用于診斷和治療腫瘤的病毒樣顆粒綴合物的制作方法

用于診斷和治療腫瘤的病毒樣顆粒綴合物的制作方法
【專利摘要】本公開內容涉及使用與光敏分子綴合的病毒樣顆粒來診斷和/或治療腫瘤(例如眼腫瘤)的方法和組合物。
【專利說明】
用于診斷和治療腫瘤的病毒樣顆粒綴合物
[0001] 相關申請
[0002] 本申請依據351^.(：.§119(6)要求于2013年9月18日提交的美國臨時申請號61/ 879,627的權益，其通過引用整體并入本文。
技術領域
[0003] 本公開內容涉及腫瘤診斷和治療的領域。
【背景技術】
[0004] 盡管有許多治療可用于癌癥，但是很多形式的癌癥仍無法治愈、不可治療或者變 得對標準治療具有抗性并且用于很多癌癥的有效治療具有不期望的副作用。眼癌(ocular cancer)(例如眼黑素瘤和成視網膜細胞瘤）的治療特別具有挑戰性。診斷為患有眼黑素瘤 的患者根據腫瘤大小具有很少治療選擇，包括：（1)外科手術，例如切除術(resection)、摘 出術(enucleation)或摘除術(exenteration )，其全部是高度侵入性的并且主要涉及移除 眼和視神經部分（在外科手術后，患者通常安裝人工眼）；和（2)斑塊近程治療（plaque brachytherapy)，其為一種放射治療，其中將用放射性粒子(radioactive seed)覆蓋一側 的薄金屬(例如，金)片縫合到眼的外壁上且所述粒子以腫瘤為目標。在治療結束時，將該薄 金屬片移除，所述治療通常持續數天。放射性相關的嚴重并發癥包括:最常見的白內障形 成，繼之為玻璃體出血。其他的并發癥包括干眼、角膜炎、放射誘發性虹膜新血管形成 (radiation-induced iris neovascularization)、新生血管性青光眼、放射誘發性視網膜 病、放射誘發性視神經病變、鞏膜外沉積(ep i sc I era I depos i t)、鞏膜壞死和/或眼外肌改 變。已報道，在用斑塊近程治療進行治療的10%至63%的患者中發生放射性視網膜病，并且 從治療到發生黃斑病變的平均時間為約25.6個月。
[0005] 發明概述
[0006] 本公開內容至少部分地提供了用于檢測和/或選擇性地靶向腫瘤細胞(例如用于 診斷和/或治療癌癥(例如，眼癌））的方法和組合物。在一些情況下，本文中提供的方法和組 合物可用于選擇性地殺傷癌性腫瘤細胞而不損傷健康細胞。例如，可選擇性地向腫瘤細胞 遞送包含光敏分子(例如，與光敏分子綴合）的病毒樣納米顆粒，并通過暴露于光來對其進 行光活化。當光活化時，光敏分子吸收光子，并且所吸收的能量導致引起毒性(例如，細胞毒 性）的分子改變。"光敏病毒樣納米顆粒"（在本文中還稱為"光敏病毒樣顆粒"）指與光敏分 子綴合的病毒樣納米顆粒。令人驚奇的是，光敏分子與病毒樣納米顆粒的綴合不干擾該納 米顆粒的組織/腫瘤向性(tropism)(例如，病毒樣納米顆粒對特定宿主腫瘤組織或腫瘤細 胞的特異性）。
[0007] 本公開內容的病毒樣納米顆粒(還稱為病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)) 一般由LI衣殼蛋白或LI和L2衣殼蛋白的組合裝配，并且在一些實施方案中，所述光敏分子 與形成病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白綴合。因此，本公開內容的多個方面提供了靶向腫瘤的 病毒樣納米顆粒，其包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子。
[0008]本公開內容的一些方面還提供了靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其每個顆粒包含約50至 約500、約50至約600、約50至約700、約50至約800、約50至約900或約50至約1000個光敏分 子。在一些實施方案中，靶向腫瘤的病毒樣顆粒每個顆粒包含約400、約500、約600、約700、 約800、約900或約1000個光敏分子。在一些實施方案中，靶向腫瘤的病毒樣顆粒每個顆粒包 含500個光敏分子或1000個光敏分子。
[0009]在一些實施方案中，所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒(papilloma virus)衣殼蛋白。例 如，在一些實施方案中，所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒（non-human papilloma virus)衣殼蛋白，例如牛乳頭瘤病毒(bovine papilloma virus)衣殼蛋白。在 一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒(human papilloma virus)衣殼蛋白 并且不與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16、HPV 18或對HPV具有特異性的已 有(pre-existing)抗體交叉反應。
[0010] 在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含乳頭狀瘤Ll或L1/L2蛋白（例如，人、牛或 其他物種）。在一些實施方案中，所述Ll或L1/L2 VLP不與針對人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18的中和性抗體或對其他HPV具有特異性的已有抗體交叉反應。然而，在一些實施方案中， 所述病毒樣顆粒包含HPVl 6的人乳頭瘤病毒衣殼蛋白。
[0011] 在一些實施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白的表面暴露的肽綴合。
[0012] 在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含Ll衣殼蛋白或Ll和L2衣殼蛋白的組合。 在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒由Ll衣殼蛋白組成。
[0013] 在一些實施方案中，病毒樣顆粒包含BPV Ll衣殼蛋白（例如，SEQ ID N0:2)，BPV LI和BPV L2衣殼蛋白的組合。在一些實施方案中，病毒樣顆粒包含HPV LI衣殼蛋白或HPV Ll和HPV L2衣殼蛋白的組合。在一些實施方案中，HPV Ll衣殼蛋白是具有經修飾的免疫原 性和/或抗原性的變體HPV16/31 Ll蛋白（例如，SEQ ID N0:1)。因此，在一些實施方案中，病 毒樣顆粒包含變體HPV16/31 Ll衣殼蛋白或變體HPV16/31 Ll衣殼蛋白（例如，SEQ ID NO: 1)和HPV L2衣殼蛋白的組合，或者由其組成。
[0014]在一些實施方案中，病毒樣顆粒的衣殼蛋白具有經修飾的免疫原性和/或抗原性。 這樣的衣殼蛋白的非限制性實例是HPV16/31 Ll衣殼蛋白（例如，SEQ ID N0:1)。與野生型 病毒樣顆粒相比，本文中可將包含經修飾的衣殼蛋白的病毒樣顆粒稱為包含經修飾免疫原 性和/或抗原性的病毒樣顆粒。
[0015]在一些實施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白共價綴合。在一些實施方案中，所述 光敏分子與衣殼蛋白的氨基酸綴合。在一些實施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白的氨基 酸的胺基團（例如，脂族伯胺)綴合。在一些實施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白的賴氨酸 殘基的胺基團（例如，賴氨酸的側鏈胺)綴合。在一些實施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白 的精氨酸和/或組氨酸殘基的胺基團綴合。本公開內容提供了用于使光敏分子與賴氨酸以 及包含胺基團的其他氨基酸綴合的方法。
[0016] 在一些實施方案中，所述光敏分子不破壞(compromise)(例如，阻止、干擾或抑制） 病毒樣顆粒與腫瘤細胞表面的結合。在一些實施方案中，所述光敏分子不破壞(例如，阻止、 干擾或抑制）病毒樣顆粒與腫瘤細胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycan)或其他多糖的結合。
[0017] 在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含約10至約1000個光敏分子。在一些實施 方案中，所述病毒樣顆粒包含約50至約1000個光敏分子。在一些實施方案中，所述病毒樣顆 粒包含約100至約1000個光敏分子。在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含約100至約500 個光敏分子。在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含約500至約1000個或更多個光敏分 子。
[0018] 在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含約10至約1000個光敏分子，所述光敏分 子與Ll衣殼蛋白、L2衣殼蛋白或Ll衣殼蛋白和L2衣殼蛋白之組合的賴氨酸殘基或其他氨基 酸殘基綴合。
[0019] 在一些實施方案中，所述光敏分子通過紅外光、近紅外光或紫外光來活化。當如本 文中的其他部分所述，當光敏分子吸收光子并且所述吸收的能量導致引起毒性的分子改變 時，認為所述分子被"活化"。
[0020] 在一些實施方案中，所述光敏分子包含熒光染料、紅外染料、近紅外染料、撲啉分 子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。
[0021] 在一些實施方案中，所述光敏分子是卟啉分子。根據本公開內容使用的卟啉分子 的實例包括但不限于:HpD(血卟啉衍生物）、基于HpD的分子(HpD-based)、ΒΗ)(苯并卟啉衍 生物）、ALA(5-氨基乙酰丙酸)和德卟啉(texaphyrin)。在一些實施方案中，所述卟啉分子是 維替泊芬(verteporf in，Visudyne@)。
[0022] 在一些實施方案中，所述光敏分子是葉綠素分子。根據本公開內容使用的葉綠色 分子的實例包括但不限于：二氫卟酚（chlor in)、紅紫素 （purpur in)和菌綠素 (bacteriochlorin)〇
[0023] 在一些實施方案中，所述光敏分子是染料。用于根據本公開內容使用的染料的實 例包括但不限于釀菁(口111：11&1〇〇5^11；[116)和萘菁(11&口1：11&1005^11；[116)。
[0024] 在一些實施方案中，所述酞菁染料是焚光分子和近紅外分子二者。例如，在一些實 施方案中，所述酞菁染料是IR700染料(例如，IRl>ye_7〇〇DX，U-C：OR?hiR7〇〇染料是 一種吸收和發射波長在通常為680nm至800nm的近紅外(near-inf rared，NIR)光譜內的焚光 染料。本文中還提供了吸收和發射波長在NIR光譜內的另一些熒光染料。
[0025] 在一些實施方案中，所述光敏分子選自：酞菁染料（例如，IR700染料，例如 IRDyew7〇〇DX)、撲啉分子(例如，維替泊芬，例如Visudyne?)以及酞菁染料和卟啉分子 的組合。
[0026] 本公開內容的一些方面提供了這樣的方法，其包括向患有腫瘤的對象施用本文中 提供的任一種病毒樣顆粒或光敏病毒樣顆粒。在一些實施方案中，所述方法包括在允許光 敏分子可視化的波長下活化病毒樣顆粒的光敏分子。因此，在一些實施方案中，本公開內容 的光敏分子用作成像劑和/或診斷劑。在一些實施方案中，所述方法包括在導致光敏分子具 有細胞毒性的光波長下活化所述分子。在一些實施方案中，所述方法包括在這樣的光波長 下活化光敏分子，所述光波長在腫瘤細胞內產生造成導致壞死的直接且不可逆的細胞損傷 的能量傳遞。因此，在一些實施方案中，本公開內容的光敏分子用作治療劑和/或預防劑。
[0027] 本公開內容的一些方面提供了這樣的方法，其包括向患有腫瘤的對象施用靶向腫 瘤的病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子。在一些實施方案中，所 述方法包括在使光敏分子可見的波長下活化病毒樣顆粒的所述分子。即，所述光敏分子在 光激發之后重新發射光。在一些實施方案中，所述方法包括在使光敏分子具有細胞毒性從 而殺傷腫瘤細胞的波長下活化所述分子。即，所述光敏分子在光激發之后經歷導致光敏分 子變得對細胞具有毒性的分子改變。
[0028] 本公開內容的一些方面提供了這樣的方法，其包括向患有腫瘤的對象施用靶向腫 瘤的病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒包含約50至約1000、約50至500,或約500至1000個光敏分 子。在一些實施方案中，方法包括向患有腫瘤的對象施用靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其包含 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000個或更多個光敏分子。在一些實施方案中， 所述方法包括在使光敏分子可見的波長下活化所述分子。在一些實施方案中，所述方法包 括在使光敏分子具有細胞毒性從而殺傷腫瘤細胞的波長下活化所述分子。
