從cho細胞培養物中制備抗體用于偶聯的制作方法

從cho細胞培養物中制備抗體用于偶聯的制作方法
【專利摘要】本發明部分基于以下觀察，即CHO細胞氧化酶，尤其是QSOX1可在看似嚴苛的抗體純化過程中留存以隨后降低抗體與藥物的偶聯效率。氧化酶是否在純化過程中留存取決于采用哪些純化技術，這可在抗體之間不同。已知CHO細胞氧化酶的污染是后續偶聯的潛在問題，可針對任意抗體設計將CHO氧化酶消除或至少減少至可接受水平的合適的純化方案。
【專利說明】從CHO細胞培養物中制備抗體用于偶聯
[00011 本申請要求2013年11月25日提交的美國臨時申請號61/908，568的權益，該申請通 過引用全文納入本文用于所有目的。
[0002] 序列表
[0003] 名稱為3100-001 llPC-ST25.txt的IlKB的序列表于2014年11月21日生成，其通過 引用納入本文。
[0004] 背景
[0005] 在數百次臨床試驗之后，迄今為止大約30種單克隆抗體已經被Π)Α批準用于治療 多種病癥，包括癌癥、自身免疫疾病和感染因子。更多抗體尚未被批準的一個原因是抗體單 獨提供的作用機制，如效應物功能或阻斷受體-配體相互作用可能不夠有力以具有充分的 治療效果。抗體-藥物偶聯物(ADC)提供了其它機制，尤其是向細胞內部遞送與抗體偶聯的 毒性部分，從而殺死細胞或者抑制其增殖。現有2種ADC在售:布妥昔單抗和曲妥珠單抗。許 多其它ADC處于研發的不同階段。ADC的產生包括抗體表達和純化，之后是通常通過接頭將 抗體化學偶聯至藥物。
【附圖說明】
[0006] 圖1:氧化性雜質對載藥量的影響。在所示時間處，樣品被還原并偶聯。偶聯水平隨 著時間降低的趨勢表明存在氧化性雜質。
[0007] 圖2a-2c: SEC分離后組分中抗體制備物(批號DEVNKB-I)中的氧化活性（圖2a)。用 抗-ALR(肝再生的活化劑）和抗-QSOXl抗體染色的SEC組分的Western印跡(分別是圖2b和 2c) 〇
[0008] 圖3a-c:抗體制備物(批號DEVNKB-I)在Poros蛋白A柱上的分級分離（圖3a);各組 分中的氧化活性（圖3b);和顯示匯集的組分3和4的蛋白質內容物的SDS-PAGE凝膠圖像（圖 3c)。箭頭指示與70kDa QSOXl和76kDa QS0X2-致的分子量。
[0009] 定義
[0010] 分離的抗體或ADC對于生產或純化過程中產生的干擾蛋白和其他污染物通常是至 少50%w/w純的，但不排除單克隆抗體與過量的藥學上可接受的運載體或旨在促進其使用 的其他載劑混合。有時，單克隆抗體或ADC對于生產或純化過程中產生的干擾蛋白和污染物 是至少60 %、70 %、80 %、90 %、95或99 % w/w純的。
[0011]單克隆抗體單獨或作為ADC的組分與其目標抗原的特異性結合指親和力為至少 106、107、108、109或1011 1。特異性結合在幅度上可檢測地高于與至少一個不相關靶標之間 的非特異性結合并可與之區分。特異性結合可以是特定空間擬合(如鎖和鑰匙類型)或特定 官能團之間鍵形成的結果，而非特異性結合通常是范德華力的結果。然而，特異性結合并不 必然表示單克隆抗體結合一個且僅結合一個靶標。
[0012]基礎抗體結構是亞基的四聚體。各四聚體由兩對多肽鏈構成，各對有一條"輕鏈" (約25kDa)和一條"重鏈"（約50-70kDa)。各鏈的氨基末端部分包含約100-110或更多氨基酸 的可變區，主要負責抗原識別。該可變區初始表達連接至可切割信號肽。不含信號肽的可變 區有時稱為成熟可變區。因此，例如，輕鏈成熟可變區是不含輕鏈信號肽的輕鏈可變區。各 鏈的羧基端部分界定恒定區。重鏈恒定區主要負責效應物功能。
[0013] 輕鏈被歸類為κ或λ。重鏈被歸類為γ、μ、α、δ或ε，并確定了抗體的同種型，分別為 IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區通過約12個或更多個氨基酸的 "J"區連接，重鏈也包括約10個或更多個氨基酸的"D"區。（通常參見，《基礎免疫學》 (Fundamental Immunology) (Paul，W.編，第2版，紐約拉文出版社（Raven Press，Ν· Υ.)， 1989，第7章，通過引用全文納入本文以用于所有目的）。
[0014] 各輕鏈/重鏈對的成熟可變區形成抗體結合位點。因此，完整抗體有兩個結合位 點。除了雙功能或雙特異性抗體的情況之外，這2個結合位點是相同的。鏈均顯示由三個高 變區接合的相對保守框架區(FR)的相同通用結構，所述高變區也稱為互補決定區或CDR。來 自各對的兩條鏈的CDR通過框架區比對，能結合特定表位。從N-端到C-端，重鏈和輕鏈都包 含結構域?1?1、0)1?1^1?2、001?2、？1?、0)1?和?1?4。各結構域氨基酸的分配與1( &&&丨，《免疫學感 興趣蛋白的序列》（Sequences of Proteins of Immunological Interest)(馬里蘭州貝塞 斯達的國立衛生研究院（National Institutes of Health)(1987和1991))或Chothia和 Lesk J.Mol.Biol .196:901-917( 1987);Chothia等，Nature 342:878-883( 1989)的定義一 致。Kabat還提供了廣泛使用的編號慣例(Kabat編號），其中為不同重鏈之間或不同輕鏈之 間相應的殘基分配了相同的編號。
[0015] 術語"抗體"包括完整抗體及其結合片段。一般而言，抗體片段與衍生它們的完整 抗體競爭以特異性結合靶標，包括分開的重鏈，輕鏈Fab、FaV、F(al/ )2、F(ab) c、雙抗體、 Dab、納米抗體和Fv。可通過重組DNA技術，或通過完整免疫球蛋白的酶促或化學分離來產生 片段。術語"抗體"也包括雙抗體(同二聚體Fv片段)或小抗體(Vl-V h-Ch3)、雙特異性抗體等。 雙特異性或雙功能抗體是具有2個不同重鏈/輕鏈對和2個不同結合位點的人工雜交抗體 (參見，例如，Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp. Tmmunol . ,79:315-321(1990) ；KosteIny 等，J. Immunol·，148:1547-53(1992))。術語"抗體"包括抗體本身(裸抗體)或與細胞毒性藥 物或細胞生長抑制性藥物偶聯的抗體。
[0016] 術語"表位"是指抗原上抗體與之結合的位點。表位能夠由連續的氨基酸來形成或 由于一個或多個蛋白三級折疊而并列的不連續的氨基酸來形成。當接觸變性溶劑時，由連 續氨基酸形成的表位通常保留，而由三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時丟失。 表位通常包含在獨特空間構象中的至少3個或更常見的至少5個或8-10個氨基酸。確定表位 空間構象的方法包括，例如X-射線晶體法和二維核磁共振。參見，例如《表位作圖方案》，刊 于《分子生物學方法》（Epitope Mapping Protocols，in Methods in Molecular Biology)，卷66，Glenn E.Morris編（1996)。
[0017] 可以在簡單的免疫實驗中鑒定識別相同表位或重疊的抗體，顯示一種抗體與另一 種抗體競爭結合目標抗原的能力。也可通過對與抗原結合的抗體進行X射線結晶以鑒定接 觸殘基，從而定義抗體的表位。或者，如果抗原中導致一個抗體的結合能力減弱或消失的 所有氨基酸突變導致另一個抗體的結合能力減弱或消失，則說明這兩個抗體擁有相同的表 位。如果一些導致一個抗體的結合能力減弱或消失的氨基酸突變導致另一個抗體的結合能 力減弱或消失，則說明這兩個抗體擁有重疊的表位。
[0018] 可通過試驗確定抗體之間的競爭，其中一個受測試的抗體抑制了參考抗體與共同 抗原的特異性結合(參見例如Junghans等，Cancer Res.50:1495,1990)。如果在競爭性結合 試驗中，過量的測試抗體(例如至少2x、5x、IOx、20x或IOOx)抑制了參考抗體至少50 % (優選 75%、90%或99%)的結合，則說明測試抗體與參考抗體之間產生競爭。競爭試驗鑒定到的 抗體(競爭抗體)包括與參考抗體結合同一表位的抗體和所結合的表位與參考抗體結合的 表位距離足夠靠近而產生位阻的抗體。
[0019] 術語"患者"包括接受預防性或治療性治療的人和其他哺乳動物對象。
[0020] 出于將氨基酸取代分類為保守性或非保守性的目的，氨基酸分類如下：組1(疏水 性側鏈）:11161：、313、￥31、1611、；[16;組11(中性親水性側鏈）：05^、861'、1：111';組111(酸性側鏈）： 38口、8111 ;組1￥(堿性側鏈）陽11、8111、11丨8、178、3坪;組￥(影響鏈取向的殘基）：817、口1'0 ;以及 組VI(芳族側鏈）：丨印、丨7^?1^。保守性取代包括相同類別的氨基酸之間的取代。非保守取 代指將一種類型的成員更換為另一種類型的成員。
[0021] 通過Kabat編號慣例對抗體序列進行最大程度的比對以確定序列相同性百分比。 比對后，如果比較的是對象抗體區域(如重鏈或輕鏈的整個成熟可變區）與參考抗體的相同 區域，則對象和參考抗體區域之間的序列相同性百分比為對象和參考抗體區域中被相同氨 基酸所占據的位置數目除以兩個區域經排列位置的總數，不計算缺口，乘以100以轉化為百 分數。
