北五味子肝損傷保護提取物及其組合物的醫藥用途和制備方法
【專利摘要】本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種維吾爾藥北五味子肝損傷保護活性提取物及其組合物的醫藥用途和制備方法以及它在脂肪肝，酒精肝，肝細胞壞死，肝硬化等肝病方面的治療用途。所述的提取物通過如下方法制備：維吾爾藥北五味子經溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱先用石油醚：丙酮混合溶劑（石油醚：丙酮，100:0-100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚：丙酮混合溶劑（石油醚：丙酮，100:2-100:8，體積比）洗脫，石油醚：丙酮100:2-100:8洗脫液干燥即得。
【專利說明】
北五味子肝損傷保護提取物及其組合物的醫藥用途和制備 方法
技術領域
[0001] 本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種維吾爾藥北五味子肝損傷保護提取物及其 組合物的醫藥用途和制備方法以及它在脂肪肝，酒精肝，肝細胞壞死，肝硬化等肝病方面的 治療用途。
【背景技術】
[0002] 五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz. ) Baill.或華中五味 子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果實。前者習稱"北五味子"，后 者習稱"南五味子"。秋季果實成熟時采摘，曬干或蒸后曬干，除去果梗及雜質。唐等《新修 本草》載"五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味"，故有五味子之名。五味子分為南、北二種。 古醫書稱它室藉、玄及、會及，最早列于神農本草經上品中藥，能滋補強壯之力，藥用價值極 高，有強身健體之效。
[0003] 目前中醫臨床應用：北五味子性酸溫無毒，對常見老年病肺腎虛損之咳喘，消渴尿 多，氣虛自汗，陰虛盜汗，均有治療作用。對改善老年心血不足、心氣虛、心腎不交之失眠心 悸均有良好作用。故常用于：老年肺腎虛損之咳喘，氣短。老年自汗、盜汗，津傷口渴，消渴， 陰虛口干，腎虛之證。老年心虛、心悸怔忡，健忘失眠。西醫臨床應用：用北五味子一味或北 五味子復方治療慢性肝炎，使ALT顯著降低或恢復正常。可能是一種肝臟代謝調節劑。用 于鎮咳、祛痰。北五味子復方治療體虛失眠。用于老年人延緩衰老等，故為治療老年病的有 效藥物。
[0004] 總之，該品能提高體力，消除疲勞，改善智力及提高工作效率。老年人隨增齡而腎 精漸虛，體力日衰，腦力減退，北五味子補腎精改善腦力，故能益智強身，而實驗研究表明北 五味子在泌尿生殖系統有一定的抗衰老作用。因此，北五味子是一味對延緩衰老有益并能 治療某些老年病的有效藥物。
[0005] 本發明發現北五味子甲醇提取物具有肝損傷保護活性，通過大規模、系統地活性 篩選，本發明成功地發現了北五味子提取物及其部分化學組分，具有顯著地肝損傷保護活 性，該活性提取物及其組合物有望應用于脂肪肝，酒精肝，肝細胞壞死，肝硬化等肝病方面 的治療。
【發明內容】
[0006] 本發明所解決的技術問題是提供一種北五味子提取物。
[0007] 本發明還提供了以北五味子提取物為主要活性成分的組合物。
[0008] 本發明同時提供了北五味子提取物及其組合物的制備和在制備肝損傷保護藥物 中的應用。
[0009] 本發明是通過如下技術方案實現的：
[0010] 維吾爾藥北五味子經甲醇超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠（SiO2)柱分離，上樣后 的硅膠柱，用石油醚-丙酮（100:0-100:100)混合溶劑梯度洗脫（石油醚-丙酮，比例見 表1)，各石油醚-丙酮比例混合溶劑洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外篩選體系測試其肝損 傷保護活性，意外地發現先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:0-100:1，體積 比）洗脫，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2-100:8,體積比）洗脫，得到的 100:2-100:8石油醚-丙酮混合溶劑洗脫液經回收有機溶劑，干燥后，具有顯著地肝損傷保 護活性，而其他比例的洗脫組分，沒有肝損傷保護活性。優選地，先用石油醚：丙酮混合溶劑 (石油醚：丙酮，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚：丙酮混合溶劑（石油醚：丙酮，100:8,體 積比）洗脫，石油醚：丙酮100:8洗脫液干燥即得。本發明的肝損傷保護活性的化合物，可 以通過以上方法，得到富集，從而與其他雜質類成分分離開。該北五味子肝損傷保護活性提 取物從未見文獻報道，其薄層譜色譜（TLC)分析表征如圖1，TLC分析條件：GF254硅膠板， 展開系統：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（3:1:1)顯色方法：香草醛-硫酸顯色。
[0011] 具體，發現過程如下：
[0012] 1、北五味子經甲醇超聲提取物的制備
[0013] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取物 SN0180A :2. 3700g，留樣：0· 2516g
[0014] 2、石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫方法和結果
[0015] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取 物SN0180A :2. 3700g。上硅膠柱色譜，拌樣硅膠2g，空白硅膠10g，玻璃柱內徑2. 0cm，石油 醚-丙酮系統梯度洗脫（條件見表1)，柱體積25mL，每個梯度洗脫200mL，得到，各個濃度 提取洗脫液的洗脫物，回收溶劑，即得，石油醚：丙酮梯度洗脫提取物，TLC分析結果見圖2， TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（3:1:1)顯色方法：香草 醛-硫酸顯色。
[0016] 表1:
[0018] 3、肝?貝忉休JT泊T土師逃力達邪珀米
[0019] 1)實驗條件
[0020] a)細胞株信息
[0021] 人肝癌細胞株HepG2購于中國典型培養物保藏中心細胞庫。
