治療傷口的方法

治療傷口的方法
【專利摘要】本公開內容提供了用于治療受試者中的傷口愈合的方法，所述方法包括向受試者施用抑制VEGF?B信號傳導的化合物。
【專利說明】治療傷口的方法
[0001] 相關申請資料
[0002] 本申請要求于2013年12月18日提交的名稱為"治療傷口的方法"的澳大利亞專利 申請號2013904942和于2013年12月19日提交的名稱為"治療傷口的方法"的澳大利亞專利 申請號2013904966的優先權。這兩個申請的全部內容在此通過引用并入。
[0003] 序列表
[0004] 本申請與電子形式的序列表一起提交。序列表的全部內容在此通過引用并入。 發明領域
[0005] 本申請涉及用于治療或預防傷口的方法。
[0006]背景介紹
[0007] 傷口愈合是復雜的過程，牽涉凝固階段、發炎階段、肉芽組織形成階段和組織重塑 階段。這些事件由在損傷部位釋放的細胞因子和生長因子觸發。許多因素可以復雜化或干 擾正常的充分傷口愈合。例如，這樣的因素包括年齡、感染、營養不良、免疫抑制、藥物、輻 射、糖尿病、周圍血管疾病、全身性疾病、吸煙、壓力等。
[0008] 慢性傷口是不通過有序和及時的修復過程進行以產生解剖和功能完整性的那些。 慢性傷口估計影響570萬患者并且僅在美國就耗費約US$200億/年。
[0009] 對于糖尿病(這是一種慢性的、使人衰弱的疾病，其在2008年影響美國的約3.47億 人)患者，糖尿病足部潰瘍的發展(也稱為傷口，或在一些情況下，慢性傷口）是一種常見的 并發癥。因為皮膚用作針對環境的主要屏障，開放的難愈傷口可能是災難性的;可能會導致 主要的失能(包括肢體缺失），甚至死亡。足部潰瘍是糖尿病人中約85%下肢截肢的先兆。
[0010] 在糖尿病中，傷口愈合的任何階段可被中斷。然而，糖尿病傷口的關鍵特征是胞外 基質蛋白合成和降解的不平衡。此外，慢性炎癥導致成熟肉芽組織形成的延遲和傷口拉伸 強度的降低。
[0011] 當前傷口護理策略包括手術和醫療方法。用藥旨在控制或預防感染，防止缺血和 水腫，減輕疼痛和改善代謝狀態。局部治療包括例如生長因子和富含血小板的血漿的局部 應用和例如水膠體和水凝膠的傷口敷料。手術治療包括血管成形術、植皮和機械支持以減 少壓力。每種療法具有其自身的缺點，例如極為需要在正確的愈合階段介入、令人失望的功 效以及成本高。因此，本領域存在對于改善的傷口治療的需要。
[0012] 發明概述
[0013]在創造本發明的過程中，本發明人研究了在創傷例如糖尿病傷口的公認小鼠模型 中，抑制血管內皮生長因子B(VEGF-B)的信號傳導的作用。本發明人通過向其中已誘發傷口 的糖尿病小鼠施用VEGF-B的拮抗劑（例如，拮抗性抗體)來研究此生長因子的作用。本發明 人發現VEGF-B的抑制導致顯著更快的傷口閉合和愈合。本發明人還發現，這種改善的傷口 愈合在傷口閉合的早期階段(例如當傷口最大和開口時)是特別顯著的。在一些情況下（例 如，在本文中所描述的實驗中），盡管對糖尿病受試者的血糖水平具有稍許影響，傷口愈合 中的變化也會發生，表明抑制VEGF-B通過附加于或不同于血糖控制的途徑提供傷口愈合益 處。
[0014] 本發明人的發現提供了通過抑制VEGF-B信號傳導來誘導或增強傷口愈合或治療 傷口或減緩或預防受試者中的傷口并發癥的方法的基礎。例如，本公開內容提供了用于治 療受試者中的傷口的方法，該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0015] 在另一實例中，本公開內容提供了用于誘導或增強受試者中的傷口愈合的方法， 該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0016] 傷口愈合的評估可以例如通過傷口面積的百分比減少或完全傷口閉合來測定。傷 口面積可以通過定量分析(例如，傷口的面積測量，傷口的平面追蹤等)來測定。完全傷口閉 合可以通過例如皮膚閉合而無引流或敷料需要來確定。傷口的照片、傷口的物理檢查等也 可以用于評估傷口愈合。傷口愈合的加速可以以百分比加速來表示或以時間對愈合的風險 比來表示。
[0017] 在另一實例中，本公開內容提供了用于預防或減緩傷口或傷口的并發癥的進展的 方法，該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0018] 在一個實例中，傷口是急性或常規的，例如，熱損傷(例如，燒傷），外傷，手術，大面 積皮膚癌的切除，深部真菌和細菌感染，血管炎或硬皮病。
[0019] 在另一實例中，傷□是慢性的。例如，傷□是動脈性潰瘍，糖尿病傷口，糖尿病潰 瘍，壓迫性潰瘍或靜脈性潰瘍。
[0020] 在一個實例中，傷口是皮膚傷口。
[0021 ]在一個實例中，受試者患有肥胖和/或糖尿病。
[0022]例如，受試者患有糖尿病，例如1型或2型糖尿病。在這樣的情況下，傷口可以稱為 糖尿病傷口（即，在糖尿病受試者中的傷口）或糖尿病潰瘍（即，在糖尿病受試者中的潰瘍）。 例如，傷口是糖尿病足部潰瘍或糖尿病腿部潰瘍。
[0023]在一個實例中，傷口是褥瘡性潰瘍。
[0024]在一個實例中，受試者患有神經病(例如，糖尿病性神經病）、周圍血管疾病、血糖 控制不良、以往的足部潰瘍或截肢、腎病(或糖尿病性腎病）、小和大血管的缺血或視敏度不 良中的一種或多種。
[0025]在一個實例中，受試者具有傷口。
[0026]在另一實例中，受試者處于發展傷口（例如，慢性傷口）的風險中，并且在例如手術 (當會誘發傷口時）之前施用所述化合物。例如，本公開內容提供了用于減少傷口（例如，誘 發的傷口，例如，通過手術誘發的）的嚴重程度的方法。
[0027]如本文所例舉的，VEGF-B信號傳導的抑制在糖尿病傷口的治療中是有效的。因此， 在一個實例中，本公開內容提供了用于治療糖尿病受試者中的傷口的方法，該方法包括向 受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0028] 本公開內容還提供了用于增強或誘導具有傷口的糖尿病受試者中的傷口愈合的 方法，該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0029] 在一個實例中，受試者處于傷口進展的風險中。例如，受試者患有糖尿病。例如，受 試者患有糖尿病和糖尿病性神經病、周圍血管疾病、血糖控制不良、以往的足部潰瘍或截 肢、腎病(或糖尿病性腎病）、小和大血管的缺血或視敏度不良中的一種或多種。
[0030] 在一個實例中，本公開內容提供了用于減少或預防糖尿病受試者中的傷口的進展 的方法，該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0031] 在另一實例中，本公開內容提供了用于減少具有傷口的受試者(例如，糖尿病受試 者)將需要截肢的風險的方法，該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0032] 在一個實例中，化合物以有效量施用以具有一種或多種下列效應：
[0033] ?與未曾施用所述化合物的受試者(例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）中的 速率相比，增強傷口閉合的速率;和/或
[0034] ?與未曾施用所述化合物的受試者(例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）中的 速率相比，增大特定時間點(例如，在治療開始后）的傷□閉合的量;和/或
[0035] ?與未曾施用所述化合物的受試者（例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）相 比，增強受試者中的血管成熟。
[0036] 本公開內容還提供了用于在受試者中產生一種或多種下列效應的方法，該方法包 括向已具有傷口（和任選患有糖尿病)的受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物：
[0037] ?與未曾施用所述化合物的受試者(例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）中的 速率相比，增強傷口閉合的速率;和/或
[0038] ?與未曾施用所述化合物的受試者(例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）中的 速率相比，增大特定時間點(例如，在治療開始后）的傷□閉合的量;和/或
[0039] ?與未曾施用所述化合物的受試者（例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）相 比，增強受試者中的血管成熟。
[0040] 在一個實例中，抑制VEGF-B信號傳導的化合物特異性抑制VEGF-B信號傳導。這不 意味著本公開內容的方法不包括抑制多種VEGF蛋白的信號傳導，僅意指抑制VEGF-B信號傳 導的化合物(或其部分)是特異于VEGF-B的，例如，不是VEGF蛋白質的一般抑制劑。該術語也 并不排除例如雙特異性抗體或包含其結合結構域的蛋白，其可以利用一個(或多個)結合結 構域特異性抑制VEGF-B信號傳導，并且可以利用另一個結合結構域特異性抑制另一種蛋白 質的信號傳導。
[0041 ] 在一個實例中，抑制VEGF-B信號傳導的化合物結合VEGF-B。例如，該化合物是包含 結合或特異性結合至VEGF-B并中和VEGF-B信號傳導的抗體可變區的蛋白質。
[0042]在一個例子中，化合物是抗體模擬物。例如，化合物是包含免疫球蛋白例如IgNAR、 駱駝科動物抗體或T細胞受體的抗原結合結構域的蛋白質。
[0043]在一個實例中，化合物是結構域抗體(例如，僅包含結合VEGF-B的重鏈可變區或僅 輕鏈可變區)或僅重鏈抗體(例如，駱駝科動物抗體或IgNAR)或其可變區。
[0044] 在一個實例中，化合物是包含Fv的蛋白質。例如，蛋白質選自：
[0045] (i)單鏈Fv片段(scFv);
[0046] (ii)二聚scFv(di-scFv);或
[0047] (iv)雙抗體；
[0048] (V)三鏈抗體；
[0049] (vi)四鏈抗體；
[0050] (vii)Fab；
[0051] (viii)F(ab'）2;
[0052] (ix)Fv;或
[0053 ] (X)連接至抗體的恒定區、Fe或重鏈恒定結構域(Ch ) 2和/或Ch3的⑴至（i X)之一。
[0054] 在另一個實例中，化合物是抗體。示例性的抗體是全長和/或裸抗體。
[0055] 在一個實例中，化合物是重組的、嵌合的、C D R移植的、人源化的、類人源化的 (synhumanized)、靈長類動物化的、去免疫化的或人的蛋白質。
[0056]在一個實例中，化合物是包含競爭性抑制抗體2H10與VEGF-B的結合的抗體可變區 的蛋白質。在一個實例中，所述蛋白質包含重鏈可變區（Vh)，其包含SEQ ID N0:3所示的序 列，和輕鏈可變區(Vl)，其包含SEQ ID NO:4所示的序列。
[0057]在一個實例中，化合物是包含抗體2H10的人源化可變區的蛋白質。例如，蛋白質包 含可變區，所述可變區包含抗體2H10的Vh和/或Vl的互補決定區（⑶R)。例如，蛋白質包含： [0058] ("乂卜其包含：
[0059] (a)包含SEQ ID N0:3的氨基酸25-34所示的序列的CDRl;
[0060] (b)包含SEQ ID N0:3的氨基酸49-65所示的序列的CDR2;和
[0061 ] (c)包含SEQ ID N0:3的氨基酸98-108所示的序列的CDR 3;和
[0062] (ii)VL，其包含：
[0063] (a)包含SEQ ID N0:4的氨基酸23-33所示的序列的CDRl;
[0064] (b)包含SEQ ID N0:4的氨基酸49-55所示的序列的CDR2;和
[0065] (c)包含SEQ ID N0:4的氨基酸88-96所示的序列的CDR3。
[0066]在一個實例中，化合物是包含Vh和Vl的蛋白質，Vh和Vl是抗體2H10的人源化可變 區。例如，蛋白質包含：
[0067] ("乂卜其包含：
[0068] (a)包含SEQ ID N0:3的氨基酸25-34所示的序列的CDRl;
[0069] (b)包含SEQ ID N0:3的氨基酸49-65所示的序列的CDR2;和
[0070] (c)包含SEQ ID N0:3的氨基酸98-108所示的序列的CDR 3;和
[0071] (ii)VL，其包含：
[0072] (a)包含SEQ ID N0:4的氨基酸23-33所示的序列的CDRl;
[0073] (b)包含SEQ ID N0:4的氨基酸49-55所示的序列的CDR2;和
[0074] (c)包含SEQ ID N0:4的氨基酸88-96所示的序列的CDR3。
[0075]在一個實例中，任何前述段落中的可變區或Vh包含SEQ ID N0:5所示的序列。
[0076]在一個實例中，任何前述段落中的可變區或Vl包含SEQ ID N0:6所示的序列。
[0077]在一個例子中，化合物是抗體。
[0078] 在一個實例中，化合物是包含含有SEQ ID NO: 5所示的序列的Vh和含有SEQ ID NO: 6所示的序列的Vl的抗體。
[0079] 在一個實例中，蛋白質或抗體是由編碼任何前述蛋白質或抗體的核酸或表達所述 蛋白質或抗體的細胞所編碼的任何形式的蛋白質或抗體(例如，包括翻譯后修飾的蛋白質 或抗體）。
[0080] 在一個實例中，蛋白質或抗體包括：
[0081] (丨八卜其包含：
[0082] (a)包含SEQ ID NO: 11的核酸編碼的序列或包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的 CDRl;
