出可逆地克服皮膚屏障的潛力，從而幫 助活性成分輸送穿過皮膚。雖然某些化學和物理皮膚滲透劑已經應用到護膚品配方中，但 一些皮膚透皮吸收促進劑不僅將活性物質促透進皮膚，還同時將有害物質及刺激物質一起 帶入皮膚中，使皮膚出現過敏等損害，如氮酮。一些促透劑雖然可以起到安全促透效果，但 是其促透的速效性、持久性均不佳。
[0004] 因此，市場對于可以選擇性促透，即只將有益物質促透吸收至皮膚，阻擋有害物質 的進入，從而安全促透的促透劑有著迫切的需求。同時如何增加促透劑的速效性及持久性 仍是本領域技術人員研究的熱點。

【發明內容】

[0005] 本發明的首要目的在于提出一種從天然植物中開發，以促進皮膚對于活性物質運 行吸收的中藥組合物。
[0006] 本發明的再一目的在于提出一種上述中藥組合物的制備方法。
[0007] 本發明的發明思路為：
[0008] 本發明利用先進的生物技術，結合中國傳統的中醫理論，將藁本、當歸、丹參、肉 桂、藤茶有效的組合在一起，形成復方，并將其提取后得到提取物，通過其親水親油性、形成 的滲透通道便于活性物質進入皮膚角質層類脂的脂質雙分子層，并通過其對刺激性物質的 拮抗作用，減少對皮膚的刺激性和毒性隱患，達到綜合的活性物質對皮膚的安全滲透作用。 佐以薄荷和山茱萸效果更佳。
[0009] 藁本：味辛，性溫。歸膀胱經。具有祛風散寒，除濕止痛的功效。主治風寒表證，巔 頂疼痛，風濕痹痛。
[0010] 當歸：性味甘、辛、溫。歸肝、心、脾經。具有補血；活血；調經止痛；潤燥滑腸的功 效。
[0011] 丹參：性味苦，微寒。歸心、肝經。有祛瘀止痛，活血通經，清心除煩之功效。用于 月經不調，經閉痛經，癥瘕積聚，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠；肝脾腫大，心絞 痛。
[0012] 肉桂：味辛、甘，性大熱。歸腎、脾、心、肝經。有補火助陽，引火歸元，散寒止痛，溫 通經脈的功效。用于陽痿宮冷，腰膝冷痛，腎虛作喘，虛陽上浮，眩暈目赤，心腹冷痛，虛寒吐 瀉，寒疝腹痛，痛經經閉。
[0013] 藤茶：俗稱藤婆茶、莓茶、白猴、山甜茶、龍須茶、土家甘露或土家神茶等，其學名為 顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz) W. T. wang]。主要分布于我國湖南、湖 北、廣西等地，既可用于治療咽喉腫痛、感冒發熱、黃疸型肝炎、皰疔等癥，又可日常泡飲，清 涼解渴。藤茶中黃酮含量之高（可達40%以上）在植物界中實屬罕見，多酚含量亦比較高 (在20%左右），黃酮類化合物及多酚類化合物具有廣泛的生理活性。近代醫學研究表明， 藤茶及其提取物口服具有調節免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血壓、降血糖、保肝、護肝以 及減輕乙醇中毒等功效。
[0014] 薄荷：味辛，性涼。入肺、肝經。具有疏散風熱，清利頭目，利咽透疹，疏肝行氣的功 效。主治外感風熱，頭痛，咽喉腫痛，食滯氣脹，口瘡，牙痛，瘡疥，癮疹，溫病初起，風疹瘙癢， 肝郁氣滯，胸悶脅痛。
[0015] 山茱萸：別稱山萸肉、山芋肉、山于肉等，成熟果實為中藥，用于眩暈耳鳴，腰膝酸 痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫。
[0016] 為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0017] -種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物，由下述重量份配比 的原料藥制成：
[0018] 稾本2~6重量份、當歸1~4重量份、丹參1~4重量份、肉桂1~3重量份、藤 茶1~3重量份。
[0019] -種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物，由下述重量份配比 的原料藥制成：
[0020] 稾本2~6重量份、當歸1~4重量份、丹參1~4重量份、肉桂1~3重量份、藤 茶1~3重量份、薄荷1~3重量份、山茱萸1~3重量份。
[0021] 一種上述兩種外用中藥組合物的制備方法，具體步驟如下：
[0022] (1)上述原料藥粉碎后按所述重量份配比稱取，混勻；
[0023] (2)體積百分比為60%~90%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 : 10~I :30,70°C~90°C提取1~4小時；
[0024] (3)將步驟⑵得到的提取液冷卻至20°C~30°C，200~400目粗過濾，濾出藥渣 后進行真空抽濾，收集二次濾液；
[0025] (4)將濾液旋轉蒸發全部乙醇得到濃縮液，濃縮液中加入1，3- 丁二醇，加入量為 步驟（3)所得二次濾液量體積百分比的60%~90% ;混溶均勻，過濾，取清液，即得。
[0026] 所述步驟⑵中乙醇的體積百分比為70%，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 : 15 ;提取時間為3小時。
[0027] 所述步驟（3)中真空抽濾條件為在布氏漏斗里鋪兩層濾紙，濾紙中間夾0. 3~ 0. 6cm娃藻土進行真空抽濾。