[0022] b)藥品及試劑
[0023] 樣品無菌條件下，DMSO溶解配置成母液濃度為100mg/mL，使用時用DMEM培養液稀 釋至所需濃度（DMSO < 1%。）。
[0024] DMEM培養基干粉購于美國GIBCO公司。胎牛血清購于北京元亨圣馬生物技術研究 所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴鹽（MTT)。
[0025] c)儀器
[0026] CO2培養箱（SANYO,日本）
[0027] 垂直層流潔凈工作臺（上海上凈凈化設備有限公司）
[0028] 倒置生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）
[0029] 低/高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）
[0030] 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）
[0031] 酶標儀（伯樂生命醫學產品有限公司）
[0032] 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）
[0033] 鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠）
[0034] PH 計（SART0RIUS，德國）
[0035] 2)實驗方法和過程
[0036] 取對數期生長的！fepG2細胞，用DMEM培養液稀釋為5. 0 X IO4個/mL，IOOul每孔 接種于96孔板中，于培養箱中培養。過夜培養以后，使用半乳糖胺（30mM)培養5h進行造 模。造模結束后加入相應的待測樣品，繼續培養24h后采用MTT法進行細胞存活率評價。 MTT法，即加入IOul MTT (5mg/ml)，培養4h后棄去上清液，然后加入IOOul DMSO,震蕩均勻 后利用酶標儀在570nm下測試吸光度值，進而通過細胞生長抑制率的變化來評價樣品的肝 臟保護作用。
[0037] 3)實驗結果 「00381 棄 2 .
[0044] 結果發現：本發明優選的技術方案為：維吾爾藥北五味子經有機溶劑超聲提取， 提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙 酮，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗 脫，石油醚：丙酮100:8洗脫液經回收有機溶劑，干燥，得到高活性提取物，即為該肝損傷保 護的提取物。該肝損傷保護活性提取物從未見文獻報道，其TLC分析表征如圖1。
[0045] 4、肝損傷保護活性有效提取物的提取方法研究
[0046] 1)提取溶劑的種類研究
[0047] 分別用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑等有 機溶劑提取，并測試半乳糖胺造模后加入提取物的IfepG2細胞生長抑制率，實驗結果如下：
[0048] 表 3 :
[0050] 研究結果表明：提取用有機溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水 混合溶劑、乙醇水混合溶劑。
[0051] 2)提取溶劑的用量研究
[0052] 分別用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/體積比）有機溶劑提取，并測試提取物 的肝損傷保護活性，結果如下：
[0053] 表 4 :
[0054]
[0056] 活性提取物的提取所用有機溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。
[0057] 3)干燥方法的研究
[0058] 分別用真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等方法，對得到 的肝損傷保護活性提取物進行干燥，以含水量、TLC、活性測試為指標，發現真空干燥法、冷 凍干燥法、鼓風干燥、離心干燥、旋蒸干燥法適用于對肝損傷保護活性提取物進行干燥，其 中，最優為真空干燥法、冷凍干燥法。
[0059] 表 5 :
[0061] 優選地，北五味子肝損傷保護活性提取物的制備方法為：
[0062] 維吾爾藥北五味子經有機溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的 硅膠柱，先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱 體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱體 積，石油醚：丙酮100:8洗脫液經回收有機溶劑，干燥，即為該活性提取物。以上條件最優為 先用石油醚：丙酮混合溶劑（石油醚：丙酮，100: 1，體積比）洗脫10倍柱體積，繼用甲醇洗 脫20倍柱體積。其中，
[0063] 1)提取物提取用溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、 乙醇水混合溶劑，最優條件為甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有機溶劑用量為藥材重 量的2-50倍（重量/體積比）。
[0064] 2)提取物干燥方法可以為真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風干燥、離心干燥、旋蒸干 燥法等，最優為真空干燥法、冷凍干燥法。
[0065] 5.北五味子肝損傷保護活性提取物（先用石油醚：丙酮=100:1洗脫，再用石油 醚：丙酮=100:8洗脫得到的提取物）的醫藥用途研究
[0066] 按優化的北五味子肝損傷保護活性提取物制備方法制備的活性提取物，經測試， 在半乳糖胺造模后，加入活性提取物，HepG2細胞的生長抑制率為13. 5%。
[0067] 由于北五味子肝損傷保護活性提取物具有預防和治療脂肪肝，酒精肝，肝細胞壞 死，肝硬化等肝病方面的用途。因此，我們發現的北五味子肝損傷保護活性提取物具有廣泛 的醫藥用途。
[0068] 6、北五味子肝損傷保護活性提取物的組合物及其制備方法研究
[0069] 1)固體分散體
[0070] 處方
[0072] 制備方法：
