一種含青蒿素和紫杉醇的聯合用藥物及其用圖
【專利摘要】本發明涉及一種聯合用藥物，含有第一活性成分青蒿素或其衍生物，和第二活性成分紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，以及任選的藥學可接受的輔料。青蒿素或其衍生物與紫杉醇聯合應用可以用于治療和/或預防黑色素瘤，二者具有很好的協同作用，同時大大降低了紫杉醇的用量。
【專利說明】
一種含青蒿素和紫杉醇的聯合用藥物及其用途
技術領域
[0001] 本發明涉及一種含青蒿素和紫杉醇的聯合用藥物，該聯合用藥物可以用于治療和 /或預防黑色素瘤。
【背景技術】
[0002] 黑色素瘤是臨床上較為常見的皮膚黏膜和色素膜惡性腫瘤，是一種十分危險的致 命皮膚癌，其發病率雖較基底細胞癌、鱗狀細胞癌低，但惡性度大，轉移發生早，死亡率高。
[0003] 根據美國國立綜合癌癥網絡（NCCN)指南，一線治療推薦達卡巴嗪（Dacarbazine， DTIC)單藥、替莫唑胺（Temozolomide，TMZ)或TMZ/DTIC單藥為主的聯合治療（如聯合順 鉑或福莫斯汀）；2008年新增二線治療一般推薦紫杉醇聯合卡鉑方案。長期以來，達卡巴嗪 是晚期黑色素瘤內科治療的"金標準"，單藥治療有效率為7. 5%~12. 2%，目前其他化療 藥物在總生存上均未超越達卡巴嗪。現階段，化療對于中國黑色素瘤患者來說還是一項重 要的治療手段。因此，研發出有效、毒副作用較低的抗黑色素瘤藥物意義重大，也很迫切。
[0004] 青蒿素是我國中國醫藥學工作者1971年從菊科植物黃花蒿（Atemisia annua L.) 葉中提取分離得到的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯類化合物，其結構與傳統抗瘧藥完 全不同，能迅速殺滅紅細胞內期瘧原蟲，為WHO認定的全球控制瘧疾流行的有效藥物，也是 我國具有安全知識產權的藥物。經過化學改造可生成多種衍生物，如青蒿琥酯、雙氫青蒿 素、蒿甲醚等均是治療瘧疾的高效低毒的單體。
[0005] 隨著研究的深入，青蒿素及其衍生物在抗腫瘤、免疫調節、抗血吸蟲等方面均有一 定的療效。尤其在抗腫瘤方面，青蒿素及其衍生物主要通過誘導細胞凋亡、抑制自由基的產 生、抑制血管生成等作用發揮抗腫瘤作用。而且青蒿素類藥物作用并不是單一靶點，能有效 克服多藥耐藥，與傳統化療藥無交叉耐藥，又安全、低毒。
[0006] 紫杉醇（Taxol)是從紫杉（紅豆杉）的樹皮、樹干或針葉中提取或半合成的二萜 類化合物，通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩定，抑制細胞有絲分裂，臨床 上常作為治療乳腺癌、卵巢癌和肺癌的一線藥物使用，另外也用于聯合用藥治療膀胱癌、食 管癌、腎癌等。但是，化療時紫杉醇導致的過敏反應、骨髓抑制、胃腸道反應、心臟毒性等發 生率較高。
[0007] 本發明人意外地發現紫杉醇與青蒿素及其衍生物有良好的協同抗黑色素瘤作用， 而且聯合用藥能大大減少紫杉醇的用量，降低其毒性。
【發明內容】
[0008] 本發明的第一方面提供一種聯合用藥物，含有第一活性成分青蒿素或其衍生物， 和第二活性成分紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，以及任選的藥學可接受的輔料。
[0009] 本發明的第二方面提供本發明第一方面所述的聯合用藥物在制備用于治療和/ 或預防黑色素瘤的藥物中的用途。
[0010] 本發明的第三方面提供一種治療和/或預防黑色素瘤的方法，該方法是將第一活 性成分青蒿素或其衍生物和第二活性成分紫杉醇聯合施用到需要治療的個體中，或者是將 本發明第一方面所述的聯合用藥物施用到需要治療的個體中。其中第一活性成分和第二活 性成分同時、分別或者依次施用到需要治療的個體中。
[0011] 本發明中，所述的青蒿素或其衍生物選自青蒿素、青蒿琥酯、雙氫青蒿素、蒿甲醚 或其可藥用的鹽、水合物，優選為青蒿琥酯、雙氫青蒿素。
[0012] 本發明中，雙氫青蒿素的結構式如式1所示，青蒿琥酯的結構式如式2所示，紫杉 醇的結構式如式3所示。