[0028] 所述步驟（4)是在真空度-0. 09MPa，40°C~50°C條件下旋轉蒸發全部乙醇。
[0029] -種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥提取物，其中所述外用中藥 提取物由上述方法提取得到的。
[0030] 上述外用中藥提取物在制備具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的護膚品添加 劑中的用途。
[0031] -種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的護膚品添加劑，所述護膚品添加劑由 上述外用中藥提取物經滅菌后制得。所述滅菌程序為90°C水浴滅菌20~40分鐘。
[0032] 本發明提供的中藥提取物可在護膚品制備過程中添加進護膚品中，以促進護膚品 中活性物質被皮膚吸收。該中藥組合物經簡單粉碎混合后涂抹皮膚也可起到一定的促透功 效。
[0033] 本發明的有益結果：
[0034] 本發明經實驗證實對短肽類物質、維生素類、黃酮類及植物活性成分多糖類物質 均有很好的促透效果。經安全性實驗可以證實，本發明具有明顯的抗敏抗刺激功效，較之現 有技術更安全、溫和選擇性促透。其次本發明克服了現有技術中促透效果緩慢，持久性差的 問題，本發明經實驗證實可以達到速效促透及長效促透的功效，對皮膚應急修復及持久保 護提供有力的支持。本發明原材料獲取容易、制備方法簡便，綠色安全，易于被過敏人群接 受，具有很好的應用前景和市場前景。
【附圖說明】
[0035] 圖1為促八勝妝灰光不蹤組織切片圖（左上：實施例3 ;右上：實施例2 ;左下：實 施例1 ;右下：1%氣酬）；
[0036] 圖2為煙酰胺含量標準曲線；
[0037] 圖3為不同濃度實施例1提取物促煙酰胺吸收透過率曲線；
[0038] 圖4為實施例1與氮酮對豚鼠皮膚的組織切片（上行為不同濃度氮酮處理HE組 織切片，下行為不同濃度實施例提取物處理HE組織切片圖）；
[0039] 圖5為不同實施例對1 %海藻糖的促透功效；
[0040] 圖6為不同實施例對10%燕麥多肽的促透功效；
[0041] 圖7為不同促透劑對5%甘草黃酮的促透功效。
【具體實施方式】
[0042] 本發明中所用的藥材均可以從中國藥材集團公司購買得到，符合中華人民共和國 藥典2005版標準。其他原料均可通過市售購買獲得，本發明所用的儀器名稱及廠家見表1。
[0043] 表 1
[0045] 實jmw丄半漢明1T約ShT日''十刀H、J P」食
[0046] (1)下述原料藥粉碎后按所述重量配比稱取，混勻；
[0047] 藁本20g、當歸10g、丹參10g、肉桂10g、藤茶20g、薄荷10g、山茱萸10g。
[0048] (2)體積百分比為70%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :15,放置于 電熱恒溫水浴鍋中，80°C提取3小時；
[0049] (3)將步驟（2)得到的提取液從恒溫水浴鍋中取出，靜置冷卻至常溫，200目粗過 濾，濾出藥渣，得濾液；將該濾液再進行真空抽濾，抽濾條件：在布氏漏斗里鋪兩層濾紙，濾 紙中間夾〇. 5cm娃藻土真空抽濾，收集二次濾液；
[0050] (4)二次濾液在真空度-0· 09MPa，43°C條件下旋轉蒸發全部乙醇得濃縮液；加二 次濾液量70% (體積百分比）的1，3_ 丁二醇與濃縮液混溶均勻，過濾，取清液，即得。
[0051 ] 實施例2本發明中藥組合物的制備
[0052] (1)下述原料藥粉碎后按所述重量配比稱取，混勻；
[0053] 藁本60g、當歸20g、丹參30g、肉桂20g、藤茶10g、薄荷20g、山茱萸30g
[0054] (2)體積百分比為90%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :10,放置于 電熱恒溫水浴鍋中，70°C提取4小時；
[0055] (3)將步驟⑵得到的提取液從恒溫水浴鍋中取出，靜置冷卻至20°C，200目粗過 濾，濾出藥渣，得濾液；將該濾液再進行真空抽濾，抽濾條件：在布氏漏斗里鋪兩層濾紙，濾 紙中間夾〇. 3cm娃藻土真空抽濾，收集二次濾液；
[0056] (4)二次濾液在真空度-0· 09MPa，40°C條件下旋轉蒸發全部乙醇得濃縮液；加入 二次濾液量90% (體積百分比）的1，3_ 丁二醇與濃縮液混溶均勻，過濾，取清液，即得。
[0057] 實施例3本發明中藥組合物的制備
[0058] (1)下述原料藥粉碎后按所述重量配比稱取，混勻；
[0059] 藁本30g、當歸40g、丹參40g、肉桂30g、藤茶30g、薄荷30g、山茱萸20g
[0060] (2)體積百分比為60%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :30,放置于 電熱恒溫水浴鍋中，90°C提取1小時；
[0061] (3)將步驟（2)得到的提取液從恒溫水浴鍋中取出，靜置冷卻至30°C，400目粗過 濾，濾出藥渣，得濾液；將該濾液再進行真空抽濾，抽濾條件：在布氏漏斗里鋪兩層濾紙，濾 紙中間夾〇. 6cm娃藻土真空抽濾，收集二次濾液；