[0083] (b)包含SEQ ID NO: 12的核酸編碼的序列或包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的 CDR2;和
[0084] (c)包含SEQ ID NO: 13的核酸編碼的序列或包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的 CDR 3;和/或
[0085] (ii)VL，其包含：
[0086] (a)包含SEQ ID NO: 14的核酸編碼的序列或包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的 CDRl;
[0087] (b)包含SEQ ID NO: 15的核酸編碼的序列或包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的 CDR2;和
[0088] (c)包含SEQ ID NO: 16的核酸編碼的序列或包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的 CDR3〇
[0089] 在一個實例中，蛋白質或抗體包括：
[0090] (^乂卜其包含：
[0091] (a)包含SEQ ID NO: 23的核酸編碼的序列或包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的 CDRl;
[0092] (b)包含SEQ ID N0:24的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:30的氨基酸序列的 CDR2;和
[0093] (c)包含SEQ ID N0:25的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:31的氨基酸序列的 CDR 3;和/或
[0094] (ii)VL，其包含：
[0095] (a)包含SEQ ID N0:26的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:32的氨基酸序列的 CDRl;
[0096] (b)包含SEQ ID N0:27的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列的 CDR2;和/或
[0097] (c)包含SEQ ID N0:28的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:34的氨基酸序列的 CDR3〇
[0098] 在一個實例中，蛋白質或抗體包括：
[0099] (^乂卜其包含：
[0100] (a)包含SEQ ID NO: 35的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:41的氨基酸序列的 CDRl;
[0101] (b)包含SEQ ID NO: 36的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:42的氨基酸序列的 CDR2;和
[0102] (c)包含SEQ ID NO: 37的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:43的氨基酸序列的 CDR 3;和/或
[0103] (ii)VL，其包含：
[0104] (a)包含SEQ ID NO: 38的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:44的氨基酸序列的 CDRl;
[0105] (b)包含SEQ ID NO: 39的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:45的氨基酸序列的 CDR2;和
[0106] (C)包含SEQ ID N0:40的核酸編碼的序列或包含SEQ ID N0:46的氨基酸序列的 CDR3〇
[0107] 在一個實例中，化合物在組合物內。例如，組合物包括包含如本文中所述的抗體可 變區或Vh或Vl或抗體的蛋白質。在一個實例中，組合物還包括蛋白質或抗體的一種或多種變 體(例如，翻譯后修飾的變體）。例如，其包括缺少編碼的C-末端賴氨酸殘基的變體、脫酰胺 變體和/或糖基化變體和/或例如在蛋白質的N-末端包含焦谷氨酸的變體和/或缺乏N-末端 殘基(例如抗體或V區中的N-末端谷氨酰胺）的變體和/或包含分泌信號的全部或部分的變 體。編碼的天冬酰胺殘基的脫酰胺變體可能會導致產生異天冬氨酸和天冬氨酸亞型，或甚 至產生牽涉相鄰氨基酸殘基的琥珀酰胺。編碼的谷氨酰胺殘基的脫酰胺變體可能會導致谷 氨酸。當提及特定氨基酸序列時，旨在包括包含這樣的序列和變體的異質混合物的組合物。
[0108] 在一個實例中，抑制VEGF-B信號傳導的化合物抑制或阻止VEGF-B的表達。例如，所 述化合物選自反義物、s iRNA、RNAi、核酶和DNAzyme。
[0109] 在一個實例中，VEGF-B是哺乳動物VEGF-B，例如，人VEGF-B。
[0110] 在一個實例中，受試者是哺乳動物，例如靈長類動物，例如人。
[0111] 本文描述的治療方法可另外包括施用用于傷口的其它治療。
[0112] 本文所述的治療糖尿病傷口或潰瘍的方法可以另外包括施用其它化合物以治療 或預防糖尿病(或延緩其進展）。本文描述了示例性的化合物。
[0113] 在另一實例中，本公開內容提供了抑制VEGF-B信號傳導用于誘導或增強受試者中 的傷口愈合和/或預防或減緩受試者中的傷口或傷口的并發癥的進展的化合物。
[0114]在另一實例中，本公開內容提供了抑制VEGF-B信號傳導的化合物在制造用于誘導 或增強受試者中的傷口愈合和/或預防或減緩受試者中的傷口或傷口的并發癥的進展的藥 物中的用途。
[0115]本公開內容還提供了試劑盒，其包含抑制VEGF-B信號傳導的化合物，包裝有在治 療或預防傷口中使用和/或使用本公開內容的方法的說明書。
[0116] 示例性傷口和化合物描述于本文中并且將被認為對前三段示出的本公開內容的 實例應用必要修改。
[0117] 本公開內容的實例應被認為對改善傷口愈合或減少復發或傷口（例如，糖尿病性 潰瘍)復發的可能性或加速傷口愈合應用必要修改。
[0118] 附圖簡述
[0119] 圖1是顯示使用2H10的抗VEGF-B治療在嚴重糖尿病動物模型中不顯著影響創傷后 的血糖水平或體重減輕的一系列圖示。圖A顯示在對照或抗VEGF-B治療的糖尿病db/db或非 糖尿病db/+小鼠中在動物的創傷之前和之后的飼養血糖水平且圖B顯示在對照或抗VEGF-B 治療的糖尿病db/db或非糖尿病db/+小鼠中在動物的創傷之前和之后的飼養體重(N = 4-7/ 組）。數值是平均值土s.e.m。
[0120] 圖2是顯示使用2H10的VEGF-B的藥理學抑制增強嚴重糖尿病小鼠模型中的傷口閉 合的圖示。改善的傷口閉合在糖尿病db/db BKS動物中的VEGF-B藥理學抑制后檢測到。在非 糖尿病db/+BKS小鼠中在VEGF-B抑制后未發現傷口閉合的差異(N = 8-14/組）。數值是平均 值土s · e .m。相較于對照治療的db/db小鼠，* F〈0 · 05，**P〈0 · 01，***P〈0 · 001。
[0121] 圖3包括顯示盡管血糖水平沒有差異，使用2H10的抗VEGF-B治療仍然在短時間段 內加速傷口愈合的一系列圖示。分析用2H10或對照抗體治療的db/db動物以及db/+動物。圖 A顯示在前四天的血糖水平(N = 5-6/組），B組顯示在前四天的傷口閉合(N=10-12/組）。數 值是平均值土 s. e .m。相較于對照治療的db/db，*#P〈0.0 Ol。
[0122] 圖4是顯示使用2H10的抗VEGF-B治療減少在糖尿病創傷期間被上調的幾個基因的 表達的圖示。在2 H 10或對照抗體治療的db/db小鼠和對照治療的db/+小鼠 （n = 8-14/組）中 測量終點IGF-I，TGF-b，TNF-α，α-SMA，COLla，Fgf-7和IFN- γ表達水平。數值是平均值土 s . e . m。相較于對照治療的db/db動物，*Ρ〈0.05，相較于對照治療的db/+小鼠動物，#Ρ〈 〇.〇5，##?〈〇.〇1。16?-1;胰島素樣生長因子1，了6?-13 :轉化生長因子0，了即-€[;腫瘤壞死因子， a- SM; a-平滑肌肌動蛋白，COLla; a-11型膠原，Fgf-7;成纖維細胞生長因子7。
[0123] 圖5包括顯示db/db小鼠中的VEGF-B抑制影響血管形態學但不促進細胞增殖的一 系列圖示。頂部圖顯示Brdu/DAPI染色的定量并且下部圖顯示來自具有對照或2H10抗體的 db/db小鼠的CD45、CIV和CD31染色的定量。N = 4-6/組。數值是平均值土 s.e.m。相較于對照 治療的 db/db，*P〈0 · 05，**P〈0 · 01。
[0124] 圖6是顯示VEGF-B信號傳導通路在糖尿病傷口中被上調的圖示。在來自糖尿病db/ db小鼠和非糖尿病db/+小鼠的傷口的組織中測量終點Vegfb ,Vegfrl，Fatp4, Vegfa和 Vegfr2表達水平。將表達水平標準化至TUBB5。數值是平均值土 s.e.m。對照治療的db/db相 較于對照治療的db/+，#P〈0.05，##P〈0.01，n = 3-5。Vegfb;血管內皮生長因子B; Vegfr 1;血 管內皮生長因子受體I，Fatp4;脂肪酸轉運蛋白4，Vegfa;血管內皮生長因子A; Vegfr2;血管 內皮生長因子受體2。
[0125] 圖7是顯示使用2H10的抗VEGF-B治療降低db/db小鼠的皮膚中的脂質累積的圖示。 所描述的圖顯示用對照或2H10抗體治療的db/db和db/+中的油紅0染色的定量。數值是平均 值土 s. e. m。對照治療的db/db相較于2H10治療的db/db小鼠，#*P〈0.001 Jb/+動物相較于 對照治療的db/db小鼠 ，###P〈0.001。
[0126] 序列表的信息
[0127] SEQ ID NO: 1是含有21個氨基酸的N末端信號序列的人VEGF-B186同種型的氨基酸 序列。
[0128] SEQ ID N0:2是含有21個氨基酸的N末端信號序列的人VEGF-Bm同種型的氨基酸 序列。
[0129] SEQ ID NO:3是來自抗體2H10的Vh的氨基酸序列。
[0130] SEQ ID NO:4是來自抗體2H10的Vl的氨基酸序列。
[0131] SEQ ID NO:5是來自抗體2H10的人源化形式的Vh的氨基酸序列。
[0132] SEQ ID NO:6是抗體2H10的人源化形式的Vl的氨基酸序列。
[0133] SEQ ID NO:7是來自抗體4E12的Vh的氨基酸序列。
[0134] SEQ ID NO:8是抗體4E12的Vl的氨基酸序列。
[0135] SEQ ID NO:9是來自抗體2F5的Vh的氨基酸序列。
[0136] SEQ ID NO: 10是抗體2F5的Vl的氨基酸序列。
[0137] SEQ ID NO: 11是來自抗體2H10的Vl CDRl的核苷酸序列
[0138] SEQIDN0:12是來自抗體2H10的VLCDR2的核苷酸序列
[0139] SEQIDN0:13是來自抗體2H10的VLCDR3的核苷酸序列
[0140] SEQ ID NO:14是來自抗體2H10的Vh CDRl的核苷酸序列
[0141] SEQIDN0:15是來自抗體2H10的VHCDR2的核苷酸序列
[0142] SEQIDN0:16是來自抗體2H10的VHCDR3的核苷酸序列
[0143] SEQ ID NO: 17是來自抗體2H10的Vl CDRl的氨基酸序列
[0144] SEQIDN0:18是來自抗體2H10的VLCDR2的氨基酸序列
[0145] SEQIDN0:19是來自抗體2H10的VLCDR3的氨基酸序列
[0146] SEQ ID NO:20是來自抗體2H10的Vh CDRl的氨基酸序列
[0147] SEQIDN0:21是來自抗體2H10的VHCDR2的氨基酸序列
[0148] SEQIDN0:22是來自抗體2H10的VHCDR3的氨基酸序列
[0149] SEQ ID NO:23是來自抗體2F5的Vl CDRl的核苷酸序列
[0150] SEQ ID NO:24是來自抗體2F5的Vl CDR2的核苷酸序列
[0151] SEQ ID NO:25是來自抗體2F5的Vl CDR3的核苷酸序列
[0152] SEQ ID NO:26是來自抗體2F5的Vh CDRl的核苷酸序列
[0153] SEQ ID NO:27是來自抗體2F5的Vh CDR2的核苷酸序列
[0154] SEQ ID NO:28是來自抗體2F5的Vh CDR3的核苷酸序列
[0155] SEQ ID NO:29是來自抗體2F5的Vl CDRl的氨基酸序列
[0156] SEQ ID NO:30是來自抗體2F5的Vl CDR2的氨基酸序列
[0157] SEQ ID NO:31是來自抗體2F5的Vl CDR3的氨基酸序列
[0158] SEQ ID NO:32是來自抗體2F5的Vh CDRl的氨基酸序列
[0159] SEQ ID NO:33是來自抗體2F5的Vh CDR2的氨基酸序列
[0160] SEQ ID NO:34是來自抗體2F5的Vh CDR3的氨基酸序列
[0161] SEQ ID N0:35是來自抗體4E12的Vl CDRl的核苷酸序列
[0162] SEQIDN0:36是來自抗體4E12的VLCDR2的核苷酸序列