[0073] 稱取北五味子提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的質量比 分別放入燒杯中，加入適量的無水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至北五味子提取物和載體 完全溶解，充分混合均勻后轉入旋蒸儀中除去有機溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得北五味 子有效提取物PVP包合物。
[0074] 2)環糊精包合物
[0076] 制備方法：
[0077] 將β -環糊精與1-5倍水研勻，加北五味子有效提取物（水難溶性的應先溶于少 量有機溶劑中）繼續充分研磨至成糊狀物，低溫干燥即得環糊精包合物。
[0078] 3)分散片處方：
[0079]
[0080] 制備方法：
[0081] 1.北五味子有效提取物分散體的制備，精密稱取北五味子提取物、Vc，加入處方量 的十二
[0082] 烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻 后，在70°C的溫度下蒸干，粉碎，過100目篩；
[0083] 2.將第一步中的北五味子有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯聚維酮，預膠化 淀粉，用適量的濃度為70 %乙醇做濕潤劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放 置15min后，60°C烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻 后，壓片即得。
[0084] 7、北五味子肝損傷保護活性提取物的檢測方法研究
[0085] 我們發現，可以用薄層色譜的方法，很好地檢測和標示北五味子肝損傷保護活性 提取物的特征。見圖1
[0086] 具體條件為：GF254硅膠板，展開系統：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)顯色方法： 香草醛-濃硫酸顯色。
【附圖說明】：
[0087] 圖1北五味子肝損傷保護活性提取物的TLC色譜圖；
[0088] 圖2北五味子得到的化學組分的TLC色譜圖。
【具體實施方式】
[0089] 以下實施例表示本發明的實用性，本發明不受此限制。
[0090] 實施例1 :
[0091] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm內徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙 酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮， 100:8，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:8， 體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，真空干燥，即為該活性提取物。收率0.9%。
[0092] 實施例2 :
[0093] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL乙醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm內徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙 酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮， 100:8，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:8， 體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。收率0.73%。
[0094] 實施例3 :
[0095] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL丙酮超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm內徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙 酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮， 100:8，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:8， 體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，鼓風干燥，即為該活性提取物。收率0.68%。
[0096] 實施例4 :
[0097] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL氯仿超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm內徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙 酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮， 100:8，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:8， 體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，離心干燥，即為該活性提取物。收率0.69%。
[0098] 實施例5 :
[0099] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL乙酸乙酯超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅 膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙 酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮， 100:8，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:8， 體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，旋蒸干燥，即為該活性提取物。收率0.63%。
[0100] 實施例6 :