[0062] (4)二次濾液在真空度-0· 09MPa，50°C條件下旋轉蒸發全部乙醇得濃縮液；加入 二次濾液量60% (體積百分比）的1，3_ 丁二醇與濃縮液混溶均勻，過濾，取清液，即得。
[0063] 實施例4本發明中藥組合物的制備
[0064] (1)下述原料藥粉碎后按所述重量配比稱取，混勻；
[0065] 藁本20g、當歸10g、丹參10g、肉桂10g、藤茶20g。
[0066] (2)體積百分比為70%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :15,放置于 電熱恒溫水浴鍋中，80°C提取3小時；
[0067] (3)將步驟（2)得到的提取液從恒溫水浴鍋中取出，靜置冷卻至常溫，200目粗過 濾，濾出藥渣，得濾液；將該濾液再進行真空抽濾，抽濾條件：在布氏漏斗里鋪兩層濾紙，濾 紙中間夾0. 5cm娃藻土真空抽濾，收集二次濾液；
[0068] (4)二次濾液在真空度_0· 09MPa，43°C條件下旋轉蒸發全部乙醇得濃縮液；加二 次濾液量70% (體積百分比）的1，3_ 丁二醇與濃縮液混溶均勻，過濾，取清液，即得。
[0069] 實施例5本發明中藥組合物的制備
[0070] (1)下述原料藥粉碎后按所述重量配比稱取，混勻；
[0071] 藁本60g、當歸20g、丹參30g、肉桂20g、藤茶10g。
[0072] (2)體積百分比為90%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :10,放置于 電熱恒溫水浴鍋中，70°C提取4小時；
[0073] (3)將步驟⑵得到的提取液從恒溫水浴鍋中取出，靜置冷卻至20°C，200目粗過 濾，濾出藥渣，得濾液；將該濾液再進行真空抽濾，抽濾條件：在布氏漏斗里鋪兩層濾紙，濾 紙中間夾〇. 3cm娃藻土真空抽濾，收集二次濾液；
[0074] (4)二次濾液在真空度-0. 09MPa，40°C條件下旋轉蒸發全部乙醇得濃縮液；加入 二次濾液量90% (體積百分比）的1，3_ 丁二醇與濃縮液混溶均勻，過濾，取清液，即得。
[0075] 實施例6本發明中藥組合物的制備
[0076] (1)下述原料藥粉碎后按所述重量配比稱取，混勻；
[0077] 藁本30g、當歸40g、丹參40g、肉桂30g、藤茶30g。
[0078] (2)體積百分比為60%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :30,放置于 電熱恒溫水浴鍋中，90°C提取1小時；
[0079] (3)將步驟（2)得到的提取液從恒溫水浴鍋中取出，靜置冷卻至30°C，400目粗過 濾，濾出藥渣，得濾液；將該濾液再進行真空抽濾，抽濾條件：在布氏漏斗里鋪兩層濾紙，濾 紙中間夾〇. 6cm娃藻土真空抽濾，收集二次濾液；
[0080] (4)二次濾液在真空度-0· 09MPa，50°C條件下旋轉蒸發全部乙醇得濃縮液；加入 二次濾液量60% (體積百分比）的1，3_ 丁二醇與濃縮液混溶均勻，過濾，取清液，即得。
[0081] 實施例7本發明護膚品添加劑的制備
[0082] 護膚品添加劑由實施例1中藥提取物經滅菌后制得。所述滅菌程序為90°C水浴滅 菌20分鐘。
[0083] 實施例8本發明護膚品添加劑的制備
[0084] 護膚品添加劑由實施例1中藥提取物經滅菌后制得。所述滅菌程序為90°C水浴滅 菌40分鐘。
[0085] 本發明功效實驗
[0086] -、實施例1、實施例2、實施例3所得中藥組合物A、B、C對六勝肽透皮運行吸收功 效評價
[0087] (1)研究目的
[0088] 通過觀察中藥組合物A、B、C對鼠皮透過性的影響，評價藥組合物A、B、C對短肽類 活性物質透皮運行吸收的積極作用。
[0089] (2)實驗材料
[0090] 受試品：實施例1、實施例2、實施例3、所得中藥組合物A、B、C陽性對照1 %氮酮 實驗動物：去除皮下脂肪及血管的豚鼠鼠皮，（購自北京金牧羊實驗動物養殖公司）。試劑： 六勝肽（北京澤溪源公司）、菁染料（CyDye3，北京泛博生化）、O %，20 %，30 %蔗糖PBS緩沖 液（自配）
[0091] 實驗儀器：皮膚切片機（Leica CM1850)、激光共聚焦熒光顯微鏡（LSCM-TCS-SP5， Leica)、移液器
[0092] (3)實驗方法
[0093] 首先將獲得質量純度在98%以上的六勝肽，與菁染料預期分子連接標記。選取 200_300g重豚鼠過夜培養，分成A、B二組，分別將其背部脫毛。之后在已去毛的豚鼠背部 上標記一個半徑為Icm的圓形區域，并分別標記為并位置保持一致；對于A組豚鼠，分別對 其涂抹不同中藥提取物，對于B組豚鼠，則分別對其涂抹氮酮，與此同時分別在所有豚鼠背 部涂抹含熒光標記物的成分六勝肽。經過〇. 5小時后，迅速脫頸處死A、B二組豚鼠，剪取其 標記部位皮膚，小心剝離，制作冰凍切片，指甲油封片。
[0094] 組織切片主要步驟：
[0095] a.將已標記透皮后的鼠迅速處死，取其標記區域的鼠皮。
[0096] b.迅速放置于4%多聚甲醛固定5小時左右。
[0097] c.去除后使用0%，20%，30%蔗糖PBS依次沉底，時間各約1小時。
[0098] d.取出后迅速冷凍，置于冷凍切片機，20 μ m切片。