[0163] SEQIDN0:37是來自抗體4E12的VLCDR3的核苷酸序列
[0164] SEQ ID N0:38是來自抗體4E12的Vh CDRl的核苷酸序列
[0165] SEQIDN0:39是來自抗體4E12的VHCDR2的核苷酸序列
[0166] SEQIDN0:40是來自抗體4E12的VHCDR3的核苷酸序列
[0167] SEQ ID N0:41是來自抗體4E12的Vl CDRl的氨基酸序列
[0168] SEQIDN0:42是來自抗體4E12的VLCDR2的氨基酸序列
[0169] SEQIDN0:43是來自抗體4E12的VLCDR3的氨基酸序列
[0170] SEQ ID N0:44是來自抗體4E12的Vh CDRl的氨基酸序列
[0171] SEQIDN0:45是來自抗體4E12的VHCDR2的氨基酸序列
[0172] SEQIDN0:46是來自抗體4E12的VHCDR3的氨基酸序列
[0173] 發明詳述
[0174] 一般的
[0175] 在整個本說明書中，除非另外特別說明或上下文另有要求，否則對單個步驟、物質 的組合物、步驟的組或物質的組合物的組的提及應認為包含一個和多個(即一個或多個)那 些步驟、物質的組合物、步驟的組或物質的組合物的組。
[0176] 本領域技術人員將理解，本公開內容易于作出各種變化和修改，除了具體描述的 那些以外。應當理解，本公開內容包括所有這樣的變化和修改。本公開內容還單獨或共同地 包括本說明書中提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物以及所述步驟或特征的任 何和所有組合或任意兩種或多種。
[0177] 本公開內容的范圍不受本文所描述的具體實例限制，其僅用于示例的目的。功能 性等同的產品、組合物和方法顯然在本公開內容的范圍之內。
[0178] 本公開內容的任何實例在本文應被認為對本公開內容的任何其它實例應用必要 修改，除非另有特別說明。
[0179]除非另有具體定義，本文使用的所有技術和科學術語應當認為具有與通常由本領 域普通技術人員所理解的（例如，在細胞培養，分子遺傳學，免疫學，免疫組織化學，蛋白質 化學，和生物化學中）相同的含義。
[0180] 除非另有說明，本公開內容中使用的重組蛋白、細胞培養和免疫學技術是本領域 技術人員熟知的標準程序。這樣的技術在各種來源的文獻中得到描述和解釋，所述來源為 例如：J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)，J. Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，T · A · Brown(編輯），Essential Molecular Biology : A Practical Approach,Volumes land 2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames (editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and 1996),和F.M.Ausubel等人（editors) ,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley_Interscience(1988,包括直到目前為止所有的更 新），Ed Harlow and David Lane(編輯）Antibodies: A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988),和J.E.Coligan等人（編輯）Current Protocols in Immunology ,John Wiley&Sons(包括直到目前為止所有的更新）。
[0181] 可變區及其部分、免疫球蛋白、抗體及其片段在本文的描述和定義可通過在下列 參考資料中的討論進一步闡明：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md. ,1987和1991,Bork等人，J Mol.Biol.242,309-320,1994,Chothia and Lesk J.Mol Biol.196:901-917,1987, Chothia等人Nature 342,877-883,1989和/或Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273,927-948,1997。
[0182] 蛋白質或抗體在本文中的任何討論將被理解為包括制造和/或儲存過程中產生的 蛋白質或抗體的任何變體。例如，在制造或儲存過程中，抗體可被脫酰胺化(例如，在天冬酰 胺或谷氨酰胺殘基)和/或具有改變的糖基化和/或具有轉換為焦谷氨酰胺的谷氨酰胺殘基 和/或具有移除或"修剪"的N-末端或C-末端殘基和/或具有不完全加工的信號序列的一部 分或全部并且作為結果保留在該抗體的末端。應理解的是包含特定氨基酸序列的組合物可 以是所述的或編碼的序列和/或該所述的或編碼的序列的變體的異質混合物。
[0183] 術語"和/或"，例如，"X和/或Y"應被理解為意指"X和Y"或"X或Y"，并應認為是對兩 種含義或任一含義提供明確的支持。
[0184] 貫穿本說明書中，詞語"包括"或變型例如"包含"或"含有"將被理解為暗指包括所 述的元素、整數或步驟、或元素、整數或步驟的組，但不排除任何其它元素、整數或步驟、或 元素、整數或步驟的組。
[0185] 如本文所用，術語"來源于"應被認為表示指定的整數可以從特定來源獲得，盡管 非必需地直接從該來源獲得。
[0186] 選擇的定義
[0187] VEGF-B已知以兩個主要的同種型存在，稱為VEGF-B186和VEGF-B167。僅用于命名而 非限制的目的，人VEGF-B 186的示例性序列示于NCBI參考序列:NP_003368.1，NCBI蛋白登錄 號NP_003368、P49765和AAL79001以及SEQ ID N0:1中。在本公開內容的上下文中，VEGF-Bi86 的序列可以缺少21個氨基酸的N-末端信號序列（例如，如在SEQ ID NO: 1的氨基酸1至21所 示的）。僅用于命名而非限制的目的，人VEGF-Bi67的示例性序列示于NCBI參考序列：NP_ 001230662.1，NCBI蛋白登錄號AAL79000和AAB06274以及SEQIDN0 :2中。在本公開內容的 上下文中，VEGF-B167的序列可以缺少21個氨基酸的N-末端信號序列(例如，如在SEQ ID NO: 2的氨基酸1至21所示的）JEGF-B的其它序列可使用本文提供的和/或公共可得的數據庫中 的序列測定和/或使用標準技術(例如，Ausubel等人，（editors) ,Current Protocols in Molecular Biology ,Greene Pub.Associates 和 Wiley-Interscience(1988,包括直到目前 為止所有的更新）或Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press( 1989)中描述的）測定。對人VEGF-B的提及可以被縮寫 為hVEGF-B。在一個實例中，本文對VEGF-B的提及是對VEGF-B 167同種型的提及。
[0188] 本文對VEGF-B的提及還包括在W02006/012688中所述的VEGF-Bio-IQ8肽。
[0189] 術語"傷口"將被認為意指其中受試者的組織被破壞(例如，撕裂，刺破，切割，或以 其它方式損壞)的任何損傷。
[0190] 如本文所用，術語"皮膚傷口"應被認為意指受試者皮膚的一個或多個層的病變， 例如，其中所述病變包括一個或多個細胞凋亡的真皮細胞和/或一個或多個壞死的真皮細 胞。術語"皮膚傷口"應被認為包括影響受試者的表皮層和/或受試者的真皮層和/或受試者 的皮下的傷口。
[0191] 術語"慢性傷口"是指不在有序集合的階段和可預測的時間量中愈合的傷口。一般 來說，在三個月內不愈合的傷口被認為是慢性的。慢性傷口包括但不限于，例如，動脈性潰 瘍，糖尿病性潰瘍，壓迫性潰瘍，靜脈性潰瘍等。急性傷口可以發展成慢性傷口。
[0192] 術語"急性傷口"或"常規傷口"是指經歷常規傷口愈合修復的傷口。
[0193] 術語"傷口的進展"將被理解為意指傷口的惡化，例如，在大小和/或深度和/或進 展上增加至更高級階段和/或感染的發展。
[0194] 本公開內容的上下文中的術語"愈合"是從施用化合物直到顯著或完全的傷口閉 合(完全傷口收縮)的時間的提升或加速。
[0195] 術語"組織"是指人體中的細胞團，其一起形成特定的功能。組織包括但不限于皮 膚、軟骨和結締組織。
[0196] 術語"重組體"應被理解為意指人工遺傳重組的產物。因此，在包含抗體可變區的 重組蛋白的背景下，該術語不包括受試者體內天然存在的不是在B細胞成熟過程中出現的 天然重組的產物的抗體。然而，如果這樣的抗體是分離的，它應被認為是包含抗體可變區的 分離的蛋白質。同樣地，如果編碼蛋白質的核酸是分離的并且使用重組手段表達，則所得的 蛋白質是包含抗體可變區的重組蛋白。重組蛋白還包括當它在細胞、組織或受試者（例如， 在其中表達它）中時通過人工重組手段表達的蛋白質。
[0197] 術語"蛋白質"應被認為包括單個多肽鏈，即，一系列通過肽鍵連接的連續氨基酸 或一系列共價或非共價連接到彼此的多肽鏈(即，多肽復合物）。例如，該多肽鏈系列可以使 用適當的化學或二硫鍵共價連接。非共價鍵的實例包括氫鍵、離子鍵、范德華力以及疏水相 互作用。
[0198] 術語"多肽"或"多肽鏈"將從前述段落理解為意指一系列通過肽鍵連接的連續氨 基酸。
[0199] 本領域技術人員將意識到"抗體"通常被認為是包含由多個多肽鏈(例如包含輕鏈 可變區(Vl)的多肽和包含重鏈可變區(Vh)的多肽)構成的可變區的蛋白質。抗體還通常包括 恒定結構域，其中的一些可以被排列成恒定區，其在重鏈的情況下包括恒定片段或可結晶 的片段(Fe) Jh和Vl相互作用以形成包含抗原結合區的Fv，其能夠特異性地結合一種或幾種 密切相關的抗原。一般情況下，來自哺乳動物的輕鏈是κ輕鏈或λ輕鏈并且來自哺乳動物的 重鏈是α，δ， ε，γ或μ。抗體可以是任何類型（例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、種類（例 如，IgG 1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA^IgA 2)或亞類。術語"抗體"還包括人源化抗體，靈長類動物 化抗體，人抗體，類人源化的抗體和嵌合抗體。
[0200] 術語"全長抗體"，"完整抗體"或"完全抗體"可互換使用來指處于其基本上完整形 式的抗體，而不是抗體的抗原結合片段。具體地，完全抗體包括具有包含Fe區的重鏈和輕鏈 的那些抗體。恒定結構域可以是野生型序列恒定結構域(例如，人野生型序列恒定結構域） 或其氨基酸序列變體。
[0201] 如本文中所使用的，"可變區"是指如本文所定義的能夠特異性結合抗原的抗體的 輕鏈和/或重鏈的部分，并且包括互補決定區（⑶R)(即，⑶Rl，⑶R2和⑶R3)和構架區(FR)的 氨基酸序列。示例性可變區包括三個或四個FR(例如，FR1、FR2、FR3和任選地FR4)以及三個 CDR。在來源于IgNAR的蛋白質的情況下，該蛋白質可能缺少CDR2 Jh是指重鏈的可變區。Vl是 指輕鏈的可變區。
[0202] 如本文所用，術語"互補決定區"（同義詞：CDR;即，CDR1、CDR2和CDR3)是指抗體可 變結構域的氨基酸殘基，它的存在是抗原結合所必需的。每個可變結構域通常具有鑒定為 CDRl、CDR2和CDR3的3個CDR區域。分配給CDR和FR的氨基酸位置的定義可以根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health，Bethesda，Md. ,1987和1991或本公開內容的執行中的其它編號系統，例如，Chothia and Lesk J.Mol Biol .196:901-917,1987;Chothia等人Nature 342,877-883,1989;和/或 Al-Lazikani 等人，J Mol Biol 273:927-948,1997 的典型編號系統；Lefranc 等人， Devel .And Compar .Immunol. ,27 :55-77,2003 的IMGT編號系統；或 Honnegher and Plii kthun J .Mol .Biol. ,309:657-670,2001 的 AHO 編號系統。
[0203] "框架區"（FR)是非⑶R殘基的那些可變結構域殘基。
[0204] 如本文所用，術語"Fv"應被認為意指任何蛋白質，可包含多個多肽或單個多肽，其 中I和Vh締合并形成具有抗原結合位點的復合體，即，能夠特異性地結合抗原。形成抗原結 合位點的Vh和Vl可以是在單個多肽鏈中或在不同的多肽鏈中。此外，本公開內容的Fv(以及 本公開內容的任何蛋白質）可以具有結合或不結合相同抗原的多個抗原結合位點。該術語 應理解為包括直接來源于抗體的片段，以及對應于使用重組手段產生的這樣的片段的蛋白 質。在一些實例中，Vh未連接至重鏈恒定結構域（Ch)I和/或Vl未連接至輕鏈恒定結構域 (Cl)。含有多肽或蛋白質的示例性Fv包括Fab片段，Fab'片段，F(ab'）片段，scFv，雙抗體，三 鏈抗體，四鏈抗體或更高階的復合物，或者連接于恒定區或其結構域例如Ch2或Ch3結構域的 任何前述抗體，例如，微型抗體。"Fab片段"由抗體的一價抗原結合片段組成，并可以通過用 木瓜蛋白酶消化完全抗體來產生以得到由完整的輕鏈和重鏈的一部分組成的片段，或可使 用重組方法來產生。抗體的"Fab '片段"可以通過用胃蛋白酶處理完全抗體，隨后還原，以得 到由完整的輕鏈和包含Vh和單個恒定結構域的重鏈的一部分的分子來獲得。兩個Fab'片段 通過以這種方式處理的抗體來獲得。Fab'片段還可以通過重組方法產生。抗體的"F(ab'）2 片段"由通過兩個二硫鍵保持在一起的兩個Fab '片段的二聚體組成，并且通過用胃蛋白酶 處理完全抗體分子得到，且沒有隨后的還原。"Fab2"片段是包括使用例如亮氨酸拉鏈或Ch3 結構域連接的兩個Fab片段的重組片段。"單鏈Fv"或"scFv"是包含抗體的可變區片段(Fv) 的重組分子，其中輕鏈的可變區和重鏈的可變區通過合適的柔性多肽接頭共價連接。
