用于治療癌癥和感染性疾病的方法和組合物的制作方法

用于治療癌癥和感染性疾病的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物；以及使用所述組合物來治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的方法。本發明還涉及CD4淋巴細胞耗竭劑和至少一種其它藥劑的組合用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的用途。所述其它藥劑可以是免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑或免疫調節劑或其組合。
【專利說明】
用于治療癌癥和感染性疾病的方法和組合物
技術領域
[0001] 本發明涉及分子免疫學和細胞生物學。本文具體描述了使用單獨CD4淋巴細胞耗 竭劑或與免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑或免疫調節劑中的任何一種或多 種組合來治療癌癥或感染性疾病的組合物和方法。
【背景技術】
[0002] 本文中所引用的所有出版物均通過引用整體并入，其程度就如同每個單獨的出版 物或專利申請被明確地和單獨地指定為通過引用并入一樣。以下描述包括可以用于理解本 發明的信息。這并不是承認本文所提供的任何信息是現有技術或與目前要求保護的發明相 關，或明確或隱含地引用的任何出版物是現有技術。
[0003] 免疫系統可以提供針對癌癥的保護。有效的免疫刺激產生持久的記憶淋巴細胞， 其能夠對重復抗原激發快速地作出應答。表達CD4的淋巴細胞包括輔助性T細胞和調節性T 細胞。輔助性T細胞對于增加過繼免疫反應是關鍵的。然而，調節性T細胞(Treg)抑制細胞毒 性T細胞的功能并且通常用于限制免疫反應。因此，CD4耗竭被評價為用于消除Treg活性的 策略。雖然⑶4淋巴細胞中只有一小部分是Treg細胞，但⑶4耗竭仍然是用于消耗Treg活性 的有效方法，并且重要的是，它具有快速轉變到臨床使用的潛力。人源化CD4耗竭抗體已經 在自身免疫病癥的臨床試驗中被評價為抑制免疫系統的策略。然而，本文所描述的是使用 CD4淋巴細胞耗竭抗體來刺激免疫系統。本文提供了針對受試者中的癌癥和感染性疾病的 療法，所述療法是通過將CD4+淋巴細胞的耗竭與免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫 佐劑和免疫調節劑或其組合中的任何一種或多種組合。

【發明內容】

[0004] 本發明的各個實施方案提供用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/ 或減緩其進展的方法。所述方法包括提供包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物和向受試者施 用治療有效量的該組合物，從而治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其 進展。
[0005] 本發明的各個實施方案提供用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/ 或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑和選自由免疫檢查點抑制劑、 過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的組的至少一種其它藥劑；以及向受試者施 用治療有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑和治療有效量的免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、 免疫佐劑和免疫調節劑中的至少一種，從而治療、預防受試者中的病狀、減輕嚴重程度和/ 或減緩其進展。在一些實施方案中，所述方法進一步包括施用治療有效量的mTOR抑制劑。
[0006] 本發明的各個實施方案提供用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/ 或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑和過繼免疫治療劑(例如，樹 突細胞(DC)疫苗）以及施用治療有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑和治療有效量的過繼免疫治 療劑，從而治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展。
[0007] 本發明的各個實施方案提供用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/ 或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑和檢查點抑制劑(例如，抗ro-1抗體)和施用治療有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑和治療有效量的檢查點抑制劑，從而治療、 預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展。