[0029] 在一些實施方案中，所述光敏分子是激光活化的。在一些實施方案中，所述激光是 紅外激光、近紅外激光或紫外激光。在一些實施方案中，所述紅外激光為5焦耳(J)至100J (或J/cm2)(例如，5J、6J、7J、8J、9J、10J、11J、12J、13J、14J、15J、16J、17J、18J、19J、20J、 21J、22J、23J、24J、25J、26J、27J、28J、29J、30J、31J、32J、33J、34J、35J、36J、37J、38J、39J、 40J,41J,42J,43J,44J,45J,46J,47J,48J,49J,50J,51J,52J,53J,54J,55J,56J,57J,58J, 59J、60J、61J、62J、63J、64J、65J、66J、67J、68J、69J、70J、71J、72J、73J、74J、75J、76J、77J、 78J、79J、80J、81J、82J、83J、84J、85J、86J、87J、88J、89J、90J、91J、92J、93J、94J、95J、96J、 97J、98J、99J或IOOJ(或J/cm 2))。在一些實施方案中，所述激光施加約5秒至約5分鐘。
[0030] 在一些實施方案中，在向對象施用病毒樣顆粒后約30分鐘至約48小時活化光敏分 子。例如，可在向對象施用病毒樣顆粒后30分鐘活化光敏分子。在一些實施方案中，在向對 象施用病毒樣顆粒后1小時、2小時(h)、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10 小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21 小時、22小時、23或24小時活化光敏分子。在一些實施方案中，在向對象施用病毒樣顆粒后1 天、2天或3天活化光敏分子。
[0031] 在一些實施方案中，所述腫瘤是眼腫瘤或已轉移至眼部的腫瘤。例如，在一些實施 方案中，所述眼腫瘤位于玻璃體(vitreous)、脈絡膜腔(choroidal space)、虹膜、睫狀體、 鞏膜、視網膜中央凹（fovea)、視網膜、視盤或視神經中。
[0032] 在一些實施方案中，所述腫瘤位于肺、胸膜、肝、胰、胃、食管、結腸、乳腺、卵巢、前 列腺、腦、腦脊膜(meninges)、睪丸、胃腸道、腎或膀胱中。
[0033] 在一些實施方案中，所述腫瘤無需外科手術介入即可接近(accessible)。
[0034] 在一些實施方案中，所述腫瘤位于頭、頸、子宮頸、喉或皮膚中。
[0035] 在一些實施方案中，所述腫瘤是孤兒病（orphan disease)或罕見病（rare disease)〇
[0036] 在一些實施方案中，所述腫瘤是癌性的。在一些實施方案中，所述腫瘤是轉移性 的。在一些實施方案中，所述腫瘤是癌前期的或發育不良性的。
[0037] 在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒通過注射來施用。例如，所述病毒樣顆粒可通 過眼內注射到玻璃體中來施用或者可靜脈內施用。在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒用 空心針(ho 11 ow needle)或包被針（coated needle)、微型針(mini-needIe)或顯微操作針 (micro-needle)來施用。在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒表面(topically)施用。在一 些實施方案中，所述病毒樣顆粒通過植入來施用。
[0038] 在一些實施方案中，所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。例如，在一些實施方案 中，所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白，例如牛乳頭瘤病毒(BPV)衣殼蛋 白。在一些實施方案中，所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣殼蛋白并且不與人乳頭瘤病 毒(HPV) 16、HPV 18或對HPV具有特異性的已有抗體交叉反應。在一些實施方案中，所述病毒 樣顆粒包含人乳頭瘤病毒16型衣殼蛋白。在一些實施方案中，所述VLP不與對人乳頭瘤病毒 (HPV) 16、HPV 18 VLP具有特異性的抗體或由HPV感染特異性地誘導的已有抗體結合。
[0039] 本公開內容的一些方面提供了在對象中監測腫瘤（例如，眼腫瘤和惡性痣 (malignant nevi))的方法，所述方法包括向該對象(例如，向該對象的眼部)施用本文中提 供的任一種病毒樣顆粒(例如包含光敏分子(例如，熒光染料或紅外染料）的病毒樣顆粒）， 并檢測腫瘤的位置。在一些實施方案中，所述方法包括通過用激光(例如紫外激光或紅外激 光）照射該對象(例如，該對象的眼部)來檢測腫瘤的位置。在一些實施方案中，所述方法包 括在施用病毒樣顆粒之前鑒別懷疑患有腫瘤的對象。在一些實施方案中，所述方法包括通 過向患有或懷疑患有腫瘤的對象或對象的腫瘤施用光敏病毒樣顆粒來診斷和/或治療腫 瘤。
[0040] 本公開內容的另一些方面提供了選擇性地抑制癌細胞增殖或殺傷癌性細胞而不 抑制非癌性(例如，正常、健康)細胞的增殖或生存力的方法，所述方法包括向對象的腫瘤 (例如，向該對象的眼腫瘤)施用本文中提供的任一種靶向腫瘤的病毒樣顆粒(例如包含光 敏分子(例如紅外染料)的病毒樣顆粒），并通過使腫瘤經受紅外激光(例如，在約660nm至約 740nm的波長和至少8焦耳的劑量下)來有效地輻照腫瘤的癌性細胞。
[0041] 在一些實施方案中，本公開內容提供了病毒樣納米顆粒(還稱為病毒樣顆粒），其 包含與乳頭瘤病毒Ll蛋白（例如，牛乳頭瘤病毒Ll蛋白）綴合的光敏分子。在一些實施方案 中，所述病毒樣納米顆粒的直徑為20至60納米（例如，10、25、30、35、40、45、50、55或60納 米）。在一些實施方案中，病毒樣納米顆粒包含300至500個Ll(例如，BPV LI)衣殼蛋白，例如 360個Ll衣殼蛋白（例如，基于二十面體對稱）。應認識到，在一些實施方案中，病毒樣納米顆 粒各自包含約 300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、 460、470、480、490或500個1^1(例如，8?￥1^1)衣殼蛋白。然而，在一些實施方案中，病毒樣納 米顆粒包含少于300個Ll (例如，BPV Ll)衣殼蛋白。
[0042] 在一些實施方案中，本公開內容提供了與100至1000個光敏分子(例如，100、200、 300、400、500、600、700、800、900或1000個分子)共價綴合的牛乳頭瘤病毒病毒樣納米顆粒。 在一些實施方案中，牛乳頭瘤病毒(BPV)病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白包含BPV Ll衣殼蛋白 或BPV Ll和BPV L2衣殼蛋白的組合，或者由其組成。在一些實施方案中，光敏分子與病毒樣 納米顆粒(或者與病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白）通過如下形成的共價鍵綴合:光敏分子中的 酯基團與衣殼蛋白中的胺基團反應，從而形成酰胺鍵。因此，在一些實施方案中，本公開內 容的病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白與光敏分子通過酰胺鍵綴合。
[0043] 在一些實施方案中，本公開內容提供了包含300至500個BPV Ll衣殼蛋白并且/或 者直徑為20至60nm的病毒樣納米顆粒，其中至少一些（例如，10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%或100%)與1至5個（例如，1、2、3、4或5個)光敏分子（例如，11?700染 料，例如lRDveK7〇〇DX)共價綴合(例如，通過酰胺鍵）。本公開內容還提供了產生病毒樣納 V 米顆粒的方法和將病毒樣納米顆粒作為診斷劑、治療劑或預防劑施用于對象的方法。
[0044] 附圖簡述
[0045] 圖1示出了使用與光敏分子綴合的病毒樣顆粒(VLP)誘導細胞死亡的機制。
[0046] 圖2示出了二價靶向（例如，通過抗體)和多價靶向（例如，通過VLP)的比較。
[0047]圖3示出了顯示VLP與細胞結合的特異性由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG)相互作用介導并且受肝素抑制的圖。其還示出了僅當光敏 VLP與細胞結合并且使細胞經受紅外輻照時腫瘤細胞才被特異性殺傷。
[0048]圖4示出了顯示細胞死亡依賴于紅外輻射的劑量以及所遞送VLP和光敏分子（例 如，染料)的量的圖。
[0049]圖5示出了顯示在與IR700綴合的VLP(在該圖中指定為PsV)下在輻照之后的體外 卵巢癌細胞(SK0V-3)死亡的圖。
[0050] 圖6A示出了對對照VLP的電噴霧電離-飛行時間（electrospray ionization- time-of-f light，ESI-T0F)分析。圖6B示出了對與1000個分子的IR700綴合的VLP(在該圖中 指定為PsV)的ESI-TOF分析。
[0051 ] 圖7A至70不出了人表皮生長因子受體陰性（human epidermal growth factor receptor 2 negative，HER2-)眼黑素瘤細胞系（92 · I)的細胞死亡的圖，其對二價劑(例如， 抗體)和多價劑(例如，光敏VLP，還稱為VLP綴合物，在該圖中指定為PsV)的有效性進行比 較。
[0052] 圖8A至80不出了人表皮生長因子受體陽性（human epidermal growth factor receptor 2 negative，HER2+)卵巢癌細胞系（SK0V-3)的細胞死亡的圖，其對二價劑（例如， 抗體)和多價劑(例如，光敏VLP，還稱為VLP綴合物，在該圖中指定為PsV)的有效性進行比 較。
[0053] 圖9示出了顯示疫苗誘導的抗HPV16中和性抗體不阻斷BPV*IR700 VLP與眼黑素 瘤細胞系92.1結合的圖。
[0054] 圖10A示出了lRJDye?7〇〇DX NHS酯的化學結構。圖10B示出了Visudyu#的化學 結構，其中反應性羧基用圓圈標出。
[0055] 圖11示出了反應方案，其涉及（1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽） (EDC)和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)介導的Visudy 116#和VLP的連接。在該方案 中，①代表'Visudyne'%并且②代表VLP。注意，有兩條途徑到達期望的終產物。磺基-NHS的 存在易于穩定反應并且增提高望產物的產生。
[0056] 圖12示出了病毒樣納米顆粒與多種類型癌細胞結合之HSPG依賴性結合的代表性 樣品的直方圖，所述病毒樣納米顆粒包含HPV16衣殼蛋白、變體HPV16/31衣殼蛋白和BPVl衣 殼蛋白（L1，或Ll和L2蛋白）。
[0057] 圖13A和13B示出了切除腫瘤組織在明視野（圖13A)和熒光（圖13B)中的圖像，所述 切除腫瘤組織來自注射后12小時之經I 3BS注射的陰性對照小鼠、注射后12小時之經光敏病 毒樣納米顆粒注射的小鼠（#3和#4)和注射后24小時之經光敏病毒樣納米顆粒注射的小鼠 (#1和#2)。
[0058] 圖14示出了對離體TC-I腫瘤樣品中的腫瘤相關的總病毒樣納米顆粒相關熒光的 定量表示，所述樣品切除于靜脈內注射VLP后12和24小時(與圖13相同的腫瘤）。
[0059]圖15示出了實施例14的實驗設計的示意圖。
[0060] 圖16A和16B示出了皮下92 · 1眼黑素瘤(ocular melanoma，0M)細胞在體內施用光 敏病毒樣納米顆粒(在該圖中指定為NP)和光滴定后的細胞死亡百分比的圖（光處理后24小 時測量的細胞生存力）。
[0061 ]圖17A至17C示出了圖16A和16B中所示的數據的原始直方圖。
[0062] 圖18(上面的組圖）示出了從經皮下接種100μΙ PBS中的2 X IO5個TC-I腫瘤細胞并 經如下施用的動物獲得的組織樣品：（1)不處理；（2)100yg病毒樣納米顆粒(在該圖中指定 為NP)，所述納米顆粒由變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白裝配且標記有丨RDye'jOODX [無光];(3汗83與501/〇112光；（4)20(^8病毒樣納米顆粒與501/〇112光；（5)10(^8病毒樣納米 顆粒與50J/cm 2光;和(6)50yg病毒樣納米顆粒與50J/cm2光。圖18(下面的組圖）示出了六種 測試條件各自的死亡細胞百分比。
[0063]圖19A示出了實施例15中所述的實驗的示意圖。圖19B示出了注射有病毒樣納米顆 粒(在該圖中指定為納米顆粒）的動物相對于對照(具有光）中的存活百分比的圖。圖19C示 出了各小鼠中的腫瘤體積(上面的組圖）、"E7四聚體+CD8+T細胞"和"INF- γ分泌CD8+細胞"。 [0064]圖20示出了來自效力測定的結果的圖，所示效力測定比較了光敏BPV病毒樣納米 顆粒和光敏HPV病毒樣納米顆粒對細胞存活力的作用。
[0065]圖21示出了來自結合測定的結果的圖，所述結合測定比較了光敏BPV病毒樣納米 顆粒和光敏HPV病毒樣納米顆粒與細胞的結合。
[0066]圖22示出了在用光敏病毒樣納米顆粒(在該圖中指定為PsV)處理之后頭頸癌細胞 的腫瘤生長曲線的圖。
[0067]圖23Α和23Β描繪了本公開內容的光敏病毒樣納米顆粒產生過程的實例（例如，如 實施例20中所述）。
[0068] 發明詳述
[0069] 光動力學治療（photodynamic therapy，PDT)是使用無毒的光敏分子的一種光治 療形式，所述光敏分子當選擇性地暴露于光時，變得具有毒性并且靶向和/或殺傷惡性細胞 以及其他患病細胞。PDT在治療癌癥中面臨的挑戰是將高濃度的光敏分子排他性地遞送至 腫瘤細胞。為了實現靶向遞送，可使用抗體，但是抗體由于其每個抗體2至8個光敏分子的遞 送能力而受到的限制。此外，有重要的腫瘤缺乏鑒別出的腫瘤受體分子，并且因此不能用抗 體來靶向。因而，很多腫瘤仍然無法治療(例如，眼黑素瘤）。另外，還在非腫瘤細胞的表面上 發現很多被抗體/染料綴合物靶向的分子(例如，EGFR)，從而導致不想要的脫靶效應。