[0022] "包含"一種或多種所列元素的組合物或方法可包含未特別列出的其他元素。例 如，包含抗體的組合物可含有單獨的抗體或與其他成分聯用。
[0023] 數值范圍的指定包括范圍內或限定該范圍的所有整數。
[0024] 抗體效應物功能（effector function)指由Ig的Fc結構域所貢獻的功能。這類功 能可以是例如抗體依賴的細胞毒性、抗體依賴的細胞吞噬作用或補體依賴的細胞毒性。發 揮這類功能的方式可以是例如Fc效應結構域與帶有吞噬或裂解活性的免疫細胞上的Fc受 體結合，或Fc效應結構域與補體系統的組分結合。通常，由Fc結合細胞或補體組分介導的作 用導致靶向的細胞的抑制和/或消耗。抗體的Fc區可招募表達Fc受體(FcR)的細胞并使其與 抗體包被的目標細胞并列。表達IgG的表面FcR的細胞包括Fc γ RIII (CD16)、Fc γ RII (CD32) 和Fe γ RI(CD64)，其能夠作為效應細胞破壞IgG包被的細胞。這類效應細胞包括單核細胞、 巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞活性、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。Fc γ R通過IgG的參與激 活了抗體依賴的細胞毒性(ADCC)或抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP) JDCC由CD16+效應細 胞通過分泌膜孔形成蛋白和蛋白酶介導，而吞噬作用由CD32+和CD64+效應細胞介導（參見 Fundamental Immunology (《基礎免疫學》），第4版，Paul編，林普科特瑞文出版社 (Lippincott-Raven)，紐約，1997，第3、17和30章；Uchida等，2004，J.Exp.Med· 199:1659-69 ; Akewan Iop等，2001，Cancer Re s.61:4061-65 ; Watanabe等，1999, Br east Cancer Res. Treat. 53:199-207)。除ADCC和ADCP外，細胞結合抗體的Fe區也可以激活補體經典通路 以引發補體依賴的細胞毒性(CDC)。當補體系統的Clq與抗原形成復合物時，其結合抗體的 Fc區。Clq與細胞結合抗體的結合能夠起始涉及C4和C2蛋白水解激活的多個事件以生成C3 轉化酶。由C3轉化酶將C3切割為C3b的過程激活了包括C5b、C6、C7、C8和C9的終端補體組分。 總體來說，這些蛋白質在抗體包被的細胞上形成了膜攻擊復合物孔。這些孔破壞了細胞膜 的完整性，從而殺死目標細胞(參見《免疫學》（Immunobiology)，第6版，Janeway等，加蘭德 科學出版社(Garland Science)，紐約，2005,第2章）。
[0025]術語"抗體依賴的細胞毒性"或ADCC指一種誘導細胞死亡的機制，該機制依賴抗體 包被的目標細胞與帶有裂解活性的免疫細胞(也稱為效應物細胞)之間的相互作用。這類效 應物細胞包括自然殺傷細胞、單核細胞/巨噬細胞和嗜中性粒細胞。效應物細胞通過其抗原 結合位點與結合在目標細胞上的Ig的Fc效應結構域連接。抗體包被的目標細胞的死亡是效 應物細胞活性的結果。
[0026]術語"抗體依賴的細胞吞噬作用"或ADCP指由與Ig的Fc效應結構域結合的吞噬免 疫細胞（如巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突細胞)將抗體包被的細胞全部或部分內化的過 程。
[0027] 術語"補體依賴的細胞毒性"或CDC指一種誘導細胞死亡的機制，其中結合目標的 抗體的Fc效應結構域激活了一系列酶促反應，最終使得目標細胞的細胞膜上出現穿孔。通 常，抗原-抗體復合物(如在抗體包被的目標細胞上的復合物)結合并激活補體組分Clq，Clq 轉而激活補體級聯反應導致目標細胞死亡。補體的激活還會導致補體組分在目標細胞表面 的沉積，通過結合白細胞上的補體受體(如CR3)促進ADCC。
[0028] "細胞毒性作用"指靶標細胞的缺失、消除和/或死亡。"細胞毒劑"指對細胞有細胞 毒性效果的試劑。細胞毒劑可與抗體偶聯或與抗體共同給予。
[0029] "細胞生長抑制作用"指細胞增殖的抑制。"細胞生長抑制劑"指對細胞具有細胞生 長抑制效果，從而抑制細胞的特定子集生長和/或擴增的試劑。細胞生長抑制劑可與抗體偶 聯或與抗體共同給予。
[0030] 術語"藥學上可接受的"指被聯邦或州政府管理機構批準或可被批準，或美國藥典 或其它通常接受的藥典所列的用于動物，更具體是用于人的。術語"藥學上相容的成分"指 與抗體或ADC共同配制的藥學上可接受的稀釋劑、輔料、賦形劑或載劑。
[0031] 短語"藥學上可接受的鹽"指抗體或其偶聯物或與抗體共同給藥試劑的藥學上可 接受的有機或無機鹽。示例性鹽包括:硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、 碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸性檸檬酸 鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍 膽酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸 鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和撲酸鹽（即1，Γ -亞甲基-雙_(2-羥基3-萘甲酸 鹽））鹽。藥學上可接受的鹽可以包含例如乙酸根離子、琥珀酸根離子、或其他抗衡離子的另 一個分子。該抗衡離子可以是穩定母體化合物上電荷的任何有機或無機部分。另外，藥學上 可接受的鹽可在結構中具有超過一個的帶電原子。其中多個帶電原子是藥學上可接受的鹽 的一部分的示例能有多個抗衡離子。因此，藥學上可接受的鹽可具有一個或多個帶電原子 和/或一個或多個抗衡離子。
[0032] CHO細胞是指中華倉鼠卵巢細胞并且包括各種品系，包括，例如，DG44、Dxb11、CHO- K、CHO-K ^CHO-S0
[0033]短語"載藥量"或"偶聯率"是指ADC溶液或組合物或反應混合物中每個抗體的平均 藥物數量。
[0034]除非本文中另有明確說明，術語"約"包括所述值的標準偏差內的值。
[0035] 發明詳述
[0036] I ·概述
[0037] 本發明部分基于以下觀察：CHO細胞氧化酶，尤其是quiescin Q6巰基氧化酶I (QSOXl)可在看似嚴苛的抗體純化過程中留存，并以足夠降低抗體與藥物的后續偶聯加載 效率的量存在于抗體制備物中。雖然純化過程似乎產生具有對于抗體可接受的低比例的背 景污染物/雜質的抗體，可能仍然存在足量的氧化酶以導致抗體上的巰基在抗體還原之后 被氧化，由此不可供于偶聯至藥物。雖然，本發明的實踐并不依賴于對機制的理解，QSOXl在 純化的抗體產品中的持續存在可能由一些純化條件下抗體與QSOXl之間的相互作用導致。 氧化酶是否在純化過程中留存取決于采用哪些純化技術，這可在抗體之間不同。在鑒定具 有小但顯著的量的CHO細胞氧化酶的看似純的抗體制備物的存在的可能性之前，弱的偶聯 加載效率（由不足的藥物與抗體平均比所反映）可能已經被錯誤地歸因于多種原因中的任 一種。然而，已知CHO細胞氧化酶的污染是后續偶聯的潛在問題，可針對任意抗體設計將CHO 氧化酶消除或至少減少至可接受水平的合適的純化方案。
[0038] II. CHO細胞氧化酶
[0039] QSOXl是人QSOXl ,Swiss-Prot 000391的中華倉鼠同源物。該酶催化巰基氧化成二 硫鍵，同時還原氧。述及QSOXl是指全長QSOXl酶(帶或不帶信號肽)及其任意片段，包括其天 然產生的變體，無論是由CHO細胞天然釋放或因抗體純化過程而釋放均保留巰基氧化能力。 CHO細胞培養基中的QSOXl產生表觀大小范圍65-75kDa，或更具體地68-72kDa的條帶。示例 性的QSQXl片段可包括胞外結構域、硫氧還蛋白結構域和/或ERV/ALR疏基氧化酶結構域。預 測的QSOXl同種型Xl蛋白質序列先前已被鑒定為SEQ ID NO: 1并具有GenBank登錄號XP_ 003500174.1。從此即已更新了QXOXl預測的同種型Xl蛋白質序列。更新的序列示于SEQ ID N0:2并且具有GenBank登錄號XP_007639037.1。在一些方面中，QS0Xl是指與SEQIDN0 :2具 有 90% 或更高（91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列相同性 并且保留巰基氧化能力的CHO細胞氧化酶。在一些方面中，QSOXl是指包括以下氨基酸序列 并保留巰基氧化能力的CHO細胞氧化酶:SEQ ID NO:2的第94個氨基酸至第571個氨基酸。
[0040] 可以雜質存在的其它CHO細胞酶包括QS0X2(人Swiss-Prot Q6ZRP7的CHO同源物） 和ALR(肝再生的活化物)巰基氧化酶。簡言之，以下說明主要是指QS0X1，但是應理解為替代 性或另外指代QS0X2、ALR或經純化留存下來的其它CHO細胞氧化酶。
[00411 III.去除QSOXl和其它CHO細胞氧化酶的純化方法