[0205] 如本文所用，在提及蛋白質或其抗原結合位點與抗原的相互作用時，術語"結合" 意指相互作用取決于特定結構(例如，抗原決定簇或表位)在抗原上的存在。例如，抗體識別 并結合特定蛋白質結構，而不一般性地結合蛋白。如果抗體結合表位"A"，含有表位"A"（或 游離的，未標記的"A"）的分子的存在會在含有標記的"A"和蛋白質的反應中降低與抗體結 合的標記的"A"的量。
[0206] 如本文所用，術語"特異性結合"或"特異結合"應被認為意指本公開內容的蛋白質 比它與可選擇的抗原或細胞更頻繁、更迅速、以更大的持續時間和/或以與特定抗原或表達 其的細胞的更大的親和力反應或締合。例如，相比于蛋白質結合其它生長因子(例如，VEGF-A)或通過多反應性天然抗體（即，通過已知結合天然發現于人中的多種抗原的天然存在的 抗體)共同識別的抗原，該蛋白質以實質上更大的親和力（例如，20倍或40倍或60倍或80倍 至100倍或150倍或200倍)結合VEGF-B。通常，但不一定地，提及結合意指特異性結合，每個 術語應被理解為提供對其它術語的明確支持。
[0207]如本文中所使用的，術語"中和"應被認為意指蛋白質能夠通過VEGF-Rl阻斷、減少 或阻止細胞中的VEGF-B信號傳導。用于測定中和的方法是本領域已知的和/或描述于本文 中。
[0208] 如本文中所使用的，術語"預防"、"防止"或"阻止"包括施用本公開內容的化合物， 從而阻止或阻礙病況的至少一種癥狀的發展。
[0209] 如本文中所使用的，術語"治療"、"處理"或"療法"包括施用本文描述的蛋白質，從 而減少或消除指定疾病或病況的至少一種癥狀，或減緩疾病或病況的進展。
[0210] 如本文所使用的，術語"受試者"應被認為意指任何動物，包括人，例如哺乳動物。 示例性的受試者包括但不限于人和非人靈長類動物。例如，受試者是人。
[0211] 傷口的治療
[0212]本公開內容提供了用于通過施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物加速和/或改善 和/或增強傷口愈合的方法。例如，方法包括將化合物施用至受試者的傷口或全身性施用至 受試者。
[0213]在一個實例中，受試者具有傷口。傷口可以是慢性、急性或常規的傷口。在一個實 例中，傷口是慢性的。在一個實例中，被治療的傷口是如表1中所示的OA階段傷口或IA階段 傷口或2A階段傷口或3A階段傷口。在一個實例中，被治療的傷口是如表1中所示的OB階段傷 口或IB階段傷口或2B階段傷口或3B階段傷口。在一個實例中，被治療的傷口是如表1中所示 的OC階段傷口或IC階段傷口或2C階段傷口或3C階段傷口。在一個實例中，被治療的傷口是 如表1中所示的OD階段傷口或ID階段傷口或2D階段傷口或3D階段傷口。
[0214]表1:傷口階段(通過Texas傷口分類系統定義）
[0216] 在一個實例中，受試者患有受感染的和/或缺血的傷口。
[0217] 在一個實例中，傷口是全層傷口。
[0218] 在一個實例中，傷口是糖尿病性潰瘍，例如，糖尿病足部潰瘍。糖尿病性潰瘍可以 使用表1所示的系統分類。在另一個實例中，潰瘍根據如表2所示的Wagner潰瘍分類系統分 類。
[0219] 表2 = Wagner潰瘍分類系統
[0221] 糖尿病足部潰瘍的一些風險因素的實例包括周圍神經病，其影響足部的運動和感 覺功能，受限的關節活動，足畸形，足壓力分布異常，反復的輕微創傷，和受損的視敏度。周 圍感覺神經病是主要因素。約45 % -60 %的所有糖尿病性潰瘍是神經性的，而高達45 %既有 神經性又有缺血性成分。伴隨著無感覺的足，患者不能夠感知在每日生活的步行和活動期 間由例如匹配不良的鞋引起的對足部的反復損傷。神經病與行走的生物力學改變組合導致 反復的鈍挫傷和異常高應力載荷分布到足的易受傷害部分，從而導致胼胝形成和皮膚侵 蝕。潰瘍形成后，它往往是緩慢愈合的，可以繼續擴大，提供了局部或全身感染的機會，并且 需要全面的醫療和手術護理以促進愈合。
[0222] 在一個實例中，傷口在施用本文描述的化合物前存在于或已經存在于受試者上至 少約2周。在一個實例中，傷口在施用本文描述的化合物前存在于或已經存在于受試者上至 少約4周。在一個實例中，傷口在施用本文描述的化合物前存在于或已經存在于受試者上至 少約6周。
[0223]本公開內容的方法還適用于正在經歷或已經經歷了治療的受試者，其中所述治療 延遲或提供無效傷口愈合。治療可以包括，但不限于，用藥、輻射、導致免疫系統抑制的治療 等。在一個實例中，受試者具有第二病況，其中所述第二病況延遲或提供無效傷口愈合。第 二病況包括但不限于，例如，糖尿病，周圍血管疾病，感染，自身免疫疾病或膠原血管疾病， 導致免疫系統抑制的疾病狀態等。
[0224] 定量分析可用于評估傷口愈合，例如，測定傷口面積的％減少，或傷口完全閉合 (例如，通過例如皮膚閉合而無引流或敷料需要來測量）。傷口面積在治療之前、期間和之后 通過本領域技術人員已知的方法評估。例如，評估可以通過例如定量面積法、照片、物理檢 查等來測定。傷口面積可以在治療之前、期間和之后測定。在一個實例中，傷口面積可以通 過測量傷口長度L(以例如cm計的最長的邊到邊長度)和寬度W(以例如cm計的垂直于L的最 長的邊到邊寬度），并且將L乘W以獲得估計的表面積(cm)來評估。用于治療的傷口的大小可 以變化。在本發明的一個實例中，治療前的傷口面積為約〇. 4cm2或更多，或者約1.0 cm2或更 多，或在約0.4cm2和約IOcm2之間，或在約Icm 2和約IOcm2之間，或在約Icm2和約7cm2之間，或 在約Icm 2和約5cm2之間，或大于4.Ocm2。所述面積可以在清創之前或之后進行測量。
[0225] 傷口愈合的加速可通過傷口愈合的％加速和/或風險比進行描述。例如，當與對照 相比較時，化合物的施用加速傷口愈合大于50%，或等于或大于60%，等于或大于70%，等 于或大于74%，等于或大于75%，等于或大于80%，等于或大于85%，等于或大于90%，等于 或大于95%，等于或大于100%，等于或大于110%或更多。
[0226] 本公開內容的方法包括加速和/或改善和/或增強受試者群體中的傷口愈合。例 如，方法包括將化合物施用給群體的受試者，其中所述化合物的施用導致群體中與對照相 比大于10% (或大于12%，或14%，或15%，或17%，或20%，或25%，或30%，或33%，或 35%，或40%，或45%，或50%或更多）的傷口愈合改善。
[0227] 本公開內容還提供了用于減少傷口（或潰瘍）的復發的方法。例如，方法包括向受 試者施用化合物，以使得潰瘍復發的發病率降低。
[0228] 還提供了用于降低例如處于發展傷口（例如，慢性傷口）的風險中的將要經歷手術 (當將誘發傷口時）的受試者中的傷口的嚴重性的方法。
[0229] 在替代實例中，本公開內容提供了用于減少由受試者中的傷口引起的結疤的方 法，該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0230] 在其它替代實例中，本公開內容提供用于預防傷口的形成（即，新的傷口）的方法， 該方法包括向受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。
[0231] VEGF-B信號傳導抑制劑
[0232] 包含抗體可變區的蛋白質
[0233] 示例性的VEGF-B信號傳導抑制劑包括抗體可變區，例如是結合VEGF-B和中和 VEGF-B信號傳導的抗體或抗體片段。
[0234] 在一個實例中，抗體可變區特異性結合VEGF-B。
[0235] 合適的抗體和包含其可變區的蛋白質在本領域中是已知的。
[0236] 例如，抗VEGF-B抗體及其片段描述于W02006/012688中。
[0237] 在一個實例中，抗VEGF-B抗體或其片段是競爭性抑制2H10與VEGF-B的結合的抗體 或其抗原結合片段。在一個實例中，抗VEGF-B抗體或其片段是抗體2H10或其嵌合的、CDR移 植的或人源化形式或其抗原結合片段。在這方面，抗體2H10包含含有SEQ ID NO:3所示的序 列的Vh和含有SEQ ID NO:4所示的序列的Vl。這種抗體的示例性的嵌合和人源化形式描述于 W02006/012688 中。
[0238] 在一個實例中，抗VEGF-B抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:5所示的序列的Vh和 含有SEQ ID NO:6所示的序列的Vl的抗體。
[0239] 在一個實例中，抗VEGF-B抗體或其片段是競爭性抑制4E12與VEGF-B的結合的抗體 或其抗原結合片段。在一個實例中，抗VEGF-B抗體或其片段是抗體4E12或其嵌合的、CDR移 植的或人源化形式或其抗原結合片段。在這方面，抗體4E12包含含有SEQ ID NO:7所示的序 列的Vh和含有SEQ ID NO:8所示的序列的Vl。
[0240] 在一個實例中，所述化合物是包含抗體4E12的人源化可變區的蛋白質。例如，該蛋 白質包括可變區，其包含抗體4E12的Vh和/或Vl的互補性決定區（CDR)。例如，該蛋白質包含：
[0241] (^乂卜其包含：
[0242] (a)包含SEQ ID N0:7的氨基酸25-34所示的序列的CDRl;
[0243] (b)包含SEQ ID N0:7的氨基酸49-65所示的序列的CDR2;和
[0244] (c)包含SEQ ID N0:7的氨基酸98-105所示的序列的CDR 3;和
[0245] (ii)VL，其包含：
[0246] (a)包含SEQ ID N0:8的氨基酸24-34所示的序列的CDRl;
[0247] (b)包含SEQ ID N0:8的氨基酸50-56所示的序列的CDR2;和
[0248] (c)包含SEQ ID N0:8的氨基酸89-97所示的序列的CDR3。
[0249] 在一個實例中，抗VEGF-B抗體或其片段是競爭性抑制2F5與VEGF-B的結合的抗體 或其抗原結合片段。在一個實例中，抗VEGF-B抗體或其片段是抗體2F5或其嵌合的、CDR移植 的或人源化形式或其抗原結合片段。在這方面，抗體2F5包含含有SEQ ID NO:9所示的序列 的Vh和含有SEQ ID NO: 10所示的序列的Vl。
[0250] 在一個實例中，所述化合物是包含抗體2F5的人源化可變區的蛋白質。例如，該蛋 白質包括可變區，其包含抗體2F5的Vh和/或Vl的互補性決定區（CDR)。例如，該蛋白質包含：
[0251] (土八卜其包含：
[0252] (a)包含SEQ ID N0:9的氨基酸25-34所示的序列的CDRl;
[0253] (b)包含SEQ ID N0:9的氨基酸49-65所示的序列的CDR2;和
[0254] (c)包含SEQ ID N0:9的氨基酸98-107所示的序列的CDR 3;和
[0255] (ii)VL，其包含：
[0256] (a)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸24-34所示的序列的CDRl;
[0257] (b)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸50-56所示的序列的CDR2;和
[0258] (c)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸89-96所示的序列的CDR3。
[0259] 在另一實例中，抗體和包含其可變區的蛋白利用標準方法產生，例如，如在本領域 中已知的或本文中簡單地描述的方法。
[0260] 基于免疫的方法
[0261] 為了產生抗體，將任選地與任何合適的或期望的佐劑和/或藥學上可接受的載體 配制的VEGF-B或其表位攜帶片段或部分或其修飾形式或編碼其的核酸（"免疫原"）以可注 射組合物的形式施用至受試者(例如，非人動物受試者，例如，小鼠，大鼠，雞等）。示例性非 人動物是哺乳動物，例如鼠動物(例如，大鼠或小鼠）。注射可以是鼻內，肌肉內，皮下，靜脈 內，皮內，腹膜內，或通過其它已知的途徑。任選地，多次施用免疫原。用于制備和表征抗體 的手段是本領域已知的（見，例如，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。用于在小鼠中產生抗VEGF-B抗體的方法描述于W02006/012688 中。
[0262] 多克隆抗體的產生可以通過在免疫后在不同點采集免疫動物的血液來監測。如果 需要實現所需的抗體滴度，可以給予第二增強注射。重復增強和滴定的過程直到實現合適 的滴度。當獲得期望水平的免疫原性時，對經免疫的動物放血，分離和儲存血清，和/或將所 述動物用于產生單克隆抗體(mAb)。