[0099] e.置于多聚賴氨酸洗過的載玻片貼片，晾干。
[0100] f.熒光共聚焦顯微鏡（激光器為氦氖633nm)觀察結構。
[0101] 最后，經制作好的冰凍切片置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照分析結果。
[0102] (4)實驗結果
[0103] 實施例3,在豚鼠的皮膚中有了一定熒光信號，即六勝肽在豚鼠皮膚中有了一定透 過。
[0104] 實施例2,在豚鼠的皮膚中有了較強熒光信號，且在真皮中已有明顯累計，即六勝 肽在豚鼠皮膚中有較多透過。
[0105] 實施例1，熒光信號在豚鼠的皮膚中有彌散分布，可能是六勝肽在豚鼠皮膚中有過 度透過到了皮下組織中。
[0106] 1. 0%濃度下的氮酮，在豚鼠的皮膚中有了較強熒光信號，即六勝肽在豚鼠皮膚中 有較多透過到皮下組織中，具體見圖1。
[0107] 發明人利用實施例4、5、6制備得到的提取物重復上述實驗，其結果均顯示提取物 對六勝肽具有透過性，實驗效果同上述。
[0108] 人體皮膚最重要組成元素之一就是蛋白質，而蛋白質就是氨基酸鍵結成的勝肽鏈 (poly-peptide)。目前在一些皮膚相關的護膚品中使用的大多數是不超過10個氨基酸的 短肽如：二勝肽、三勝肽、五勝肽、六勝肽等。六勝肽在化妝品勝肽類添加物中算是分子量比 較大的分子量（888)，因為我們的實驗證明了運化因子能對六勝肽有促透作用，所以對于其 他分子量更小且常添加在化妝品中的其他短肽也會有促透作用。二、實施例1中藥提取物 A對維生素類物質促透作用
[0109] L實驗目的：
[0110] 維生素類物質對于皮膚有很好的營養功效，是維持人體生命活動必須的一類活性 物質，對皮膚具有美白、抗衰等多種功效，是化妝品中常用功效添加劑。將維生素類物質更 高效的促透進皮膚，有利于皮膚健康，也可降低化妝品中功效物質的含量，降低生產成本。 所以進行維生素類物質促透作用的研究已經成為近些年化妝品行業的研究熱點之一。
[0111] 2.實驗內容
[0112] 2.1儀器與試藥
[0113] 2. I. 1儀器：高效液相色譜儀；Franz透皮吸收儀；分析天平；超聲儀；移液管；容 量瓶；渦旋振蕩器，鼠皮（北京金牧羊實驗動物養殖公司）。
[0114] 2. 1. 2試藥煙酰胺對照品（購于廣州南沙龍沙有限公司）；生理鹽水（購于四川 科倫藥業股份有限公司，批號M13072421);水溶性氮酮，（購于北京貝麗萊斯生物化學有限 公司）；樣品明細見表2。
[0115] 表2樣品明細
[0117] 2. 1.3樣品制備方法
[0118] 樣品1 :精確稱取煙酰胺對照品0. 300g，實施例1中藥提取物A0.0 30g，生理鹽水 5. 670g，充分溶解，制備成質量分數為5%的煙酰胺，0. 5%的實施例1中藥提取物A供給液。 4°C保存待用，使用前恢復室溫。
[0119] 樣品2 :精確稱取煙酰胺對照品0. 300g，實施例1中藥提取物A0.0 60g，生理鹽水 5. 640g，充分溶解，制備成質量分數為5%的煙酰胺，1. 0%的實施例1中藥提取物A供給液。 4°C保存待用，使用前恢復室溫。
[0120] 樣品3 :精確稱取煙酰胺對照品0. 300g，實施例1中藥組合物AO. 120g，生理鹽水 5. 580g，充分溶解，制備成質量分數為5%的煙酰胺，2. 0%的實施例1中藥組合物A供給液。 4°C保存待用，使用前恢復室溫。
[0121] 樣品4 :精確稱取煙酰胺對照品0. 300g，水溶性氮酮0. 060g，生理鹽水5. 640g，充 分溶解，制備成質量分數為5%的煙酰胺，I. 0%的水溶性氮酮供給液。4°C保存待用，使用前 恢復室溫。
[0122] 樣品5 :精確稱取煙酰胺對照品0. 300g，生理鹽水5. 700g，充分溶解，制備成質量 分數為5%的煙酰胺供給液。4°C保存待用，使用前恢復室溫。
[0123] 2. 2鼠皮制備：
[0124] 2. 2. 1將豚鼠（北京軍事醫學院動物中心）脫頸椎處死；
[0125] 2. 2. 2迅速將其腹部毛用醫用剪刀盡量剪短；
[0126] 2. 2. 3用脫毛膏將其腹部毛脫凈；
[0127] 2. 2. 4剝離腹部皮膚并除去皮下脂肪，血管，用蒸餾水反復沖洗至凈；
[0128] 2. 2. 5用生理鹽水沖洗數遍，置-80 °C冰箱中冷藏備用。
[0129] 2. 3 Franz擴散池進行體外透皮吸收實驗
[0130] 2. 3. 1鼠皮：實驗開始前，將鼠皮置于生理鹽水中浸泡15min。
[0131] 2. 3. 2接受液：生理鹽水。
[0132] 2. 3. 3 供給液：A、B、C、D、E。
[0133] 2. 3. 4實驗過程：
[0134] 向體外滲透擴散裝置恒溫槽中加入適量水。開啟電源和恒溫槽磁力攪拌，設定恒 溫槽中水溫為37 士 0. TC。將硅膠膜用鐵夾子固定在兩室擴散池之間，向垂直擴散池的 接受池內加入12ml接受液，放入體外滲透擴散裝置恒溫槽中預熱，設定接受池攪拌速度為 400轉/分。向供給池內分別加入供給液5ml。開始記時，當樣品滲透0. 5h、lh、2h、3h、4h、 6h、IOh取樣400 μ L置具塞離心管中，每次取樣的同時向接受池中補充等量的接受液并排 除池中的氣。
[0135] 3.實驗結果
[0136] 3. 1樣品前處理