[0008] 本發明的各個實施方案提供用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/ 或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑、樹突細胞(DC)疫苗和mTOR抑 制劑以及施用有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑、樹突細胞疫苗和mTOR抑制劑中的每一種，從而 治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展。
[0009] 本發明的各個實施方案提供包含CD4淋巴細胞耗竭劑的藥物組合物。另外的實施 方案提供包含免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑中的任一種的 藥物組合物。
[0010] 本發明的各個實施方案提供用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/ 或減緩其進展的試劑盒。所述試劑盒包括CD4淋巴細胞耗竭劑和關于使用組合物來治療、預 防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的說明書。
[0011] 本發明的各個實施方案提供用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/ 或減緩其進展的試劑盒。所述試劑盒包括CD4淋巴細胞耗竭劑以及免疫檢查點抑制劑、過繼 免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑中的至少一種。所述試劑盒進一步包括關于使用CD4淋 巴細胞耗竭劑以及免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑中的至少 一種來治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的說明書。
[0012] 在各個實施方案中，所述病狀是癌癥。在示例性的實施方案中，癌癥可以是腎癌、 黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、肺癌、結腸癌或膀胱癌中的任一種。在一些實 施方案中，所述病狀是感染性疾病。
[0013] 本發明的各種方法、組合物和試劑盒可用于治療癌癥或感染性疾病。在示例性實 施方案中，本發明的方法、組合物和試劑盒可用于治療惡性贅生細胞增生性病癥或疾病的 某些子集，包括但不限于癌和黑色素瘤。在示例性實施方案中，癌包括腎細胞癌。
【附圖說明】
[0014] 在參照圖中說明了示例性實施方案。希望本文所公開的實施方案和附圖將被認為 是說明性的而非限制性的。
[0015] 圖1根據本發明的各個實施方案描繪了存在mTOR抑制的免疫刺激和抑制作用二 者;然而凈效應是增強的抗腫瘤免疫。（a)黑色素瘤腫瘤預防模型的實驗方案:小鼠 （n = 5/ 組)在第-30天和第-23天接受腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗，并在第-23天至第-13天每日腹膜 內注射替西羅莫司（temsirolimus)。在第0天，將B16腫瘤細胞皮下注射到側腹中。示出了 B16腫瘤生長(左側)和生存(右側）曲線。結果代表重復實驗。（b)表征在用DC疫苗和替西羅 莫司治療后的淋巴細胞的實驗方案：將Thy I. IPme 1 -1淋巴細胞過繼轉移至Thy 1.2B6小鼠 中，該小鼠在第-6天接受腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗并且每日接受替西羅莫司達5天。在第0 天收獲脾細胞，并針對〇)8、11^1.1、11^丨』〇11168和0)4/^(??3染色并通過流式細胞術進行分 析。提供了代表性結果(左)和匯總數據(右）。結果代表重復實驗。（c)使用經替西羅莫司處 理48小時的pmel-Ι淋巴細胞和腫瘤裂解物脈沖的CpG活化DC，在體外混合培養物中表征淋 巴細胞。針對〇)8、11^1.1、11^丨』〇11168和0)4/^(??3使淋巴細胞染色并通過流式細胞術進行 分析。提供了代表性結果（左）和匯總數據（右）。結果代表重復實驗。*P<〇.〇5，**p< 0.01，***ρ<0·005〇
[0016] 圖2根據本發明的各個實施方案描繪了CD4耗竭增強mTor抑制的抗腫瘤作用。（a) 在第〇天，將RENCA-CA9腫瘤細胞植入到Balb/C小鼠中（n = 5/組）。在第6天和第10天用aCD4 抗體使⑶4淋巴細胞耗竭。在第14至第34天，每天用替西羅莫司處理小鼠。監測腫瘤生長。結 果代表三次重復實驗。（b)在相同的實驗中，在第45天收獲淋巴細胞，用CA9肽再刺激，并且 針對CD8和IFN γ染色。（c)在⑶4耗竭后，在第0、1、10天收集脾、淋巴結和血液。針對⑶4、⑶8 和FoxP3使淋巴細胞染色并通過流式細胞術進行分析。（c-e)報告了在CD4耗竭后的第0、1、 I〇天的脾、淋巴結和血液中的CD4細胞的百分比。（d)在CD4耗竭后，報告了 CD4或CD8陽性的 脾細胞的百分比，并且報告了FoxP3陽性的CD4細胞的百分比。（e)在相同的實驗中，報告了 CD4、CD8和CD4/FoxP3 陽性的脾細胞的絕對數量。*p <0 · 05，**p <0 · 01，***p <0 · 005。