[0070] 本公開內容部分地基于以下出人意料的發現:可將病毒樣顆粒(VLP)(例如，乳頭 狀瘤VLP)(在本文中還稱為病毒樣納米顆粒)化學修飾成攜帶很多光敏分子(例如，IR700) 而不喪失其靶向腫瘤的能力或結構穩定性。例如，在一些實施方案中，可將VLP化學修飾成 攜帶多于50個分子、多于100個分子，或多于1000個分子(或約1000個光敏分子）。由Ll，或Ll 和L2衣殼蛋白裝配的病毒樣顆粒可選擇性地與癌細胞結合并感染癌細胞而不影響非癌性 細胞，從而使治療的細胞毒性最小化(參見美國專利申請公開No. US20100135902A1，其整體 通過引用并入本文）。此外，在一些實施方案中，遞送高量光敏分子/顆粒能夠實現用極少量 的藥物(例如，皮摩爾濃度)在光輻射之后選擇性地殺傷腫瘤細胞。
[0071] VLP的關鍵細胞結合特征是衣殼蛋白（例如，LI)上存在大量的肝素結合位點。令人 驚奇地，光敏分子與表面氨基酸的綴合(例如，通過酰胺鍵與表面氨基酸例如表面賴氨酸殘 基、精氨酸殘基或組氨酸殘基綴合)不破壞VLP與腫瘤細胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG)的結合。盡管，本公開內容描述了光敏分子與衣殼蛋白的表面暴露肽的綴合，但是應 理解光敏分子可與衣殼蛋白的任何肽綴合。即，光敏分子可僅與Ll蛋白綴合或者與Ll和L2 蛋白的組合綴合。與光敏分子綴合的蛋白質和氨基酸殘基可取決于病毒樣顆粒的組成。
[0072] 前述發現對開發新的靶向癌癥治療具有重要的啟示。例如，本公開內容的光敏VLP (還稱為VLP綴合物)相對于具有非常有限遞送能力的其他靶向分子(例如抗體)而言提供一 定的優勢。另外，本公開內容的光敏VLP可用于靶向由于尚未鑒定到合適的腫瘤表面特異性 決定簇而不能通過抗體或其他革G向分子革El向的廣泛多種腫瘤(例如，眼腫瘤）。此外，所述光 敏VLP可用于治療遠端轉移。另外，所述光敏分子可用于診斷和治療早期惡性或癌前期病變 (例如，轉化性、惡化前或惡性眼痣）。
[0073] 本文中使用的"病毒樣顆粒"（VLP)指有組織的衣殼樣結構(例如，形狀為大致球形 或圓柱形），其包含Ll或Ll和L2殼粒(capsomer)的自裝配有序排列并且不含病毒基因組。病 毒樣顆粒在形態和抗原性上類似于真正的病毒體(viron)，但是其缺乏病毒遺傳物質（例 如，病毒核酸），從而使顆粒不具感染性。VLP可用于向接受者細胞遞送藥劑(例如，預防劑、 治療劑或診斷劑）或者閉合的環狀或線性DNA或RNA分子。應理解，術語"病毒樣顆粒"或 "VLP"和"假病毒"或"PsV"在本文中可互換使用并且還可與術語"病毒樣納米顆粒"互換使 用。
[0074] 本文中使用的"祀向腫瘤的病毒樣顆粒"指靶向腫瘤(例如，癌性)細胞但不靶向非 腫瘤(例如，非癌性，或正常、健康的)細胞的VLP(例如，在完好組織中）。
[0075]根據本公開內容的VLP相對于野生型乳頭瘤病毒VLP而言可具有經修飾的免疫原 性和/或抗原性。所述VLP可例如由具有經修飾免疫原性和/或抗原性的變體衣殼蛋白的殼 粒裝配。具有"經修飾免疫原性和/或抗原性"的變體衣殼蛋白是這樣的衣殼蛋白，對其氨基 酸進行了天然或合成修飾(例如，突變、替換、缺失、聚乙二醇化或插入）以降低或阻止衣殼 蛋白被已有(例如，內源性)病毒血清型特異性抗體識別。變體衣殼蛋白可以是人乳頭瘤病 毒(HPV)Ll變體、非人乳頭瘤病毒Ll變體或基于來自不同HPV血清型之氨基酸組合的乳頭瘤 病毒Ll變體。例如，具有經修飾免疫原性和/或抗原性的Ll變體可以是基于HPV血清型16和 HPV血清型31(在本文中稱為"變體HPV16/31 Ll蛋白"-SEQ ID N0:1)的重組蛋白，其在國際 公布No.W0/2010/120266(其整體通過引用并入本文）中進行了描述。
[0076]在一些實施方案中，VLP是乳頭瘤病毒VLP。所述VLP可以是人乳頭瘤病毒VLP(例 如，來自于可感染人的病毒），然而在另一些實施方案中，所述VLP為非人乳頭瘤病毒VLP。非 人VLP的實例包括由但不限于來自于以下的那些：牛乳頭瘤病毒、鼠乳頭瘤病毒、棉兔 (cotton-rabbit)乳頭瘤病毒和獼猴或恒河猴乳頭瘤病毒顆粒。在一些實施方案中，所述 VLP是牛乳頭瘤病毒病毒樣納米顆粒(例如，1型病毒樣納米顆粒）（例如，由BPV Ll衣殼蛋白 或BPV Ll和BPV L2衣殼蛋白的組合裝配）。
[0077]本文中使用的"衣殼蛋白"指其中一些形成殼粒低聚體的蛋白質單體。本文中使用 的"殼粒"指病毒衣殼的基本低聚體結構單位，其為保護病毒(例如，人乳頭瘤病毒(HPV))的 遺傳物質的外部蛋白質覆蓋物。本公開內容的衣殼蛋白包括乳頭瘤病毒Ll主要衣殼蛋白 (major capsid protein)和乳頭瘤病毒L2次要衣殼蛋白（minor capsid protein)。在一些 實施方案中，本公開內容的VLP僅包含LI衣殼蛋白，而在另一些實施方案中，所述VLP包含LI 和L2衣殼蛋白的混合物(或組合）。
[0078]在一些實施方案中，病毒樣顆粒中Ll衣殼蛋白的百分比大于該病毒樣顆粒中L2衣 殼蛋白的百分比。例如，在一些實施方案中，病毒樣顆粒中Ll衣殼蛋白的百分比為(病毒樣 顆粒中的總衣殼蛋白數量的）80%至100%。在一些實施方案中，病毒樣顆粒中Ll衣殼蛋白 的百分比為 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。 在一些實施方案中，病毒樣顆粒中L2衣殼蛋白的百分比為(該病毒樣顆粒中的總衣殼蛋白 數量的H %至25%。例如，在一些實施方案中，病毒樣顆粒中L2衣殼蛋白的百分比為1 %、 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、 19%或 20%。
[0079]在一些實施方案中，病毒樣顆粒包含12至72個L2蛋白。在一些實施方案中，病毒樣 顆粒包含360個Ll蛋白和12至72個L2蛋白。在一些實施方案中，衣殼蛋白裝配成直徑為20至 60nm的病毒樣納米顆粒。例如，衣殼蛋白可裝配成直徑20、25、30、35、40、45、50、55或6011111的 病毒樣納米顆粒。
[0080] 本文中使用的"外衣殼蛋白"指暴露在VLP表面的衣殼蛋白。在一些實施方案中，外 衣殼蛋白（例如，Ll蛋白）與(例如，至少1個)光敏分子綴合。
[0081] 本文中使用的"光敏分子"指當選擇性地暴露于光時變得"活化"（還稱為"光活 化"）的無毒分子。在一些實施方案中，活化的光敏分子在光激發之后重新發射光(例如，熒 光團）。在一些實施方案中，活化的光敏分子在光激發之后可變得具有毒性或者可產生毒性 分子。例如，稱為光敏劑的一類光敏分子在吸收光之后可躍迀到激發態并發生氧的系間跨 越(intersystem crossing)以產生單線態氧(singlet oxygen)。這種單線態氧迅速攻擊其 遇到的任何有機化合物，因此高度細胞毒性的。
[0082]根據本公開內容的多個方面，光敏分子可與VLP的衣殼蛋白（例如，Ll和/或L2衣殼 蛋白）綴合。在一些實施方案中，所述光敏分子與VLP的衣殼蛋白共價綴合。在一些實施方案 中，所述光敏分子與VLP的衣殼蛋白的賴氨酸殘基共價綴合。本文中可將與光敏分子綴合的 VLP稱為"VLP綴合物"或"光敏VLP"。在一些實施方案中，所述光敏分子包含NHS(N-羥基琥珀 酰亞胺)酯基團，其與衣殼蛋白的胺基團（例如，賴氨酸或其他氨基酸的胺基團）反應以形成 共價酰胺鍵。
[0083] 光敏分子(photosensitive molecule，PM)與VLP的比例可變化。在一些實施方案 中，VLP:PM的比例為約1:10至約1:1000、約1:10至約1:500、約1:50至約1:500或約1:50至約 1:1000。即，在一些實施方案中，VLP可包含約10至約1000個光敏分子。在一些實施方案中， VLP:PM 的比例為1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1: 350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或 1:1000。在一些實施方案中，所述￥1^可包含10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、 400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000個光敏分子。在一些實施方 案中，所述VLP可包含多于1000個光敏分子或少于10個光敏分子。
[0084] 1個以上光敏分子可與單個衣殼蛋白綴合。例如，單個衣殼蛋白（例如，Ll或L2衣殼 蛋白）可與1至5個(例如，1、2、3、4或5個)光敏分子綴合。因此，衣殼蛋白的一個以上氨基酸 可與光敏分子綴合。在一些實施方案中，單個衣殼蛋白可與1至2、1至3或2至3個光敏分子綴 合。因此，光敏分子可與單個衣殼蛋白的1、2、3、4或5個不同氨基酸（例如，賴氨酸、精氨酸 和/或組氨酸，或其他氨基酸)綴合。
[0085] 根據本公開內容使用的光敏分子的實例包括但不限于熒光染料、紅外染料、近紅 外染料、卟啉分子和葉綠素分子。
[0086] 根據本公開內容使用的熒光染料的實例包括但不限于：吖啶橙、吖啶黃、Alexa Fluor、7-氨基放射菌素 D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO染料、金胺-羅丹明染色劑、苯并蒽酮、 bimane、9, 10-雙（苯基乙炔基）蒽、5，12-雙（苯基乙炔基）并四苯、雙苯酰亞胺 (bisbenzimide)、黑光漆、鈣黃綠素、羧基熒光素、羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯、羧基熒 光素琥珀酰亞胺酯、1-氯-9,10-雙(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9,10-雙(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9,10-二苯基蒽、香豆素、DAPI、暗淬滅劑（dark quencher)、Di0C6、DyLight Fluor、Fluo_3、 ?1110-4、？1110?1'(^6、焚光素、異硫氰酸焚光素、焚光素圖像引導的外科手術、；^1101'0-」3(16染 色劑、fura-2、fura_2-乙酰氧基甲基酯、GelGreen、GelRed、綠色焚光蛋白、七甲川染料 (heptamethine dye)、印度黃、Indo-I、螢光黃、螢光素、MCherry、部花青(Merocyanine)、尼 羅藍、尼羅紅、光學增白劑、二萘嵌苯（perylene)、焰紅染料（phloxine)、藻膽素 (phycobilin)、藻紅蛋白、藻紅素、碘化丙錠、pyranine、羅丹明、羅丹明123、羅丹明6G、 RiboGreen、RoGFP、紅焚稀（rubrene)、（E)-二苯乙稀、（Z)-二苯乙稀、磺基羅丹明101、磺基 羅丹明B、SYBR Green I、synapto_pHluorin、四苯基丁二稀、四鈉三（紅菲繞啉二磺酸鹽）韋了 (Π )、德克薩斯紅(Texas Red)、鈦黃、TSQ、傘形酮(umbelliferone)、黃色熒光蛋白和YOYO-1〇
[0087] 根據本公開內容使用的光敏染料的實例包括但不限于：HpD、卟吩姆鈉 (Photofrin?、Photogera_ V PhotosailHemporfin_)、m - τ H p c、替莫泊芬 (Foscan?)、維替泊芬（Visudyne?)、HPPH( photochlor?)、鈀-細菌-脫鎂葉綠 酸（Tookad?.)、5-ala、5氨基乙酰丙酸（.Levulan?)、5-ala甲酯（Metvix? )、.5_ ala節酯（Benzvix? )、5-ala己酯（.Hexvix?)、镥（π〗）-德卟啉或莫特沙芬-镥 (Lutex?、LuMn?、Angrin ⑨、Optrin? )、SnET2、本紫紅素乙酯錫（IV) (Purlytin⑧、jPliotrex?)、NPe6、單-L-天冬胺酰基二氫卟酚e6、他拉泊芬鈉 (Talporfm(i、Laserphyrinii )、B 〇 p p、硼化原卟啉（BOPP?:)、鋅酞菁 (CGP5S847? )、硅酞菁（Pc4? )、磺化鋁酞菁衍生物的混合物（Photosens? )、 ΑΤΜΡη、乙酰氧基-四（β-甲氧基乙基-)卟啉烯）、ΤΗ9402和二溴羅丹明甲酯。
[0088] 根據本公開內容使用的光敏染料的實例包括可用于熒光成像的那些（例如，近紅 夕Knir)熒光染料），例如La JoiiaBluejv 和:IRl)ye、R7〇〇DX。
[0089] 本公開內容還提供了向患有腫瘤的對象施用包含與衣殼蛋白綴合之光敏分子的 靶向腫瘤的病毒樣顆粒的方法，或向患有腫瘤的對象施用包含約50至約1000(例如，50、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或 1000)個光敏分子之靶向腫瘤的病毒樣顆粒的方法。
[0090] 在一些實施方案中，所述對象是哺乳動物，例如人。
[0091] 施用模式可通過注射、輸注、植入、表面施用或者通過通常用于遞送病毒樣顆粒的 任何其他方式。在一些實施方案中，根據注射區域使用空心針、包被針、微型針或顯微操作 針。在一些實施方案中，施用模式通過注射到眼內空間中或者注射到眼玻璃體中（例如，以 靶向眼腫瘤或已轉移到眼部的腫瘤）。
[0092] 可用于遞送本公開內容的病毒樣顆粒的試劑的試劑包括但不限于：鹽水、MgCl2、 海藻糖、透明質酸鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或前述兩種或更多種試劑的任意組合。