[0042]本申請提供了可用于鑒定并去除QSOXl和其它CHO細胞氧化酶如QS0X2或ALR的幾 種技術(詳細內容參見實施例）。一種技術是將抗體制備物加載到蛋白A柱上，并且在中等或 高鹽條件下（例如，至少150mMNaCl，或150-500mM NaCl)洗滌。QSOXl從柱中洗脫，而抗體保 持結合。另一種技術是使用例如Millipore XOHC膜的深度過濾。抗體通過濾器，而QSOXl被 濾器捕獲。另一種技術是陰離子交換色譜，優選使用帶季銨基團的強陰離子交換劑。GE醫療 公司的Capto-Q柱是合適的。在合適的條件下（例如，約8的pH和約5-7mS/cm的電導率），抗體 流過柱而QSOXl保持結合。另一種技術是苯基-膜過濾。這種類型的膜基于疏水性相互作用 分離。在合適條件下(例如，pH 6-8和檸檬酸鈉0.35-0.4M)，抗體通過并且QSOXl結合至膜。 [0043] IV.去除測試
[0044]可通過多種試驗來檢測QSOXl，如實施例中進一步詳述，包括使用對QSOXl具有特 異性的抗體的Western印跡。也可通過對從凝膠上切下的合適分子量（約65-70kDa，取決于 糖基化狀態）的條帶進行肽序列分析或LC-MS/MS來檢測QSOXl。也可通過功能試驗來檢測 QS0XUQS0X1活性生成過氧化氫，其轉而通過在二甲酚橙存在下Fe2+氧化導致的簡單顏色 變化而被檢測到。QSOXl的特征性功能活性被Zn2+(例如，至少90%)而不是EDTA和許多其 它鹽(KI、MnS04、NaCl)或尿素特異性抑制。如實施例2所證明，也可通過DTNB試驗來檢測 QSOXl0
[0045] 如果在下文所述的任何試驗或實施例中可在陰性對照水平以上檢測到(超過實驗 誤差），則認為QSOXl存在。在一些方面中，低至lug/ml或66ppm的QSOXl水平可抑制抗體藥物 加載效率。因此，在一些方面中，可接受的水平可表示低于〇.5ug/ml或33ppm，并且優選低于 0.1ug/ml或6ppm，或低于0.01ug/ml或0.6ppm。優選地，QSOXl的水平在陰性對照水平內，如 實施例中所述的任意試驗模式所確定。
[0046] 或者或另外，QS0X1的可接受水平可定義為等于或低于可得到藥物對抗體的可接 受偶聯率的水平。合適的偶聯率優選在目標偶聯率的90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %以內。可影響偶聯率并且可被控制以實現目標偶聯率的參數包括， 例如，抗體的還原條件(例如，還原劑類型和相對于抗體濃度的濃度）、藥物接頭相對于抗體 的濃度、偶聯反應時間和偶聯反應溫度。優選地，QS0X1的水平使得其在抗體還原反應期間 不阻止達到正確的還原程度和/或其在還原后但在偶聯之前不立即重新氧化已經還原的巰 基。換言之，優選地，QS0X1的水平使其不干擾抗體的還原或經還原的抗體的穩定性。
[0047]或者或另外，可接受水平的QS0X1可被定義為在DTNB試驗或亞鐵氧化二甲酚橙試 驗中產生0.1或更低吸光度單位的水平。簡言之，DTNB試驗是這樣一種試驗，其中測量并比 較了對照樣品和測試樣品中游離巰基之間的反應。例如參見實施例2。在亞鐵氧化二甲酚橙 試驗中，測量過氧化氫作為活性指標。例如參見實施例1。
[0048] V ·工作流方案
[0049]用編碼待表達的抗體的鏈的載體轉化CHO細胞并經培養以表達該抗體。表達通常 初始在較小培養物體積(例如，1-50L)上進行，目的在于提供足夠的抗體來確定純化方案。 然后，含表達的抗體的培養基經歷抗體純化方案的至少一個步驟以獲得適于化學偶聯或藥 物應用的純度水平(例如，相對大分子污染物/雜質的至少90、95、97、98或99 % w/w的抗體）。 該純化方案通常包括至少2個柱色譜步驟、至少一個并且通常多個過濾步驟、病毒滅活步 驟，和濃縮和重懸/稀釋步驟。在完成純化步驟中的任一個或全部之后，可測試抗體制備物 是否存在QS0X1。如果檢測到QSOX高陰性對照試驗的背景(超過實驗誤差)或檢測到高于被 認為后續偶聯不可接受的水平，則用第二(不同）純化步驟和/或方案重復初始培養基(或另 一種類似培養基，如果初始培養基的量不足）的純化。第二純化步驟和/或方案可與第一純 化步驟和/或方案在純化類型上(例如，陰離子對陽離子交換色譜，用于過濾的膜類型），或 在用于上樣或洗脫的緩沖劑等其它變量上不同。
[0050] 在進行第二純化步驟/方案之后或期間，可測試所得抗體制備物的QS0X1。如果以 高于背景或高于可接受水平的水平檢測到QS0X1，則用含或不含對QS0X1酶的進一步測試的 其它純化方案進行純化。無論是在第一純化方案，還是第二或后續純化方案之后，最終得到 的抗體制備物中QS0X1不可被檢測到在高于背景或被檢測到但被認為可接受的水平上。
[0051] 在已經確定能將QS0X1降低至超過檢測限或至少降低至可接受的水平的純化方案 的情況下，進行CHO細胞的第二培養，有時稱為生產培養。培養基經歷已經確定對純化抗體 和去除QS0X1有效的純化步驟/方案。所得的純化的抗體被還原并隨后偶聯至試劑，例如，藥 物。
[0052]第二或生產培養物一般大于用于確定純化方案的初步培養物。例如，生產培養物 可以比初步培養物體積大至少100倍或1 〇〇〇倍。一般在至少一年的時間段內（例如，在至少5 年的時間段內）重復(批次培養)或連續進行生產培養，如通過之前確定能夠成功純化不含 QSOXl的抗體的純化方案來從所述培養純化抗體。
[0053]在替代的工作流中，來自CHO細胞的培養基經過抗體純化過程而不必測試QSOXl 酶，并且純化的制備物經歷與藥物的化學偶聯。如果偶聯加載效率(平均藥物/抗體)意外地 低（即，藥物分子對抗體的數量低于目標），則測試純化的制備物是否存在QS0X1。如果酶以 高于背景水平或高于被認為可接受的水平存在，則通過不同的純化方法從CHO細胞培養基 中純化抗體，之后測試QSOXl酶。然后，如果必要，則將通過不同的方法純化，之后測試QSOXl 反復進行直至發現一種純化方法，其同時從一般污染物/雜質中純化抗體以得到可接受的 純度并且將QSOXl去除至背景水平或被認為偶聯可接受的水平。當找到這種純化方法時， 其可用于從CHO細胞的第二培養物中制備抗體。然后，純化的抗體通過一個或多個游離巰基 偶聯至藥物。
[0054] VI.抗體與藥物的偶聯
[0055] 抗體可與細胞毒性或細胞生長抑制性部分(包括其藥學上可兼容的鹽)偶聯以形 成抗體藥物偶聯物(ADC)。抗體可偶聯至除藥物以外的試劑，例如，穩定劑(例如，PEG部分）。 特別適用于與抗體偶聯的部分是細胞毒劑(如化療藥）、前藥轉化酶、放射性同位素或化合 物或者毒素(這些部分統稱為藥物）。例如，抗體可與細胞毒劑(如化療藥)或毒素(如細胞生 長抑制劑或殺細胞劑，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉類毒素）偶 聯。
[0056] 出于本發明的目的，藥物通過抗體上的巰基偶聯至所述抗體。該巰基可以是半胱 氨酸側鏈上的巰基。半胱氨酸殘基可天然存在于抗體中（例如，鏈間二硫鍵)或通過其它方 式引入，例如，誘變。將藥物偶聯至抗體上的巰基的方法是本領域所熟知的（參見，例如，美 國專利號7，659，241、7，498，298、和國際公開號WO 2011/130613)。抗體在偶聯之前經還原 以賦予可用于偶聯的巰基。可使用本領域已知的條件還原抗體。還原條件是通常不引起任 何抗體的實質變性和通常不影響抗體的抗原結合親和性的那些條件。一方面，用于還原步 驟的所述還原劑是TCEP(三(2-羧基乙基)膦)并且TCEP在室溫下過量加入30分鐘。例如，250 yL的IOmM TCEP pH 7.4溶液在室溫下30分鐘可容易地還原I-IOOyg抗體的鏈間二硫化物。 然而，可使用其它還原劑和條件。還原條件的示例包括5-8的pH范圍的5°C至37°C的溫度。本 發明的發明人已經發現，在由還原劑還原之后由氧化酶如QSOXl將巰基氧化成二硫鍵能夠 使巰基不可用于偶聯。
[0057]除非從抗體上切除（例如通過水解、通過抗體降解或通過切割劑），否則藥物可通 過降低活性的方式偶聯至抗體。這類藥物可以通過一段可切割的接頭與抗體相連，所述接 頭對目標細胞胞內環境的切割敏感但對胞外環境基本不敏感，使得目標細胞內化ADC后對 其進行切割(例如在內體中，或者例如憑借pH敏感性或蛋白酶敏感性、在溶酶體環境中或在 胞膜窖環境中）。
[0058] 一般地，ADC包括藥物和抗體之間的接頭。如上文所述，該接頭在胞內環境下是可 切割的，胞內環境中對接頭的切割從抗體上釋放出藥物（例如在溶酶體或內體或胞膜窖 中）。該接頭可以是例如被胞內肽酶或蛋白酶(包括溶酶體或內體蛋白酶)切割的肽酰接頭。 一般而言，肽酰接頭的長度為至少兩個氨基酸或至少三個氨基酸。切割劑可包括組織蛋白 酶B和D和纖溶酶（參見例如Dubowchik和Walker，1999，Pharm. Therapeutics 83:67-123) 〇 最常見的是可由目標細胞內存在的酶切割的肽酰接頭。例如，可使用可由癌組織中高表達 的硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B切割的肽酰接頭(如包含Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly肽 的接頭）。其它這類接頭描述于，例如，US 6，214，345。可由胞內蛋白酶切割的示例性肽酰接 頭是Val-Cit接頭或Phe-Lys二肽(參見例如美國專利6,214,345,其描述了具有Val-Cit接 頭的多柔比星的合成）。使用胞內蛋白水解釋放藥物的一個優點是該試劑在偶聯時通常減 弱，且偶聯物的血清穩定性通常較高。