[0014] 本發明所述的聯合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為1:1~ 4:1，優選為1:1~7:3,更優選為3:2~7:3,進一步優選7:3。
[0015] 在一個具體實施方案中，本發明所述的聯合用藥物，其中第一活性成分為雙氫青 蒿素或其可藥用鹽、水合物，第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分 與第二活性成分的摩爾比為3:2~7:3,進一步優選7:3。
[0016] 在另一個具體實施方案中，本發明所述的聯合用藥物，其中第一活性成分為青蒿 琥酯或其可藥用鹽、水合物，第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分 與第二活性成分的摩爾比為1:1~7:3,優選為3:2~7:3,進一步優選7:3。
[0017] 本發明所述的聯合用藥物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一種制劑單元 中，或者第一活性成分和第二活性成分分別在不同的規格制劑單元中。
[0018] 在應用本發明所述的聯合用藥物時，其中第一活性成分和第二活性成分可以同 時、分別或者依次給藥。
[0019] 發明的有益效果
[0020] 本發明分別進行了青蒿素或其衍生物與紫杉醇聯合抑制B16(小鼠黑色素瘤細 胞）增殖的試驗。結果顯示，本發明青蒿素或其衍生物與紫杉醇聯合應用對黑色素瘤細胞 的抑制作用有很好的協同效應，大大減少了紫杉醇的用量，并且提高了療效，在達到相同的 治療效果的情況下，有效降低了紫杉醇的毒副作用。
【附圖說明】
[0021] 圖1為雙氫青蒿素與紫杉醇聯合應用對B16黑色素瘤細胞作用的Fa-CI值曲線 圖。
[0022] 圖2為青蒿琥酯與紫杉醇聯合應用對B16黑色素瘤細胞作用的Fa-CI值曲線圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規產品。
[0024] 試劑和方法
[0025] 細胞株：B16黑色素瘤細胞，購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC)，細胞編號：CX0036。
[0026] 藥品：雙氫青蒿素（DHA，重慶華立武陵山制藥有限公司，純度99. 1% )，注射用青 蒿琥酯（ATS，桂林南藥，批號ZA111202)，紫杉醇（Taxol，上海龍翔生物醫藥開發有限公司， 批號 120703)。
[0027] 藥物配制：① 100 μ M青蒿琥酯（ATS)藥液的配制：用ImLO. 5 %碳酸氫鈉溶液溶 解60mg青蒿琥酯，藥物濃度為60000 μ g/mL。取10 μ L60000 μ g/mL的ATS至含有5990 μ L RPMI-1640培養基（Gibco,貨號：11875-093,下同）的IOmL刻度離心管中，濃度即為 100 μ g/mL ;取 3. 84mL 至 6. 16mL RPMI-1640 培養基中，即可配成 100 μ M (38. 4 μ g/mL)的 ATS母液，其中碳酸氫鈉濃度為0. 003%。
[0028] ②100 μ M雙氫青蒿素（DHA)藥液的配制：用十萬分之一天平稱取DHAO. OlOOgJ 200 μ L二甲基亞砜（DMSO)進行溶解，藥物濃度為50000 μ g/mL。取10 μ L50000 μ g/mL的 0擬至含有499(^1^?]\〇-1640培養基的1〇1^刻度離心管中，8卩為10(^8/111匕取2.841^ 至7. 16mL RPMI-1640培養基中，即可配成100 μ M(28. 4 μ g/mL)的DHA母液，其中DMSO濃 度為0.06%。
[0029] ③100 μΜ紫杉醇（Taxol)藥液的配制：用十萬分之一天平稱取TaxolO. OlOOg， 用200 μ LDMSO進行溶解，藥物濃度為50000 μ g/mL。取20 μ L50000 μ g/mL的Taxol至含 有9980 μ L RPMI-1640培養基的IOmL刻度離心管中，即為100 μ g/mL，取8. 54mL至I. 46mL RPMI-1640培養基中，即可配成100 μ M(85. 4 μ g/mL)的Taxol母液，其中DMSO濃度為 0· 17%〇