[0093] 本公開內容的光敏分子可在合適的波長下被活化。在一些實施方案中，所述光敏 分子的活化使其具有細胞毒性或者能夠產生細胞毒性分子。合適的波長包括但不限于：紫 外波長、可見波長、紅外波長或近紅外波長。在一些實施方案中，所述光敏分子在600nm至 800nm或660nm至740nm的波長下被活化并且變得具有細胞毒性。在一些實施方案中，所述光 敏分子在以下波長下被活化并且變得具有細胞毒性：約600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、 650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm、750nm、760nm、 770nm、780nm、790nm或800nnu在一些實施方案中，所述光敏分子在小于600nm或大于800nm 的波長下被活化。用于光敏分子活化的合適波長將取決于所使用的具體分子。
[0094] 本公開內容的光敏分子根據所述分子的類型可通過紅外光、近紅外光或紫外光來 活化。例如，在一些實施方案中，可使用紅外激光、近紅外激光或紫外激光來活化VLP綴合物 的光敏分子。通過所述激光遞送的能量的范圍可以是約5J至約100J、約5焦耳(J)至約50J， 或約8J至約36J。在一些實施方案中，通過所述激光遞送的能量為8J、9J、10J、11J、12J、13J、 14J、15J、16J、17J、18J、19J、20J、21J、22J、23J、24J、25J、26J、27J、28J、29J、30J、31J、32J、 33J,34J,35J,36J,37J,38J,39J,40J,41J,42J,43J,44J,45J,46J,47J,48J,49J,50J,51J, 52J、53J、54J、55J、56J、57J、58J、59J、60J、61J、62J、63J、64J、65J、66J、67J、68J、69J、70J、 71了、721、731、7封或751。在一些實施方案中，通過所述激光遞送的能量為10幾2(^、30了、 40J、50J、60J、70J、80J、90J或100J。
[0095] 可向光敏分子(或光敏VLP)施加光或激光約5秒至約5分鐘。例如，在一些實施方案 中，向光敏分子施加光或激光5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55秒以活化所述分子。在 一些實施方案中，向光敏分子施加激光1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5分鐘，或者更久。應理 解，向光敏分子施加光或激光的時間長度可根據例如該激光的能量(例如，瓦特數)而變化。 例如，可向光敏分子施加具有較低瓦特數的激光較長的時間以活化所述分子。
[0096] 可在施用VLP綴合物后約30分鐘至約48小時向光敏分子(或VLP綴合物)施加光或 激光。例如，在一些實施方案中，在施用VLP綴合物后30、35、40、45、50或55分鐘向光敏分子 施加光或激光。例如，在一些實施方案中，在施用VLP綴合物后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時向光敏分子施加光或激光。在一些實施 方案中，在施用VLP綴合物后36或48小時向光敏分子施加光或激光。
[0097]可直接向腫瘤部位施加光或激光。例如，可通過照射眼部來活化靶向眼腫瘤的VLP 綴合物。
[0098] 根據本公開內容，任何類型的腫瘤均可以是靶標。腫瘤的實例包括但不限于位于 眼部、肺、胸膜、肝、胰、胃、食管、結腸、乳腺、卵巢、前列腺、腦、腦脊膜、睪丸、腎、膀胱、頭、 頸、子宮頸和/或皮膚的那些。
[0099] 在一些實施方案中，所述腫瘤是眼腫瘤。所述眼腫瘤可位于玻璃體、脈絡膜腔、虹 膜、睫狀體、鞏膜、視網膜中央凹、視網膜、視盤或視神經。
[0100]在一些實施方案中，所述腫瘤是癌性或惡性的。在一些實施方案中，所述腫瘤是轉 移性的。還可靶向其他腫瘤。例如，本申請提供了用于靶向子宮頸癌細胞、卵巢癌細胞、黑素 瘤癌細胞、肺癌細胞、頭和/或頸癌細胞以及膀胱癌細胞的方法和組合物。
[0101] 組合物
[0102] 在一些實施方案中，本公開內容的病毒樣顆粒(病毒樣納米顆粒)是光敏分子綴合 的病毒樣納米顆粒。所述病毒樣納米顆粒包含來自乳頭瘤病毒的一種或兩種類型的衣殼蛋 白。在一些實施方案中，所述衣殼蛋白是經修飾的。衣殼蛋白通常自裝配成直徑為約55nm的 "空"原衣殼(proto-capsid)(例如，包含空核心的類球形顆粒）。在原衣殼成熟形成病毒樣 納米顆粒(病毒樣顆粒)之后，隨后使病毒樣納米顆粒與光敏分子(例如，IR700染料，例如 m.[)yew)700DX，由U-COlf制造的紅外染料)化學綴合。
[0103] 在一些實施方案中，所述光敏病毒樣納米顆粒提供在一次性使用小瓶(例如，硼硅 酸鹽玻璃小瓶）中的無菌溶液(例如，1或2ml)中。在一些實施方案中，所述光敏病毒樣納米 顆粒在無菌水溶液中提供，所述無菌水溶液任選地包含似(：1、1((：1、他冊〇4.2!1 20、1(趾〇4或者 前述兩種或更多種的任意組合。在一些實施方案中，NaCl可以以400至600mMol(例如， 500mMol)的濃度存在于溶液中。在一些實施方案中，KCl可以以2至6mMol(例如，2.7mMol)的 濃度存在于溶液中。在一些實施方案中，Na 2HP〇4.2H20可以以5至15mMol (例如，IOmMol)的濃 度存在于溶液中。在一些實施方案中，KH2PO4可以以1至3mMol (例如，2mMol)的濃度存在于溶 液中。
[0104] 在一些實施方案中，光敏病毒樣納米顆粒是經稀釋的并且使用通常用于眼科操作 的無菌的注射器或針來眼內施用。本公開內容還提供了其他施用途徑和向其他腫瘤和/轉 移瘤施用，如本文中的其他部分所述。
[0105] 在一些實施方案中，每個病毒樣納米顆粒包含12至72個殼粒，其中每個殼粒包含5 分子的Ll衣殼蛋白（例如，每分子為55至56kD)和1分子的L2衣殼蛋白（例如，每分子為 52kD)。在一些實施方案中，每個病毒樣納米顆粒包含12至72個殼粒，其中每個殼粒僅包含 Ll衣殼蛋白（例如，每個殼粒5分子Ll蛋白）。
[0106] 在一些實施方案中，每個病毒樣納米顆粒具有10至1000個分子(例如，500個分子） 的光敏分子(IR700染料，例如丨:RDye K'7〇〇DX)與蛋白質的至少一個氨基酸(例如，賴氨酸氨 基酸)化學綴合(例如，通過酰胺鍵）。
[0107] 產生病毒樣顆粒的方法
[0108] 為了產生本公開內容的光敏病毒樣納米顆粒，可將哺乳動物細胞(例如293T細胞 (例如，HEK293F細胞））培養(例如，懸浮培養)并用編碼BPV或HPV Ll(或者Ll和L2)衣殼蛋白 的核酸瞬時轉染。這誘導形成原衣殼（例如，如Buck等Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19,2007年12月中所述）。在細胞團回收和破碎之后，可用benzonase 處理對原衣殼進行宿主DNA清除并使其經受隨后的體外成熟過程以形成穩定的病毒樣納米 顆粒。在純化之后，可使病毒樣納米顆粒與光敏分子(例如，IR700 NHS酯)化學綴合以產生 光敏病毒樣納米顆粒。圖23示出了本文中提供的產生過程的一個實例的示意性圖示。
[0109] 因此，在一些方面，本文中提供了產生光敏分子的方法，其包括(a)用編碼一種或 更多種衣殼蛋白的核酸瞬時轉染細胞，從而形成原衣殼，（b)收集原衣殼并使原衣殼經受體 外成熟過程，從而形成穩定的病毒樣納米顆粒，以及(C)使病毒樣納米顆粒與50至1000個光 敏分子綴合。在一些實施方案中，所述病毒樣納米顆粒與500個光敏分子綴合。在一些實施 方案中，所述病毒樣納米顆粒通過酰胺鍵與光敏分子綴合(例如，通過光敏分子的酯基與病 毒樣納米顆粒衣殼蛋白的氨基酸的胺基團反應）。 實施例
[0110] 實施例 1-//?/_>% K700DX 的綴合
[0111] VLP(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒)與 光敏分子(例如，丨:RI)yefi700DX)的化學綴合操作如下。通常來說，使VLP的溶液以lmg/ml的 濃度維持在PBS，pH = 7.2和0.3至0.5M NaCl中。IR700(例如，IRDye:?700DX)分子作為干 NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)酯(NHS-酯與蛋白質上的胺基團反應以形成共價酰胺鍵）（圖10A) 由生產商供應。蛋白質上的可利用胺基團是蛋白質的氨基末端或氨基酸(例如，賴氨酸)上 的ε_氨基。將干燥固體IR700-NHS酯以5mg/ml的濃度溶解于DMSO中并冷凍儲存。通常來說， VLP:染料的不同比例通過將不同量的IR700-NHS與固定量的VLP(通常為Iml的I3BS中的Img/ ml溶液)混合來實現。典型的比例和IR700-NHS的量列于下表中： 「01121 券1
[0114] 為了實現200:1的比例，將Iml的PBS中的lmg/ml VLP與3.2μ1 IR700-NHS酯溶液混 合。使這些反應在室溫下進行2至4小時。在反應完成之后，通過肝素親和柱色譜純化VLP以 使未結合的IR700-NHS與新形成的VLP-IR700綴合物(還稱為光敏VLP)分離。
[0115] 實施例2_衫畑辦財?的綴合
[0116] Visudynea^VLP的綴合遵循略不同于IR7OO-NHS的方案。Visudyne*分子需要 在綴合至VLP之前與NHS進行官能化。該官能化通過使用EDC(1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙 基)碳二亞胺鹽酸鹽)來實現。EDC用于官能化具有游離羧酸分子的分子，例如Vimidyne ii (參見圖10B，用圓圈標出），并且在磺基-NHS存在下有效地將NHS部分轉移至該試劑。該反應 方案概括于圖11中。簡言之，使約2mM EDC和2 X摩爾過量的磺基-NHS與不同量的 Visudyne#反應。在于室溫下15分鐘之后，通過添加2-巰基乙醇直至2〇mM的終濃度來停止 反應。將該反應混合物添加至PBS，pH=7.2+0.3-0.5M NaCl中的lmg/ml濃度的Img VLP并在 室溫下孵育2至4小時。最后，通過肝素親和柱色譜使未反應的組分與VLP綴合物分離。
[0117]實施例3-VLP結合特異性由HSPG介導并且受肝素的抑制。
[0118] 在以下條件下處理懸浮的SK-0V-3細胞:無 VLP(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白 和!^1^蛋白之組合的病毒樣納米顆粒），與人丨6\3卩1|101'1<丨88(圖3/1488*?^"）或 IR700(圖3，"11?700*?^"）綴合的￥1^，或在批?6存在下孵育的相同￥1^綴合物。在孵育之 后，使這些培養物經受4焦耳的690mm近紅外光。未經光輻照細胞的平行組用作對照。在輻照 之后，評估培養物的細胞死亡程度。圖3顯示顯著細胞殺傷的唯一條件是細胞暴露于 IR700* PsV和4焦耳的光。在暴露于AF488* PsV下未觀察到類似的細胞死亡，表明細胞死亡 是IR700染料綴合物特異性的。此外，在HSPG存在下細胞死亡幾乎完全消除，表明VLP與細胞 的結合對于IR700介導的細胞死亡是至關重要的。
[0119] 實施例4-細胞死亡取決于紅外輻射以及VLP和IR700的量。
[0120]用不同濃度的VLP(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒 樣納米顆粒）處理懸浮的SK-0V-3細胞，所述VLP已綴合有不同量的IR700染料（例如， IRDyeil^OODX)。使用未與IR700染料綴合的VLP作為對照。在孵育之后，使這些培養物經受 0或16焦耳的690nm近紅外光。在光處理之后，評估細胞死亡的程度。圖4顯示細胞死亡依賴 于IR700染料的存在和光處理二者。這得到以下觀察結果的支持:細胞死亡依賴于VLP濃度 和IR700染料綴合比例二者。
[0121] 實施例5-SK0V-3細胞在經與IR700綴合的VLP處理之后于輻照后的體外細胞死亡。
[0122] 將SK0V-3卵巢癌細胞平板接種在24孔板上并用兩種不同濃度的光敏VLP顆粒(例 如，與IR700染料綴合之包含變體HPV16/31L1蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒） (2.5yg(紅)和0.25yg(藍））在37°C下處理1小時。在結合之后，將細胞洗滌，隨后用4J的光處 理。基于對LDH釋放的酶促評估來確定細胞死亡(通過測量490nm下的吸光度來確定）。分別 測試三種不同摩爾比的VLP: IR700綴合：1:500、1:1000和1:2000。圖5顯示對于這兩個受試 濃度而言，均在1:1000的VLP: IR700( "PsV: IR70"）比例下觀察到最大的細胞死亡效力。使用 去污劑介導的細胞裂解作為陽性對照。
[0123] 實施例6-IR700_PsV復合物的結構評價
[0124] 圖6示出了對對照VLP(PsV) (A)和IR700綴合的VLP(PsV) (B)的ESI-TOF分析。在圖 6B中，將反應設置成實現每個VLP(PsV)分子與1000個IR700分子綴合。ESI-TOF掃描中的信 號尖峰對應于VLP Ll蛋白。相對于對照樣品，在綴合樣品中觀察到5517amu的轉移，所述綴 合樣品對應于平均3個綴合IR700分子（1840amu)/Ll蛋白或者約1000個IR700分子/VLP(通 常來說，每個VLP具有360個Ll)。
[0125] 實施例7-藥劑結合決定在眼黑素瘤細胞系中細胞死亡的程度。