[0137] 精密稱取樣品100 yL，加流動相定容到lmL，加流動相稀釋至刻度，搖勻。取一定 溶液過0. 45 μ m有機系濾膜，濾液保存于2mL棕色進樣瓶中作為待測樣液，備用。
[0138] 3. 2標準液制備
[0139] 精密稱取煙酰胺標準品Img置于IOmL的容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度， 搖勻，作為儲備液。精密稱量儲備液〇. 2mL，0. 4mL，0. 6mL，0. 8mL，1.0 mL于具塞試管中，定容 到 lmL，制成20、40、60、80、100 μ g/mL的溶液。取一定溶液過0. 45 μ m有機系濾膜，濾液保 存于2mL棕色進樣瓶中作為待測樣液，備用。
[0140] 3.3色譜條件
[0141] 色譜柱，C18 色譜柱（250mm X 4. 6mm，5 μ m);
[0142] 流動相：甲醇-水（20 :80);
[0143] 流速：1.0ml/min ;
[0144] 檢測波長為：26 Inm ;
[0145] 進樣體積：20μ1;
[0146] 柱溫：30°C ;
[0147] 理論塔板數按煙酰胺峰計算不低于3000。
[0148] 3.4標準曲線制備
[0149] 取標準工作溶液分別進樣，以目標峰面積為縱坐標，標準液溶液濃度為橫坐標進 行線性回歸，建立標準工作曲線。具體見圖2。
[0150] 表3標準曲線測試結果
[0152] 3.5樣品含量測試結果
[0153] 取"3. 1"下處理的待測溶液進樣，根據測定成分的峰面積，分別代入標準工作曲線 上，取得煙酰胺的質量溶度。
[0154] 表4樣品A的測試結果
[0162] 表8樣品E的測試結果
[0163]
[0164] 3.6數據采集
[0165]
[0166] 根據以下公式計算出累積透過量Q( μ g/cm2)。
[0167] 注：Q為累積透過量（μ g/cm2)，S為透皮擴散面積（cm2)，V1S Franz擴散池接受 液體積（mL)，P η為第η次取樣時接受液的質量濃度（μ g/mL)，P i為第i次取樣時接受液 的質量濃度（μ g/mL)，％為取樣量（mL)。
[0168] 表9樣品A的透過累積量
[0170] 表10樣品B的透過累積量
[0171]

[0178] 具體見圖3。
[0179] 3. 7分析與討論
[0180] 實驗數據表明，IOh濃度為5 %煙酰胺溶液自身的單位面積的累積透過量僅為 3577.0 μ g/cm2,使用實施例1進行促透以后，累積透過量有所提高。實施例1對煙酰胺促 透起效量為1. 〇%。促透〇. 5h，單位面積累積透過量增加145% ;促透4h，單位面積累積透 過量增加109% ;促透10h，單位面積累積透過量增加109%。實施例1對煙酰胺的促透效 果，隨著實施例1濃度的增大而增加。2.0%的實施例1促透4h，單位面積累積透過量增加 182% ;促透10h，單位面積累積透過量增加216%。
[0181] 發明人用實施例2至6得到的中藥提取物重復上述實驗，其結果均表明提取物對 對煙酰胺具有很好的促透效果。
[0182] 維生素按照溶解性可分為脂溶性（如維生素 A、維生素 D、維生素 E、維生素 K)和水 溶性（如維生素 B1、維生素 B2、維生素 B3、維生素 B5、維生素 B12、維生素 C)兩大類。脂溶性 維生素與皮膚屏障中的脂類物質結構有相似性，具有相似相溶的特性，溶解度較好。水溶性 維生素，根據相似相溶原理，透皮有一定阻礙。煙酰胺是水溶性維生素代表物質B 3前體，具 有優良的美白效果。本發明中藥提取物對煙酰胺具有很好的促透效果，根據相似相同原理， 說明其對水溶性維生素均具有良好的促透效果。
[0183] 三、實施例1所得中藥提取物A使用安全性評價
[0184] 要檢測所研發實施例1是否有著良好安全性或刺激性，在有或無實施例1的條件 下對活體豚鼠皮膚進行處理，并作經典的HE組織石蠟切片進行觀察。通過比較豚鼠皮膚表 皮損傷的差異就可檢驗促透劑的安全性或刺激性。
[0185] 實驗材料
[0186] 皮膚切片機、HE染料、萊卡熒光顯微鏡、移液器、
[0187] 標記物：實施例1提取物、氮酮、伊紅、蘇木精、二甲苯、石蠟等
[0188] 主要流程
[0189] (1)首先配制不同濃度（0%、0·5%、1·0%、2·0% )的樣本1(實施例1)與樣本 2 (氮酮）。
[0190] (2)選取200~300g重豚鼠，分成A、B二組，分別將其背部脫毛。之后在已去毛 的豚鼠背部上標記三個半徑為Icm的圓形區域，并分別標記為并位置保持一致。
[0191] (3)對于A組豚鼠，分別對其涂抹不同濃度的樣本1(實例1)，對于B組豚鼠，則分 別對其涂抹不同濃度的樣本2 (氮酮）。
[0192] (4)經過0.5小時后，迅速脫頸處死A、B二組豚鼠，剪取其標記部位皮膚，小心剝 離，制作HE切片。
[0193] HE切片主要步驟
[0194] (a)切片在二甲苯中脫蠟5~10分鐘。
[0195] (b)移入二甲苯和純酒精（I : 1)混合液中5分鐘左右（如經二次二甲苯脫蠟，此 步可略）。
[0196] (c)入100%、95%、85%、70%酒精，各級為2~5分鐘。最后經蒸餾水轉入染液。
[0197] (d)蘇木精染液染色5~15分鐘。