[0101] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL甲醇水混合溶劑（甲醇：水=1:1)超聲提取 15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內徑小柱），先用石油醚-丙 酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混 合溶劑（石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑 (石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取 物。收率0.83%。
[0102] 實施例7 :
[0103] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=1:1)超聲提取 15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內徑小柱），先用石油醚-丙 酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混 合溶劑（石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑 (石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，真空干燥，即為該活性提取 物。收率0.76%。
[0104] 實施例8 :
[0105] 取維吾爾藥北五味子20g，經IOOmL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=90:10)超聲提取 15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內徑小柱），先用石油醚-丙 酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混 合溶劑（石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑 (石油醚-丙酮，100:8,體積比）洗脫的洗脫液經回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取 物。收率0.87%。
[0106] 實施例9 :固體分散體
[0107] 稱取北五味子提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的質量比 分別放入燒杯中，加入適量的無水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至北五味子提取物和載體 完全溶解，充分混合均勻后轉入旋蒸儀中除去有機溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得北五味 子有效提取物PVP包合物。
[0108] 實施例10 :環糊精包合物
[0109] 將β -環糊精與1~5倍水研勻，加北五味子有效提取物（水難溶性的應先溶于 少量有機溶劑中）繼續充分研磨至成糊狀物，低溫干燥即得環糊精包合物。
[0110] 實施例11 :分散片
[0111] 1.北五味子有效提取物分散體的制備，精密稱取北五味子提取物、Vc，加入處方 量的十二烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻 后，在70°C的溫度下蒸干，粉碎，過100目篩；
[0112] 2.將第一步中的北五味子有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯聚維酮，預膠化 淀粉，用適量的濃度為70 %乙醇做濕潤劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放 置15min后，60°C烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻 后，壓片即得。
【主權項】
1. 一種維吾爾藥北五味子提取物，其特征為，維吾爾藥北五味子經溶劑超聲提取，提取 液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用體積比100:0-100:1的石油醚-丙酮混合 溶劑洗脫，繼用體積比100:2-100:8的石油醚-丙酮混合溶劑洗脫，體積比為100:2-100:8 的石油醚-丙酮混合溶劑干燥即得。2. 如權利要求1所述的維吾爾藥北五味子提取物，其特征為，先用體積比100:1的石 油醚-丙酮混合溶劑洗脫，繼用體積比100:8的石油醚-丙酮混合溶劑洗脫，石油醚：丙酮 100:8洗脫液經回收有機溶劑，干燥即為該提取物。3. 如權利要求1或2所述的維吾爾藥北五味子提取物，其特征為，提取用溶劑為甲醇、 乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑或乙醇水混合溶劑，優選甲醇或95%乙醇，提 取用有機溶劑用量為藥材重量的2-50倍(重量/體積比)。4. 如權利要求1-3任何一項所述維吾爾藥北五味子提取物，其特征為，先用體積比 100:1的石油醚：丙酮混合溶劑洗脫2-50倍柱體積，繼用體積比100:8的石油醚：丙酮混合 溶劑洗脫2-50倍柱體積，最優條件為先用體積比100:1的石油醚：丙酮混合溶劑洗脫10倍 柱體積，繼用體積比100:8的石油醚：丙酮混合溶劑洗脫20倍柱體積。5. -種藥物組合物，其特征在于，包含權利要求1-4任何一項所述的北五味子提取物 和藥學上可接受的載體。6. -種藥物制劑，其特征在于，包含權利要求1-4任何一項所述的北五味子提取物或 權利要求5所述的藥物組合物。7. 如權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于，所述的制劑為固體分散體、環糊精包合 物、分散片。8. 權利要求1-4任何一項所述的北五味子提取物或權利要求5所述的組合物或權利要 求6所述的藥物制劑在制備肝損傷保護藥物中的應用。9. 如權利要求8所述的應用，其特征為，所述的肝損傷為脂肪肝，酒精肝，肝細胞壞死 或肝硬化。10. 如權利要求1-4任何一項所述的北五味子提取物，其特征在于，用TLC法檢測，其色 譜條件為：GF254硅膠板，展開系統：氯仿：乙酸乙酯：甲醇=3:1:1，顯色方法：香草醛濃硫酸 顯色。
【文檔編號】A61K36/79GK105982996SQ201510079853
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月15日
【發明人】王金輝, 黃健, 李理
【申請人】沈陽藥科大學