[0126] 使懸浮的眼黑素瘤細胞系(92.1;HER2J暴露于不同稀釋度之與IR700染料(例如， IRDyeii 700DX)綴合的Herceptiliii抗體或與IR7〇〇染料綴合的VLP (例如，包含變體 HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒）。然后，評估平行培養物的藥劑 結合（圖7C)或者在不存在（圖7B)或存在（圖7A)16焦耳的690nm近紅外光下的細胞死亡。圖 7C顯示VLP與92.1眼黑素瘤細胞的結合具有濃度依賴性，而基本不存在Herceptiiili!抗體 結合。圖7B顯示，在光不存在下，無細胞死亡。圖7A顯示僅在經光敏VLP處理的細胞中的濃度 依賴性細胞死亡。
[0127] 實施例8-藥劑結合決定在卵巢癌細胞系中細胞死亡的程度。
[0128] 使懸浮的SK-0V-3細胞(HER2-)暴露于不同稀釋度之與IR700染料(例如，IRDve wi V 700DX)綴合的Herceptin8抗體或VLP顆粒(例如，包含變體HPVl6/31 Ll蛋白和HPV L2蛋 白之組合的病毒樣納米顆粒）。然后，評估平行培養物的H:erceptin#SvLP結合（圖8C)或 者在不存在（圖8B)或存在（圖8A) 16焦耳的690nm近紅外光下的細胞死亡。圖8C顯示，VLP結 合在sk-ov-3細胞中達到飽和。.Herceptin #結合也是濃度依賴性的，但是相對于VLP而言 程度降低。圖8B顯示，在不存在光下，無細胞死亡。圖8A顯示在兩種條件下均具有濃度依賴 性細胞死亡，但是與結合類似，在VLP下響應飽和，而在.Hereeptin iil下細胞死亡出現濃度 依賴性提高。這些數據表明，與IR700綴合的VLP(PsV-IR700)比與IR700綴合的 1161^只付11^(1161^印1^11-11? 7〇0)更有效。
[0129] 實施例9-疫苗誘導的抗HPV16中和性抗體不阻斷BPV* IR 700 VLP與眼黑素瘤細 胞系92.1的結合。
[0130] 測試含有不同抗體的血清樣品抑制光敏VLP顆粒(例如，HPV16 VLP或BPV VLP)與 92.1眼黑素瘤細胞系結合的能力。圖9顯示"無血清"或"首次用于實驗的血清"（na'ive serum)條件不含中和VLP結合的活性。此外，觀察到的阻斷活性對病毒血清型具有特異性。 即，僅與IR700染料綴合的人乳頭瘤病毒樣顆粒(HPV16-IR700)被含HPV16抗體的血清中和。 與IR700綴合的牛乳頭瘤病毒樣顆粒(BPV-IR700)不會被含HPV16特異性抗體的血清中和。
[0131] 實施例10-免疫原性評價
[0132] 在與實施例9中所述類似的研究中，通過連續稀釋含有針對HPV16或BPV之抗體的 血清來確定中和效價。表2中所述的結果顯示針對HPV16的抗體僅中和HPV16。此外，針對BPV 的抗體僅中和BPV。因此，不存在HVP16抗體對BPV以及BPV抗體對HVP16的交叉反應性。
[0133] 表2
[0135] 實施例11-結合研究
[0136] 該實施例的目的是評估病毒樣納米顆粒與多種類型癌細胞的結合。所述病毒樣顆 粒包含人乳頭瘤病毒16(HPV16)衣殼蛋白、變體HPV16/31 Ll衣殼蛋白和牛乳頭瘤病毒 (BPV)衣殼蛋白。另外，對含有Ll和L2衣殼蛋白或者僅含Ll衣殼蛋白的病毒樣納米顆粒進行 測試以確定病毒樣納米顆粒與癌細胞的結合是否依賴于L2。該研究的結果顯示BPV病毒樣 納米顆粒和HPV病毒樣納米顆粒具有相當的結合。
[0137] 對一大組細胞系進行篩選，其包括:雜細胞系（例如，293TT、HaCaT、PAM_212和TC-l)、子宮頸細胞系（例如，HeLa、SiHa、CaSki和C-33A)、卵巢細胞系（例如，M0SEC、SHIN-3、SK-0￥-3、肝-3 45-2、厶2780、0￥〇厶1?-3和(^^1?-4)、黑素瘤細胞系（例如，816卩10、51(]\^1^-2、 SKMEL-5、SKMEL-28和UACC)、眼黑素瘤細胞系（例如，92.1、MKT-BR、0CM-1 和UW-I)、肺細胞系 (例如，NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460 和 NCI-H522)、頭頸細胞系（例如，CAL-33(HPV-)、FaDu (HPV-)、HSC-3(HPV_)、SNU-1076(HPV_)、UM-SCC-47(HPV+)、UPCI-SSC-90(HPV+)和UPCI-SCC-154 (HPV+))，以及膀胱細胞系（例如，5637、J82、RT112、SCaBER、SVHUC、T24、UMUC-3、 UMUC-5)。
[0138] 在實驗之前，使病毒樣納米顆粒與AlexaFlu〇r488綴合使得容易且直接地分析病 毒樣納米顆粒與細胞表面的結合。使用不干擾結合的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-酯化學來使 AlexaFluor488與病毒樣納米顆粒連接。在10μg/ml、lμg/ml和0. Ιμ/ml的濃度下測試每種病 毒樣納米顆粒。
[0139] 對細胞進行胰蛋白酶處理以將其從組織培養板的塑料表面移除，洗滌并允許在搖 動臺上于生長培養基中在37°C下復蘇4小時。然后，將細胞洗滌，計數并以IX IO5個細胞/孔 置于96孔圓底板的磷酸緩沖鹽水(PBS)/2%胎牛血清(FBS)中。將病毒樣納米顆粒以100μΙ PBS/2%FBS的終體積添加至細胞。還向孔添加經與肝素預孵育的病毒樣納米顆粒（lmg/ml， 1小時，4°C )，作為對照。然后，將細胞和病毒樣納米顆粒在4°C下孵育1小時（在暗處），用 PBS/2% FBS洗滌兩次并用4%多聚甲醛在室溫下固定15分鐘。最后，將細胞再次洗滌，重懸 于200μ1 PBS/2% FBS中并使用BD FACSDIVA?(BD Biosciences，San Jose，CA)和FlowJo軟 件在BD FACSCANTO? II(K) Biosciences，San Jose，CA)上進行分析。
[0140] 使用 TC-l、HeLa、SK-0V-3、SKMEL-28、92.1、NCI-H322M、HSC-3、UPCI-SCC-15^PT24 細胞系的結果以直方圖示于圖12中。由圖12可以明顯看出：在結合測定中，所有的病毒樣納 米顆粒不管其血清型或組成(LI相對于L1/L2)都與癌細胞結合。此外，肝素競爭結合，表明 病毒樣納米顆粒結合是特異性且HSPG依賴性的。
[0141] 實施例12-生物分布時間過程
[0142] 該實施例的目的是評估病毒樣顆粒在靜脈內注射到荷瘤動物之后腫瘤的定位和 清除的時間過長。
[0143] 純病毒樣納米顆粒通過用IR700染料(例如，IRDye?700DX)以1:500的病毒樣納 米顆粒:染料比例標記病毒樣納米顆粒(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2之組合 的病毒樣納米顆粒)來制備。光敏病毒樣納米顆粒使用0PTIPREP?密度滴度介質通過密度梯 度超速離心來純化。
[0144] 在05781/6白鼠中通過皮下注射10(^1?83中的2\105個1'(：-1癌細胞來產生腫瘤。 約兩周之后，將動物隨機分成處理組。通過靜脈內注射使荷瘤動物接受I 3BS或200yg光敏病 毒樣納米顆粒(1〇〇μ1體積）。在注射后12或24小時，對動物實施安樂死。在安樂死之后，收獲 腫瘤組織并對IR700染料(例如，IRDye?700DX)的熒光進行成像，其指示光敏病毒樣納米 顆粒的存在。
[0145] 圖13B顯示從12小時和24小時兩個時間點獲得的腫瘤組織中均具有可檢出的 IR700染料(例如，IRDye? 700DX)熒光，而在PBS對照（12小時時間點）中未檢測到熒光。月中 瘤組織中的定量總熒光繪制于圖14中所描繪的圖中。
[0146] 實施例13-生物分布時間過程
[0147] 該實施例的目的是評估病毒樣顆粒在靜脈內注射到荷瘤動物之后腫瘤的定位和 清除的時間過程。
[0148] 將經純化的病毒樣納米顆粒在裂解物中用AlexaFluor488標記并使用0PTIPREP? 密度滴度介質通過密度梯度超速離心進行純化。
[0149] 在白化C57B1/6小鼠中通過皮下注射100μΙ PBS中的2X105個TC-I癌細胞來產生 腫瘤。約2周之后，通過靜脈內注射以100μΙ的體積遞送200yg光敏病毒樣納米顆粒。在注射 光敏病毒樣納米顆粒之后于以下時間點收獲腫瘤4=1、2、4、8、12、24、48和72小時。在收獲 之后，將腫瘤碎片冷凍以用于顯微鏡評估。對于該顯微鏡評估，對組織切片進行進一步染 色。將針對HPV16的兔多克隆血清與AlexaFluor-488二抗聯合使用。將血管用大鼠抗⑶31抗 體和抗大鼠 AlexaFluor-594二抗共染色。將細胞核用DAPI突出顯示。
[0150] 數據(原位圖像未示出）證明在1-小時時間點存在光敏病毒樣納米顆粒。信號的定 位顯示與血管中相關。最高染色水平顯示出現在8小時時間點，并且在8小時時間點光敏病 毒樣納米顆粒顯示正從血管中向腫瘤細胞擴散。最后，在24小時和48小時時間點，顯示腫瘤 中具有很低的病毒樣納米顆粒信號。
[0151] 實施例14-全身性施用后的體內效力
[0152] 設計該實施例中所示的研究以測量單次處理后24小時的腫瘤生存力。該研究建立 了長期體內研究的指導方案。
[0153] 完整的研究設計示于圖15中。根據腫瘤大小的范圍，將動物隨機分配成使得大和 小腫瘤在每個組(η = 3，鹽水處理組;η = 5，IR700(例如IRDye?7〇〇DX)-光敏病毒樣納米顆 粒處理組）中平均分布。在光處理前12小時靜脈內施用病毒樣納米顆粒。測試100微克（100μ g)和200yg劑量。光處理包括25J(在400mW下62.3秒)或50J(在400mW下125秒）。24小時之后， 收獲腫瘤并使用膠原酶和DNA酶進行處理以產生單細胞懸液。然后，施用BD 黃色染色劑，并將細胞放置通過FACSCANT0? π。數據作為死細胞的百分 比來報道，如Pacific orange通道中的焚光位移所指示的（圖16Α)。
[0154] 2 0 0 μ g單劑量的I R 7 0 0 (例如，IRBye? 700DX)光敏病毒樣納米顆粒 (nanoparticle，NP)在用50J的光處理之后能夠殺傷大部分的腫瘤細胞（圖16B和圖17C)。當 用25J的光處理腫瘤時，200yg NP下的殺傷水平降低接近一半（圖16B和圖17B)。IOOyg的NP 在25J光下不足以誘導殺傷（圖16B和圖17B);然而在50J劑量下觀察到一定程度的腫瘤死亡 (圖16B和圖17C)。該研究為體內研究提供了必需的IR700(例如，:丨RDyf 700DX)光敏病毒 樣納米顆粒和光劑量信息。
[0155] 實施例15-免疫系統活化研究
[0156] TC-I腫瘤模型能夠在免疫活性動物中檢測用病毒樣納米顆粒處理之后的抗腫瘤 免疫誘導。TC-I腫瘤系由經HPV16癌基因 E6和E7以及表達C-Ha-Ras的突變基因永生化的 C57B1/6肺上皮細胞發展而來(Lin KY，等，Cancer Research. 56( 1): 21-6，1996)。這些細胞 可皮下植入或者，對于研究轉移模型，其可靜脈內注射以將細胞接種在肺中。近二十年來， 這些細胞已用于測試E6和E7治療性疫苗的效力。E7以C57B1/6為背景具有獨特的MHC I類表 位，已表明如果可引發針對它的CD8 T-細胞應答，則其具有保護性（H-2Db，aa 49-57 RAHYNIVTF)(Feltkamp MC，等European Journal of Immunology.23(9):2242-9,1993)。可 如下檢測這些應答:對細胞進行四聚體染色并用肽重新刺激細胞，之后進行細胞內細胞因 子染色。
[0157] 劑量響應研究：向動物皮下接種100μΙ PBS中的2 X IO5個TC-I細胞。在接種后約兩 周，將動物隨機分成六組：（1)無處理對照；（2)無光的IOOyg病毒樣納米顆粒（標記有 IRDye?700DX且包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白的組合)對照；（3)PBS與50J/cm2 光對照；（4)200yg病毒樣納米顆粒與50J/cm2光；（5)100yg病毒樣納米顆粒與50J/cm2光;和 (6) 50yg病毒樣納米顆粒與50 J/cm2光。通過靜脈內注射使小鼠接受100μΙ體積的PBS或病毒 樣納米顆粒，并在12小時后使用690nm激光向腫瘤施加光。24小時后將腫瘤收獲，消化以產 生單細胞懸液并用生存力染色劑染色以測量死細胞的百分比（圖18，上方）。
[0158] 高劑量組中的幾只動物經歷與腫瘤溶解綜合征（tumor lysis syndrome)相關的 癥狀，這可能歸因于大量且迅速的腫瘤壞死并且細胞內成分釋放到動物的系統中。盡管 "lOOyg病毒樣納米顆粒與50J/cm 2光"組中沒有死亡，但是該組中的小鼠的確展現出一些疾 病體征（圖18,上方）。"無光的IOOyg納米顆粒"和"PBS與50J/cm 2光"組未展現出疾病體征， 表明所觀察的響應是由病毒樣納米顆粒和光的組合引起的。總之，接受病毒樣納米顆粒和 光的所有組中均具有明顯的壞死。所有組中均發生最大殺傷并且未觀察到劑量響應(圖18， 下方）。
[0159] 存活研究：向動物皮下接種100μΙ PBS中的2X IO5個TC-I細胞。在接種后約2至3 周，將動物隨機分成處理組(25yg病毒樣納米顆粒)和安慰劑組(僅PBS)。使小鼠接受兩輪處 理，相隔三天。認為以下為一次處理:單次靜脈內注射1〇〇μ1的25yg病毒樣納米顆粒或無菌 1^，12小時后使用69〇11111激光以5(^/〇11 2進行光處理。每3至4天測量腫瘤大小，并且當動物 的腫瘤大小達到> 1500mm3時（圖19A)，對其實施安樂死。
[0160] 在腫瘤小于500mm3的動物中，用病毒樣納米顆粒處理能夠延遲生長或輻射腫瘤 (圖19B和19C)。在安慰劑組中，對腫瘤生長動力學無作用。開始時具有最小腫瘤的兩只動物 在第一次處理的7天內未表現出腫瘤跡象，并且有三只動物表現出腫瘤減小的跡象（圖 19C)〇