[0017] 圖3根據本發明的各個實施方案描繪了 CD4耗竭和替西羅莫司的組合產生依賴于 記憶CD8細胞的抗腫瘤免疫。（a)每日用替西羅莫司處理荷瘤小鼠 （n = 8)，然后在原發性腫 瘤植入后第35天用RENCA-CA9再激發。在第36天通過注射aCD8抗體使⑶8細胞耗竭。（b)用替 西羅莫司和CD4耗竭處理荷瘤小鼠 （n = 8)，然后在原發性腫瘤植入后第35天用RENCA-CA9再 激發。在第36天通過注射aCD8抗體使CD8細胞耗竭。（c-e)從經過替西羅莫司和CD4耗竭處理 的小鼠中收獲淋巴細胞。用CA9肽和IL2(10u/ml)體外培養淋巴細胞3天，然后過繼轉移到初 次用于實驗的B6小鼠中，在24小時后通過靜脈內注射的2xl0 5個RENCA腫瘤細胞激發該小 鼠。在靜脈內腫瘤激發后第30天收集肺。測定了肺重量(d)和肺腫瘤沉積物的數量(ehlL〗 (白細胞介素 _2)，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.005。
[0018] 圖4根據本發明的各個實施方案描繪了 CD4耗竭和替西羅莫司治療的組合增強CD8 記憶細胞的功能。（a)實驗方案:將來自Thyl. IPmel-I小鼠的淋巴細胞過繼轉移到Thyl .2B6 小鼠中，用腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗進行刺激并在第7天和第10天用aCD4抗體處理，并且在 第10天至第24天每日用替西羅莫司處理。結果代表三次重復實驗。（b)在用腫瘤裂解物脈沖 的DC疫苗進行再激發前一天收獲脾細胞(n = 3/組），用抗體染色，并通過流式細胞術進行分 析。示出了對于指示標記陽性的CD8細胞的百分比。（c)在用腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗進行 再激發后的4天收獲脾細胞(n = 3/組），用抗體染色，并通過流式細胞術進行分析。示出了對 于指示標記陽性的⑶8細胞的百分比。*p <0.05, <0.01<0.005。
[0019] 圖5根據本發明的各個實施方案描繪了 F〇XP3+Treg耗竭和替西羅莫司的組合增強 體內CTL功能。(a)實驗方案:DEREG小鼠接受腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗，并在第6天和第10天 通過腹膜內用白喉毒素處理，并且在第10天至第20天每日用替西羅莫司處理。在第35天進 行體內CTL測定。（b)使用在用白喉毒素處理小鼠之前和之后獲得的外周血淋巴細胞，通過 流式細胞術評估CD4+FoxP3+細胞。（c)使用在注射靶細胞后14小時收獲的脾細胞通過流式 細胞術分析體內CTL結果。CTL(細胞毒性T淋巴細胞），*p<0.05，#p<0.01，*#p<0.005。
[0020] 圖6根據本發明的各個實施方案描繪了 F〇xP3+Treg的過繼轉移在用CD4耗竭和替 西羅莫司的組合處理過的小鼠中降低體內CTL功能。（a)實驗方案:B6接受腫瘤裂解物脈沖 的DC疫苗，并在第6天和第10天通過腹膜內用α⑶4抗體處理，并且在第14天至第24天每日用 替西羅莫司處理在第20天過繼轉移從來自接受腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗的GFP-FoxP3小鼠 的淋巴細胞分選的Treg，并在第35天進行體內CTL測定。（b)使用在注射靶細胞后14小時收 獲的脾細胞通過流式細胞術分析體內CTL結果（n = 3/組）。葉<0.05，**p<0 . Ol 0.005〇
[0021] 圖7根據本發明的各個實施方案描繪了在經過CD4耗竭處理后，恢復的Treg群體的 免疫抑制性降低。（a)使用在圖4a中所概述的實驗方案處理小鼠。在第45天，通過流式細胞 術檢查脾細胞中的CD4+FoxP3+細胞。（b)在CD4耗竭后回收的脾細胞被用來富集CD4+細胞， 其然后通過⑶25狀態進行分選。對于所得組，示出了針對⑶4+⑶25+狀態和⑶4+⑶25-狀態 的代表性流式細胞術。（c)CD4+CD25-細胞與用B16腫瘤裂解物脈沖的DC共培養。通過流式細 胞術分析CD4+CD25-細胞的IFN γ或IL4表達。（d) CD4+CD25+細胞與用Bl6腫瘤裂解物脈沖的 DC和來自使用B16腫瘤裂解物脈沖的DC進行免疫的小鼠的CD8細胞共培養。通過流式細胞術 使用CFSE稀釋測定監測CD8細胞增殖。*p<0 · 05，#p<0 · 01，*#p<0 · 005。
[0022] 圖8根據本發明的各個實施方案描繪了腫瘤增加 Treg。檢查來自荷瘤小鼠（直徑為 約I cm)和無腫瘤對照小鼠的淋巴結、脾、骨髓和外周血淋巴細胞(PBL)中表達FoxP3的⑶4細 胞的百分比。示出了流式細胞術結果。
[0023]圖9根據本發明的各個實施方案描繪了 aCD4抗體使效應CD4亞型耗竭。(a)在施用α CD4抗體之前(第0天)和之后的1天或10天收集脾細胞，并通過流式細胞術進行分析。示出了 針對CD4和IL-2、IL-4或IL-17染色的總脾細胞的數目。（b)示出了針對IL-2、IL-4或IL-17染 色的⑶4細胞的百分比。
[0024] 圖10根據本發明的各個實施方案描繪了免疫刺激前的CD4耗竭阻止CD8記憶細胞 的形成。實驗方案類似于圖4。包括其中在第-1天和第+1天施用aCD4抗體的另一個組(組A)。 (a)示出了在再激發記憶細胞后5天收獲的脾細胞中表達Thyl. 1的CD8細胞的百分比。（b)示 出 了表達 Eomes 的 CD8 細胞的百分比。*ρ<0·05，**ρ<0·01，***ρ<0·005。
[0025] 圖11根據本發明的各個實施方案描繪了 Treg或CD4細胞的耗竭增強抗腫瘤作用。
[0026] 圖12根據本發明的各個實施方案描繪了 CD4耗竭增強Η)-1阻斷抗腫瘤作用。
[0027] 圖13根據本發明的各個實施方案描繪了 CD4耗竭增強腫瘤特異性細胞免疫。A.實 驗示意圖。B.CD4耗竭刺激腫瘤特異性干擾素 -γ從CD8細胞的分泌。因此，CD4耗竭導致能夠 響應于腫瘤而被活化的CD8細胞的訓導。C.這些相同的CD8細胞能夠殺傷RENCA腫瘤細胞。 D.B16腫瘤生長曲線。