[0059] 該可切割接頭可以是pH敏感型的，即在某些pH值下對水解敏感。通常，pH敏感型接 頭可在酸性條件下水解。例如，能使用在溶酶體中可水解的酸不穩定性接頭(如腙、縮氨基 脲、縮氨基硫脲、順式-烏頭酰胺(cis-aconitic amide)、原酸酯、縮醛、縮酮等）。（參見例如 美國專利號5,122，368;5,824,805;5,622，929 ; Dubowchik 和Walker，1999， Pharm.Therapeutics 83:67-123!Neville等，1989，Biol.Chem.264:14653-14661)。這類接 頭在中性pH條件下（例如在血液中）相對穩定，但在低于pH5.5或5.0的條件(接近溶酶體的 pH)下不穩定。
[0060] 其他接頭在還原條件下是可切割的（如二硫化物接頭）。二硫化物接頭包括可用 3八丁六0-琥珀酰亞胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯）、3?〇?0-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫） 丙酸酯）、SPDB(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亞胺基-氧基 羰基-?-甲基-?-(2-吡啶基-二硫）甲苯）、SPDB和SMPT形成的接頭。（參見例如Thorpe等， 1987，CancerRes. 47:5924-5931; Wawrzynczak等，刊于《免疫偶聯物:放射成像和癌癥治療 中的抗體偶耳關物》（Immunocon jugates : Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer)(C.W.Vogel編，牛津大學出版社(Oxford U.Press)，1987。也參見美國 專利號4,880,935)。
[0061 ]接頭也可以是丙二酸接頭（Johnson等，1995，Anticancer Res · 15:1387-93)、馬來 酰亞胺苯甲酰接頭(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299-1304)或3'-N-酰胺類似物 (Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem · 3(10): 1305-12) 〇
[0062] 該接頭還可以是不可切割的接頭，例如與藥物直接連接并通過抗體的蛋白酶降解 釋放的馬來酰亞胺-亞烷基或馬來酰亞胺-芳基接頭。
[0063] 該接頭是包含可與抗體上存在的基團反應的官能團的接頭。在一些方面中，接頭 通過接頭的硫原子和抗體的硫原子之間的二硫鍵連接至抗體。在其他方面中，接頭通過接 頭的馬來酰亞胺基與抗體的硫原子成鍵。在一些方面中，硫原子來自鏈間二硫鍵的半胱氨 酸殘基或來自引入抗體的半胱氨酸殘基(例如，根據EU索引的239位處）。
[0064]可用于偶聯至抗體的細胞毒劑的類別包括，例如，抗微管蛋白劑、DNA小溝結合物、 DNA復制抑制劑、化療敏化劑、吡咯并苯并二氮雜軍二聚體等。其它示例性的細胞毒劑的類 別包括蒽環類抗生素、澳瑞他汀、喜樹堿、多卡米星、依托泊苷、美登醇和長春花生物堿。一 些示例性的細胞毒劑包括澳瑞他汀(例如，澳瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小溝結合物(例 如，烯二炔和偏端霉素）、多卡米星、紫杉烷(例如，紫杉酚和多西紫杉醇）、美登木素、苯并二 氮雜萆（例如，吡咯并[1，4]苯并二氮雜草、吲哚并苯并二氮雜草、和噁唑苯并二氮雜草）、長 春花生物堿、多柔比星、嗎啉代-多柔比星、和氰基嗎啉代-多柔比星。
[0065] 細胞毒劑可以是化療劑，例如，多柔比星、紫杉醇、美法侖、長春花生物堿、氨甲蝶 呤、絲裂霉素 C或依托泊甙。試劑還可以是CC-1065類似物、卡奇霉素、美登素、多拉司他汀10 類似物、根霉素或海葵毒素。
[0066] 細胞毒劑也可以是澳瑞他汀。例如，該澳瑞他汀可以是澳瑞他汀E，例如澳瑞他汀E 和酮酸間形成的酯。例如，澳瑞他汀E可與對乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反應，分別產生AEB 和AEVB。其它澳瑞他汀包括AFP、MMAF和MMAE。各種澳瑞他汀的合成和結構描述于，例如，US 2005-0238649和US2006-0074008。
[0067] 細胞毒劑可以是DNA小溝結合物。（參見例如，美國專利6，130，237)。例如，該小溝 結合物可以是CBI化合物或烯二炔(例如，卡奇霉素）。
[0068] 細胞毒劑或細胞生長抑制劑可以是抗微管蛋白劑。抗微管蛋白劑的例子包括：紫 杉烷(例如，Taxol? (紫杉醇）、Taxotere? (多西紫杉醇））、T67 (杜拉瑞克(Tular ik))、長春 花生物堿(例如，長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱），和澳瑞他汀(例如，澳瑞他汀E、 AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他合適的抗微管蛋白劑包括，例如漿果赤霉素衍生物、紫杉 燒類似物(如埃博霉素 A和B)、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙素和秋水仙胺(colcimid)、雌 氮芥、隱花植物素(cryptophycin)、西馬多丁、美登木素、考布他汀、淅皮海綿內酯和艾榴塞 洛素（eleutherobin) 〇
[0069] 細胞毒劑可以是美登木素，另一類抗微管蛋白劑。例如，美登木素可以是美登素或 含藥物接頭如DM-I或DM-4的美登素（ImmunoGen，Inc ·;也參見Chari等，1992，Cancer Res.52:127-131)〇
[0070] 示例性抗體藥物偶聯物包括以下的vcMMAE和mcMMAF抗體藥物偶聯物，其中p代表 載藥量并且范圍是1-20并且Ab是抗體：
[0071]
[0072]
[0073]
[0074] mcMMAF
[0075]或其藥學上可接受的鹽。
[0076] VII.抗體純化方法
[0077]已知大量用于從CHO上清中純化蛋白質的技術。這些技術包括離心、過濾、沉淀、病 毒滅活和多種類型的柱色譜包括蛋白-A、蛋白-G、蛋白-L、陰離子交換、陽離子交換、混合模 式、羥基磷灰石、尺寸排阻色譜，和目標親和色譜。色譜步驟通常采用至少2種緩沖劑，一種 用于上樣，一種用于洗脫。緩沖劑可改變pH和離子強度等因素。示例性的抗體純化包括至 少一個過濾步驟、至少一個病毒滅活步驟、蛋白A柱和至少一種其它柱。考慮到不同技術，上 樣和洗脫溶液中緩沖劑、PH和其它賦形劑的可能性的數量，不同純化過程的數量非常大。因 此，通常憑經驗確定不同抗體的合適純化過程以鑒定同時將抗體純化至藥物應用可接受的 水平(一般由抗體對大分子污染物/雜質的比率確定），并且其中QSOXl和/或其它CHO細胞氧 化酶減少至低于可檢測水平或至少減少至可接受水平的過程。
[0078] 可使用硫酸銨沉淀法來從血清、腹水或細胞培養物上清中富集并濃縮抗體。隨著 樣品中這種溶致鹽濃度增加，蛋白質和其它大分子逐漸溶解性降低直至它們沉淀。抗體比 血清的大多數其它蛋白質和組分在更低的硫酸銨濃度下沉淀。沉淀的選擇性、產率、純度和 重復性取決于多個因素，包括時間、溫度、PH和鹽含量。
[0079] 也可使用酸性或陽離子聚電解質來使抗體的細胞污染物絮凝。聚電解質通常通過 吸附至顆粒以在表面上產生相反電荷斑片來發揮作用。由于靜電吸引，該帶然后可粘附于 相反顆粒表面上的裸斑片。
[0080] 在細胞培養液的澄清中可使用深度濾器，以維持膜濾器上的容量或保護色譜柱或 病毒濾器。深度濾器一般由纖維素、多孔過濾助劑如硅藻土和離子帶電樹脂粘合劑制成。深 度濾器可同時采用尺寸排阻和吸附結合來實現分離效果。
[0081] 膜色譜或膜吸附劑的功能與填充的色譜柱類似，但是以常規過濾模塊的形式。膜 色譜利用微孔膜，通常是含有附連至膜結構中的內孔表面的功能性配體的多層。市售的Q膜 包括 ChromaSorb?(密理博公司（Millipore))、Mustang? (波樂公司（Pall))和.Sartobind? (薩托瑞斯公司（Sartorius))。在中性至弱堿性pH和低電導率下，病毒、DNA、內毒素、大群宿 主細胞蛋白質和浸出的蛋白A結合至Q膜，而一般堿性抗體分子則流過膜基質且不結合。
[0082] 超濾是壓力驅動的膜過程，其廣泛用于抗體離心和緩沖劑交換。超濾是基于尺寸 的分離法，其中大于膜孔的物質保留而較小的物質自由通過。通過不同組分在給定壓力驅 動力下穿過膜的過濾速率的差異來實現超濾分離。使用滲濾模式實現緩沖劑交換，其中最 終所需組合物的緩沖劑以與濾出液排出相同的速率加入滯留液體系統，由此保持恒定的 滯留液體積。用范圍為l_20nm的膜孔的超濾可提供分子量為500道爾頓至1000千道爾頓范 圍的物質的分離。
[0083] 高效切向流過濾(HPTFF)是二維單元操作，其中同時利用尺寸和電荷差異來純化 和分離。可在相同的單元操作中完成蛋白質濃縮和緩沖劑交換。