[0161] 免疫學研究:對于免疫學讀出，在第0天(第一次處理之前）、第10天和第17天收集 血液。裂解紅細胞并將剩余的細胞分成兩半，一半對細胞表面標志物(⑶62L、⑶127、⑶103、 CD69、CD4、CD8、CD3、H2-DbE7(49-57)四聚體)進行染色。將另一半用HPV16E7肽49-57重新刺 激4.5小時，之后用針對⑶4、⑶8和IFN- γ的抗體以及生存力染料進行染色以區別活細胞。
[0162] 在腫瘤生長受控的兩只動物的血液中，可檢測到"Ε7四聚體+CD8+T-細胞"和"INF-γ分泌性CD8+細胞"（在用Ε7肽重新刺激之后)二者，表明已引發潛在的抗腫瘤響應(圖19)。
[0163] 實施例16-組織學分析
[0164] 光敏病毒樣納米顆粒(例如，與IR700染料綴合的包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒)在組織學水平的作用使用鼠異種移植模型進行評估。簡 言之，將1.5 X IO6個92.1葡萄膜黑素瘤(uveal melanoma)細胞植入到nu/nu小鼠后脅的皮 下間隙中。允許腫瘤達到約200mm3,此時通過靜脈內注射200yg光敏病毒樣納米顆粒來處理 動物。在注射光敏病毒樣納米顆粒后12小時，用50J/cm 2的690nm近紅外光輻照腫瘤部位。再 24小時之后，對動物實施安樂死，將腫瘤組織切除，在福爾馬林中固定，進行石蠟包埋和處 理以用于標準組織學檢查。
[0165] 蘇木精和伊紅(H&E)圖像揭示:相比較于未處理組具有高度壞死（圖像未示出）。當 與對照腫瘤相比時，經光敏病毒樣納米顆粒和激光處理的腫瘤具有蒼白外觀。通過在較高 放大倍數下進行檢查，經光敏病毒樣納米顆粒處理腫瘤的細胞與經對照處理的腫瘤相比表 現出顯著的細胞質損失。另外，壞死程度覆蓋整個腫瘤，從而得出NIR光穿透通過整個腫瘤 組織深度的結論。
[0166] 實施例17-葡萄膜黑素瘤的原位異種移植模型中的病毒樣納米顆粒活性
[0167] 最常見的眼部原發性惡性腫瘤是葡萄膜黑素瘤(UM)。在美國，每年出現約2,000位 患者，而在歐洲發生得更為頻繁。盡管對UM存在數種治療選擇，但是沒有哪種治療能可靠地 控制腫瘤生長、保護視力并且使輻射相關副作用的發生最小化。
[0?68]病毒樣納米顆粒光治療(phototherapy，PT)是一種新的分子祀向性癌癥治療，其 涉及需要施用藥物和光活化二者的兩階段過程。病毒樣納米顆粒PT的藥物部分是與 IRDye?7〇〇DX(用作光敏化劑的一種近紅外(NIR)酞菁染料)綴合的光敏病毒樣納米顆粒 (NP)，之后施加設計成治療患有原發性葡萄膜黑素瘤之成人的非熱NIR光。
[0169]在本研究中，在葡萄膜黑素瘤的原位異種移植模型中對光敏病毒樣納米顆粒的抗 癌活性進行評價。在該模型中，將人葡萄膜黑素瘤細胞植入免疫抑制兔的脈絡膜腔中，并允 許其生長。當通過眼底檢查(fundoscopy)可觀察到腫瘤時，將動物分配成處理組或對照組。 在兩種情況下，均通過眼底檢查和超聲追蹤動物的進行性腫瘤生長或對處理的響應。在研 究結束之后，還通過大體病理學和組織病理學檢測攜帶腫瘤的眼部。
[0170]該研究使用總共20只植入有92.1葡萄膜黑素瘤細胞系的兔來進行。總計，20只動 物中有11只發生腫瘤。有兩只動物在處理之前的隨訪期期間意外死亡;將這些動物用作未 處理對照。未經激光處理的幾只動物具有額外的眼腫瘤;將些動物用作內對照。將前房中具 有腫瘤的動物從研究中排除。
[0171] 與對照動物相比，所有的經處理腫瘤均表現出主要腫瘤響應，這通過眼底檢查、大 體病理學和組織病理學評價得到證明。鄰近腫瘤的視網膜組織不受處理的影響。
[0172] 綜上所述，基于在施用光敏病毒樣納米顆粒并施用激光之后觀察到的腫瘤響應和 壞死的程度，本文中提供的治療方法可用于治療葡萄膜黑素瘤。
[0173] 研究時間表:兩個處理組：1)全腫瘤處理;2)無處理。
[0174] 表3
[0176] 方法和實驗設計：
[0177] 測試體系
[0178] 表4
L 0180」 模型
[0181] 細胞培養
[0182] 人葡萄膜黑素瘤細胞系92.1(由Jerry Y博士Niederkorn，University of Texas Southwestern Medical Center ,Dallas，TX惠贈)在完全培養基(具有 10% 胎牛血清、IOOU/ mL青霉素 G、250ng/mL兩性霉素 B和100yg/mL鏈霉素溶液的RPMI-1640)中在5 % CO2中于37 °C 下進行培養。
[0183] 動物和免疫抑制誘導
[0184] 本研究使用平均初始體重為約3kg的新西蘭白兔。通過每日皮下注射環孢素 A (CsA;山地明50mg/mL;Novartis Pharmaceuticals ,Cambridge，MA，USA)來免疫抑制兔。在 整個實驗期間維持CsA施用以防止自發性腫瘤消退。劑量方案為:細胞接種前每天15mg/kg， 持續3天，此后持續4周，之后是每天10mg/kg，直至實驗結束。根據獸醫的判斷進一步減少劑 量。根據每只動物的體重每日調整CsA劑量。每日測量體重，并將其張貼在圈養兔的房間中。
[0185] 在隨訪期間，每日監測動物的CsA毒性癥狀，例如牙齦肥大、垂涎、腹瀉和體重減 輕。如果動物表現出CsA毒性的早期征象(例如，食欲不振），則立即針對支持性管理而咨詢 獸醫人員，例如食欲刺激物和GI活動力增強劑。還可根據獸醫的建議考慮調整注射劑量。
[0186] 細胞植入
[0?87] 在CsA處理后的第3天，通過肌內注射氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪（6mg/kg)來麻 醉動物。在麻醉之后，向右眼施用1至3滴的0.5%鹽酸丙美卡因，并使用彎曲的套管將1.0 X IO6個92. 1人葡萄膜黑素瘤細胞以100μ1懸液的體積注射到兔右眼的脈絡膜上腔 (suprachoroidal space)中。簡言之，在眼上放置消毒帷簾以避免任何毛發或睫毛污染，并 用10 %聚維酮碘(betadine)溶液清潔結膜。接下來，在眼肌下使用縫合線來使眼睛向前轉 動，并在將結膜切開之后，從角膜緣（limbus)約IOmm進行鞏膜切開術。然后，將套管插入到 鞏膜切口（slerotomy)(其長度的1/3至1/2)中并將細胞（100yL，含有1.0 X 10-6個細胞)注 射到脈絡膜上腔中。緩慢地取回針，并繃緊閉合鞏膜切口的縫合線以確保注射部位發生最 低回流。在外科手術傷口上施用一滴抗生素眼用溶液(紅霉素軟膏）以防止感染。
[0188] 圈養、飼料、水和環境條件、適應環境
[0189] 在分組圈養中，將動物以每組6只圈養并隨意供給新鮮、可口且營養充分的食物。 隨意提供干凈、可飲用且未經污染的水。將環境控制設置為溫度維持在22±4°C(68±5°F)， 并且相對濕度為50% ± 20%。維持12小時的光照/黑暗周期。在動物到達設施(faciIity)之 后，使其適應環境至少5天，之后進行基線評價。在基線眼底檢查評價之后，將動物分配到測 試組。
[0190] 受試品和對照品
[0191]表5:受試品的載劑
[0197] 劑量制劑的制備
[0198] 將受試品在無菌注射用水中以1:1稀釋。
[0199] 受試品/對照品的施用
[0200] 給藥:光敏病毒樣納米顆粒或鹽水通過眼內注射到玻璃體中來施用。
[0201]激光施用：激光處理使用具有Coherent Opa] :Ph〇t〇aCtivat〇r?激光器的狹縫 燈系統來施加，所述激光器在83秒的持續時間內以600mW的功率遞送690nm光，總能量密度 (f Iuence)為50 J/cm2。激光斑點尺寸設定為5mm的直徑并且這樣，大于該尺寸的腫瘤用重疊 斑點進行激光處理。在由于眼部并發癥(例如，玻璃體炎、視網膜脫離)而不能劃定腫瘤邊界 的明確區別的情況下，可對整個懷疑區域進行激光處理。
[0202] 死亡率/發病率檢查：除有兩只動物死于CsA并發癥之外，所有的動物在整個實驗 期間均保持良好的健康狀況(參見下文）。
[0203] 臨床觀察:所有動物均由動物設施人員每日觀察;記錄觀察結果。大多數動物經歷 一定程度的重量減輕和食欲不振，這是由CsA引起。
[0204] 眼科學
[0205] 頻率:通過眼底檢查和超聲的眼科檢查每周進行。
[0206] 操作：使動物鎮靜并使用眼用鹽酸去氧腎上腺素和托吡卡胺滴劑來使其右眼擴 大。接下來，使用間接雙目檢眼鏡（indirect binocular ophthalmoscope)對眼進行眼底檢 查。眼科學家對任何的眼部并發癥進行記錄。當鑒別到腫瘤時，通過將其與視盤(視盤直徑 [DD]; IDD =約1.75mm)進行比較來估計尺寸。對于超聲讀數，在眼底檢查之后立即向眼部施 加超聲探針以使通過眼底檢查確定的腫瘤的位置可視化。超聲測量證明在技術上是困難 的，主要是因為一些腫瘤位于過于外周而不能適當地可視化。結果，并非總是可測量最大的 腫瘤尺寸;并且在大多數情況下僅可對高度進行量化。
[0207] 最終操作和解剖病理學
[0208] 計劃外死亡:根據方案指南，在本研究中使用的20只動物中，一只動物由于重量減 輕（> 20 %的到達時體重)而對其實施了安樂死。一只動物意外地死于由CaA毒性引起的胃 腸道停滯（gastrointestinal stasis) 〇
[0209] 計劃性安樂死：在研究結束后，根據公認的美國獸醫醫學協會（American Veterinary Medical Association，AVMA)指南對動物實施安樂死。使用氯胺酮-甲苯噻嗪-乙酰丙嗪（分別為〇.7511111^/1^、511^/1^和20至3511^/1^)和丁丙諾啡(0.211^/1^)的組合在麻 醉下對動物放血。
[0210] 結果
[0211] 總的來說，有11只動物發生組織病理學上明顯的腫瘤。如前所述，有兩只動物意外 死亡并將其用作未處理對照。有9只具有不同腫瘤大小的動物接受用病毒樣納米顆粒進行 處理。一只動物由于腫瘤范圍在不能進行激光處理的赤道前段中而在評價中排除。
[0212] 對于在眼后部中具有腫瘤并且接受全處理(光敏病毒樣納米顆粒+激光）的動物， 觀察到顯著的腫瘤響應，其以以下三個要素為特征：1)誘導廣泛的腫瘤壞死;2)生長模式改 變，從擴散變為"袖套樣模式"（sleeve-like pattern);和3)不影響鄰近的視網膜。
[0213] 表8


[0217] 未處理對照
[0218] 兔#14由于不能接受的重量減輕（>20%初始體重)而在第4周對其實施了安樂死。 針對腫瘤存在的眼底檢查由于大出血和視網膜脫離而無說服力。該動物未接受處理。
[0219] 超聲:該兔由于死亡時機而未經歷超聲檢查。
[0220] 大體病理學/組織病理學:基于大體病理學，觀察到尺寸為3mm高度(height，H) X 8mm最大腫瘤尺寸（largest tumor dimension，LTD)的眼內腫瘤，并且基于組織病理學，觀 察到尺寸為2.2mm H和9.5最大腫瘤尺寸的眼內腫瘤。基于大體病理學，觀察到尺寸為1.4_ 高度和9.4_最大腫瘤尺寸的眼外腫瘤。眼內和眼外腫瘤二者中有約10%是壞死的。未檢測 到袖套模式。
[0221] 全處理
[0222] 兔 9
[0223] 兔#9在第四周在眼底上具有大小為約IDD的臨床上可檢出的腫瘤，立即對其進行 處理。在隨后的一周，估測腫瘤為0.5DD。在第6周，估測腫瘤為<0.f5DD，并且在最后一周，未 檢測到腫瘤。
[0224] 超聲:在第3周時，超聲未辨別到腫瘤，但是在第4周，鑒別到尺寸為1.04mm高度的 團塊。在后續幾周，超聲的測量結果減退，直至截止第6周及此后腫瘤不再可見。
[0225] 大體病理學/組織病理學：組織病理學揭示無腫瘤或細胞。然而，尚需獲得整個眼 的系列切片和免疫組織化學結果以進一步證實該結果。
[0226] 兔 6
[0227] 在第四周，存在腫瘤的臨床懷疑(視網膜下的團塊升高），但是在實驗持續期間視 網膜下出血、流體和視網膜脫離對臨床尺寸估測造成妨礙。
[0228] 超聲:通過超聲，在第3周檢測到4.88mm的大團塊，其在第4周生長至5.29mm，在此 點我們開始進行處理。在第5周，測量腫瘤為4.88mm，而在第6和7周，測量腫瘤分別為4.02mm 和4.98mm〇
[0229] 大體病理學/組織病理學:基于大體病理學，鑒別到兩種獨特的腫瘤：眼內腫瘤和 結膜腫瘤，后者懷疑是由細胞植入期間發生回流造成。由于結膜腫瘤的位置原因，不能對其 進行處理，并且因此我們考慮將其作為內對照。眼內腫瘤解聚集并且尺寸為7mm HXll mm LTD。還鑒別到尺寸為6mm HX9 LTD mm的延伸部(extraocular extension)，其具有特征性 的質地。基于組織病理學，測量眼內腫瘤為4.9mm HX8.3 LTD mm并且>70%壞死，其中剩 余的大部分存活細胞形成前述袖套樣模式。未經處理的結膜腫瘤表現出遠遠更低的壞死 (約15 % )并且袖套模式不明顯。
[0230] 該研究的目的是探索光敏病毒樣納米顆粒+NIR光在兔眼中的葡萄膜黑素瘤原位 異種移植模型中的活性。接受光敏病毒樣納米顆粒+激光處理的所有動物均對該處理作出 有利的響應。這對小至中等腫瘤而言特別明顯，作為處理響應和完全組織病理學響應，所述 腫瘤具有明顯的腫瘤縮小。例如在第4周時呈現小腫瘤的兔9中，通過頭兩個劑量的處理該 腫瘤完全根除并且在第二處理后兩周在臨床上或組織病理學上均不再檢測到。在較大的腫 瘤（例如兔4)中，腫瘤大部分壞死，這與未處理的對照（兔14)形成明顯對比，所述對照僅在 約10%的腫瘤體積中表現出壞死，清楚地指示處理效力。此外，接受全處理之具有眼內腫瘤 的數只動物具有未經激光處理的眼外延伸部；與經處理的腫瘤部分相比，這些部分表現出 顯著更低的壞死，這是支持激光活化的光敏病毒樣納米顆粒用于治療葡萄膜黑素瘤的效力 的另一證據。鄰近腫瘤的視網膜區域未受處理的影響。
[0231] 基于處理之后的眼內腫瘤響應，尤其與對照（未經處理的眼外部分）相比，本文中 提供的數據支持光敏病毒樣納米顆粒在腫瘤存在下用于治療眼黑素瘤的選擇性且強效的 抗癌活性。
