西藏扁芒菊揮發油及其在制藥中的用圖
【專利摘要】本發明屬藏藥制藥領域，涉及西藏扁芒菊揮發油及其在制藥中的用途，本發明從西藏扁芒菊植物中提取得到的揮發油，其中主要成分為甜沒藥烯萜醇；纈草酮；斯巴醇；石竹烯和綠花白千層醇等，經藥理篩選CPE法和MTT法進行不同濃度梯度活性檢測，結果證實所述的西藏扁芒菊植物揮發油有良好的抗炎和抗流感病毒活性。本發明的西藏扁芒菊植物提取的揮發油可用于制備抗炎、抗流感病毒或防治季節性流感的藥物。尤其是用于制備防治人禽流感的藥物；以及用于制備防治甲型H1N1型流感藥物和防治季節性流感藥物；本發明的所述的西藏扁芒菊揮發油還可用于制備解熱藥物。
【專利說明】
西藏扁芒菊揮發油及其在制藥中的用途
技術領域
[0001] 本發明屬藏藥制藥領域，涉及西藏扁芒菊揮發油及其在制藥中的用途，具體涉及 來源于西藏扁芒菊植物揮發油在制備抗炎、抗病毒藥藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 流感病毒（Influenza viruses)屬正粘病毒科，是RNA病毒。據研究報道，流感病 毒核蛋白NP和基質蛋白Ml抗原性的不同，流感病毒可分為甲（A)、乙（B)和丙（C)三型， 該三種型的流感病毒均能感染人。其中，A型流感病毒根據其表面血凝素蛋白（HA)和神經 氨酸酶（NA)的結構以及其基因特性的不同又可分成若干亞型，至今發現的HA有16個亞型 H1-H16, NA有9個亞型N1-N9。研究顯示，流感病毒具有很強的宿主特異性，人流感病毒識 別SAa 2,6Gal特異性受體，主要存在于人的呼吸道中，因此流感病毒會引起急性呼吸道傳 染病，以及引起心肌炎、肺炎、支氣管炎等多種并發癥。據報道，季節性流感病毒株不斷地在 亞洲演化，形成重疊性的流行蔓延；根據世界衛生組織的統計數據，全球每年有大約300萬 至500萬人因感染流感病毒而嚴重發病（P. Palese, M.L. Shaw, PA (2007)，pp :1647 - 1689 ; T.Ito et al. , Arch. Virol. , 140(1995), pp. 1163 - 1172) 〇
[0003] 流感病毒是至今未被有效控制的傳染性疾病。目前，臨床實踐中應對流感病毒 的主要干預方式是采用疫苗和藥物治療。其中，抗流感病毒藥物根據作用機制分為兩類， 第一類是上市較早的離子通道阻斷劑，以金剛烷胺和金剛乙胺為代表；第二類是神經氨酸 酶（NA)抑制劑；目前由美國FDA批準的抗流感病毒藥物有磷酸奧司他韋（oseltamivir phosphate)，扎那米韋（zanamivir)和帕拉米韋（peramivir)三個抗流感病毒藥物 (Centers for Disease Control and Prevention http://www. cdc. gov ;張強，趙慶杰， 等.藥學，2010, 45 (3) : 289-299)。研究顯示，迄今，國內外采用的抗流感病毒藥物均存在有 一定的副作用，并且對最新流行的病毒株均存在有一定的耐藥性，因此，開發新型抗流感病 毒藥物是迫在眉睫。
[0004] 近年來植物揮發油除了用于芳香療法，按摩療法，個人護理等以外，在治療抑 郁癥、炎癥、癌癥等疾病發現有很多有利的科學證據，例如，紫蘇屬植物揮發油主要成 分中，發現1-紫蘇醛（Ι-Perillaldehyde)可用于治療抑郁癥；香檸檬、藍桉樹揮發油 在流行性感冒上顯現有潛在的效果；伊朗布留序（Bunium persicum)揮發油主要含有 gamma-砲品稀，茴香甲醛和對傘花經等，顯示具有抗炎作用（Ito，et al. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011, Jun 22, pp:1-5 ；Selvarani, James, American Journal of Essential Oils and Natural Products, 2014 ；2(1):47-53 ； Hajhashemi, et al., 2011, Pharm. Biol. 49, 146 - 151 ；ffu et al. , BMC Complement. Altern. Med.，10(2010)，p:69)。