[0028] 圖14根據本發明的各個實施方案描繪了抗CD4抗體、替西羅莫司和樹突細胞疫苗 的組合展現增強的抗腫瘤活性。Α.實驗示意圖。Β.示出了具有平均值標準誤差（SEMW^B16 腫瘤生長曲線。**Ρ<〇.〇〇1。
【具體實施方式】
[0029] 本文引用的所有參考文獻通過引用整體并入，就如同完全闡述一般。除非另有規 定，否則本文所使用的技術和科技術語具有如本發明所屬技術領域的一般技術人員通常所 理解的相同含義。Al Ien等人，Remington: TheSc ienceandPracticeof Pharmacy第22版， PharmaceuticalPress(2012 年 9 月 15 曰）；Homyak等人， IntroductiontoNanoscienceandNanotechnology，CRCPress(2008);Singleton和 Sainsbury，Di ctionaryofMicrobio IogyandMo IecularBio Iogy第3版，修訂版，，J .Wil ey& Sons(NewYork，NY2006);Smith,March' sAdvancedOrganicChemistryReactions， MechanismsandStructure第7版，J.Wiley&Sons(NewYork，NY2013);Singleton， DictionaryofDNAandGenomeTechnology第3版，Wiley-BlackwelI (November28,2012);以及 Green和Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual第4版， ColdSpringHarborLaboratoryPress (ColdSpringHarbor，NY2012)提供給本領域技術人員 關于本申請中所用的許多術語的一般指導。關于如何制備抗體的參考文獻，參見 Greenfield,AntibodiesALaboratoryManual第2版，ColdSpringHarborPress (ColdSpringHarborNY，2013); K6hler和MiIstein，Derivationofspecificantibody-producingtissuecultureandtumorlinesbycelIfusion,Eur.J.Tmmunol·1976年7月6 日 (7) :511-9;9116611和361;[01<:，!1111]1&11126(1;[1111]11111〇81〇13111;[118，美國專利第5,585,089號（1996年 12月）；以及Riechmann等人，Reshapinghumanantibodiesfortherapy，Naturel988Mar24， 332(6162):323-7。
[0030] 關于兒科學的參考文獻，參見Schwartz等人，The5_MinutePediatricConsult第4 版，，LippincottWilliams & Wilkins，（Junel6, 2005) ;Robertson 等人， TheHarrietLaneHandbook:AManualforPediatricHouseOfficers第I7版，Mosby(2005年6月 24 曰）；和Hay 等人，CurrentDiagnosisandTreatmentinPediatrics (CurrentPediatricsDiagnosis&Treatment)第18版，McGraw-HiIlMedical(September25， 2006) 〇
[0031] 本領域技術人員將認識到類似于或等同于本文所描述的那些的許多方法和材料， 它們可以用于本發明的實踐中。結合以舉例方式說明本發明的實施方案的各種特征的附 圖，本發明的其它特征和優點將從以下詳細描述變得顯而易見。實際上，本發明不以任何方 式限于所描述的方法和材料。為方便起見，本文、本說明書、實施例和所附權利要求中所采 用的某些術語集合于此。
[0032] 除非另有說明，或由上下文暗示，否則下列術語和短語包括下文提供的含義。除非 另外明確說明，或從上下文中顯而易見，否則以下術語和短語不排除所述術語或短語在其 所屬領域中已獲得的含義。所述定義被提供來幫助描述具體實施方案，并且不旨在限制要 求保護的發明，因為本發明的范圍僅受權利要求限制。除非另有規定，否則本文所使用的所 有技術和科學術語具有如本發明所屬技術領域的一般技術人員通常所理解的相同含義。 [00 33]如本文中所使用，術語"包含（comprising)"或"包含（comprises)"被用來指在一 個實施方案中有用的組合物、方法和其相應的組分，還開發式地包含未指定的要素，它們無 論是否有用。本領域內的人員應該了解的是，一般情況下，本文所使用的術語通常旨在作為 "開放式"術語(例如，術語"包括"應該被解釋為"包括但不限于"，術語"具有"應該被解釋為 "具有至少"，術語"包括"應該被解釋為"包括但不限于"等）。
[0034]除非另有說明，否則在描述本申請的一個具體實施方案的上下文中（特別是在權 利要求書的上下文中）使用的術語"一種"和"一個"和"該"以及類似提及可以被解釋為涵蓋 單數和復數。本文中列舉的值的范圍僅旨在用作單獨地提及落在該范圍內的每個不同值的 速寫方法。除非本文另有指示，否則每個單獨的值被并入本說明書中，就如同它在本文中被 單獨地列舉一樣。可以按照任何適當的順序進行本文中描述的所有方法，除非本文中另外 指示或顯然與上下文矛盾。針對本文的某些實施方案所提供的任何和所有實例或示例性用 語(例如，"諸如"）的使用僅旨在更好地闡明本申請，并且不對另外要求保護的本申請的范 圍構成限制。縮寫"e.g.(例如)"衍生自拉丁語exempligratia，并且在本文中用于指示非限 制性實例。因此，縮寫"e.g."與術語"例如"同義。本說明書中沒有任何語言應該被解釋為指 示任何未要求保護的元素對本申請的實踐是必要的。