[0232] 實施例18-比較HPVLl與BPVLl的體外效力測定
[0233] 光敏病毒樣納米顆粒(例如，與IR700染料綴合之包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒）的效力通過體外細胞殺傷測量來測定。葡萄膜黑素瘤細 胞(例如，細胞系0CM-1或92.1)通過常規方法使用EDTA和胰蛋白酶的溶液來收獲。一經從組 織培養塑料移出，就將細胞懸浮于完全生長培養基中并允許其在37°C下復蘇約30分鐘。在 該復蘇期期間，在PBS+2%胎牛血清中以l/21og增量（2000pM、600pM、200pM、60pM、20pM、 6pM、2pM和0.6pM)制備光敏病毒樣納米顆粒的連續稀釋物。在復蘇期之后，將細胞計數，離 心并懸浮于TOS+2%FBS中直至細胞密度為3 X IO6Ail。向病毒樣納米顆粒稀釋物添加等體 積的細胞懸液以在適當濃度（1000pM、300pM、100pM、30pM，、10pM、3pM、IpM和0 · 3pM)的病毒 樣納米顆粒中產生1.5 X IO6個細胞/ml。這些條件(例如，360μ1)是在冰上孵育約I. 5小時至 2小時。
[0234] 在該孵育之后，將管離心以收集細胞并隨后將細胞在無光敏病毒樣納米顆粒的情 況下用PBS+2%FBS洗滌兩次。在最后的離心之后，將細胞懸浮于200μ1 PBS+2%FBS中。每份 樣品移出1〇〇μ1并將其轉移至96孔1/2區板的孔。然后，使用Coherent Opal Photoactivator眼科激光器用25 J/cm2(600mW，43秒)近紅外光（689nm)福照每份樣品。在福 照之后，隨后將細胞樣品轉移至新的管。將經光輻照和未經輻照的樣品均放置在37°C下，再 持續1至2小時。
[0235] 在該孵育之后，將最終20μ1的細胞樣品與AOPI染色劑（吖啶橙和碘化丙啶）1:1混 合并使用NexcelomCellometer Auto 2000評價細胞的生存力。圖20顯示，BPVLl和HPVLl在 半最大有效濃度(EC50)(BPVLl = 88pm;HPVLl = 60.5pm)下對細胞生存力具有相當的作用， 表明所述光敏分子的效力彼此相當。
[0236] 圖21示出了分析光敏病毒樣納米顆粒結合之來自圖20中所述的殺傷測定的細胞 樣品。在Odyssey Clx凝膠/板掃描儀上對來自殺傷測定的細胞進行掃描。Odyssey Clx專門 設計成用于檢測和量化一系列紅外染料，包括IR700染料(例如，IRDyeK)7〇〇DX)。因此，在 該測定中，經不同濃度光敏病毒樣納米顆粒處理的細胞顯示出濃度依賴性量的與細胞相關 的熒光，表明細胞與BPV-L1-IR700和HPV-L1-IR700二者都結合。
[0237] 實施例19-光敏病毒樣納米顆粒在頭頸癌的異種移植模型中的活性。
[0238] 將頭頸癌細胞植入nu/nu小鼠的背部側脅中。允許腫瘤生長兩周。一旦腫瘤達到 150_3的平均大小，就將動物如下隨機分成6個研究組(每組7只動物）：鹽水;光敏病毒樣納 米顆粒(HPV16/31 Ll/L2;200yg劑量）；鹽水+NIR光(50J/cm2);光敏病毒樣納米顆粒(200yg 劑量)+NIR光(50J/cm2);光敏病毒樣納米顆粒（IOOyg劑量)+NIR光(50J/cm2);以及光敏病毒 樣納米顆粒(50yg劑量)+NIR光(50J/cm 2)。每3天進行給藥和NIR光處理。每3至5天記錄腫瘤 測量結果。
[0239] 盡管所有的對照對其相應的處理均未表現出實質性效應，但是在所有給藥組中均 觀察到顯著的腫瘤生長抑制（圖22)。所觀察到的腫瘤生長抑制是劑量依賴性的。在高劑量 組中存在腫瘤響應。在200yg處理組中有兩只動物死亡，這與大量細胞死亡相關并且潛在地 與腫瘤溶解綜合征相關的毒性相關。
[0240]實施例20-光敏病毒樣納米顆粒的產生
[0241]為了產生本公開內容的光敏病毒樣納米顆粒，將HEK293F在懸浮培養物中培養，并 用編碼Ll (或者Ll和L2)衣殼蛋白的雙順反子質粒DNA瞬時轉染。這誘導形成原衣殼(如Buck 等Current Protocols in Cell Biology26.1.1-26· 1.19,2007年 12月中所述）。在細胞團 回收并破碎之后，使原衣殼經受benzonase處理以去除宿主DNA污染物并經受后續的體外成 熟過程以形成穩定用于綴合的病毒樣納米顆粒。在純化之后，將病毒樣納米顆粒與 IR700NHS酯化學綴合以產生光敏病毒樣納米顆粒。圖23示出了產生過程的示意性圖示。
[0242] 由該實施例中所述的過程產生的光敏病毒樣納米顆粒已使用SDS-PAGE、SE-HPLC 和DLS進行表征，并且顯示純度為90 %至95 %。來自HEK293細胞的組蛋白作為病毒樣納米顆 粒組合物的一部分存在并且占病毒樣納米顆粒總蛋白的10%至15%。
[0243] 序列
[0244] 變體HPV16/31 Ll蛋白核苷酸序列（SEQ ID N0:1)
[0245] ATGAGCCTGTGGCTGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGC ACCGACGAGTACGTGGCCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGCACCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTA CTTCCCCATCAAGAAGCCCAACAACAACAAGATCCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGA TCCACCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGG GCCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGCT GGACGACACCGAGAACGCCAGCGCCTACGCCGCCAACGCCGGCGTGGACAACAGGGAGTGCATCAGCATGGACTACA AGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCAGCCCCTGCACCAAC GTGGCCGTGAACCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGATCAACACCGTGATCCAGGACGGCGACATGGTGGACAC CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCACCAGCATCT GCAAGTACCCCGACTACATCAAGATGGTGAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTACCTGAGGAGGGAGCAG ATGTTCGTGAGGCACCTGTTCAACAGGGCCGGCGCCGTGGGCGAGAACGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCAG CGGCAGCACCGCCACCCTGGCCAACAGCAACTACTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGACGCCCAGA TCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTG ACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCCTGTGCGCCGCCATCAGCACCAGCGAGACCACCTACAAGAA CACCAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGCGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCC TGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAGCATGAACAGCACCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGCAGCCC CCCCCCGGCGGCACCCTGGAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCGCCTGCCAGAAGCACACCCCCCC CGCCCCCAAGGAGGACCCCCTGAAGAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGG ACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGCAAGAGG AAGGCCACCCCCACCACCAGCAGCACCAGCACCACCGCCAAGAGGAAGAAGAGGAAGCTGTGA
[0246] BPVlLl核苷酸序列（SEQ ID N0:2)
[0247] ATGGCCCTCTGGCAGCAGGGGCAGAAACTCTACCTGCCACCCACACCCGTGTCAAAAGTCCTGTGTTCC GAGACATACGTCCAGCGGAAGTCAATCTTCTACCACGCCGAGACCGAAAGGCTCCTCACCATCGGCCACCCCTACTA CCCCGTCAGCATTGGCGCTAAGACCGTGCCCAAAGTCTCCGCCAACCAATACCGCGTGTTCAAGATCCAGCTGCCCG ACCCAAACCAGTTCGCCCTGCCCGATCGCACCGTGCATAACCCCTCCAAGGAAAGACTCGTCTGGGCCGTGATCGGC GTCCAAGTCTCACGGGGCCAACCCCTGGGCGGCACCGTGACCGGCCATCCAACCTTCAACGCCCTCCTGGACGCCGA GAACGTCAACCGGAAAGTCACAACACAAACCACCGACGATCGCAAGCAGACCGGGCTGGACGCCAAACAGCAGCAAA TCCTCCTCCTGGGGTGCACACCCGCTGAGGGCGAGTACTGGACCACCGCTCGGCCCTGCGTGACCGACAGGCTGGAG AACGGGGCTTGTCCCCCCCTGGAGCTGAAGAATAAGCATATCGAGGACGGCGACATGATGGAGATCGGCTTCGGCGC CGCTAACTTCAAGGAGATCAACGCCTCCAAGAGCGACCTGCCCCTGGATATCCAGAACGAAATTTGTCTCTATCCCG ATTATCTGAAGATGGCCGAAGATGCCGCCGGCAACTCAATGTTTTTCTTCGCCCGCAAGGAGCAAGTCTACGTGCGG CATATTTGGACACGGGGCGGGAGCGAAAAGGAGGCTCCCACAACCGACTTCTACCTGAAAAACAACAAGGGCGACGC TACACTGAAGATCCCATCCGTCCACTTCGGCTCCCCATCCGGGAGCCTCGTCAGCACCGACAACCAGATCTTCAACA GACCATATTGGCTGTTTAGGGCTCAAGGGATGAATAACGGCATCGCTTGGAACAACCTGCTCTTCCTGACCGTCGGC GATAACACCAGGGGCACCAACCTGACAATCTCCGTGGCTAGCGACGGCACACCCCTGACCGAATACGACTCAAGCAA GTTTAACGTGTATCACCGGCACATGGAGGAGTACAAACTGGCTTTCATCCTGGAACTGTGTAGCGTCGAGATTACCG CCCAGACCGTCAGCCACCTCCAGGGCCTGATGCCAAGCGTCCTGGAGAACTGGGAGATCGGCGTCCAACCACCAACA AGCAGCATCCTGGAAGATACATACAGATACATCGAAAGCCCCGCCACCAAGTGCGCCTCAAACGTGATCCCCGCCAA GGAGGATCCCTACGCCGGCTTCAAATTCTGGAATATCGACCTGAAGGAGAAACTGAGCCTCGATCTGGACCAGTTCC CACTCGGCCGGCGGTTCCTGGCCCAACAGGGCGCTGGCTGCAGCACCGTCCGGAAGAGGCGGATCTCACAAAAGACC AGTTCCAAACCCGCCAAGAAGAAGAAGAAGTAG
【主權項】