[0084] 可通過在低pH下處理來滅活病毒和/或通過各種方法包括過濾來去除病毒。現有 的病毒滯留濾器是具有非常小的孔的超濾器或微濾器。病毒過濾膜由疏水性聚醚砜(PES)、 聚偏二氟乙烯(PVDF)和再生纖維素制成。
[0085] 離子交換色譜使用帶正電或帶負電的樹脂來基于其在給定緩沖系統中的凈電荷 來結合蛋白質。可確定結合并釋放具有高度特異性的目標抗體的條件（例如，PH和離子強 度）。相反地，可發現結合除了抗體以外接近全部其它樣品組分的條件。陰離子交換色譜使 用帶正電的基團，其可以是弱堿性的，如二乙基氨基乙基(DEAE)或二甲基氨基乙基(DMAE)， 或強堿性的，如三甲基氨基乙基(TMAE)或季氨基乙基(QAE)。
[0086] 陽離子交換色譜使用經帶負電的官能團修飾的樹脂。陽離子和陰離子色譜是互補 技術:與一種分子強烈結合，但與其它分子弱結合。
[0087]陽離子交換柱可以是強酸性配體如磺丙基、磺乙基和磺異丁基或弱酸性配體如羧 基。陽離子交換色譜已經用于許多mAb的純化過程，其pi值范圍是約中性或略低(例如，約6) 至堿性。大多數人源化IgGl和IgG2亞型是陽離子交換色譜的良好候選物，其中抗體在上樣 步驟期間結合到樹脂上并且通過增加洗脫緩沖劑中的電導率或增加 PH來洗脫。在上樣和洗 滌組分中去除與帶負電的處理相關的雜質如DNA、一些宿主細胞蛋白質、浸出的蛋白A和內 毒素。陽離子交換色譜也可從所需的抗體中分離脫酰胺產物、氧化的物質和N-末端截短的 形式，以及高分子量物質。抗體在陽離子交換樹脂上的結合取決于PH和電導率，以及樹脂類 型。SP S印harose FF和SP S印harose XL是2種常用的市售樹脂。
[0088]疏水性相互作用色譜(HIC)是基于其疏水性分離蛋白質的有用工具，并且與基于 電荷、尺寸或親和性分離蛋白質的其它技術互補。樣品通常在高鹽緩沖劑中加載到HIC柱 上。緩沖劑中的鹽與水分子相互作用以降低溶液中蛋白質分子的溶劑化作用，從而暴露樣 品蛋白質中的疏水性區域，其隨后結合至HIC樹脂。分子的疏水性越強，促進結合所需的鹽 越少。
[0089] 固定的金屬螯合物色譜使用螯合物-固定的二價金屬離子(例如，銅、鈷或鎳)來結 合含有三個或更多連續組氨酸殘基的簇的蛋白質或肽。該策略最常用于純化已經工程改造 以含有末端6xHis融合標簽的重組蛋白質。IgG是血清(或單克隆雜交瘤細胞培養物上清）中 豐度最低的蛋白質之一，其具有能夠被固定的鎳結合的組氨酸簇。結合和洗脫的條件可針 對具體樣品優化以提供溫和且可靠的抗體純化。
[0090] 蛋白A、蛋白G和蛋白L，包括其重組變體，是通常用于從多種物質中關鍵抗體類型 的親和純化的示例性蛋白質。蛋白A色譜一般包括在pH 6-8下使澄清的細胞培養物上清通 過柱，在該條件下，抗體結合，并且不需要的組分如宿主細胞蛋白質和細胞培養基組分以及 病毒流過柱。可進行任選的中間洗滌步驟以從柱上去除非特異性結合的雜質，之后在PH 2.5-4下洗脫產物。目前存在三種主要類型的蛋白A樹脂，其基于樹脂主鏈組成分類:玻璃或 二氧化娃基，例如，Prosep vA、Prosep vA Ultra(密理博公司）；瓊脂糖基，例如，蛋白A Sepharose Fast Flow、MabSelect(GE醫療公司）；和有機聚合物基，例如，聚苯乙稀-二乙稀 基苯Poros A和MabCapture(應用生物系統公司(Applied Biosystems))。根據抗體，可使用 幾種洗脫緩沖劑組分如乙酸、檸檬酸、磷酸、精氨酸HCl和甘氨酸HCl。洗脫pH的選擇也取決 于抗體與樹脂的結合親和性，抗體的結合親和性越高，則需要越低的洗脫pH。
[0091] 陶瓷羥基磷灰石(Ca5(PO4)3OH)2是一種形式的磷酸鈣，其通常與磷酸鈉梯度洗脫 聯用來從二聚體、聚集體和浸出的蛋白A等其它污染物中分離抗體。
[0092]具體地，本文和實施例部分中描述了用于去除QSOXl的技術，并且其可與任意上述 技術聯用或另外使用。
[0093] VIII.示例性抗體
[0094]所述的純化方法和工作流可用于任意抗體，包括非人、人源化、人、嵌合、鑲嵌、納 米抗體、(^13、8(^￥'8^&13等。本發明的方法最常用于待偶聯至試劑的抗體，用于診斷或治療 用途。例如，該方法可用于待偶聯至藥物的抗體，用于治療用途。一些這類抗體對癌細胞抗 原是免疫特異性的，該抗原優選在細胞表面上，其可在抗體結合后在細胞中內化。抗體可指 向的目標包括癌細胞上的受體及其配體或反受體(例如，CD3、CDl 9、⑶20、⑶22、⑶30、⑶33、 CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、Her-2、VEGF或VEGFR、CTLA-4、LIV-I，和連接蛋白-4)。
[0095]本發明的方法也可用于純化待用于制備用于自身免疫疾病的治療或預防的ADC的 抗體。
[0096]本發明的方法也可用于純化結合至活化的淋巴細胞上表達的受體或受體復合物 的抗體。
[0097]本發明的方法也可用于純化對病毒或微生物抗原有特異性的抗體。
[0098]市售的抗體及其適用于本發明的方法的靶標的一些示例包括阿來組單抗、CD52、 利妥昔單抗、CD20、曲妥珠單抗Her/neu、尼妥珠單抗、西妥昔單抗、EGFR、貝伐單抗、VEGF、帕 麗珠單抗、RSV、阿昔單抗、GpIIb/II Ia、英利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、戈利木單抗 TNF-α、巴昔麗單抗(baci Iiximab )、達麗珠單抗、IL-2、奧馬珠單抗、IgE、吉姆單抗、0)33、那 他珠單抗、VLA-4、維多珠單抗α4β7、貝利木單抗、BAFF、奧特力昔珠單抗、特普利珠單抗CD3、 奧法木單抗、奧瑞珠單抗CD20、依帕珠單抗CD22、阿侖單抗CD52、依庫麗單抗C5、卡那木單抗 (^1^1^1]1111]^13)11^-10、美泊利單抗11^-5、瑞利珠單抗、托珠單抗11^-61?、烏斯克努單抗，和布 雷奴單抗IL-12。任選地，該抗體不是布妥昔單抗。
[0099] IX.治療方法和藥物組合物
[0100]按照上述方法產生的ADC以表明劑量、給藥途徑和給藥頻率的有效方案給予，其延 緩待治療疾病的發生、降低其嚴重程度、抑制其進一步劣化，和/或緩解其至少一種跡象或 癥狀，如癌癥、自身免疫疾病或感染，包括任意上述的指示。如果患者已經患有疾病，則方案 可以指治療有效的方案。如果患者相對于一般群體處于疾病的升高風險中但還未經歷癥 狀，方案可以指預防有效的方案。在一些情況中，可在單個患者中相對于歷史對照或同一患 者過去的經歷觀察治療或預防有效性。在其他情況中，治療或預防有效性表現為臨床前或 臨床試驗中治療后患者的群體相對于未治療對照群體的狀況。
[0101] ADC的劑量一般根據ADC的藥物組分變化。示例性劑量可包括，例如1.0yg/kg至 7 · 5mg/kg、或 2mg/kg至7 · 5mg/kg，或 3mg/kg至7 · 5mg/kg 對象體重，或0 · 1-20或0 · 5_5mg/kg 體 重（如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或1011^/1^)或10-1500或200-150011^作為固定劑量。在一些 方法中，給予患者至少1.5mg/kg、至少2mg/kg或至少3mg/kg的劑量，每三周或更久給藥一 次。劑量取決于給藥頻率、患者的狀況和對先前治療的反應(如果有的話），無論該治療是預 防性的還是治療性的且無論該疾病是急性的還是慢性的等。
[0102] 給藥可以是胃腸外、靜脈內、口服、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、局部、鼻內或 肌肉內。還可使給藥直接定位于如腫瘤內。優選通過靜脈或皮下給藥對全身循環進行給藥。 靜脈內給藥可以是例如輸注一段時間（如30-90分鐘)或單次推注注射。
[0103] 給藥頻率取決于ADC在循環中的半衰期、患者的病癥和給藥途徑等因素。該頻率可 以是按照患者病癥的變化或所治療癌癥的進展進行每天、每周、每月、每季度或不規則間隔 給藥。在一段持續治療過程中，靜脈內給藥的一個示例性頻率為介于一周兩次和每季度一 次之間，但也可采用更高或更低頻率的劑量。在一段持續治療過程中，靜脈內給藥的其他示 例性頻率為介于每周一次或每四周三次之間，但也可采用更高或更低頻率的劑量。對于皮 下給藥，示例性劑量頻率為每天至每月，但也可采用更高或更低頻率的劑量。
[0104] 所給予的劑量次數取決于疾病的性質（例如是否存在急性或慢性癥狀)和疾病對 治療的反應。對于急性病癥或慢性病癥的急性惡化，1次至10次之間的劑量通常是足夠的。 對于急性病癥或慢性病癥的急性惡化，有時單次推注劑量(任選以分開的形式)是足夠的。 對于急性病癥或急性惡化的復發，可重復治療。對于慢性病癥，可以規律間隔給予抗體，例 如每周、隔周、每月、每季度、每六個月，持續至少1、5或10年，或患者終身。
[0105] 用于胃腸道外給藥的藥物組合物優選為無菌且基本等滲(240-360m0sm/kg)且在 GMP條件下制造。可以單位劑量形式（即單次給藥的劑量)提供藥物組合物。可使用一種或多 種生理學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑制備藥物組合物。制劑取決于所選擇的 給藥途徑。就注射而言，ADC可配制在水性溶液中，優選生理相容性緩沖液，如漢克斯(Hank' s)溶液、林格(Ringer ' s)溶液或生理鹽水緩沖液或醋酸緩沖液（以減少注射位點的不舒適 性）。該溶液可包含配制劑，如助懸劑、穩定劑和/或分散劑。或者，抗體可以是使用前用合適 的載劑（如無菌無熱原的水)進行重建的凍干形式。液體制劑中抗體的濃度可以是例如1-100mg/ml，如10mg/ml。