[0198] (e)水洗玻片上多余染液，0. 5~1%鹽酸酒精（70%酒精配制）分色片刻。鏡檢 控制，直至細胞核及核內染色質清晰為止，約數10秒鐘。
[0199] (f)流水沖洗15~30分鐘，或者在碳酸鋰飽和液中短時間堿化或藍化，即細胞核 呈藍色。
[0200] (g)蒸餾水短洗。
[0201] (h)0. 1~0. 5%伊紅染液染色1~5分鐘，若著色困難，可在每100毫升染液中加 入1~2滴冰醋酸，使易著色且不易脫色。
[0202] ⑴依次經70%、85%、95%、100%酒精脫水，各級為2~3分鐘，在95%以下濃度 的酒精中伊紅易脫色，應適當縮短時間。
[0203] (j)二甲苯透明（二次），共約10分鐘。
[0204] (k)封片：擦去切片周圍多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋 玻片封固。
[0205] 實驗結果：如圖4所示。
[0206] 實施例1提取物：實施例1提取物在0%的濃度下，即沒有運化因子存在時，豚鼠 皮膚中的表皮層尤其是角質層非常完好；實施例1提取物在0.5%的濃度下，在豚鼠的表 皮層整體上依舊完好，僅僅局部區域開始出現褶皺或變薄；實施例1提取物在1.0%的濃 度下，豚鼠表皮有變薄，局部角質層開始與表皮出現結合不穩或者脫落；實施例1提取物在 2. 0%的濃度下，豚鼠表皮層出現彌散性角質層變薄現象。
[0207] 氮酮：氮酮在0%的濃度下，即沒有氮酮存在時，豚鼠皮膚中的表皮層尤其是角質 層非常完好；氮酮在0.5%的濃度下，在豚鼠的表皮層開始出現大面積褶皺，角質層開始與 表皮出現結合穩甚至分離現象；氮酮在1.0%的濃度下，在豚鼠的表皮層及角質層開始出 現大面積脫落，褶皺，表皮層受損明顯；氮酮在2. 0%的濃度下，在豚鼠的表皮層褶皺，受損 明顯。
[0208] 結論
[0209] 根據實驗結果，從縱向（濃度）上看：實施例1濃度在2%以下使用，對豚鼠表皮皮 膚，尤其是角質層損傷基本比較小，因而實施例1安全濃度為：< 2% ;而氮酮濃度在0. 5% 時，豚鼠表皮角質層就有分離現象存在，1%時角質層有脫落現像，2%時表皮受損嚴重，因 而氮酮的安全濃度為：< 1%。從橫向（與同濃度氮酮比較）看：同一濃度下（〇. 5%，1. 0%， 2.0% )氮酮對于豚鼠表皮尤其是角質層的刺激或傷害均明顯大于實施例1。綜上，實施例 1提取物具有明顯的抗敏抗刺激功效，溫和促透，使用安全性大大優于氮酮。發明人用實施 例2至6所得提取物重復上述實驗，效果同上述，其結果均表明提取物與氮酮相比具有很好 的安全性。
[0210] 四、實施例1、實施例2、實施例3所得中藥提取物A、B、C透皮效果實驗。
[0211] 1.實驗目的
[0212] 1.實驗驗證實施例1、實施例2、實施例3三種組方對于與皮膚的穿透作用。
[0213] 2.實驗內容
[0214] 2. 1儀器與試藥
[0215] 2. I. 1儀器：高效液相色譜儀；Franz透皮吸收儀；分析天平；超聲儀；移液管；容 量瓶；渦旋振蕩器，鼠皮（北京金牧羊實驗動物養殖公司）；棕色瓶；分光光度計
[0216] 2. 1.2試藥生理鹽水（購于四川科倫藥業股份有限公司，批號M13072421); 水溶性氮酮，（購于北京貝麗萊斯生物化學有限公司）；無水葡萄糖；苯酚；NaN0 2;10% Al(NO3)3;
[0217] 2.2鼠皮制備：
[0218] 2. 2. 1將豚鼠（北京軍事醫學院動物中心）脫頸椎處死；
[0219] 2. 2. 2迅速將其腹部毛用醫用剪刀盡量剪短；
[0220] 2. 2. 3用脫毛膏將其腹部毛脫凈；
[0221] 2. 2. 4剝離腹部皮膚并除去皮下脂肪，血管，用蒸餾水反復沖洗至凈；
[0222] 2. 2. 5用生理鹽水沖洗數遍，置-80 °C冰箱中冷藏備用。
[0223] 2. 3 Franz擴散池進行體外透皮運行吸收實
[0224] 2. 3. 1鼠皮：實驗開始前，將鼠皮置于生理鹽水中浸泡15min。
[0225] 2. 3. 2接受液：生理鹽水。
[0226] 2. 3. 3 供給液:A、B、C
[0227] 3.實驗方法
[0228] 3. I Franz擴散池實驗
[0229] 將制備好的鼠皮用鐵夾子固定在兩室擴散池之間，向垂直擴散池的接受池內加入 5mL質量分數為0. 9 %的NaCl溶液（生理鹽水），設定接受池攪拌速度為400轉/分，設定 恒溫槽中水溫為37 士 0.1°C。向供給池內分別加入供給液，以保鮮膜封住上口。當樣品滲 透1、2、4、6、8、10、12、24小時時，分別取樣V2置具塞離心管中，每次取樣的同時向接受池中 補充等量的接受液并排除池中的氣泡。根據被測物的不同，采用不同的檢測法檢測接受液 中樣品濃度。根據公式（1)計算出累積透過量Q(mg/cm 2)。
[0230]
⑴
[0231] 注：Q為累積透過量，S為透皮擴散面積（我們的擴散池 R = 0. 6cm，S = I. 1304cm2)，V1S Franz擴散池接受液體積（V 5mL)，P n為第η次取樣時接受液的質量 濃度（mg/mL)，P i為第i次取樣時接受液的質量濃度（mg/mL)，V2為取樣量。
[0232] 通過公式（1)計算后，做出累積量與時間的曲線圖。
[0233] 3. 2苯酚硫酸法檢測糖類促透