[0005] 青藏高原其極端環境撫育著豐富多樣的植物藥用資源，同時其極端環境導致高原 疾病多樣化。多源細菌和病毒引起的肺部感染是青藏高原人們常見的疾病，然而目前市場 上抗病毒藥物對高原特殊流行性感冒未見有很好的治愈效果，如，尤其在2011年至2014 年期間在孩童、老人及青年各個年齡階段的藏族人出現了因流行性感冒引起呼吸道感染疾 病，由于西藥干預未見有治愈效果，導致患者最終選擇長期服用藏藥進行治療。
[0006] 西藏扁芒菊（Waldheimia glabra(Decne. ) Rgl.)，藏名為"剛布"，是菊科扁芒菊 屬植物，分布于印度北部、巴基斯擔、阿富汗、蘇聯中亞地區，生長于我國青藏高原喜馬拉雅 山脈及閃底斯山脈海拔4900~5500米的高山碎石坡石縫中，常以民間熏香或泡水喝等方 式用于預防和治療感冒；亦見有部分醫學書籍記載西藏扁芒菊植物全草在民間用于外感表 證、發熱頭痛、項背強痛等。《中國植物志報道》藏族群眾有采用西藏扁芒菊植物全草干預感 冒等病癥。
[0007] 鑒于目前國內外關于西藏扁芒菊在抗病毒和抗炎的研究工作屬于空白的現狀，雖 然有研究報道了涉及采集尼珀爾昆布地區的扁芒菊（Waldheimia)植物次生代謝產物及其 抗自由基酸類化合物隨海拔濃度變化的研究工作（Annamaria Giorgi),其中采用頂空固相 萃取法對揮發性有機物化學成分分析，但是，該研究采集植物分布與本發明來源植物分布 不同，尤其生態環境有截然不同；該研究得到的主要化學成分與本發明擬提供的植物中提 取的揮發油成分不同；以及該研究尚未報道揮發油的藥理活性等等，本申請的發明人擬提 供西藏扁芒菊揮發油及其在制藥中的新用途，尤其是西藏扁芒菊植物揮發油的抗炎、抗流 感病毒活性的藥物用途。
【發明內容】
[0008] 本發明目的是為克服現有技術的缺陷，提供新的抗病毒藥物，涉及西藏扁芒菊揮 發油及其在制藥中的用途，尤其涉及來源于西藏扁芒菊（W. glabra)植物提取的揮發油及 該揮發油在制備抗炎和抗流感病毒藥物中的用途。
[0009] 本發明從西藏扁芒菊（W. glabra)植物中提取得到的揮發油，經藥理篩選CPE法和 MTT法進行不同濃度梯度活性檢測，結果證實西藏扁芒菊植物揮發油有良好的抗炎和抗流 感病毒活性。
[0010] 本發明所述的西藏扁芒菊即指扁芒菊屬（Waldheimia)西藏扁芒菊種（W. glabra) 的全草。本發明的植物揮發油來源于西藏扁芒菊（W. glabra)植物揮發油。
[0011] 本發明的西藏扁芒菊揮發油通過下述方法制備：
[0012] 采用西藏扁芒菊植物干草粉碎，過篩后，用蒸餾水浸泡4h，然后用水蒸氣蒸餾法提 取，得到1. 5 %的淡黃色精油。
[0013] 本發明對西藏扁芒菊揮發油進行了化學成分分析：
[0014] 西藏扁芒菊植物提取的揮發油用氣相色譜-質譜檢測（GC-MS)、分析，經搜索 NIST譜庫以及標準樣品比對結合人工解析質譜圖，首次鑒定了 67個化合物，其中主要 成分為甜沒藥稀碗醇（a -Bisabolol，CAS#515_69_5) 20. 22 % ;繳草酬（Jatamansone CAS#1803-39-0) 11.79 %;斯巴醇（（-)-Spadhuleno#l 139-30-6)8.2 %;石竹烯 (Caryophyllene) 6. 06% ;綠花白千層醇（Viridiflorol) 5. 18%等。
[0015] 本發明進行了西藏扁芒菊揮發油抗流感病毒活性實驗：
[0016] CPE法（細胞病變）檢測西藏扁芒菊提取的揮發油對流感病毒A型的甲型流感病 毒A3 (H3N2) (A3/京科/30/95)(購買于上海疾控中心）的抑制作用，用MTT法檢測西藏扁 芒菊提取的揮發油對MDCK細胞毒性，以利巴韋林作為陽性對照進行實驗；結果顯示所述的 揮發油濃度在100 μ g/ml時，CPE抑制率達到37. 5%，且無明顯毒性，表明西藏扁芒菊揮發 油在中等劑量下有良好的抗流感病毒活性。