[0106] 使用本發明的ADC進行的治療可與化療、放療、干細胞治療、手術、抗病毒劑、抗生 素、免疫抑制劑或刺激物，或其他對所治療病癥有效的療法聯用。可與用于治療癌癥或自身 免疫疾病的ADC-起給予的有用的其他試劑的類別包括，例如，針對癌細胞上表達的其他受 體的抗體、抗微管蛋白藥劑(如耳他汀）、DNA小溝結合物、DNA復制抑制劑、燒化劑(如鉑絡合 物，如順鉑、單鉑、二鉑和三核-鉑絡合物和卡鉑）、蒽環類抗生素、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝 物、化療增敏劑、多卡米星、依托泊甙、氟化嘧啶、離子載體、脂肪酸釋放激素、亞硝基脲、順 鉑、預形成化合物、嘌呤抗代謝劑、嘌呤霉素、放療增敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制 劑、長春花生物堿等。
[0107] 在一些方面中，與不采用ADC的相同治療(例如，化療)相比，采用ADC治療可使腫瘤 患者的中值無進展存活或總體存活時間增加至少30%或40%，但優選50%、60%至70%或 甚至100%或更長，尤其是在復發或難治時。在一些方面中，與不采用ADC的相同治療(例如， 化療)相比，治療(例如，標準化療)可使具有腫瘤的患者的完全反應率、部分反應率或目標 反應率(完全+部分)增加至少30%或40%，但優選50%、60%至70%或甚至100%。
[0108] 通常，相對于接受單獨的標準治療(或加安慰劑）的患者的對照組相比，在臨床試 驗(如II期、ΙΙ/ΠΙ期或III期試驗）中，前述使用標準治療加 ADC治療的患者的中值無進展 存活和/或應答率的提高是統計學上顯著的，例如處于P = O.05或0.01或甚至0.001水平。通 過癌癥的臨床試驗中常規使用的客觀標準測定完全和部分應答率，例如國家癌癥研究所 和/或食品藥品管理局接受或列出的那些。 實施例
[0109] 實施例1=QSOXl存在于從CHO細胞培養物純化的抗體制備物的證據
[0110] 從在CHO細胞中表達的抗體的純化所得的批號DEVNKB-I意外顯示出弱的藥物偶 聯。相反，批號L22042/E顯示所需水平的藥物偶聯。因為藥物與抗體的偶聯受游離巰基介 導，懷疑批號DEVNKB-I中存在具有氧化活性的雜質。圖1顯示氧化性雜質對藥物與抗體偶聯 功效的影響。來自批號DEVNKB-I的抗體(菱形標記)顯示在超過50分鐘的時間里隨著還原時 間增加而減少的載藥量，而來自L22042/E的抗體(方形標記)顯示在還原過程中載藥量的一 致且預期的水平。
[0111] 因為已經觀察到在CHO細胞中產生的其它抗體的某些制備物具有與批號DEVNKB-I 相似的氧化活性，氧化活性的來源是令人感興趣的。為了確定氧化活性的來源，通過凝膠電 泳和Western印跡以及液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析批號DEVNKB-I是否存在巰基氧 化酶。
[0112] 凝膠電泳和WesternEp跡
[0113] 在通過SDS-PAGE分離和銀染后比較批號DEVNKB-I和L22042/E沒有揭示明顯對應 于氧化活性的任何蛋白質條帶(數據未顯示）。為了實現更好的分辨率，通過尺寸排阻色譜 分離批號DEVNKB-1。如實施例2所述，測試組分的氧化活性。參見，圖2a。對應于峰值活性的 組分通過SDS-PAGE分離，印跡，然后用針對候選巰基氧化酶蛋白質(包括QSOXl、QS0X2和ALR (肝再生的增強因子））的抗體染色。圖2b和2c分別顯示了使用抗-ALR和抗-QSOXl-抗，之后 采用兔抗-山羊IgG二抗的Western印跡分析的結果。印跡顯示二抗和許多產物相關物質之 間的廣泛交叉反應性。不過，在抗-QSOXl印跡中檢測到對應于65kD至70kD的分子量的峰值 組分27-29中的條帶（圖2c)，其與倉鼠 QSOXl的預測重量相一致(70，356道爾頓）。
[0114] LC-MS/MS 分析
[0115] 為了鑒定在抗-QSOXl Western印跡中檢測到的65_70kD蛋白質，通過在Poros蛋白 A柱上的親和色譜來分離批號DEVNKB-1。參見，圖3a。如實施例2所述，測試組分的氧化活性。 參見圖3b。基本上，所有的氧化活性都來自組分3和4。來自一系列三次運行的組分3和4經匯 集并通過SDS-PAGE分析。參見圖3c。最明顯的條帶在65-70kD范圍并且形成彌漫的單個條帶 或雙峰，與Western印跡一致。使用凝膠消化和LC-MS/MS，該條帶被鑒定為QSOXl陽性。
[0116] 氧化劑表征
[0117] 除了在批號DEVNKB-I中表征氧化活性，使用亞鐵氧化二甲酚橙(FOX)試驗來測試 該批號的巰基氧化活性。巰基氧化酶催化以下反應：
[0118] 2R-SH+〇2^R-S-S-R+H2〇2
[0119] 隨著反應進行，氧被消耗并且產生過氧化氫。可容易并可靠地檢測到過氧化氫副 產物，并且因此用作巰基氧化酶活性的代表物。在FOX試驗中，過氧化氫氧化亞鐵離子(Fe 2+) 以產生鐵離子(Fe3+)。然后，亞鐵離子與二甲酚橙復合以形成吸收560nm光的化合物。因此， 通過監測560nm光的吸收(例如，使用分光光度計），可確定樣品中巰基氧化活性的量。通過 確定560nm讀數的差，將陰性對照的值與測試樣品的值比較。如果所得的值超過0.1吸光度 單位，則樣品對氧化性雜質而言是陽性的。如表1所示，DEVNKB-I的存在產生0.70-0.80的 560nm吸光度。然而，同時加入DEVNKB-I和ImM Zn2+，吸光度僅為0.008。數據顯示，ImM Zn2+ 可基本上消除批號DEVNKB-I中的氧化活性。這與具有黃素依賴性巰基氧化酶結構域，如 QSOXl的氧化劑相一致。
[0120] 表1
[0122] 進行其它試驗來觀察EDTA能否逆轉批號DEVNKB-I中氧化酶活性的Zn2+-依賴性消 除。在這些實驗中，向含或不含Η)ΤΑ的試驗緩沖劑中加入Zn 2+。另外，評價了具有EDTA的試驗 緩沖劑。如表2所示，相對于含額外EDTA的試驗緩沖劑，由于存在Zn 2+，與批號DEVNKB-I相關 的氧化活性降低了 95%。然而，同時加入Zn2+和額外的EDTA僅僅降低了 6%的氧化活性。因 此，EDTA有效逆轉了氧化活性的Zn2+-依賴性抑制。同樣地，這是對于具有黃素依賴性的巰 基氧化酶結構域的氧化劑(如QS0X1)所預期的。
[0123] 表2
[0125] 基于Western印跡數據、LC-MS/MS數據（未顯示）和氧化活性的表征，確定批號 DEVNKB-I中的氧化活性是QSOXl巰基氧化酶。
[0126] 實施例2:檢測CHO細胞培養物中QSOXl的試驗
[0127] 為了提供對抗體制備物中氧化活性的檢測（例如，當抗體預期與藥物偶聯時），開 發了利用部分還原的SGN-30(cAC10抗體，其是布妥昔單抗的抗體組分作為底物)的試驗。選 擇SGN-30作為底物，因為cACIO抗體已被一致性地純化而沒有QSOXl污染。可代替SGN-30使 用其它具有游離巰基的充分表征的底物。
[0128] 該試驗包括用測試樣品孵育底物（例如，SGN-30) -段固定的時間，然后使用DTNB (5，5'-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸），也稱為埃爾曼試劑)檢測底物中游離巰基的量。
[0129]
[0130] 底物中的游離巰基與DTNB相互反應，切割二硫鍵并且產生2-硝基-5-硫代苯甲酸 根(NTBJ，其在中性和堿性pH下在水中經離子化成NTB2'NTB2^為黃色并且可使用分光光度 計并測量412nm處的可見光吸光度來快速定量。如果測試樣品中存在氧化性雜質，則底物上 的游離巰基(例如，在未已經包括在二硫鍵中的半胱氨酸殘基中）被氧化成二硫鍵，產生較 少的游離巰基。因此，底物和DTNB之間有較少的反應，導致樣品產生較少的黃色和相應的 412nm光處較低的吸光度。
[0131] DTNB和游離巰基之間的反應是快速并且符合化學計量的。因此，如果需要，可使用 14, ISOir1Cnf1的摩爾消光系數對底物中游離巰基的量進行定量(適用于稀釋緩沖劑溶液）。
[0132] 試驗中使用的材料包括分光光度計(例如，Agilent型號8453);石英比色皿(例如， Starna，16.50-Q-10/Z15);1M Tris HCl，pH 7·4;0·5Μ EDTA，pH 8.0;磷酸二氫鉀；磷酸氫 二鉀；聚山梨酯80;DTNB(例如，Sigma D218200)。
[0133] 該試驗包括對至少陰性對照樣品、陽性對照、測試樣品和分光光度計孔板的分光 光度分析。可根據需要分析其它對照和/或測試樣品。對照和測試樣品的成分示于表3。試驗 中使用的緩沖劑是IOmM磷酸鉀，0.2mg/mL聚山梨酯80，pH 6.0。然而，根據待分析的測試樣 品的緩沖劑，其它稀釋緩沖劑也是合適的。待分析樣品的終體積是150yL，但也可根據需要 調節。為了簡化該試驗，可制備含有緩沖劑、EDTA、水和底物(例如，部分還原的cACl 0)的主 混合物，在向I OOyL的主混合物中加入50yL的樣品之后開始試驗。