[0035] 如本文中所使用，術語"治療"或"改善"在關于疾病、病癥或醫學病狀使用時是指 治療性治療和預防性或防范性措施，其中目的是防止、逆轉、緩解、改善、抑制、減輕、減緩或 阻止癥狀或病狀的進展或嚴重程度。術語"治療"包括減少或減輕病癥的至少一種不良作用 或癥狀。如果一種或多種癥狀或臨床標記減少，則治療一般是"有效的"。或者，如果疾病狀 態的進展減少或停止，則治療是"有效的"。也就是說，"治療"不僅包括癥狀或標記的改善， 而且還包括癥狀的進展或惡化(將在缺少治療的情況下預期到）的停止或至少減緩。此外， "治療"可以意指追求或獲得有益的結果，或降低個體發展病狀的機會，即使該治療最終是 不成功的。需要治療的受試者包括已患有所述病狀的受試者以及易于患有所述病狀的受試 者或將要預防所述病狀的受試者。
[0036] "有益的結果"或"期望的結果"可以包括但決不限于:減輕或緩解疾病狀況的嚴重 程度、防止疾病狀況惡化、治愈疾病狀況、防止疾病狀況發展、降低患者發展疾病狀況的機 會、降低發病率和死亡率以及延長患者的生命或預期壽命。作為非限制性實例，"有益的結 果"或"期望的結果"可以是一種或多種癥狀的緩解、不足程度的降低、癌癥進展的穩定（即， 未惡化)狀態、轉移或侵襲的延遲或減緩以及癌癥相關癥狀的改善或減輕。
[0037] 如本文中所使用，術語"施用"是指通過使如本文所公開的藥劑至少部分定位在所 需位點的方法或途徑將該藥劑置于受試者中。
[0038] 如本文中所使用，"癌癥"或"腫瘤"是指干擾身體器官和系統的正常功能的不受控 制的細胞生長，和/或所有贅生細胞生長和增殖(無論是惡性還是良性的），以及所有的癌前 和癌性細胞和組織。在此定義中包括良性和惡性癌癥，以及休眠腫瘤或微轉移。如本文中所 使用，術語"癌"是指由上皮細胞所引起的癌癥。如本文中所使用，術語"侵入性"是指浸潤和 破壞周圍組織的能力。黑色素瘤是皮膚腫瘤的侵入性形式。癌癥的實例包括但不限于:B細 胞淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤和/或非霍奇金氏淋巴瘤）、腦腫瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、肝細 胞癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲狀腺癌、腎癌、癌、黑色素 瘤、頭頸癌、腦癌和前列腺癌(包括但不限于雄激素依賴性前列腺癌和雄激素非依賴性前列 腺癌）。
[0039] 如本文中所使用，"病狀"和"疾病狀態"可以包括癌癥、腫瘤或感染性疾病。在示例 性實施方案中，所述病狀包括但決不限于惡性贅生細胞增生性病癥或疾病的任何形式。在 示例性實施方案中，病狀包括腎癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、肺癌、結腸 癌或膀胱癌中的任何一種或多種。
[0040] 本文所使用的"免疫細胞"是指哺乳動物免疫系統的細胞，包括但不限于:抗原呈 遞細胞、B細胞、嗜堿性粒細胞、細胞毒性T細胞、樹突細胞、嗜酸性粒細胞、粒細胞、輔助性T 細胞、白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、記憶細胞、單核細胞、天然殺傷細胞、中性粒 細胞、吞噬細胞、漿細胞和T細胞。
[0041] 本文所使用的"免疫反應"是指包括但不限于下列的免疫:先天性免疫、體液免疫、 細胞免疫、免疫、炎癥反應、獲得性(適應性)免疫、自身免疫和/或過度活躍免疫。
[0042] 如本文所使用，術語"樣本"或"生物樣本"表示從生物有機體提取或分離的樣本， 例如來自受試者的腫瘤樣本。示例性生物樣本包括但不限于：生物流體樣本;血清;血漿； 尿;唾液;腫瘤樣本;腫瘤感染性疾病和/或組織樣本等。該術語還包括上述樣本的混合物。 術語"樣本"還包括未經處理或預處理(或預加工）的生物樣本。在一些實施方案中，樣本可 以包括來自受試者的一個或多個細胞。在一些實施方案中，樣本可以是腫瘤細胞樣本，例如 該樣本可以包括癌細胞、來自腫瘤的細胞和/或腫瘤感染性疾病。
[0043] 術語"功能性"在連同"衍生物"或"變體"或"片段" 一起使用時是指這樣的多肽，其 具有的生物活性大體上類似于其衍生物或變體或片段為所述多肽的實體或分子的生物活 性。
[0044]如本文所使用，"受試者"意指人或動物。通常，動物是脊椎動物，諸如靈長類動物、 嚙齒動物、家畜或狩獵動物。靈長類動物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和獼猴（例如，恒河 猴）。嚙齒動物包括小鼠、大鼠、土拔鼠、雪貂、兔和倉鼠。家畜和狩獵動物包括牛、馬、豬、鹿、 野牛、水牛、貓科動物(例如家貓)和犬科動物（例如，狗、狐貍、狼）。術語"患者"、"個體"和 "受試者"在本文中可互換使用。在一個實施方案中，受試者是哺乳動物。哺乳動物可以是 人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但是并不限于這些實例。另外，本文所描述 的方法可以用于治療家養動物和/或寵物。