[0017] 本發明進行了西藏扁芒菊揮發油的抗炎藥理實驗：
[0018] 以LPS和PolyI = C為刺激劑，激活巨噬細胞系RAW264. 7的TLR4、TLR3受體，引發 下游的炎癥反應，通過檢測細胞上清中NO評估揮發油在抗LPS和Poly IC誘導的炎癥的能 力強弱，同時用MTT法測定樣品的細胞毒性。結果，西藏扁芒菊揮發油在20ug/ml時能顯著 抑制LPS誘導的炎癥，且無明顯毒性。
[0019] 本發明的西藏扁芒菊植物提取的揮發油進一步可用于制備抗炎、抗流感病毒或防 治季節性流感的藥物。尤其是所述的西藏扁芒菊植物提取的揮發油可用于制備防治人禽流 感的藥物；以及用于制備防治甲型HlNl型流感藥物和防治季節性流感藥物；本發明的所述 的西藏扁芒菊揮發油也可用于制備解熱藥物。
【附圖說明】
[0020] 圖1是西藏扁芒菊（W. glabra)抗炎活性NO值，其中，Sample DJ(濃度分別為 4, 20, 100ug/ml)。
[0021] 圖2是西藏扁芒菊（W. glabra)細胞毒性MTT值，其中，Sample DJ(濃度分別為 4, 20, 100ug/ml)。
[0022] 圖3西藏扁芒菊（W. glabra)標準總離子譜圖。
[0023] 圖4 (：8至C 33標準離子譜圖。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1提取制備西藏扁芒菊揮發油
[0025] 取西藏扁芒菊（W. glabra)干燥全草，用中藥粉碎機粉碎，并過（40目）篩，稱取 l〇〇g，用蒸餾水浸泡過夜。按照《中華人名共和國國家藥典2010版附錄XD》揮發油測定方 法提取4h，得1. 5 %的淡黃色精油；
[0026] 按照《中華人名共和國國家藥典2010版附錄XD》揮發油測定方法進行化學成分分 析；采用氣相色譜-質譜檢測（GC-MS)分析，色譜-質譜分析條件為如下：
[0027] 檢測儀器：美國Thermo DSQ氣相色譜-質譜聯用儀；
[0028] 色譜條件：Hp_5MS 毛細管柱（5 % phenyl methyl siloxane， 30mX0. 25_Χ0. 25μπι)毛細管柱；進樣口溫度：250°C ;柱溫：起始溫度60°C，保持2min; 以15°C /min升至300°C，保持8min ;載氣（He);流速：lmL/min ;分流比：200:1 ;進樣量： l.OyL；
[0029] 質譜條件：電離方式EI，電離能量70eV，離子源溫度250°C，傳輸線溫度：250°C;掃 描范圍（41-40(^11111) ;標準譜庫：見31'庫；
[0030] 經氣相色譜-質譜分離檢測得到的化合物質譜圖在NIST庫搜庫，同時結合標 準樣品的譜圖比較，結合人工解析質譜圖鑒定了 67個化合物，其中主要成分為下式的 (I )甜沒藥稀砲醇（a_Bisabolol，CAS#515-69_5)20. 22% ;( II )繳草酮（Jatamansone CAS#1803-39-0) 11. 79 % ;斯巴醇（（-)-Spadhuleno#1139-30-6)8. 2 % ; ( III )石竹烯 (Caryophyllene) 6. 06% ; (IV)綠花白千層醇（Viridiflorol) 5. 18%等。
[0031]
[0033] 實施例2西藏扁芒菊揮發油抗流感病毒活性篩選實驗
[0034] 用MTT法檢測制得的西藏扁芒菊揮發油對MDCK細胞毒性，CPE法（細胞病變）檢 測所述西藏扁芒菊揮發油對流感病毒A型的甲型流感病毒A3 (H3N2) (A3/京科/30/95)(購 買于上海疾控中心），抑制作用，以利巴韋林作為陽性對照實驗：
[0035] 首先，進行藥物的細胞毒性檢測，MDCK細胞在細胞培養板中培養形成單層后，加入 不同濃度的藥液繼續培養，以細胞病變或MTT染色法為觀察指標，用Reed-Muench法計算藥 物對細胞無毒的最大濃度（TD。）和半數中毒濃度（TD 5。）；