[0134] 表3
[0136] 如下進行樣品制備和分析。對應于待分析的對照和樣品標記微量離心管。將IOOyL 的主混合物置于各管中。向對應的對照/測試樣品管中加入50yL的各樣品。管通過渦旋混 合。將管置于37°C水浴或孵育器中并孵育2小時。標記各樣品的第二微量離心管并且將100μ L的ImM DTNB置于各管中。在2小時孵育結束時，從水浴/孵育器中移出樣品并且將IOOyL的 樣品轉移至含IOOyL的DTNB的相應微量離心管中。管通過渦旋混合。樣品在室溫下孵育至少 5分鐘，然后確定吸光度。在412nm下測量吸光度并且相對于700nm處的吸光度校正（即，確定 A412-A700) 〇可收集200至700nm的光譜。
[0137] 為了評價測試樣品中存在氧化性雜質，通過確定412nm讀數的差來對陰性對照(緩 沖劑)的值(412nm-700nm)與測試樣品的值進行比較。如果所得的值超過0.1吸光度單位，則 樣品對氧化性雜質而言是陽性的。
[0138] 當測試來自抗體培養物的培養基時，試驗一般產生高的值(約0.5AU)，表明高水平 的氧化劑。然而，試驗讀數基于顏色，并且細胞培養基中的顏色往往干擾試驗讀數。因此，難 以使用該試驗確切測量澄清的收獲物中的氧化性雜質。優選在至少一個純化步驟，例如，在 至少一個色譜步驟之后(例如，在蛋白A、離子交換或HIC色譜之后)測量氧化性雜質。
[0139] 該試驗一般測量巰基氧化酶的活性，包括從QSOXl、QS0X2、ALR和其它酶產生的活 性。也可使用針對具體巰基氧化酶的更具體試驗，例如，如實施例1所述。
[0140] 實施例3:去除QSOXl的方法
[0141] 通過在蛋白A上進行鹽洗滌來減少氧化性雜質
[0142] 在本文中稱為抗體2的第二抗體制備物發現有不可接受的高水平氧化活性(在通 過離心和過濾澄清化之后）。為了去除氧化性雜質，評價了各種強度的鹽洗滌的蛋白A色譜。
[0143] 3 · 2cm直徑，23 · 2cm床高（193 · 2mL床體積）的MabSelect Sure蛋白A柱用25mM 1^8,50禮似(：1，？!17.5平衡，然后加載至258 11^13/1填充床。在加載之后，用含各種水平的 NaCl的50mM Tris緩沖的溶液洗滌柱，如表4所示。使用25mM乙酸鹽，pH 3.4進行抗體洗脫。 流速在4分鐘停留時間中保持恒定。
[0144] 使用實施例2的試驗分析柱洗脫液中氧化性雜質的水平。數據(參見表4)顯示，當 用中等（150mM NaCl)或高（500mM NaCl)濃度的鹽洗滌時，蛋白A洗脫液中不含氧化性雜 質。含低濃度的鹽(50mM NaCl)的洗滌液在將氧化性雜質的水平降至低于0.1的吸光度閾值 方面是無效的。來自高濃度鹽的洗滌液含有高水平的氧化性雜質，證明高濃度鹽洗滌液使 雜質從柱樹脂或mAb上解吸。
[0145] 該結果一般表明氧化性雜質對蛋白A配體、樹脂主鏈和/或mAb的親和性被高離子 強度溶液破壞，這與離子相互作用相一致。
[0146] 表4
[0148] 深度過濾
[0149] 也測試深度過濾去除氧化性雜質的能力。深度濾器，Millipore XOHC濾器用50-lOOL/m2的水潤濕并且用至少15L/m2的平衡緩沖劑（例如，pH為7.5-8并且NaCl濃度為50-IOOmM)平衡。以230L/m 2/小時進行過濾。在20-60L/V的目標上樣系數下的（LMH)。為了回收 產品，用足夠體積的平衡緩沖劑沖洗濾器以確保達到目標峰值收集。通過280nm處的吸光度 來收集濾液。使用這類條件，去除氧化性雜質。
[0150] 陰離子交換-Capto Q
[0151] 觀察到Capto Q強陰離子交換柱(GE醫療生命科學公司，目錄號17-5316)當在用pH 8.0和電導率<8mS/cm(例如，5-7mS/cm)的緩沖劑的流出模式下運行時導致去除氧化性雜 質。這些條件提供了使用Capto Q柱評價氧化性雜質去除的起點。對于抗體1，證明需要具 有低電導率和高pH的緩沖劑來有效清除氧化性雜質。以流出模式運行Capto Q柱。在合適的 條件下，樹脂不滯留mAb，而樹脂吸附氧化性雜質。之后使用高鹽緩沖劑從樹脂上提取氧化 性雜質。對于第二抗體，抗體2，如表5所示，在7.5的pH下證明有效清除(7.5-8有效），前提是 緩沖劑的電導率是llmS/cm(需要低于或等于11的電導率）為7并且電導率范圍為11-15mS/cm的緩沖劑在以流出模式從mAb分離雜質方面是無效的，如pH 7.5且電導率151115/〇11 的緩沖劑。
[0152]表5
[0154] 苯基膜
[0155] 當以流出模式運行時，還已經發現Sartobind Pheny丨⑧從CHO細胞中產生的抗體制 備物中有效清除氧化性雜質。在合適的條件下，氧化性雜質被膜滯留，而mAb不被滯留。之后 可使用低鹽緩沖劑從樹脂上提取氧化性雜質。通過將抗體稀釋至目標檸檬酸鹽摩爾濃度 (一般是0.3-0.4M檸檬酸鈉)和pH( -般是6-8)來制備上樣物。膜在5倍膜體積(MV)的選擇匹 配稀釋的抗體上樣物的平衡緩沖劑中平衡。然后將稀釋的上樣物施加到膜上，并且用IOMV 的稀釋緩沖劑洗滌膜。不含氧化性雜質的抗體制備物來自流出液。用例如50mM Tris，pH 8 來洗脫結合的材料，并且用例如5MV的pH 6.5的25mM磷酸鈉，20 % IPA來再生膜。以IOmL/分 鐘或3.3MV/分鐘運行該過程。收集流出的整個峰，例如，使用2mm流體路徑在280nm下從0.1 至0.1AU。
[0156] 表6提供了來自苯基膜上的純化步驟的數據。在苯基流出液中測量的氧化性雜質 的水平范圍是0.1至0.04吸光度單位。
[0157] 表6
[0159] 為了確定使用苯基膜的操作穩健性，在不同的pH和檸檬酸鹽摩爾濃度的條件下應 用苯基膜純化步驟之后評價抗體2制備物中存在的氧化性雜質。參見表7。為了降低流出液 中氧化性雜質的水平，檸檬酸鹽的摩爾濃度優選上限，〇. 4M。
[0160] 表7
[0162] 上文和下文中提到的所有專利申請、網頁、其他出版物、登錄號等均通過引用全文 納入本文以用于所有目的，就好像各項均特定和單獨表示通過引用納入本文。如果不同版 本的序列在不同的時間與一個登錄號相關，則表示在本申請的有效申請日與該登錄號相關 的版本。有效申請日表示早于實際申請日或關于該登錄號的一項優選權申請的申請日（如 果適用）。類似地，如果不同版本的出版物在不同時間公開，除非另有說明，否則表示與本申 請的有效申請日最接近時間公開的版本。除非另有特定說明，本發明中的任意特征、步驟、 元件、實施方式或方面均可與任意其他的聯用。雖然出于方便和理解的目的，通過闡述和舉 例的方式詳細描述了本發明，但可明顯看出，某些改變和修改應屬于所附權利要求書的范 圍。
[0163] 序列表：
[0164] SEQ ID NO: 1:
[0165] MATGLRRREYIWLLWALTITVSYLVALFSHLLRILTVKKLQWRPVLNLAVLDCAEETNTAVCRDFNISG FPTVRFFKAFSKNGSGITLPVADASVETLRRKLIDALESHSDMWSSSRPKLKPAKLVEINEFFAETNEDYLVLIFED KDSYVGREVTLDLFQHHIPVHRVLNTERNAVSKFGVVEFPSCYLLFRNGSFSRVPVVMESRLFYTSYLKGMSGPILV DPPTTTISTDAPVTTDVVPTVWKVANHARIYMADLESSLHYIFLVEVGKFSVLEGQRLLALKKLVAVLAKYFPGRPL AQNFLHSIHDWLQRQQRKKIPYKFFRAALDNRKEGIVLTEKVNWVGCQGSKPHFRGFPCSLWILFHFLTVQASRYSE NHPQEPADGQEVLQAMRSYVQWFFGCRDCAEHFENMAASTMHRVRSPTSAVLWLffTSHNKVNARLSGAPSEDPYFPK VQWPLRELCFDCHNEINGREPVWDLEATYRFLKAHFSSENIILDTPVAGLATQRNPQILGATPEPVMDALELETRNS VLGHERAASTESPGATALNVPVGKPEASGPQALYTGQGPPEHMEEPQRVTQGHTQGQQHLSKRDTEVLTLPEVNHLQ GPLELRRGGRSPKQLVNIPEGEPEAPAIRGQGPWLQVLGRGFSHLDISLCVGLYSVSFVCLLAMYTYFRARLRTPKG HLVTQ
[0166] SEQ ID NO:2:
[0167] MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG AVQVSVLYSS SDPVTVLNAN TVRSTVLRSN GAffAVEFFAS WCGHCIAFAP TffKELAYDVR EffRPVLNLAV LDCAEETNTA VCRDFNISGF PTVRFFKAFS KNGSGITLPV ADASVETLRR KLIDALESHS DMffSSSRPKL KPAKLVEINE FFAETNEDYL VLIFEDKDSY VGREVTLDLF QHHIPVHRVL NTERNAVSKF GVVEFPSCYL LFRNGSFSRV PVVMESRLFY TSYLKGMSGP ILVDPPTTTI STDAPVTTDV VPTVffKVANH ARIYMADLES SLHYIFLVEV GKFSVLEGQR LLALKKLVAV LAKYFPGRPL AQNFLHSIHD WLQRQQRKKI PYKFFRAALD NRKEGIVLTE KVNWVGCQGS KPHFRGFPCS LffILFHFLTV QASRYSENHP QEPADGQEVL QAMRSYVQffF FGCRDCAEHF ENMAASTMHR VRSPTSAVLff LffTSHNKVNA RLSGAPSEDP YFPKVQffPLR ELCFDCHNEI NGREPVffDLE ATYRFLKAHF SSENIILDTP VAGLATQRNP QILGATPEPH M