1. 靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子。2. 權利要求1所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。3. 權利要求2所述的病毒樣顆粒，其中所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒衣 殼蛋白。4. 權利要求3所述的病毒樣顆粒，其中所述非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白是牛乳頭瘤病毒 衣殼蛋白。5. 權利要求2所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣殼蛋白并 且不與人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18或對HPV具有特異性的已有抗體交叉反應。6. 權利要求1至5中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1衣殼蛋白。7. 權利要求1至5中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1和L2衣殼蛋白 的組合。8. 權利要求7所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白由L1衣殼蛋白組成。9. 權利要求1至8中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒具有經修飾的免疫 原性和/或抗原性。10. 權利要求1至9中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白共 價綴合。11. 權利要求1至10中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白的 賴氨酸殘基綴合。12. 權利要求10或11所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過共價酰胺鍵與所述衣 殼蛋白綴合。13. 權利要求1至12中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣 顆粒與腫瘤細胞表面的結合。14. 權利要求13所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣顆粒與腫瘤 細胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結合。15. 權利要求1至14中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約10至約 1000個光敏分子。16. 權利要求15所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約50至約1000個光敏分 子。17. 權利要求16所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約100至約1000個光敏分 子。18. 權利要求1至17中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子包含熒光染料、紅 外染料、近紅外染料、撲啉分子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。19. 權利要求1至18中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過紅外光、近紅 外光或紫外光來活化。20. 權利要求1至19中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子選自酞菁染料、維 替泊芬分子以及酞菁染料和維替泊芬分子的組合。21. 靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其包含約50至約1000個光敏分子。22. 權利要求21所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與衣殼蛋白綴合，所述衣殼蛋白 是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。23. 權利要求22所述的病毒樣顆粒，其中所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒 衣殼蛋白。24. 權利要求23所述的病毒樣顆粒，其中所述非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白是牛乳頭瘤病 毒衣殼蛋白。25. 權利要求22所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣殼蛋白 并且不與人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18或對HPV具有特異性的已有抗體交叉反應。26. 權利要求21至25中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述病毒樣顆 粒的衣殼蛋白綴合。27. 權利要求26所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1衣殼蛋白。28. 權利要求26或27所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1和L2衣殼蛋白的組 合。29. 權利要求28所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白由L1衣殼蛋白組成。30. 權利要求21至29中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒具有經修飾的 免疫原性和/或抗原性。31. 權利要求22至30中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白 共價綴合。32. 權利要求22至31中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白 的賴氨酸殘基綴合。33. 權利要求31或32所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過共價酰胺鍵與所述衣 殼蛋白綴合。34. 權利要求21至33中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒 樣顆粒與腫瘤細胞表面的結合。35. 權利要求34所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣顆粒與腫瘤 細胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結合。36. 權利要求21至35中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約100至約 1000個光敏分子。37. 權利要求21至36中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子包含熒光染料、紅 外染料、近紅外染料、撲啉分子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。38. 權利要求21至37中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過紅外光、近紅 外光或紫外光來活化。39. 權利要求21至38中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子選自酞菁染料、維 替泊芬分子以及酞菁染料和維替泊芬分子的組合。40. 包括以下的方法： 向患有腫瘤的對象施用權利要求1至39中任一項所述的病毒樣顆粒。41. 權利要求40所述的方法，其還包括活化光敏分子。42. 權利要求40或41所述的方法，其還包括在允許氧的系間跨越從而產生細胞毒性分 子或直接能量傳遞以損傷細胞膜的光波長下活化所述光敏分子。43. 包括以下的方法： 向患有腫瘤的對象施用包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子的靶向腫瘤的病毒樣顆粒。44. 包括以下的方法： 向患有腫瘤的對象施用包含約50至約1000個光敏分子的靶向腫瘤的病毒樣顆粒。45. 權利要求43或44所述的方法，其還包括在使所述分子可見的波長下活化光敏分子。46. 權利要求43至45中任一項所述的方法，其還包括在使光敏分子具有細胞毒性從而 殺傷腫瘤細胞的波長下活化所述分子。47. 權利要求46所述的方法，其中所述光敏分子是激光活化的。48. 權利要求47所述的方法，其中所述激光是紅外激光、近紅外激光或紫外激光。49. 權利要求48所述的方法，其中通過所述紅外激光遞送的能量為5J至100J。50. 權利要求49所述的方法，其中通過所述紅外激光遞送的能量為50J。51. 權利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述激光施加約5秒至約5分鐘。52. 權利要求43至51中任一項所述的方法，其中在施用所述病毒樣顆粒之后約30分鐘 至約48小時活化所述光敏分子。53. 權利要求43至52中任一項所述的方法，其中所述腫瘤是眼腫瘤。54. 權利要求53所述的方法，其中所述眼腫瘤位于玻璃體、脈絡膜腔、虹膜、睫狀體、鞏 膜、視網膜中央凹、視網膜、視盤或視神經中。55. 權利要求43至52中任一項所述的方法，其中所述腫瘤位于肺、胸膜、肝、胰、胃、食 管、結腸、乳腺、卵巢、前列腺、腦、腦脊膜、睪丸、腎或膀胱中。56. 權利要求43至53中任一項所述的方法，其中所述腫瘤無需外科手術介入即可接近。57. 權利要求52所述方法，其中所述腫瘤位于頭、頸、子宮頸、喉或皮膚中。58. 權利要求43至57中任一項所述的方法，其中所述腫瘤是孤兒病或罕見病。59. 權利要求43至58中任一項所述的方法，其中所述腫瘤是癌性或惡性的。60. 權利要求59所述的方法，其中所述腫瘤是轉移性的、癌前期的、發育不良性的或者 具有指示惡性轉化的可疑生長細胞。61. 權利要求43至60中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒通過注射來施用。62. 權利要求61所述的方法，其中所述病毒樣顆粒用空心針或包被針、微型針或顯微操 作針來施用。63. 權利要求43至60中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒表面、眼內、玻璃體內、 脈絡膜上施用。64. 權利要求43至60中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒通過植入來施用。65. 權利要求43至64中任一項所述的方法，其中所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。66. 權利要求65所述的方法，其中所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒衣殼蛋 白。67. 權利要求66所述的方法，其中所述非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白是牛乳頭瘤病毒衣殼 蛋白。68. 權利要求43至64中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣 殼蛋白，不與由人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18VLP誘導的抗體或由HPV感染誘導的已有抗體 交叉反應。69. 權利要求43至68中任一項所述的方法，其中所述光敏分子與所述病毒樣顆粒的衣 殼蛋白綴合。70. 權利要求69所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含L1衣殼蛋白。71. 權利要求69或70所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含L1和L2衣殼蛋白的組合。72. 權利要求71所述的方法，其中所述衣殼蛋白由L1衣殼蛋白組成。73. 權利要求43至72中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒具有經修飾的免疫原 性和/或抗原性。74. 權利要求43至73中任一項所述的方法，其中所述光敏分子與衣殼蛋白共價綴合。75. 權利要求43至74中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白 的賴氨酸殘基綴合。76. 權利要求74或75所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過共價酰胺鍵與所述衣 殼蛋白綴合。77. 權利要求43至76中任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒 樣顆粒與腫瘤細胞表面的結合。78. 權利要求77所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣顆粒與腫瘤 細胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結合。79. 權利要求43、46至78中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含約10至約1000 個光敏分子。80. 權利要求43、46至79中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含約50至約1000 個光敏分子。81. 權利要求43至80中任一項所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含約100至約1000個 光敏分子。82. 權利要求4 3至81中任一項所述的方法，其中所述光敏分子包含熒光染料、紅外染 料、近紅外染料、撲啉分子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。83. 權利要求43至82中任一項所述的方法，其中所述光敏分子選自酞菁染料、維替泊芬 分子以及酞菁染料和維替泊芬分子的組合。
【文檔編號】A61K39/42GK105979967SQ201480057289
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年9月18日
【發明人】伊麗莎白·德洛斯皮諾斯, 約翰·T·席勒, 羅達·C·基尼斯, 約翰·麥克杜格爾
【申請人】奧拉生物科學公司, 美國政府衛生與公眾服務部