[0263] 單克隆抗體是由本公開內容考慮的示例性的抗體。通常，單克隆抗體的產生包括 用免疫原在足以刺激抗體產生細胞的條件下免疫受試者(例如，嚙齒類動物，例如，小鼠或 大鼠）。在一些實例中，將經遺傳工程化以表達人抗體而不表達鼠抗體的小鼠免疫以產生抗 體（例如，如PCT/US2007/008231 和/或Lonberg等人，Nature 368(1994) :856-859中描述 的）。免疫后，將抗體產生性體細胞(例如，B淋巴細胞）與永生細胞例如永生骨髓瘤細胞融 合。用于產生這樣的融合細胞（雜交瘤）的各種方法在本領域中是已知的并且描述于例如 Kohler and Milstein,Nature 256,495-497,1975中。然后可在足以用于抗體產生的條件 下培養雜交瘤細胞。
[0264] 本公開內容考慮了用于產生抗體的其它方法，例如，ABL-MYC技術(如例如描述于 Largaespada等人，Curr .Top.Microbiol · Immunol，166,91-96· 1990中的）〇
[0265] 基于文庫的方法
[0266] 本公開內容還包括篩選抗體或包含其抗原結合結構域(例如，包含其可變區）的蛋 白質的文庫來鑒定VEGF-B結合抗體或包含其可變區的蛋白質。
[0267] 本公開內容考慮的文庫的實例包括原態文庫Cnalfvelibrary)(來自未攻擊的受 試者），經免疫的文庫(來自用抗原免疫的受試者)或合成文庫。編碼抗體或其區域(例如，可 變區）的核酸通過常規技術(例如公開于Sambrook and Russell，eds,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd Ed,vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 中的)克隆，并用于使用本領域已知的方法編碼和展示蛋白質。用于產生蛋白質文庫的其它 技術在例如US6300064(例如，Morphosys AG的HuCAL文庫）；US5885793;US6204023; US6291158;或 US6248516 中描述。
[0268] 根據本公開內容的蛋白質可以是可溶的分泌蛋白質或可作為細胞或顆粒(例如， 噬菌體或其它病毒，核糖體或孢子)的表面上的融合蛋白呈現。各種展示文庫形式是本領域 已知的。例如，文庫是體外展示文庫（例如，核糖體展示文庫，共價展示文庫或mRNA展示文 庫，例如，如在US7270969中描述的）。在又一個實例中，展示文庫是噬菌體展示文庫，其中包 含抗體的抗原結合結構域的蛋白質被表達在噬菌體上，例如，如在US6300064;US5885793; US6204023;US6291158;或US6248516中描述的。其它噬菌體展示方法是本領域已知的并且 由本公開內容考慮。類似地，細胞展示的方法由本公開內容考慮，例如，細菌展示文庫，例 如，如在US5516637中描述的；酵母展示文庫，例如，如在US6423538中描述的或哺乳動物展 示文庫。
[0269] 用于篩選展示文庫的方法是本領域已知的。在一個實例中，本公開內容的展示文 庫使用親和純化篩選，例如，如在Scopes (In : Protein pur if i cat ion: principles and practice ,Third Edition ,Springer Ver lag, 1994)中描述的。親和純化的方法通常牽涉使 由文庫展示的包含抗原結合結構域的蛋白質與靶抗原（例如，VEGF-B)接觸和隨后洗滌、洗 脫保持結合至抗原的那些結構域。
[0270] 如果需要，將通過篩選鑒定的任何可變區或scFv容易地修飾成完整的抗體。用于 修飾或重新設計可變區或scFv成完整抗體的示例性方法例如描述于Jones等人，J Immunol Methods · 354:85-90，2010;或Jostock等人，J Immunol Methods，289:65-80，2004中。可替 代地，或另外地，使用標準的克隆方法，例如，如描述于Ausube 1等人（In : Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047150338,1987)，和/或 (Sambrook等人（In:Molecular Cloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratories ,New York ,Third Edition 2001)中的。
[0271] 去免疫化的、嵌合的、人源化的、類人源化的、靈長類動物化的和人蛋白質
[0272] 本公開內容的蛋白質可以是人源化蛋白質。
[0273] 術語"人源化蛋白質"應被理解為是指包含人樣可變區的蛋白質，所述人樣可變區 包括移植到或插入來自人抗體的FR的來自非人類物種(例如，小鼠或大鼠或非人靈長類動 物)的抗體的CDR(這種類型的抗體也稱為"CDR-移植的抗體"）。人源化蛋白質還包括其中人 蛋白質的一個或多個殘基被一個或多個氨基酸置換修飾和/或人蛋白質的一個或多個FR殘 基被相應的非人殘基取代的蛋白質。人源化蛋白質還可以包括在人抗體和在非人抗體中均 未發現的殘基。蛋白質的任何額外的區域(例如，Fc區)通常是人的。人源化可以使用本領域 已知的方法（例如，US5225539，US6054297，US7566771或US5585089)執行。術語"人源化蛋白 質"還包括超人源化蛋白，例如，如在US7732578中描述的。
[0274] 本公開內容的蛋白質可以是人蛋白質。如本文所用的術語"人蛋白質"是指具有在 人中（例如在人種系或體細胞中）發現的可變抗體區域和任選地恒定抗體區域或來自使用 這樣的區域產生的文庫的蛋白質。"人"抗體可包括不是由人序列編碼的氨基酸殘基，例如 通過隨機或定點突變在體外引入的突變(特別是牽涉蛋白質的少量殘基例如蛋白質的1、2、 3、4或5個殘基中的保守置換或突變的突變）。這些"人抗體"并不一定需要作為人的免疫應 答的結果產生，相反，它們可以使用重組手段(例如，篩選噬菌體展示文庫）和/或通過包含 編碼人抗體恒定區和/或可變區的核酸的轉基因動物(例如，小鼠）和/或使用定向選擇(例 如，如在US5565332中描述的）產生。該術語還包括這樣的抗體的親和成熟的形式。對于本公 開內容的目的，人蛋白質還將被認為是包括含有來自人抗體的FR或包含來自人FR的共有序 列的序列的FR并且其中一個或多個CDR是隨機或半隨機的的蛋白質，例如，如在US6300064 和/或US6248516所述的。
[0275] 本公開內容的蛋白質可以是類人源化的蛋白質。術語"類人源化的蛋白質"是指通 過在W02007/019620中描述的方法制備的蛋白質。類人源化的蛋白質包括抗體的可變區，其 中所述可變區包含來自新世界靈長類動物抗體可變區的FR和來自非新世界靈長類動物抗 體可變區的CDR。例如，類人源化的蛋白質包括抗體的可變區，其中所述可變區包含來自新 世界靈長類動物抗體可變區的FR和來自小鼠或大鼠抗體的CDR。
[0276] 本公開內容的蛋白質可以是靈長類動物化蛋白質。"靈長類動物化蛋白質"包括來 自在非人靈長類動物(例如，食蟹猴)的免疫后產生的抗體的可變區。任選地，將非人靈長類 動物抗體的可變區連接到人恒定區以產生靈長類動物化抗體。用于產生靈長類動物化抗體 的示例性的方法在US6113898中描述。
[0277] 在一個實例中，本公開內容的蛋白質是嵌合蛋白。術語"嵌合蛋白"是指其中抗原 結合結構域來自特定物種(例如，鼠，例如小鼠或大鼠）或屬于特定抗體種類或亞類的蛋白 質，而該蛋白質的其余部分來自來源于另一物種(例如，人或非人靈長類動物)或屬于另一 抗體種類或亞類的蛋白質。在一個實例中，嵌合蛋白質是包含來自非人類抗體(例如，鼠抗 體）的VH和/或VL的嵌合抗體，抗體的剩余區域是來自人抗體。這種嵌合蛋白質的產生在本 領域中是已知的，并且可以通過標準手段來實現（例如，在US6331415;US5807715; US4816567 和 US4816397 中描述的）。
[0278] 本公開內容還包括去免疫化的蛋白質，例如，如在W02000/34317和W02004/108158 中描述的。去免疫化的抗體和蛋白質具有移除的一個或多個表位例如B細胞表位或T細胞表 位(即，突變的）以由此降低受試者將產生針對抗體或蛋白質的免疫應答的可能性。
[0279] 包含抗體可變區的其它蛋白質
[0280] 本公開內容還考慮了包含抗體的可變區或抗原結合結構域的其它蛋白質，例如： [0281 ] ( i )單結構域抗體，其是包含抗體的Vh或I的全部或部分的單個多肽鏈(參見，例 如，US6248516);
[0282] (ii)雙抗體、三鏈抗體和四鏈抗體，例如如US5844094和/或US2008152586中描述 的；
[0283] (i i i) scFv，例如，如在 US5260203 中描述的；
[0284] (iv)微型抗體，例如，如在US5837821中描述的；
[0285] (V)如在US5731168中描述的"鑰和孔"雙特異性蛋白質；
[0286] (vi)異源綴合蛋白質，例如，如在US4676980中描述的；
[0287] (vii)使用化學交聯劑產生的異源綴合蛋白質，例如，如在US4676980中描述的；
[0288] (vi ii )Fab ' -SH片段，例如，如在Shalaby等人，J · Exp .Med ·，175: 217-225，1992中 描述的;或
[0289] (ix)Fab3(例如，如在 EP19930302894 中描述的）。
[0290] 恒定結構域融合體
[0291] 本公開內容包括包含抗體的可變區和恒定區或Fc或其結構域例如Ch2和/或Ch3結 構域的蛋白質。合適的恒定區和/或結構域將對于本領域技術人員是明顯的和/或這樣的多 肽的序列可容易地從公共可得的數據庫獲得。Kabat等人還提供了一些合適的恒定區/結構 域的描述。
[0292] 恒定區和/或其結構域可用于提供生物活性，例如，二聚化，延長的血清半衰期例 如通過與FcRn(新生兒Fc受體）結合，抗原依賴性細胞毒性(ADCC)，補體依賴性細胞毒性 (CDC)，抗原依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
[0293] 本公開內容還考慮了包含突變的恒定區或結構域的蛋白質，例如，如在 US7217797;US7217798;或 US20090041770(具有增加的半衰期）或 US2005037000(增加的 ADCC)中描述的。
[0294] 穩定化的蛋白質
[0295 ]本公開內容的中和蛋白質可包含I gG4恒定區或穩定化的I gG4恒定區。術語"穩定 化的IgG4恒定區"將被理解為意指已被修飾以減少Fab臂交換或經歷Fab臂交換的傾向或半 抗體形成或形成半抗體的傾向的I gG4恒定區。"Fab臂交換"指的是針對人IgG4的蛋白質修 飾類型，其中IgG4重鏈和連接的輕鏈(半分子)被交換為另一個IgG4分子的重鏈-輕鏈對。因 此，IgG4分子可以獲取識別兩個不同抗原的兩個不同的Fab臂（導致雙特異性分子）Aab臂 交換在體內天然地發生，并且可以通過純化的血細胞或還原劑例如還原的谷胱甘肽來體外 誘導。"半抗體"在IgG4抗體解離以形成各含有單個重鏈和單個輕鏈的兩個分子時形成。 [0 296] 在一個實例中，穩定化的IgG4恒定區包含根據Kabat系統(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987和/或1991)的鉸鏈區的241位脯氨酸。這個位置對應 于根據EU編號系統（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services，2001和 Edelman等人，Proc · Natl · Acad · USA，63，78-85，1969)的鉸鏈區的位置228。在人IgG4中，該 殘基通常是絲氨酸。在絲氨酸被脯氨酸取代后，IgG4鉸鏈區包含序列CPPC。在這方面，本領 域技術人員將知道，"鉸鏈區"是賦予抗體的兩個Fab臂移動性的連接Fc和Fab區的抗體重鏈 恒定區的富含脯氨酸的部分。鉸鏈區包括牽涉重鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。它通常被定 義為根據Kabat編號系統的從人IgGl的Glu226延伸到Pro243。其它IgG同種型的鉸鏈區可以 通過將形成重鏈間二硫(S-S)鍵的第一和最后一個半胱氨酸殘基置于相同的位置來與IgGl 序列對齊(參見例如W02010/080538)。
[0297] 其它基于蛋白質的VEGF-B信號傳導抑制劑
[0298] 可能干擾VEGF-B與其受體的生產性相互作用的其它蛋白質包括突變的VEGF-B蛋 白質。
[0299] 在一個實例中，所述抑制劑是包含結合VEGF-B(以及，例如，不顯著結合VEGF-A)的 VEGF-Rl的一個或多個結構域的可溶性蛋白。在一個實例中，可溶性蛋白還包含抗體例如 I gG 1抗體的恒定區。例如，可溶性蛋白還包含抗體例如I gG 1抗體的Fc區和任選地鉸鏈區。
[0300] 在一個實例中，蛋白抑制劑是抗體模擬物，例如，包含以類似于抗體的方式結合靶 蛋白的可變區的蛋白質支架。示例性抗體模擬物的描述如下。
[0301] 免疫球蛋白和免疫球蛋白片段
[0302] 本公開內容的化合物的實例是包含免疫球蛋白例如T細胞受體或重鏈免疫球蛋白 (例如，IgNAR，胳駝科動物抗體)的可變區的蛋白質。
[0303] 重鏈免疫球蛋白
[0304] 重鏈免疫球蛋白與許多其它形式的免疫球蛋白（例如，抗體)在結構上的不同之處 在于它們包含重鏈，但不包含輕鏈。因此，這些免疫球蛋白也稱作"僅重鏈抗體"。重鏈免疫 球蛋白發現于例如駱駝科動物和軟骨魚中（也稱為IgNAR)。