[0030] 將各自配成的100 μ M母液于-20°C保存，使用時用新鮮的RPMI-1640培養基稀釋 到相應濃度。
[0031] 實驗方法：
[0032] 取對數生長期的B16黑色素瘤細胞接種到96孔板中，細胞接種密度約為 1.0 X 105/mL，每孔90 μ L，置于37°C、5% CO2培養箱中連續培養24小時。然后取出培養板， 將各藥液稀釋到工作濃度后加入各孔，每孔加10 μ L藥液。藥物終濃度具體見表1和表2， 各濃度設3個復孔，并設置對照組（含有細胞的培養液）和空白組（空白培養液），置于 37°C、5% (：02培養箱繼續培養48小時。
[0033] 藥物處理 48 小時后，每孔加入 Cell Counting Kits-8(CCK-8, D0JIND0,批號： EQ829)試劑10 yL，置于37°C、5% CO2培養箱孵育4小時，在酶標儀檢測波長為450nm，參 考波長為630nm的條件下檢測吸光度OD值。計算腫瘤細胞生長抑制率（％)時，計算公式 如下：
[0034] 抑制率（％) =(對照組平均OD值-給藥組平均OD值）/對照組平均OD 值 X 100% ο
[0035] 聯合用藥分析方法：根據Chou T. C.和Talalay Ρ.提出的合并指數定理（The Combination Index Theorem)和質量作用中效定理（The Median-Effect Equation As the Unified Theory)進行分析（參考文獻為：Am J Cancer Res 2011 ;1 (7) :925-954)〇
[0036] 藥物質量作用中效定理公式為：Dx= Dm[fa/(l_fa)]1/m，
[0037] 藥物合并指數定理公式為：Cl = (D)Z(Dx)J(D)^(Dx)2，其中：
[0038] Cl (Combo index)是藥物聯合用藥指數，（Dx)1是第一個藥物（D)淨獨作用時抑制 率為X%的劑量，（D x)2是第二個藥物（D) 2單獨作用時抑制率為X%的劑量，而（D) JP (D) 2 分別是在兩藥聯合使用時抑制率也為X%時第一個藥物和第二個藥物的劑量。Dni是藥物的 中效劑量濃度（IC 5。)，m表示質量作用中效定理曲線的斜率，fa是抑制率。
[0039] 當Cl = 1時，表示相加作用；當Cl > 1時，表示詰抗作用；當Cl < 1時，表示協同 作用。
[0040] 使用CompuSyn 1.0電腦軟件輸入各單藥及其聯合用藥在各劑量濃度的抑制率 (即fa值），則可以自動演算m、r及Dj直，并模擬出fa-CI圖形（Chou-Talalay Plot)，自 動掃描測定藥物的拮抗、相加或協同作用。其中r表示質量作用中效定理曲線的線性相關 系數，r值不小于0. 95表示模擬的參數線性良好。實驗重復3次，每次數據單獨處理，根據 3次試驗的均值土標準差統計Dm、m和r的值。
[0041 ]表 1
[0045] 實施例1雙氫青蒿素（DHA)與紫杉醇（Taxol)聯合應用對B16黑色素瘤細胞的抑 制性試驗（η = 3)，實驗結果見表3。
[0046] 表 3
[0048] 根據以上實驗結果，使用Compusyn L 0軟件對數據進行運算可得參數Dm、m以及 質量作用中效定理曲線的線性相關系數r (η = 3)，結果見表4,并模擬DHA與Taxol藥物聯 合對Β16黑色素瘤細胞作用的Fa-CI值曲線圖，如附圖1所示。
[0049] 表 4
[0052] 在考察DHA與Taxol不同配比的組合物對B16黑色素瘤細胞的抑制作用的試驗 中，質量作用中效定理曲線的線性相關系數r的均值均大于0.95,表示參數擬合良好。單 獨用藥時，DHA和Taxol的D ni均值（半數抑制濃度）分別為11. 672 μΜ和I. 001yM;DHA 和Taxol組合物在摩爾比為3:2和7:3時，Dni均值（半數抑制濃度）分別為0. 865 μ M和 0. 472 μ Μ，比DHA或者Taxol單獨用藥時的Dni均值要低，當DHA和Taxol的摩爾比為7:3時 Dm均值降低的更為明顯。