[0036] 其次，進行藥物抗流感病毒作用檢測，MDCK細胞培養形成單層后，用IOOTCId5。（含 胰蛋白酶）的流感病毒感染細胞，吸附2小時后，傾出病毒，再加入無毒濃度下的系列濃度 的含藥培養液，繼續培養；試驗設病毒對照、細胞對照及陽性藥物對照，以病毒對照孔出現 病變達75 %以上（即4+時），可終止試驗；根據細胞病變程度CPE，用Reed-Muench法計算 半數有效濃度（IC5。）；結果顯示所述揮發油在濃度100 μ g/ml時，CPE抑制率達到37. 5%， 且無明顯毒性，表明西藏扁芒菊植物揮發有良好的抗流感病毒活性。
[0037] 表1是西藏扁芒菊細胞毒性檢測和抗流感病毒A3 (H3N2)活性測試檢測結果
[0038]
[0039] 實施例3西藏扁芒菊揮發油抗炎活性篩選實驗
[0040] 以LPS和PolyI: C為刺激劑，激活巨噬細胞系RAW264. 7的TLR4、TLR3受體，引發 下游的炎癥反應，通過檢測細胞上清中NO評估揮發油在抗LPS和Poly IC誘導的炎癥方面 的能力強弱：
[0041] 將RAW264. 7細胞消化后計數，按照4*105/ml種板，配制lmg/ml刺激劑、lmg/ml LPS貯存液、IOOuM DEX貯存液和0. 5mg/ml揮發油貯存濃度（配制濃度：8、40、200ug/ml終 濃度：4、20、100耶/1111);配制貯存液濃度 ：0.51^/1111，0130:1:800，加板后置于細胞培養箱 培養，之后取出收集上清（180ul/孔），用于測定相關炎癥介質因子分泌，加 DMEM-IO% FBS 180 μ L，5mg/ml MTT 20 μ 1 (終濃度0. 45mg/ml)，繼續培養4h，4h后，小心棄去上清，每孔 加 DMSO 200 μ 1，在振蕩器上震蕩10分鐘，于570nm比色（吸光度越大，表明活細胞數量越 多），記錄OD值，以亞硝酸鈉溶液為標準溶液建立NO標準曲線（測量范圍0-200umol/L)， 確定各組細胞上清中的NO水平；
[0042] 結果顯示，西藏扁芒菊揮發油20ug/ml時能顯著抑制LPS誘導的炎癥，在IOOug/ ml，抑制炎癥效果明顯，但是在100ug/ml時抑制細胞增長能力增強（如圖1、2所示），結果 表明，中等計量的西藏扁芒菊揮發油具有良好的抗炎作用。
【主權項】
1. 西藏扁芒菊揮發油，其特征在于，通過下述方法制備： 取西藏扁芒菊干燥全草，用中藥粉碎機粉碎，過40目篩，用蒸饋水浸泡過夜，提取制得 淡黃色精油； 其中主要成分為下式所示的（I )甜沒藥締祗醇；（II )鄉草酬；斯己醇（(-); (III) 石竹締；（IV)綠花白千層醇；2. 按權利要求1所述的西藏扁芒菊揮發油，其特征在于，所述的西藏扁芒菊揮發油采 用氣相色譜-質譜檢測（GC-M巧分析其化學成分，色譜-質譜分析條件為如下： 檢測儀器：美國化ermo DSQ氣相色譜-質譜聯用儀； 色譜條件 Wp-SMS 毛細管柱巧％ 地6115^1 meth}d siloxane，30mX0. 25mmX0. 25]im) 毛細管柱；進樣口溫度：250°C ;柱溫：起始溫度60°C，保持2min ; W 15°C /min升至300°C， 保持8min ;載氣化e);流速：1血/min ;分流比：200:1 ;進樣量：1. 0 y L ; 質譜條件：電離方式EI，電離能量70eV，離子源溫度250°C，傳輸線溫度：250°C;掃描范 圍（41-400amu);標準譜庫：NIST庫。3. 權利要求1所述的西藏扁芒菊揮發油在制備抗炎和抗流感病毒藥物中的用途。4. 按權利要求3的用途，其中所述的抗流感病毒藥物是防治人禽流感的藥物。5. 按權利要求3的用途，其中所述的所述的抗流感病毒藥物是防治甲型HlNl型流感藥 物。6. 按權利要求1的用途，其中所述的抗流感病毒藥物是是防治季節性流感藥物。7. 權利要求1所述的西藏扁芒菊揮發油在制備解熱藥物中的用途。
【文檔編號】A61P29/00GK105982936SQ201510287695
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年5月29日
【發明人】德吉, 盧燕, 陳道峰
【申請人】西藏大學