[0045]受試者可以是先前已被診斷為或鑒定為患有或具有需要監測的疾病狀態(例如， 癌癥或感染性疾病)或與該疾病狀態有關的一種或多種并發癥并且任選地已經接受針對該 疾病狀態或與該疾病/病狀有關的一種或多種并發癥的治療的個體。或者，受試者還可以是 先前尚未被診斷為具有疾病狀態或與該疾病/病狀有關的一種或多種并發癥的個體。例如， 受試者可以是表現出關于疾病狀態或與疾病狀態有關的一種或多種并發癥的一種或多種 風險因素的個體或者未表現出風險因素的受試者。對針對特定疾病狀態的治療"有需要的 受試者"可以是具有該疾病/病狀、被診斷為患有該病狀或有發展該疾病的風險的受試者。 [0046]術語"統計上顯著"或"顯著"是指存在差異的統計證據。它被定義為當零假設實際 上是真的時作出拒絕零假設的決定的概率。該決定經常使用P值作出。
[0047] 如本文中所使用，"CD4淋巴細胞"是指表達CD4的淋巴細胞，即，為⑶4+的淋巴細 胞。⑶4淋巴細胞可以是表達⑶4的T細胞。
[0048]術語"T細胞"和"T淋巴細胞"是可互換的并且在本文中同義地使用。實例包括但不 限于:初次用于實驗的T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞或其組合。
[0049] 本文所使用的"治療劑"是指用于例如治療、抑制、預防疾病、緩和其影響、減輕其 嚴重程度、降低其發展的可能性、減緩其進展和/或治愈該疾病的藥劑。由治療劑靶向的疾 病包括但不限于感染性疾病、癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞腫瘤、母細胞瘤、在各種免 疫細胞上表達的抗原以及在與各種血液疾病和/或炎性疾病相關的細胞上表達的抗原。
[0050] 除非本文另有定義，否則所使用的與本申請相關的科學和技術術語應該具有如本 公開所屬技術領域的一般技術人員通常所理解的含義。應當理解，本發明并不限于本文所 描述的具體方法、方案和試劑等，并且因此可以變化。本文所使用的術語僅出于描述具體實 施方案的目的，而不意圖限制僅由權利要求所限定的本發明的范圍。
[0051] 本文提供了方法、組合物和試劑盒，其中CD4淋巴細胞耗竭劑單獨或與各種其它療 法和藥劑組合用來靶向免疫系統，以治療癌癥和/或感染性疾病。可以與CD4淋巴細胞耗竭 劑組合使用的療法和藥劑的非限制性實例包括但不限于免疫檢查點抑制劑、過繼免疫療 法、免疫佐劑和免疫調節劑。 治療方法
[0052] 在各個實施方案中，本發明提供了一種治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展的方法。所述方法包括提供包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物和向受試 者施用治療有效量的該組合物，從而治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減 緩其進展。在一些實施方案中，所述病狀是癌癥或感染性疾病。在一些實施方案中，所述受 試者已被診斷為患有癌癥。在一些實施方案中，所述受試者已被診斷為患有感染性疾病。在 各個實施方案中，所述受試者已經患病的時間量足夠在施用包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組 合物之前使免疫系統致敏。在各個實施方案中，受試者已經患有所述病狀的時間量為1天或 更多、2天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、7天或更多、8天或更多、9 天或更多、10天或更多、15天或更多、20天或更多、1個月或更多、2個月或更多、3個月或更 多、4個月或更多、5個月或更多、6個月或更多、1年或更多或其組合。
[0053] 在各個實施方案中，本發明提供了用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑和選自由免疫檢查點抑 制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的組的至少一種其它試劑；以及向受試 者施用治療有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑和治療有效量的免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治 療劑、免疫佐劑和免疫調節劑中的至少一種，從而治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重 程度和/或減緩其進展。在一些實施方案中，所述方法進一步包括向受試者施用mTOR抑制 劑。在各個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑和其它藥劑可以依序或同時施用。在一些實施 方案中，所述病狀是癌癥。在一些實施方案中，所述病狀是感染性疾病。
[0054]在各個實施方案中，本發明提供了用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑和過繼免疫治療劑以及 向受試者施用治療有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑和治療有效量的過繼免疫治療劑，從而治 療、抑制、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展。在一個實施方案中，CD4 淋巴細胞耗竭劑是抗CD4抗體或其片段或其變體，且過繼免疫治療劑是樹突細胞疫苗。在各 個實施方案中，所述病狀是癌癥或感染性疾病。在一些實施方案中，同時施用抗CD4抗體和 樹突細胞疫苗。在一些實施方案中，依序施用抗CD4抗體和樹突細胞疫苗。在一些實施方案 中，所述方法可以進一步包括與CD4淋巴細胞耗竭劑和過繼免疫治療劑依序或同時施用有 效量的mTOR抑制劑。