[0305] 存在于天然存在的重鏈免疫球蛋白中的可變區通常稱為駱駝科動物Ig中的"Vhh結 構域"和IgNAR中的V-NAR，以從存在于常規的4-鏈抗體中的重鏈可變區（其被稱為"Vh結構 ?或"）和從存在于常規4-鏈抗體中的輕鏈可變區（其被稱為"I結構域"）來區分它們。
[0306] 重鏈免疫球蛋白不需要輕鏈的存在來以高親和力和高特異性結合相關抗原。這意 味著，單結構域結合片段可以來源于重鏈免疫球蛋白，其容易表達并且通常是穩定和可溶 的。
[0307] 來自駱駝科動物的重鏈免疫球蛋白及其可變區的一般描述和用于其生產和/或分 離和/或使用的方法特別記載于下列參考文獻W094/04678，W097/49805和WO 97/49805中。
[0308] 來自軟骨魚的重鏈免疫球蛋白及其可變區的一般描述和用于其生產和/或分離 和/或使用的方法除其它以外發現于W02005/118629中。
[0309] V-樣蛋白
[0310] 本公開內容的化合物的實例是T細胞受體。T細胞受體具有組合成相似于抗體的Fv 模塊的結構的兩個V-結構域C3Novotny等人,Proc Natl Acad Sci USA 88:8646-8650,1991 描述了 T細胞受體的兩個V-結構域(稱為α和β)可以如何融合并表達為單鏈多肽，并且進一 步地，如何改變表面殘基以降低類似于抗體scFv的疏水性。描述單鏈T細胞受體或包含兩個 V-α和V-β結構域的多聚T細胞受體的產生的其它出版物包括W01999/045110或W02011/ 107595。
[0311]包含抗原結合結構域的其它非抗體蛋白質包括具有V-樣結構域的蛋白質，其通常 是單體的。包含這樣的V-樣結構域的蛋白質的實例包括CTLA-4、⑶28和IC0S。包含這樣的V-樣結構域的蛋白質的進一步的公開內容包括在W01999/045110中。
[0312] Adnectin
[0313]在一個實例中，本公開內容的化合物是adnectiruAdnectin基于人纖連蛋白的第 十纖連蛋白III型(1()Fn3)結構域，其中環區被改變以賦予抗原結合。例如，在1()Fn3結構域的 β-夾心的一個末端的三個環可以被工程改造以使Adnectin特異性識別抗原。進一步的細節 參見 US20080139791 或 W02005/056764。
[0314] Anticalin
[0315] 在進一步的實例中，本公開內容的化合物是anticaliruAnticalin來源于脂質運 載蛋白，其是運輸小的疏水性分子例如類固醇、膽素、類視黃醇和脂質的胞外蛋白家族。月旨 質運載蛋白具有剛性β折疊二級結構，其中在錐形結構的開口端具有多個環，其可被工程化 以結合抗原。這樣的工程改造的脂質運載蛋白被稱為antical in critical in的進一步描述 參見 US7250297B1 或 US20070224633。
[0316] 親和體
[0317] 在進一步的實例中，本公開內容的化合物是親和體。親和體是來源于金黃色葡萄 球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白A的Z結構域(抗原結合結構域）的支架，其可被工程 改造以結合抗原。Z結構域由約58個氨基酸的三螺旋束組成。已通過表面殘基的隨機化產生 了文庫。更多細節見EP1641818。
[0318] Avimer
[0319]在進一步的實例中，本公開內容的化合物是AvimerC3Avimer是來源于A-結構域支 架家族的多結構域蛋白。約35個氨基酸的天然結構域采用確定的二硫鍵合結構。通過由A-結構域家族展現的天然變異的重排產生多樣性。更多細節見W02002088171。
[0320] DARPin
[0321] 在進一步的實例中，本公開內容的化合物是設計的錨蛋白重復蛋白（DARPin)。 DARPin來源于錨蛋白，其是介導膜內在蛋白附著到細胞骨架的蛋白家族。單個錨蛋白重復 是由兩個α-螺旋和轉角組成的33殘基基序。它們可以通過在每個重復的第一 α-螺旋和β-轉角中隨機化殘基來工程改造以結合不同的靶抗原。它們的結合界面可通過增加模塊數量 來增加(親和力成熟的方法）。更多細節見US20040132028。
[0322]用于產生蛋白質的方法
[0323] 重組表達
[0324] 在重組蛋白質的情況下，可以將編碼其的核酸克隆到表達載體中，然后將其轉染 到否則不產生抗體的宿主細胞例如大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞諸 如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎（HEK)細胞或骨髓瘤細胞中。用于表達 本公開內容的蛋白質的示例性細胞是CHO細胞、骨髓瘤細胞或HEK細胞。實現這些目的的分 子克隆技術來本領域中是已知的，并且描述于例如Ausubel等人，（編輯），Current Protocols in Molecular BiologyjGreene Pub.Associates and Wiley-Interscience (1988，包括到目前為止的所有更新）或Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press( 1989)中。各種各樣的克隆和體外擴增方 法適合于重組核酸的構建。產生重組抗體的方法在本領域中也是已知的。見US4816567或 US5530101，
[0325] 在分離后，將核酸插入用于進一步克隆(DNA擴增)或用于在無細胞系統或細胞中 表達的表達構建體或表達載體中與啟動子可操作地連接。
[0326] 如本文所用，術語"啟動子"將在其最廣泛的背景下考慮，并且包括基因組基因的 轉錄調節序列，包括TATA盒或起始元件，其對于精確的轉錄起始是所需的，具有或不具有例 如響應于發育和/或外部刺激或以組織特異性方式改變核酸的表達的附加調節元件(例如， 上游激活序列，轉錄因子結合位點，增強子和沉默子）。在本上下文中，術語"啟動子"還用于 描述賦予、激活或增強其可操作地連接的核酸的表達的重組、合成或融合核酸或衍生物。示 例性啟動子可以含有一個或多個特異性調節元件的額外拷貝以進一步增強表達和/或改變 所述核酸的空間表達和/或時序表達。
[0327] 如本文所使用的，術語"可操作地連接"意指相對于核酸定位啟動子以使得核酸的 表達由該啟動子控制。
[0328] 用于在細胞中表達的許多載體是可用的。載體組件通常包括但不限于下述的一種 或多種：信號序列，編碼抗體的序列（例如，來源于本文所提供的信息），增強子元件，啟動 子，和轉錄終止序列。本領域技術人員將意識到用于抗體表達的合適序列。示例性信號序列 包括原核分泌信號（例如，pelB，堿性磷酸酶，青霉素酶，Ipp或熱穩定的腸毒素 II)，酵母分 泌信號(例如，轉化酶前導序列，α因子前導序列，或酸性磷酸酶前導序列）或哺乳動物分泌 信號(例如，單純皰疹gD信號）。
[0329] 在哺乳動物細胞中具有活性的示例性啟動子包括巨細胞病毒立即早期啟動子 (CMV-IE)，人延伸因子l-α啟動子(EFl)，小核RNA啟動子(Ula和Ulb)，α-肌球蛋白重鏈啟動 子，猿猴病毒40啟動子(SV40)，Rous肉瘤病毒啟動子(RSV)，腺病毒主要晚期啟動子，β-肌動 蛋白啟動子;包括CMV增強子/β-肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子或其活性片段的混合 調節元件。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40(C0S-7，ATCC CRL 1651)轉化的猴 腎CVl系；人胚腎系（亞克隆用于在懸浮培養中生長的293或293細胞）；幼倉鼠腎細胞(BHK， ATCC CCL 10);或中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。
[0330] 適合于在酵母細胞例如選自巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris )、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)的酵母細胞中表達的典型啟動子 包括但不限于，ADHl啟動子、GALl啟動子、GAL4啟動子、CUPl啟動子、PH05啟動子、nmt啟動 子，RPRl啟動子，或TEFl啟動子。
[0331] 用于將分離的核酸或包含其的表達構建體引入細胞用于表達的手段是本領域技 術人員已知的。用于給定細胞的技術依賴于已知的成功技術。用于將重組DNA引入細胞的手 段包括顯微注射、通過DEAE-葡聚糖介導的轉染、通過脂質體介導的轉染（例如，通過使用 lipofectamine(Gibco ,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco ,MD ,USA))、PEG介導的DNA攝取、電 穿孔和微粒轟擊例如通過使用DNA包被的媽或金顆粒(Agracetus Inc.，WI ,USA)等。
[0332] 用于產生抗體的宿主細胞可以在多種培養基中培養，取決于使用的細胞類型。諸 如Ham's FlO(Sigma)，最小必需培養基（（MEM)，（Sigma)，RPMl_1640(Sigma)和Dulbecco氏 改良的Eagle培養基（（DMEM)，Sigma)的商購可得培養基適于培養哺乳動物細胞。用于培養 本文所討論的其它細胞類型的培養基在本領域中是公知的。
[0333]蛋白質純化
[0334]在產生/表達后，將本公開內容的蛋白質使用本領域中已知的方法純化。這樣的純 化提供了基本上不含非特異性蛋白質、酸、脂質、碳水化合物等的本公開內容的蛋白質。在 一個實例中，蛋白質處于這樣的制劑中：其中超過約90 % (例如95 %，98 %或99 % )的制劑中 的蛋白質是本公開內容的蛋白質。
[0335] 肽純化的標準方法被用來獲得本公開內容的分離的蛋白質，包括但不限于各種高 壓(或高效)液相色譜(HPLC)和非HPLC多肽分離方案，例如大小排阻色譜，離子交換色譜，疏 水相互作用色譜，混合模式色譜，相分離方法，電泳分離，沉淀法，鹽溶/析法，免疫色譜，和/ 或其它方法。
[0336] 在一個實例中，親和純化可用于分離含有標記的融合蛋白。使用親和色譜分離蛋 白質的方法在本領域中是公知的，并且描述于例如Scopes (In: Prote in purification: principles and practice，Third Edition，Springer Verlag, 1994)中。例如，將結合至標 記(在多組氨酸標簽的情況下，這可以是例如鎳-NTA)的抗體或化合物固定在固體支持物 上。包含蛋白質的樣品隨后與固定的抗體或化合物在足夠用于發生結合的條件下接觸一定 時間。在洗滌以去除任何未結合或非特異性結合的蛋白質后，洗脫蛋白質。
[0337] 在包含抗體的Fc區的蛋白質的情況下，蛋白A或蛋白G或其修飾形式可以用于親和 純化。蛋白A可用于分離含有人γ1、γ2或γ4重鏈Fc區的純化蛋白。蛋白G推薦用于所有小 鼠 Fc同種型和人γ 3。
[0338] 基于核酸的VEGF-B信號傳導抑制劑
[0339] 在本公開內容的一個實例中，根據本公開內容的任何實例的如本文中所述的治療 和/或預防方法包括減少VEGF-B的表達。例如，這樣的方法涉及施用減少核酸的轉錄和/或 翻譯的化合物。在一個實例中，化合物為核酸，例如反義多核苷酸，核酶，PNA，干擾RNA， s i RNA或m i croRNA，
[0340] 反義核酸
[0341] 術語"反義核酸"應當被認為意指DNA或RNA或其衍生物(例如，LNA或PNA)或它們的 組合，其互補于編碼本公開內容的任何實例中的如本文所述的多肽的特定mRNA分子的至少 一部分，并且能夠干擾轉錄后事件例如mRNA翻譯。反義方法的使用在本領域中是已知的（參 見例如，Hartmann and Endres(editors) ,Manual of Antisense Methodology ,Kluwer (1999))。
[0342] 本公開內容的反義核酸將在生理條件下與靶核酸雜交。反義核酸包括對應于結構 基因或編碼區的序列或對應于實現對基因表達和剪接的控制的序列的序列。例如，反義核 酸可對應于編碼VEGF-B的核酸的靶向編碼區，或5 非翻譯區（UTR)或3 ' -UTR或這些的組 合。它可以與內含子序列部分互補，所述內含子序列可在轉錄期間或之后剪接掉，例如，僅 與靶基因的外顯子序列互補。反義序列的長度應為至少19個連續核苷酸，例如，編碼VEGF-B 的核酸的至少50個核苷酸，例如至少100、200、500或1000個核苷酸。可以使用互補于整個基 因轉錄物的全長序列。長度可以是100-2000個核苷酸。反義序列與靶向轉錄物的同一性程 度應為至少90%，例如95-100%。
[0343] 針對VEGF-B的示例性反義核酸描述于例如W02003/105754中。
[0344] 催化核酸
[0345] 術語"催化核酸"指的是DNA分子或含DNA的分子(本領域中也稱為"脫氧核酶"或 "DNAzyme"）或RNA或含RNA的分子(也稱為"核酶"或"RNAzyme"），其特異性識別獨特的底物 并且催化這種底物的化學修飾。催化核酸中的核酸堿基可以是堿基 U)〇
[0346] 通常地，催化核酸包含用于靶核酸的特異性識別的反義序列，和核酸切割酶促活 性(在此也稱為為"催化結構域"）。可用于本公開內容的核酶的類型是錘頭核酶和發夾核 酶。
[0347] RNA 干擾