[0053] 由附圖1所示的Fa-CI曲線圖可以發現，DHA和Taxol的摩爾比為3:2和7:3時， CI值均小于1，表明二者聯合應用時具有較好的協同作用，其中DHA和Taxol的摩爾比為 7:3時，二者的協同作用最為明顯。
[0054] 實施例2青蒿琥酯（ATS)與紫杉醇（Taxol)聯合應用對Β16黑色素瘤細胞的抑制 性試驗（η = 3)，實驗結果見表5。
[0055] 表 5
[0058] 根據以上實驗結果，使用Compusyn I. 0軟件對數據進行運算可得參數Dm、m以及 質量作用中效定理曲線的線性相關系數r (η = 3)，結果見表6,并模擬ATS與Taxol藥物聯 合對Β16黑色素瘤細胞作用的Fa-CI值曲線圖，如附圖2所示。
[0059] 表 7
[0061] 在考察ATS與Taxol不同配比的組合物對Β16黑色素瘤細胞的抑制作用的試驗 中，質量作用中效定理曲線的線性相關系數r的均值均大于0.95,表示參數擬合良好。單 獨用藥時，ATS和Taxol的D ni均值（半數抑制濃度）分別為2. 573 μ M和0· 772 μ M ;ATS與 Taxol的摩爾比為1:1、3:2和7:3時，D"(半數抑制濃度）均值分別為0.711 μM、0.497 μM 和0. 359 μ Μ，比ATS或者Taxol單獨用藥時的Dni均值都要低，而且ATS與Taxol的摩爾比 為7:3時Dm均值降低的更為明顯。
[0062] 由附圖2所示的Fa-CI曲線圖可以發現，ATS與Taxol的摩爾比為1:1、3:2和7:3 時，CI值均小于1，表明二者聯合應用時具有較好的協同作用，其中ATS和Taxol的摩爾比 為7:3時，二者的協同作用最為明顯。
【主權項】
1. 一種聯合用藥物，含有第一活性成分青蒿素或其衍生物，和第二活性成分紫杉醇或 其可藥用鹽、水合物，以及任選的藥學可接受的輔料。2. 權利要求1的聯合用藥物，其中所述的青蒿素或其衍生物選自青蒿素、青蒿琥酯、雙 氫青蒿素、蒿甲醚或其可藥用鹽、水合物。3. 權利要求1的聯合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為1:1~ 4:1〇4. 權利要求1的聯合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分摩爾比為1:1~7:3。5. 權利要求1的聯合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分摩爾比為3:2~7: 3。6. 權利要求1的聯合用藥物，其中第一活性成分為雙氫青蒿素或其可藥用鹽、水合物， 第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為 3:2 ~7:3〇7. 權利要求1的聯合用藥物，其中第一活性成分為青蒿琥酯或其可藥用鹽、水合物， 第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為 1:1 ~7:3〇8. 權利要求1-7任一項的聯合用藥物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一種制 劑單元中，或者第一活性成分和第二活性成分分別在不同的規格制劑單元中。9. 權利要求1-8任一項所述的聯合用藥物在制備用于治療和/或預防黑色素瘤的藥物 中的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK105982888SQ201510098908
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月3日
【發明人】宋健平, 徐勤, 李國銘, 鄧長生, 王振華, 周玖瑤, 關業枝, 王琪, 張紅英, 鄭紹琴, 高巖, 胡艷山, 黃博
【申請人】廣州中醫藥大學科技產業園有限公司