[0234] 3. 2. 1試劑配制
[0235] 標準溶液的配制：準確稱取無水葡萄糖100.0 mg，置于100mL容量瓶中用蒸餾水定 容，得濃度為lmg/ml葡萄糖貯備溶液。
[0236] 苯酚溶液的配制：苯酚10. 00g，加入水190ml得5%苯酚溶液置于棕色瓶中。
[0237] 3. 2. 2實驗步驟
[0238] 標準曲線的繪制：
[0239] 準確吸取lmg/ml葡萄糖標準溶液1. 0, 2. 0, 3. 0,4. 0, 5. Oml置于500ml容量瓶定 容。準確吸取該系列溶液各2ml，量取2. Oml去離子水做空白對照，分別置于具有刻度試管 中，進行比色反應，繪制標準曲線。
[0240] 樣品測定：
[0241] A.取待測樣2. Oml放于試管中（以2. Oml去離子水做空白對照），加 1.0 ml 5%苯 酚溶液混勻。
[0242] B.加入5. Oml濃硫酸，混勾5min后，封管沸水浴1小時。
[0243] C.取出后冷卻至室溫，在490nm處測吸光度。
[0244] 3.2.3標準曲線：
[0245] Y = [(X+0. 0049)/0. 0101] X 稀釋倍數，R2= 0· 9999 其中，X 為吸光度值，Y 為多 糖含量（ug/ml)，X范圍應落在0. 2-0. 8之間。
[0246] 3.3福林酚法檢測多肽類促透
[0247] 3. 3. 1試劑配制
[0248] 試劑甲：
[0249] (A) IOg Na2C03+2g NaOH+O. 2? 酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O4 · 4H20)溶于 500ml 去離子 水。
[0250] ⑶0· 5g硫酸銅（CuSO4 · 5H20)溶解于100mL去離子水。每次使用將50份㈧與 1份（B)混合，即為試劑甲。
[0251] 試劑乙：
[0252] 福林酚：去離子水=1 :1混合。
[0253] 3.3.2實驗步驟
[0254] (1)取Iml樣品溶液（按測OD值要求稀釋樣品）。
[0255] (2)加入5ml試劑甲，在旋渦混合器迅速混合放入25 °C水浴10分鐘。
[0256] (3)逐管加入0. 5ml試劑乙，立即混勻，25°C水浴反應30分鐘。
[0257] (4)在700nm處測定吸光度值。
[0258] 3.3.3標準曲線
[0259] Y = [(X-0. 0415)/0. 0027] X 稀釋倍數，R2= 0. 9999 其中，X 為吸光度值，Y 為多 肽含量（ug/ml)，X范圍應落在0. 2-0. 8之間。
[0260] 3. 4亞硝酸鈉-硫酸鋁法檢測黃酮類促透
[0261] 3.4.1實驗原理
[0262] 黃酮類化合物能與硝酸鋁反應生成黃色的黃酮鋁絡合物。
[0263] 3.4.2實驗步驟
[0264] (1)取Iml樣品溶液，對照組用Iml去離子水。
[0265] (2)加入 0· 3ml 5 % 的 NaNO2溶液，搖勻。
[0266] (3)加入 0· 3ml 10 % 的 Al (NO3) 3,搖勾，靜置 3 分鐘。
[0267] (4)加入4. Oml去離子水，搖勻。
[0268] (5)加入4. Oml 4%的NaOH，搖勾，靜置10分鐘，在510nm處測定吸光度值。
[0269] 3.4.3標準曲線
[0270] Y = (I. 101X+0. 0029) X稀釋倍數，R2= 0· 9999其中X為吸光度值，Y為黃酮含 量（ug/ml)，X范圍應落在0. 2~0. 8之間。
[0271] 4.結果與分析
[0272] 4. 1本發明中藥提取物對化妝品中的植物活性多糖（海藻糖）促透結果
[0273] 海藻糖一種天然的糖類，存在于許多沙漠植物中，在植物干枯時形成一層玻璃狀 的基質，能有效地保護表皮細胞膜結構，活化細胞，調理肌膚，是化妝品當中代表性的植物 活性多糖。
[0274] 通過Franz擴散池透皮運行吸收實驗，檢測1%的不同中藥組方對1%海藻糖的促 透功效，用苯酚-硫酸法檢測透皮濃度，以1%氮酮作為陽性對照。檢測結果如圖5。從結 果中可以看出，所選3種提取物使用Ih后，均產生促透效果；累積透過量達到6mg/cm 2時各 促透劑所用時間實施例1<實施例3 <實施例2 < 1%氮酮，其中實施例1所需時間僅為 1 %氮酮的40%，促透起效迅速；所選3種中藥促透劑24小時海藻糖累積滲透量分別為：實 施例1為10. 448mg/cm2,實施例2為8. 368mg/cm2,實施例3為8. 459mg/cm2,1。其中，實施 例1對海藻糖的促透效果最佳，其24h的累積滲量約為空白對照（5.047mg/cm 2)的兩倍，且 高于陽性參照物氮酮（7. 089mg/cm2)。不同促透劑對海藻糖的促透功效為：實施例1>實施 例3>實施例2>1%氮酮。
[0275] 以上結果表明本發明提取物較現有技術具有迅速促透的功效，在皮膚應急修復中 速效促透非常關鍵，可以在皮膚修復的黃金時間內起到快速促透修復的作用。發明人利用 實施例4、5、6重復上述實驗，實驗結果同上述。
[0276] 4.2不同原料對多肽類促透結果