[0348] RNA干擾(RNAi)可用于特異性抑制特定蛋白質的產生。不受理論的限制，該技術依 賴于包含與目標基因的mRNA(在此情況下是編碼VEGF-B的mRNA)或其部分基本上相同的序 列的dsRNA分子的存在。便利地，該dsRNA可以從重組載體宿主細胞中的單個啟動子產生，其 中有義和反義序列被不相關的序列側接，所述不相關序列使得有義和反義序列能夠雜交以 形成dsRNA分子，其中不相關序列形成環結構。用于本公開內容的合適的dsRNA分子的設計 和產生是在本領域技術人員能力范圍之內的，特別是考慮到W099/32619，W099/53050的， W099/49029和W001/34815。
[0349]雜交的有義和反義序列的長度應各自為至少19個連續的核苷酸，諸如至少30或50 個核苷酸，例如至少1〇〇,200,500或1000個核苷酸。可以使用對應于整個基因轉錄物的全長 序列。長度可以是100-2000個核苷酸。有義和反義序列與靶向的轉錄物的同一性程度應是 至少85%，例如，至少90%，例如，95-100%，
[0350] 示例性小干擾RNA( "siRNA"）分子包含與祀mRNA的約19-21個連續核苷酸相同的核 苷酸序列。例如，siRNA序列開始于雙核苷酸AA，包括約30-70%的GC-含量(例如，30-60%， 例如40-60%，例如約45%-55%)，并且與不是待將其引入的哺乳動物的基因組中的靶的任 何核苷酸序列不具有高的百分比同一性，例如如通過標準BLAST搜索測定的。減少VEGF-B的 表達的不例性siRNA可從Santa Cruz Biotechnology或Novus Biologicals商購。
[0351] 減少VEGF-B的表達的短發夾RNA (shRNA)在本領域中也是已知的并且可商購自 Santa Cruz Biotechnology。
[0352] 篩選測定
[0353]抑制VEGF-B信號傳導的化合物可以使用本領域中已知的技術(例如下文描述的） 鑒定。類似地，適合用于本文中描述的方法的VEGF-B信號傳導抑制劑的量可使用本領域中 已知的技術(例如下文描述的)確定或估計。
[0354] 中和測定
[0355] 對于結合VEGF-B和抑制信號傳導的化合物，可以使用中和測定。
[0356] 在一個實例中，中和測定涉及將VEGF-B與化合物在可檢測地標記的可溶性VEGF-Rl的存在或不存在下接觸或將可檢測地標記的VEGF-B與化合物在表達VEGF-Rl或可溶性 VEGF-R1的細胞的存在或不存在下接觸。然后評估結合VEGF-R1的VEGF-B的水平。結合的 VEGF-B在存在化合物時相較于不存在化合物時的水平降低表明所述化合物抑制VEGF-B與 VEGF-Rl的結合和因此抑制VEGF-B信號傳導。
[0357] 另一中和測定在W02006/012688中描述并且涉及將包含固定在固體支持物上的第 二I g_樣結構域的VEGF-Rl的片段與用化合物預溫育的亞飽和濃度的重組VEGF-B接觸。在洗 滌以去除未結合的蛋白后，將固定的蛋白質與抗VEGF-B抗體接觸并測定結合的抗體的量 (指示固定的VEGF-B)。相較于化合物不存在時的水平，減少結合的抗體的水平的化合物被 認為是VEGF-B信號傳導的抑制劑。
[0358] 在另一實例中，抑制VEGF-B信號傳導的化合物使用依賴VEGF-B信號傳導進行增殖 的細胞來鑒定，例如，在W02006/012688中所述的經修飾以表達摻入人促紅細胞生成素受體 的胞內結構域和VEGF-Rl的胞外結構域的嵌合受體的BaF3細胞。細胞在VEGF-B的存在下和 在化合物的存在或不存在下進行培養。然后使用標準方法評估細胞增殖，例如，集落形成測 定法、胸苷摻入或細胞增殖的另一種合適標記的攝取(例如，MTS染料還原測定）。在VEGF-B 的存在下降低增殖水平的化合物被認為是VEGF-B信號傳導的抑制劑。
[0359]化合物還可以使用標準方法來評估它們結合VEGF-B的能力。用于評估結合蛋白質 的方法是本領域中已知的，例如如在Scopes(In: Protein purif ication: principles and practice ,Third Edition ,Springer Ver lag, 1994)中描述的。這樣的方法通常涉及標記化 合物，并將其與固定的VEGF-B接觸。在洗滌以去除非特異性結合的化合物后，檢測標記和因 而結合的化合物的量。當然，可以固定化合物和標記VEGF-B。還可以使用平移型測定法。可 替代地，或另外地，可以使用表面等離子體共振測定法。
[0360] 表達測定
[0361] 減少或阻止VEGF-B的表達的化合物通過將細胞與化合物接觸和測定VEGF-B的表 達水平來鑒定。用于在核酸水平測定基因表達的合適的方法是本領域中已知并且包括，例 如，定量聚合酶鏈反應(qPCR)或微陣列測定法。用于在蛋白質水平測定表達的合適的方法 也是本領域中已知的并且包括，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)，熒光連接的免疫吸附測 定(FLISA)，免疫熒光或Western印跡。
[0362] 體外測定
[0363] 許多體外測定已被描述用于評估傷口愈合，包括劃痕或刮傷測定，其中內皮細胞 或成纖維細胞的培養物被刮掉以產生無細胞區域并且在存在或不存在化合物的情況下評 估該無細胞區域的閉合速率。
[0364] 其它測定法包括雞尿囊絨膜(CAM)模型。
[0365] 體內測定
[0366] 存在用于評估傷口愈合的許多體內測定法。例如，本發明人利用了其中使糖尿病 動物受傷(例如，產生全層傷口）并在存在或不存在測試化合物的情況下隨時間評估傷口閉 合的量和/或速率的模型。
[0367] 慢性傷口的其它模型包括，例如，兔耳"潰瘍"模型，皮瓣模型，壓力性潰瘍模型(例 如，通過使用鑄件施加壓力至灰狗的腿)或皮下阿霉素施用。
[0368] 急性傷口的模型包括，例如，切口模型，切除模型和燒傷模型。
[0369] 傷口可在患有其它缺陷例如代謝缺陷的動物中產生（例如，如本文所描述的或通 過施用鏈脲霉素）。
[0370] 傷口的各種模型描述于例如Demling等人，WOUNDS. 13(lSuppl A) :5-14,2001中和 慢性皮膚潰瘍和燒傷傷口的FDA指導手冊中。
[0371 ]藥物組合物和治療方法
[0372]抑制VEGF-B信號傳導的化合物（同義詞：活性成分）可用于胃腸外、表面 (topical)、口服或局部（local)施用，氣霧劑施用，或透皮施用，以用于預防或治療性處理。 在一個實例中，化合物胃腸外施用，例如皮下或靜脈內注射。
[0373]待施用的化合物的制劑將根據施用途徑和選擇的劑型（例如溶液，乳劑，膠囊)而 變化。包含待施用的化合物的適當的藥物組合物可在生理上可接受的載體中制備。對于溶 液或乳劑，合適的載體包括，例如，水溶液或醇/水溶液，乳劑或懸液，包括鹽水和緩沖介質。 胃腸外媒介物可包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏或固定的 油。各種合適的水性載體是本領域技術人員公知的，包括水、緩沖的水、緩沖鹽水、多元醇 (例如，甘油，丙二醇，液體聚乙二醇）、葡萄糖溶液和甘氨酸。靜脈內媒介物可以包括各種添 加劑、防腐劑或流體、營養物或電解質補充劑（一般參見，Remington's Pharmaceutical Science，16th Edit ion ,Mack, Ed. 1980)。組合物可任選地含有接近生理條件所需的藥學上 可接受的輔助物質，例如PH調節劑和緩沖劑以及毒性調節劑，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化 鉀、氯化鈣和乳酸鈉。可以根據本領域已知的凍干和重構技術將化合物凍干用于存儲并在 使用前在合適的載體中重構。
[0374] 在一個實例中，本公開內容提供了包含本公開內容的化合物的表面制劑。在一個 實例中，將化合物用適合用于表面制劑的載體配制。合適的載體包括適合于應用至一個或 多個皮膚層而不必需地應用至皮膚的外層，并且適合于在其它情況下使用的化合物或其混 合物。可用于本公開內容的表面組合物的載體和賦形劑通常不會以任何顯著的程度抑制活 性化合物的相關生物活性，例如，載體或賦形劑不會顯著抑制活性化合物關于VEGF-B信號 傳導的抑制活性。例如，載體或賦形劑提供緩沖活性以維持化合物在適當的PH，以從而發揮 其生物活性，例如，載體或賦形劑是磷酸緩沖鹽水。可替代地，或另外地，載體或賦形劑包含 增強抑制劑的攝取和/或增強抑制劑的透皮遞送的化合物。例如，載體或賦形劑包含皮膚滲 透促進劑，例如，二丙二醇和/或油醇。可替代地，或另外地，載體或賦形劑包含脂質體促進 細胞攝取。
[0375] 可替代地，或另外地，載體或賦形劑包含增強化合物的活性和/或減少化合物的抑 制的化合物，例如蛋白酶抑制劑和/或DNase抑制劑和/或RNase抑制劑，從而增強抑制劑的 穩定性。
[0376] 活性成分在所選擇的介質中的最佳濃度可以憑經驗、根據本領域技術人員已知的 程序確定，并且將取決于所需的最終藥物制劑。
[0377] 用于本公開內容的化合物的施用的劑量范圍足夠大以產生所需的效應。例如，組 合物包含治療或預防有效量的化合物。
[0378]如本文所用，術語"有效量"應被認為意指抑制/減少/阻止受試者中的VEGF-B信號 傳導的化合物的足夠量。本領域技術人員將意識到，這樣的量將取決于例如化合物和/或特 定受試者和/或進行治療的傷口的類型和/或嚴重程度而變化。因此，該術語不應被解釋為 將本公開內容限制到特定的量，例如，化合物的重量或數量。
[0379] 如本文所使用的，術語"治療有效量"應被認為意指增強或誘導傷口愈合的化合物 的足夠量。
[0380] 如本文所用，術語"預防有效量"應該認為意指預防或抑制或延緩傷口的進展的化 合物的足夠量。
[0381] 劑量不應大到引起不良副作用，例如高粘度綜合征、肺水腫、充血性心臟衰竭等。 通常，劑量將隨年齡、狀況、性別和疾病在患者中的程度而變化，并且可以由本領域的技術 人員來確定。劑量可在任何并發癥的情況下由個體醫師調整。
[0382] 劑量可以為約0 · lmg/kg至約300mg/kg，例如從約0 · 2mg/kg至約200mg/kg，例如從 約0.5mg/kg至約20mg/kg，每日施用一個或多個劑量，持續一天或數天。
[0383]在一些實例中，化合物以比后續(維持劑量)更高的初始(或裝載)劑量施用。例如， 化合物以約lmg/kg至約30mg/kg的初始劑量施用。然后化合物以約0.0001mg/kg至約lmg/kg 的維持劑量施用。維持劑量可以每7-35天施用，例如，每14天或21天或28天。
[0384] 在一些實例中，使用劑量遞增方案，其中化合物以比后續劑量所使用的較低的劑 量初始施用。該劑量方案可用于受試者最初遭受不良反應的情況下。
[0385] 在受試者不充分地響應治療的情況下，可一周施用多個劑量。可替代地，或另外 地，可以施用增加的劑量。
[0386] 受試者可以用化合物通過給予多于一次暴露或一組劑量來再次治療，例如進行化 合物的至少約兩次暴露，例如，約2至60次暴露，并且更特別地約2至40次暴露，最特別地約2 至20次暴露。
[0387] 在另一實例中，任何再次治療可以以確定的間隔給予。例如，隨后的暴露可以以不 同的間隔施用，例如約24-28周或48-56周或更久。例如，這樣的暴露以各自約24-26周或約 38-42周或約50-54周的間隔施用。
[0388] 本公開內容的方法還可以包括根據本公開內容的至少一種化合物與用于預防或 治療傷口和/或糖尿病的另一種治療有效藥劑的施用一起聯合施用。
[0389]在一個實例中，本公開內容的化合物與當前正在使用的或正在開發用于預防或治 療糖尿病的至少一中另外的已知化合物組合使用。這樣的已知化合物的實例包括但不限于 常見的抗糖尿病藥物，例如磺酰脲(例如格列齊特，格列吡嗪），二甲雙胍，格列酮(例如羅格 列酮，啦格列酮），餐后血糖釋放劑(例如瑞格列奈，那格列奈），阿卡波糖和胰島素(包括所 有天然存在的、合成的和修飾形式的胰島素，例如人、牛或豬來源的胰島素;懸浮在例如低 精蛋白鋅或鋅中的胰島素和衍生物例如賴谷胰島素，賴脯胰島素，賴脯胰島素魚精蛋白，甘 精胰島素，地特胰島素或門冬胰島素）。
[0390] 在一個實例中，本公開內容的化合物與已知可用于治療傷口的化合物一起施用。 例如，化合物與抗-感染劑（例如，抗生素或抗真菌劑）、VEGF-A、IGF-l、IGF-2、PDGF、TGF-i3、 EGF或干細胞(例如，間充質干細胞或祖細胞或內皮干細胞)組合施用。
[0391] 在一個實例中，本公開內容的化合物與另一種用于傷口的治療例如敷料和/或移 植物和/或負壓力一起施用。
[0392] 可與根據本公開內容的化合物共施用的藥劑的其它實例是皮質類固醇和免疫抑 制藥物。
[0393]如根據前文將明顯的，本公開內容提供了受試者的伴隨治療性處理的方法，包括 向有此需要的受試者施用有效量的第一化合物和第二化合物，其中所述試劑是本公開內容 的化合物(即，VEGF-B信號傳導的抑制劑），并且第二試劑用于傷口或糖尿病的預防或治療。
[0394]如本文所用，如在短語"伴隨治療性處理"中的術語"伴隨"包括在第二試劑的存在 下施用第一試劑。伴隨治療性處理方法包括其中第一、第二、第三或另外的試劑共同施用的 方法。伴隨治療性處理方法還包括其中第一或另外的試劑在第二或另外的試劑的存在下施 用的方法，其中所述第二或另外的試劑例如可已在先前施用。伴隨治療性處理方法可以由 不同的行為者逐步執行。例如，一個行為者可以給受試者施用第一試劑并且第二行為者可 以給受試者施用第二試劑，并且施用步驟可以在相同的時間或幾乎相同的時間或間隔遠的 時間執行，只要第一試劑(和/或另外的試劑)是在第二試劑(和/或另外的試劑)的存在下的 施用之后。行為者和受試者可以是相同的實體(例如人）。
[0395] 在一個實例中，本公開內容還提供了用于治療或預防受試者中的傷口的方法，所 述方法包括向受試者施用包含本公開內容的至少一種化合物的第一藥物組合物和包含一 種或多種另外的化合物的第二藥物組合物。