[0055]在各個實施方案中，本發明提供了用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑和免疫檢查點抑制劑以 及向受試者施用治療有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑和治療有效量的免疫檢查點抑制劑，從 而治療、抑制、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展。在一個實施方案 中，CD4淋巴細胞耗竭劑是抗CD4抗體或其片段或其變體，且檢查點抑制劑是抗PD-I抗體或 其片段或其變體。在各個實施方案中，所述病狀是癌癥或感染性疾病。在一些實施方案中， 同時施用抗CD4抗體和抗ro-i抗體。在一些實施方案中，依序施用抗CD4抗體和抗ro-i抗體。 所述方法可以進一步包括施用mTOR抑制劑。在一些實施方案中，所述方法可以進一步包括 與CD4淋巴細胞耗竭劑和檢查點抑制劑依序或同時施用有效量的mTOR抑制劑。
[0056] 在各個實施方案中，本發明提供了用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展的方法。所述方法包括提供CD4淋巴細胞耗竭劑、過繼免疫治療劑和 mTOR抑制劑以及向受試者施用治療有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑、治療有效量的過繼免疫 治療劑和治療有效量的mTOR抑制劑，從而治療、抑制、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展。在一個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑是抗CD4抗體或其片段或其變 體。在一個實施方案中，過繼免疫治療劑是樹突細胞疫苗。在一個實施方案中，mTOR抑制劑 是替西羅莫司。在各個實施方案中，所述病狀是癌癥或感染性疾病。一些實施方案中，同時 施用抗CD4抗體、樹突細胞疫苗和mTOR抑制劑(例如替西羅莫司）。一些實施方案中，依序施 用抗CD4抗體、樹突細胞疫苗和mTOR抑制劑(例如替西羅莫司）。
[0057] 在各個實施方案中，本文所述的方法可以用于在有需要的受試者中預防癌癥轉移 或預防癌癥復發。
[0058]在本發明的各個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑可以是小分子、肽、抗體或其片 段以及核酸分子中的任何一種或多種。在一個實施方案中，所述抗體特異性結合CD4表達T 細胞如調節性T細胞(Tr eg細胞)上的⑶4。
[0059 ]抗體(例如，抗CD4抗體或抗PD-1抗體)可以是單克隆抗體或其片段、多克隆抗體或 其片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其片段或單鏈抗體中的任何一種或多種。這些抗 體可以來自任何來源，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、狗、貓、兔、豬、牛、馬、山羊、驢或人。抗體的片 段可以是Fab)2、Fv片段或它們的融合蛋白中的任何一種或多種。
[0060] 在各個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑是人源化抗CD4抗體或其片段。在各個實 施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑是扎木單抗（zano Iimumab )、凱利昔單抗（ke Iiximab)和 0KT4。
[0061] 在本發明的一些實施方案中，同時施用CD4淋巴細胞耗竭劑和其它藥劑。在其它實 施方案中，依序施用CD4淋巴細胞耗竭劑和其它藥劑。例如，在施用其它藥劑之前、期間或之 后施用CD4淋巴細胞耗竭劑。在進一步的實施方案中，伴隨食物或不伴隨食物施用CD4淋巴 細胞耗竭劑和其它藥劑。根據本發明，CD4淋巴細胞耗竭劑和/或額外的藥劑可以與其它藥 劑(包括但不限于癌癥疫苗和化療劑)組合使用。如本文所描述，額外的試劑是免疫檢查點 抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑中的任何一種或多種。
[0062] 在各個實施方案中，額外的藥劑是免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點抑制劑的實例 包括但不限于:抗150-1抗體，諸如拉姆布羅力珠單抗(]^11]1131'〇112111]^13，]\11(-3475)、尼維單抗 (Nivolumab，BMS-936558)和皮地利珠單抗（Pidil izumab，CT-011);抗PD-Ll 抗體，諸如 MPDL3280A(RG7446)、MEDI4736和BMS-936559;抗PD-L2抗體，B7-DC-Fc融合蛋白如AMP-224; 抗CTLA-4抗體，諸如曲美木單抗(treme I imumab，CP-675，206)和易普利單抗（ipi I imumab) (MDX-010);抗B7/CD28受體超家族抗體;抗吲哚胺（2,3)_二氧合酶（IDO)抗體、抗IDOl抗體、 抗ID02抗體、色氨酸、色氨酸模擬物、1-甲基色氨酸（I-MT) )、Indoximod(D-1-甲基色氨酸 (D-I-MT) )、L-1-甲基色氨酸(L-I-MT)、TX-2274;羥基脒抑制劑如INCB024360;抗TIM-3抗 體;抗LAG-3抗體如BMS-986016;激動由MHCII類驅動的樹突細胞活化的重組可溶性LAG-31 g 融合蛋白如頂P321;抗KIR2DL1/2/3或抗KIR抗體如立魯單抗（IiriIumab，IPH2102)、烏瑞魯 單抗(urelumab，BMS-663513);抗磷脂酰絲氨酸(抗PS)抗體如巴維昔單抗(Bavituximab)、 針對N-乙醇酰-GM3神經節苷脂的抗人單克隆抗體的抗獨特型鼠單克隆抗體，諸如雷庫圖單 抗(Racotumomab，曾用名為IEIO);抗0X40R抗體如IgGCD134mAb;抗B7-H3抗體如MGA271;以 及旨在通過使免疫檢查點基因沉默來治療癌癥的基于小干擾(si)RNA的癌癥疫苗。