[0277] 通過Franz擴散池透皮運行吸收實驗，檢測1 %的中藥促透劑對10%燕麥多肽的 促透功效，用福林酚法檢測透皮濃度，以1%氮酮作為陽性對照。檢測結果如圖6。從結果 中可以看出，所選3種中藥提取物使用3h后，均產生促透效果。24小時燕麥多肽累積滲透 量分別為：實例1為〇· 35mg/cm2,實例2為0· 33mg/cm2,實例3為0· 25mg/cm2。其中，實施例 1對燕麥多肽的促透效果最佳，其24h的累積滲量約為空白對照（0. 13mg/cm2)的近3倍，且 比陽性參照物氮酮（〇.21mg/cm2)提高66%，說明實施例1對燕麥多肽長效促透效果優于氮 酮。不同促透劑對燕麥多肽的促透功效為：實例1>實例2>實例3>1 %氮酮。
[0278] 以上結果表明本發明提取物較現有技術具有長效促透的功效，在皮膚護理中長效 促透可以使營養成分充分持久的滲入皮膚，使護膚效果最佳，發明人利用實施例4、5、6重 復上述實驗，實驗結果同上述。
[0279] 4. 3中藥提取物對植物活性黃酮（甘草黃酮）促透結果
[0280] 甘草黃酮是從甘草中提取的天然美白劑，它能抑制酪氨酸酶的活性，又能抑制多 巴色素互變和DHICA氧化酶的活性，是一種代表性的植物活性黃酮化妝品添加劑。
[0281] 通過Franz擴散池透皮運行吸收實驗，檢測1 %的中藥促透劑對5%甘草黃酮的促 透功效，用亞硝酸鈉-硝酸鋁法檢測透皮濃度，以1%氮酮作為陽性對照。檢測結果如圖7。
[0282] 從結果中可以看出，所選3種中藥促透劑24小時甘草黃酮累積滲透量分別為：實 施例 1 為 〇· 23mg/cm2,實施例 2 為 0· 2mg/cm2,實施例 3 為 0· 13mg/cm2,氮酮為 0· 12mg/cm2' 空白試驗為〇.〇8mg/cm2。其中，實施例1對甘草黃酮的促透效果最佳，其24h的累積滲透量 為空白對照（0. 08mg/cm2)的近3倍，且約是陽性參照物氮酮（0. 12mg/cm2)2倍，說明實施例 1對甘草黃酮長效促透效果優于氮酮。不同促透劑對甘草黃酮的促透功效為：實施例1>實 施例2>實施例3>1%氮酮〉空白試驗。
[0283] 以上結果表明本發明提取物較現有技術具有長效促透的功效，發明人利用實施例 4、5、6重復上述實驗，實驗結果同上述。
【主權項】
1. 一種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物，其特征在于，所述外 用中藥組合物由下述重量份配比的原料藥制成： 藁本2~6、當歸1~4、丹參1~4、肉桂1~3、藤茶1~3。2. -種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥組合物，其特征在于，所述外 用中藥組合物由下述重量份配比的原料藥制成： 梟本2~6、當歸1~4、丹參1~4、肉桂1~3、藤茶1~3、薄荷1~3、山菜英1~ 3〇3. -種權利要求1或2所述外用中藥組合物的制備方法，其特征在于，所述制備方法的 步驟如下： (1) 權利要求1或2所述原料藥粉碎后按所述重量份配比稱取，混勻； (2) 體積百分比為60%~90%乙醇提取，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :10~1 : 30,70°C~90°C提取1~4小時； (3) 將步驟⑵得到的提取液冷卻至20°C~30°C，200~400目粗過濾，濾出藥渣后進 行真空抽濾，收集二次濾液； (4) 將濾液旋轉蒸發全部乙醇得到濃縮液，濃縮液中加入1，3-丁二醇，加入量為步驟 (3)所得二次濾液量體積百分比的60%~90% ;混溶均勻，過濾，取清液，即得。4. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中乙醇的體積百分比為 70%，原料藥與乙醇質量體積比g/ml為1 :15 ;提取時間為3小時。5. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（3)中真空抽濾條件為在布氏 漏斗里鋪兩層濾紙，濾紙中間夾〇. 3~0. 6cm硅藻土進行真空抽濾。6. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)是在真空度-0.09MPa， 40°C~50°C條件下旋轉蒸發全部乙醇。7. -種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外用中藥提取物，其特征在于，所述外 用中藥提取物由權利要求3至6中任意一項所述制備方法提取得到的。8. 權利要求7所述外用中藥提取物在制備具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的外 用護膚品添加劑中的用途。9. 一種具有促進皮膚活性物質運行吸收功效的護膚品添加劑，其特征在于，所述護膚 品添加劑由權利要求7所述外用中藥提取物經滅菌后制得。10. 如權利要求9所述的護膚品添加劑，其特征在于，所述滅菌程序為90°C水浴滅菌 20~40分鐘。
【文檔編號】A61Q19/00GK105983023SQ201510085515
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月16日
【發明人】劉光榮, 鄧薇, 孟宏, 劉月恒, 何凡, 何一凡, 魏濤
【申請人】無限極（中國）有限公司