[0396] 在一個實例中，本公開內容的方法包括給具有傷口（例如，糖尿病性潰瘍)和接受 另一治療(例如，用于糖尿病)的受試者施用VEGF-B信號傳導的抑制劑。
[0397] 試劑盒和物質的其它組合物
[0398] 本公開內容的另一實例提供含有如上所述的可用于傷口的治療的化合物的試劑 盒。
[0399] 在一個實例中，試劑盒包括(a)包含任選地在藥學上可接受的載體或稀釋劑中的 如本文所述的抑制VEGF-B信號傳導的化合物的容器;和(b)具有用于治療受試者中的傷口 的說明的包裝說明書。
[0400] 根據本公開的這個實例，包裝說明書在容器上或與容器相關聯。合適的容器包括 例如瓶子，小瓶，注射器等。容器可以由各種材料諸如玻璃或塑料制成。容器容納或含有有 效治療傷口的組合物，并且可以具有無菌進入口（例如，容器可以是靜脈內溶液袋或具有可 通過皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶）。組合物中的至少一種活性劑是抑制VEGF-B信號傳 導的化合物。標簽或包裝說明書指示組合物用于治療適宜于治療(例如具有或易具有傷口） 的受試者，其中提供關于化合物和任何其它藥物的給藥量和間隔的具體指導。試劑盒可進 一步包括含有藥學上可接受的稀釋緩沖液(例如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸緩沖鹽水，林 格氏溶液和/或葡萄糖溶液)的附加容器。試劑盒可進一步包括從商業和用戶立場上所需的 其它物質，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
[0401]試劑盒任選地進一步包括包含第二藥物的容器，其中抑制VEGF-B信號傳導的化合 物是第一藥物，以及該制品還包括在包裝說明書上的用于使用有效量的第二藥物或用于傷 口的另一種治療來治療受試者的說明。第二藥物可以是上文所示的任何藥物。
[0402]本公開內容還提供了用于傷口的浸漬有或已在其中固定有(例如，可逆地固定在 其中）如本文所公開的化合物的敷料。示例性敷料包括繃帶，例如織物繃帶或塑料繃帶或紗 布繃帶或紗布敷料或創傷敷料。可替代地，或另外地，敷料包括支架，例如，可生物降解的支 架。例如，支架包含膠原蛋白和/或聚（乳)酸和/或聚（乙醇)酸和/或纖維蛋白。這樣的支架 可以是多孔的或無孔的或其混合物。這樣的支架的優點是，它們適應傷口的形狀并遞送治 療化合物至創傷部位。此外，隨著傷口愈合，支架分解，從而減少生物廢料。
[0403] 本公開內容包括以下非限制性實施例。
[0404] 實施例1:中和性抗VEGF-B抗體治療糖尿病小鼠中的傷口
[0405] VEGF-B的抗體介導的抑制不怎么影響糖尿病db/db//BKS小鼠中的血糖水平 [0406]本機構內伺養的雄性C57BKS/Leprdb (db/db/BKS)小鼠購自 Jackson Laboratory。 在創傷前和在實驗期間小鼠以一只小鼠/籠飼養。動物設施具有12小時的晝夜循環以及可 隨意獲得的食物和水。富集包括大鼠隧道和筑巢材料以減少壓力。db/db/BKS雄性小鼠（8 周）在創傷前用400yg的VEGF-B抗體（2H10)或同種型匹配的對照抗體(BM4)預處理2次/周 (i.P.)持續4周。在創傷后持續相同的治療方案直到殺死動物。在實驗前和期間監測體重和 血糖。血糖水平使用血糖儀(Countour棒，Bayer)從尾部分析并使用實驗室標尺測量體重。 [0407] 如圖1所示，在這個實驗中抗VEGF-B治療不改變嚴重的糖尿病db/db BKS小鼠或非 糖尿病db/+BKS小鼠中的血糖水平或體重增加。
[0408] 使用2H10的VEGF-B藥理學抑制增強嚴重糖尿病小鼠模型中的傷口閉合
[0409] 在達到15mM以上的非空腹血糖水平后，將2H10或BM4(對照）治療的db/db或db/+在 創傷前保持額外2周。這是為了在創傷時獲得嚴重糖尿病動物。在全身麻醉下通過異氟烷吸 入進行創傷。頸后的毛發用電動理發器和通過應用的脫毛霜(Veet)來去除。將皮膚用70% 乙醇消毒，之后使用6mm活檢穿孔器獲得穿透皮膚和肉膜的兩個成對圓形全層傷口。在創傷 后的前兩天期間，小鼠每天給予0.05-0. lmg/kg丁丙諾啡的皮下鎮痛注射兩次。傷口大小和 愈合進展使用數碼攝影在創傷后直接追蹤并隨后在實驗期間隔日追蹤。傷口面積通過使用 Image J軟件對每個傷口測量兩次。攝像機和傷口之間的距離通過將傷口的大小相關于每 個圖像中包括的參考對象來校正。單個傷口（每個動物兩個)作為單個實驗數據點來處理。 [0410]如圖2所示的，當用抗VRGF-B抗體治療時，糖尿病小鼠模型（db/db BKS)中的傷口 閉合顯著增強。
[0411]抗VEGF-B治療增加糖尿病小鼠模型中的傷口閉合和愈合的速率。在傷口閉合的早 期階段（第4和6天）檢測到抗VEGF-B治療的最顯著效果。這在圖3中進一步示出，其中抗 VEGF-B治療加速前四天期間的傷口愈合，盡管在血糖水平上沒有差異。
[0412] 本文中所呈現的數據表明，糖尿病的高血糖癥本身不是受損的傷口愈合過程的主 要原因。
[0413] 使用2H10的抗VEGF-B治療降低傷口愈合中上調的基因的表達
[0414] 將雄性db/db和db/+小鼠（如上所述處理并在第16天處死）用于表達分析。對傷口 進行解剖并在干冰上急速冷凍。使用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)根據制造商的說明從傷 口提取和純化總RNA。第一鏈cDNA從0.5-lyg總RNA使用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad) 合成。實時定量PCR用KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2X)Universal(KAPA Biosystems)在Rotor-Gene Q(Qiagen)實時PCR熱循環儀中根據生產商的說明進行。將表達 水平標準化至L19的表達。
[0415] 如在圖4中所示，db/db小鼠中的抗-VEGF-B治療減少了在糖尿病創傷期間被上調 的幾個基因的表達。
[0416] 使用2H10的抗VEGF-B治療影響血管形態學但不促進細胞增殖
[0417] 將雄性db/db小鼠（如上所述處理并在第16天處死）用于免疫分析。對傷口進行解 剖并在多聚甲醛中在+4 °C下固定24小時，在70 %的乙醇中水化，包埋在石蠟中并切片成3μπι 厚的橫截面。抗原修復使用抗原修復溶液pH6 (DAKO)和通過加熱切片至+98 °C進行10分鐘來 進行。用適當的一級抗體(Brdu，CD45，CIV和CD31，稀釋至l-5yg/mL)在+4°C孵育切片12小 時。應用匹配的焚光標記的第二抗體（Invitrogen,Alexa fluor，1:1000稀釋），并在室溫 (RT)孵育切片1小時，之后將其制備用于顯微鏡觀察。用AxioVision顯微鏡(Carl Zeiss)在 20x放大倍數下對切片進行拍照。然后使用AxioVision Run向導程序(pixels2)對切片進行 評價和量化。相關于DAPI的復染色強度定量BrdU染色強度并定量所有其它染色用于總像素 面積。
[0418] 如圖5所示，抗VEGF-B治療促進糖尿病傷口愈合過程中血管的成熟。
[0419] VEGF-B信號傳導通路在糖尿病傷口中被上調
[0420]對照抗體(BM4)治療的db/db或db/+基本上如上所述進行創傷并在創傷后16天處 死。用6mm活檢穿孔器對傷口進行采集用于表達和組織學分析。將組織在液氮中冷凍并保持 在-80°C直至進一步加工。用TRIzol試劑（Invitrogen)和QIAGEN RNeasy(Qiagen)根據制造 商的說明分離RNA。總RNA( 500ng)根據制造商的說明（iScr ipt cDNA合成試劑盒，Bio-Rad) 進行反轉錄。使用Platinum SYBR green SuperMix(Invitrogen)和25ng cDNA/反應進行 qPCR。將表達水平標準化至TUBB5 (微管蛋白，β51類)的表達。
[0421] 如在圖6中所示，傷口中的Vegfb和VEGF-B結合受體Vegfrl的表達隨著糖尿病和肥 胖增加。這些數據表明，VEGF-B信號傳導途徑是用于治療糖尿病創傷的合適靶。
[0422] 使用2H10的抗VEGF-B治療減少db/db小鼠的皮膚中的脂質累積
[0423] 將雄性的db/db和db/+小鼠（如上所述處理的）用于油紅O(ORO)分析。對傷口進行 解剖并在干冰上急速冷凍，并直接在低溫恒溫器的模子上將其包埋入Tissue-Tek? (Sakura)。將冷凍切片（12μπι)在油紅0工作溶液(2.5g油紅Q(Sigma-Aldrich)，溶解于400ml 99%異丙醇中，進一步在H2O中6:10稀釋，通過22μηι濾器(Corning)過濾)浸泡12分鐘并安裝 其之前在流動自來水下沖洗20分鐘。染色切片用亮視野顯微鏡(Axio Vision顯微鏡，Carl Zeiss)在40x放大倍數下檢查并捕獲最少4幀/動物。從傷口的中心區域捕獲圖像。為了脂滴 的定量，使用Axio Vision Run向導程序定量每幀中紅色像素的量用于總ORO染色(像素， a.u) 〇
[0424] 如圖7中所示，使用2H10的抗VEGF-B治療減少雄性db/db小鼠的皮膚中在創傷后的 脂質累積。
【主權項】
1. 用于在具有傷口的受試者中治療傷口或增強傷口愈合或用于阻止或減緩傷口進展 的方法，所述方法包括向所述受試者施用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。2. 權利要求1的方法，其中所述傷口是急性的或常規的。3. 權利要求1的方法，其中所述傷口是慢性的。4. 權利要求1至3中任一項的方法，其中所述傷口是皮膚傷口。5. 權利要求1至4中任一項的方法，其中所述受試者患有肥胖和/或糖尿病。6. 用于治療糖尿病受試者中的傷口或用于增強或誘導具有傷口的糖尿病受試者中的 傷口愈合或用于減少或阻止糖尿病受試者中的傷口進展的方法，所述方法包括向受試者施 用抑制VEGF-B信號傳導的化合物。7. 權利要求1至6中任一項的方法，其中所述化合物以有效量施用以具有一種或多種下 列效應： (a) 與未曾施用所述化合物的受試者（例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）中的速 率相比，增強傷口閉合的速率;和/或 (b) 與未曾施用所述化合物的受試者（例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者）中的速 率相比，增大特定時間點(例如，在治療開始后）的傷口閉合的量;和/或 (c) 與未曾施用所述化合物的受試者(例如，患有糖尿病且具有傷口的受試者)相比，增 強受試者中的血管成熟。8. 權利要求1至7中任一項的方法，其中所述抑制VEGF-B信號傳導的化合物結合VEGF-B〇9. 權利要求8的方法，其中所述化合物是抗體模擬物。10. 權利要求8的方法，其中所述化合物是包含結合或特異性結合VEGF-B并中和VEGF-B 信號傳導的抗體可變區的蛋白質。11. 權利要求10的方法，其中所述化合物是包含Fv的蛋白質。12. 權利要求11的方法，其中所述蛋白質選自： (i) 單鏈Fv片段(scFv); (ii) 二聚scFv(di-scFv);或 (iv) 雙抗體； (v) 三鏈抗體； (vi) 四鏈抗體； (vii) Fab； (viii) F(ab'）2; (ix) Fv;或 (X)連接至抗體的恒定區、Fc或重鏈恒定結構域(Ch)2和/或Ch3的⑴至（ix)之一。13. 權利要求11的方法，其中所述蛋白質是抗體。14. 權利要求1至13中任一項的方法，其中所述化合物競爭性抑制抗體2H10與VEGF-B的 結合，所述抗體2H10包含重鏈可變區（V H)和輕鏈可變區（VL)，所述重鏈可變區（VH)包含SEQ ID N0:3所示的序列，所述輕鏈可變區(VL)包含SEQ ID N0:4所示的序列。15. 權利要求1至14中任一項的方法，其中所述化合物是包含抗體2H10的人源化可變區 的蛋白質。16. 權利要求15的方法，其中所述蛋白質包含可變區，所述可變區包含抗體2H10的VH和/ 或Vl的互補決定區(CDR)。17. 權利要求16的方法，其中所述蛋白質包含： (i) VH，其包含： (a) 包含SEQ ID NO:3的氨基酸25-34所示的序列的CDR1; (b) 包含SEQ ID勵:3的氨基酸49-65所示的序列的0?2;和 (c) 包含SEQ ID N0:3的氨基酸98-108所示的序列的CDR 3;和 (ii) VL，其包含： (a) 包含SEQ ID NO:4的氨基酸23-33所示的序列的CDR1; (b) 包含SEQ ID N0:4的氨基酸49-55所示的序列的CDR2;和 (c) 包含SEQ ID N0:4的氨基酸88-96所示的序列的CDR3。18. 權利要求17的方法，其中所述蛋白質是抗體，所述抗體包含:含有SEQ ID N0:5所示 的序列的Vh和含有SEQ ID NO:6所示的序列的Vl。19. 權利要求1至7中任一項的方法，其中所述化合物抑制或阻止VEGF-B的表達。
【文檔編號】A61P17/02GK105979965SQ201480068916
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年12月18日
【發明人】U·艾里克森, A·法爾科威爾, A·梅里姆
【申請人】杰特有限公司, B-創新瑞典股份公司