【主權項】
1. 一種產生偶聯的抗體的方法，所述方法包括： (a) 進行純化方案中的至少一個純化步驟，W從表達所述抗體的C冊細胞的培養物中獲 得至少部分純化的抗體制備物； (b) 測試所述制備物是否存在CHO細胞氧化酶； (C)如果檢測到步驟(b)的制備物中存在不可接受水平的所述酶，則用不同的純化步驟 重復步驟(a)和(b); (d)如果檢測到步驟(b)的制備物中CHO細胞氧化酶W可接受水平存在或不存在，則對 表達所述抗體的CH0細胞的同一培養物或第二培養物進行導致可接受水平的CH0細胞氧化 酶或檢測不到C冊細胞氧化酶的至少一個純化步驟，W獲得至少部分純化的抗體制備物。2. 如權利要求1所述的方法，所述方法還包括步驟(e)將所述至少部分純化的抗體通過 一個或多個琉基基團與藥物偶聯，W產生偶聯的抗體。3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述(?0細胞氧化酶是QS0X1。4. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(d)中的第二培養物是在體 積上比步驟(a)中的培養物大的培養物。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(d)中的第二培養物在體積上比步驟(a) 中的培養物大至少1000倍。6. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，在至少一年的一段時間中對所述抗體的不同 培養物多次進行步驟(d)和(e)。7. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，導致可接受水平的酶或檢測不到 酶的純化方案包括W下步驟中的至少一個:用150-500mM化C1濃度的鹽洗涂液洗涂蛋白A 柱、使用深度過濾、用季錠離子柱進行陰離子交換，或苯基膜過濾。8. 如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述測試包括鑒定凝膠上65- 75kDa的條帶。9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，通過Western印跡或銀染來鑒定所述條帶。10. 如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述測試包括對QS0X1活性的功 能性測試。11. 如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述功能性測試產生過氧化氨作為所述活 性的指標。12. 如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述活性被鋒離子抑制，所述抑制被抓TA 逆轉。13. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗體不是布妥昔單抗。14. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞毒性藥物選自抗微管 蛋白劑、DNA小溝結合物、DNA復制抑制劑、化療敏化劑和化咯并苯并二氮雜菩二聚體。15. -種確定從(?0細胞培養物中純化抗體的方法的方法，所述方法包括： (a) 進行純化方法，W從表達所述抗體的C冊細胞的培養物中獲得至少部分純化的抗體 制備物； (b) 測試所述制備物是否存在CH0酶QS0X1; (C)如果檢測到步驟(b)的制備物中存在不可接受水平的所述酶，則用不同的純化方法 重復步驟(a)和(b);16. -種產生偶聯的抗體的方法，所述方法包括： 通過純化方法從CHO細胞的培養物中純化抗體，所述純化方法包括W下步驟中的至少 一個:在25-lOOmM化C1濃度下洗涂蛋白A柱、使用深度過濾、用季錠離子柱進行陰離子交 換，或苯基膜過濾，其中所述抗體與培養物中的QS0X1酶分離;并且將純化的抗體通過一個 或多個琉基與細胞毒性藥物偶聯W產生所述偶聯的抗體。17. -種產生偶聯的抗體的方法，所述方法包括： (a) 進行純化方案中的至少一個純化步驟，W從表達所述抗體的C冊細胞的培養物中獲 得至少部分純化的抗體制備物； (b) 將所述至少部分純化的抗體通過一個或多個琉基與細胞毒性藥物在一定條件下偶 聯W產生所述偶聯的抗體，其中產生不可接受地低的水平的偶聯的抗體； (C)測試步驟(a)的純化的制備物是否存在(?0細胞氧化酶； (d) 如果在步驟(C)中檢測到存在不可接受水平的所述CHO細胞氧化酶，則用不同的純 化步驟進行步驟(a)和（C)直至步驟(C)中不存在所述CHO細胞氧化酶或存在可接受水平的 所述CHO細胞氧化酶； (e) 對表達所述抗體的CHO細胞的第二培養物進行導致可接受水平QS0X1酶或檢不測到 QS0X1酶的至少一個純化步驟，W獲得純化的抗體;和 (f) 將所述純化的抗體通過一個或多個琉基基團偶聯至細胞毒性藥物，W產生所述偶 聯的抗體。18. -種產生偶聯的抗體的方法，所述方法包括： (a) 獲得抗體的制備物； (b) 測試所述制備物是否存在CHO細胞氧化酶； (C)如果檢測到步驟(b)的制備物中存在不可接受水平的所述酶，則進行純化步驟W將 所述C冊細胞氧化酶去除至可接受的水平;和 (d)將所述至少部分純化的抗體通過一個或多個琉基基團偶聯至藥物，W產生所述偶 聯的抗體。19. 一種確定抗體制備物是否適合用作藥物的方法，所述方法包括W下步驟： 測試所述制備物是否存在CHO細胞氧化酶； 如果在所述抗體制備物中檢測到存在不可接受水平的所述酶，則鑒定所述制備物為不 適于偶聯且需要進一步純化;和 如果所述抗體制備物中檢測不到酶或檢測到可接受水平的酶，則鑒定所述制備物適于 偶聯。20. -種確定抗體制備物是否適合偶聯至藥物的方法，所述方法包括W下步驟： 測試所述制備物是否存在CHO細胞氧化酶； 如果在所述抗體制備物中檢測到存在不可接受水平的所述酶，則鑒定所述制備物為不 適于偶聯且需要進一步純化;和 如果所述抗體制備物中檢測不到酶或檢測到可接受水平的酶，則鑒定所述制備物適于 偶聯。21. -種確定抗體制備物是否適合用作藥物的方法，所述方法包括W下步驟： 測試所述制備物是否存在CHO細胞氧化酶。22. -種確定抗體制備物是否適合偶聯至試劑(例如，藥物）的方法，所述方法包括W下 步驟： 測試所述制備物是否存在CHO細胞氧化酶。23. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗體是在CHO細胞中產生 的抗體。24. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗體制備物已經經歷至少 一個純化步驟。25. 如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述純化步驟是色譜純化步驟。26. -種抗體藥物偶聯物，其中所述抗體在偶聯之前經歷是否存在CHO細胞氧化酶的測 試。27. 如權利要求15或17-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述測試包括鑒定凝膠 上65-75kDa的條帶。28. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，通過Western印跡或銀染來鑒定所述條帶。29. 如權利要求15或17-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述測試包括對QS0X1活 性的功能性測試。30. 如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述功能性測試產生過氧化氨作為所述活 性的指標。31. 如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述活性被鋒離子抑制，所述抑制被抓TA 逆轉。32. 如權利要求1-7、15或17-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述測試設及監測 對照樣品和測試樣品中游離琉基和DTNB之間的反應，并且比較兩者。
【文檔編號】A61K39/395GK105979963SQ201480064191
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年11月21日
【發明人】B·海耶斯, K·比姆, D·邁耶, R·萊昂, J·瓦里爾-道格拉斯
【申請人】西雅圖基因公司