附加信 息可以見于Cree lanBC( Updateonimmunecheckpoint inhibitors in Iungcancer， CancerControl · 2014年1 月；21 ( I ) : 80 - 9)和JanedeLartigue (Another ImmuneCheckpo intEmergesasAnt icancerTarget，線上公開于 onclive · com，2013 年9月24日，星期二），這些文獻通過引用整體并入本文，就如同完全闡述一般。在一些實施 方案中，免疫檢查點抑制劑選自由以下組成的組:抗ro-1抗體、抗ro-L 1抗體、抗ro-L2抗體、 抗CTLA-4抗體、抗KIR抗體、抗IDOl抗體、抗ID02抗體、抗??Μ-3抗體、抗LAG-3抗體、抗0X40R 抗體和抗PS抗體或其組合。
[0063] 在各個實施方案中，額外的藥劑是過繼免疫治療劑。在一些實施方案中，過繼免疫 治療劑選自由以下組成的組:樹突細胞疫苗、肽疫苗、基于嵌合T細胞抗原的療法、基于T細 胞的療法、免疫細胞因子、基于熱激蛋白的疫苗、基于腫瘤溶解物的疫苗、攜帶腫瘤抗原的 病毒載體、病毒疫苗、細菌疫苗和真菌疫苗或其組合。附加信息可以見于Radvanyi等人， ClinCancerRes · 2012Decl5; 18(24): 6758-70 ;Epub20120ct2，其通過引用整體并入本文，就 如同完全闡述一般。
[0064] 在各個實施方案中，額外的藥劑是免疫佐劑。佐劑的實例包括但不限于：陽離子脂 質體-DNA復合物JVRS-100、氫氧化鋁疫苗佐劑、磷酸鋁疫苗佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、鋁膠、 ISC0M(s)?、弗氏完全佐劑（Freunc^ sCompleteAd juvant)、弗氏不完全佐劑（Freunc^ sIncompleteAd juvant)、Cp⑶NA疫苗佐劑、霍亂毒素、霍亂毒素 B亞基、脂質體、阜素疫苗佐 劑、DDA佐劑、角鯊烯型佐劑、EtxB亞基佐劑、IL-12疫苗佐劑、LTK6 3疫苗突變佐劑、 TiterMaxGold佐劑、Ribi疫苗佐劑、Montanide ISA720佐劑、棒狀桿菌源性P40疫苗佐劑、 MPL?佐劑AS04、AS02、脂多糖疫苗佐劑、胞壁酰二肽佐劑、CRL1005、殺滅的短小棒狀桿菌 (Corynebacter iumparvunm)疫苗佐劑、Montanide ISA51佐劑、百日咳博代氏桿菌 (Bordetel Iapertussis)成分疫苗佐劑、陽離子脂質體疫苗佐劑、金剛燒酰胺二肽疫苗佐 劑、Ar lace IA佐劑、VSA-3佐劑、錯疫苗佐劑、Po Iygen疫苗佐劑、Ad jumer?、藻類葡聚糖、 BayR1005、Theramide?,硬脂酰酪氨酸、Specol佐劑、Algammulin佐劑、Avridine? ,磷酸 鈣凝膠、CTAl-DD基因融合蛋白、DOC/Alum復合物、γ菊粉、Gerbu佐劑、GM-CSF、GMDP、重組 hIFN-γ/干擾素-g、白細胞介素-1β、白細胞介素-2、白細胞介素-7、Sclavo肽、 RehydrageILV佐劑、RehydrageIHPA佐劑、洛索立賓（Loxoribine)、MF59、ΜΤΡ-ΡΕ脂質體、 Murame tide佐劑、Murapalmi tine佐劑、D-Murapalmi tine佐劑、NAGO、非離子表面活性劑囊 泡、PMMA、蛋白質蝸殼、QS-21、SPT(抗原制劑）、納米乳劑疫苗佐劑、AS03、Quil-A疫苗佐劑、 RC529疫苗佐劑、LTR192G疫苗佐劑、大腸桿菌熱不穩定毒素、LT、無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽 佐劑、磷酸媽疫苗佐劑、Montanide不完全Seppic佐劑、咪喹莫特（Imiquimod)、雷西莫特 (Resiquimod)、AF03、鞭毛蛋白、Poly(I: C)、ISCOMATRIX_?,AbiSC〇-100 疫苗佐劑、白蛋 白-肝素微粒疫苗佐劑、AS-2疫苗佐劑、B7-2疫苗佐劑、DHEA疫苗佐劑、含共刺激分子抗體的 免疫脂質體、SAF-I、仙臺病毒脂蛋白體、含仙臺病毒的脂質基質、蘇氨酰胞壁酰二肽 (TMDP)、Ty顆粒疫苗佐劑、布比卡因疫苗佐劑、DL-PGL(聚酯聚(DL-丙交酯-共-乙交酯））疫 苗佐劑、IL-15疫苗佐劑、LTK72疫苗佐劑、MPL-SE疫苗佐劑、霍亂毒素的無毒性突變體E112K (111(：1'41121〇、]\^1：1^1-3和水溶性三砲稀葡糖苷化合物。附加信息可以見于3376^等人 (VAXJO：AWEB-BASEDVACCINEADJUVANTDATABASEANDITSAPPLICATIONFORANALYSISOFVACCINE ADJUVANTSANDTHEIRUSESINVACCINEDEVELOPMENT，2012;2012:831486;Epub2012年3 月13 日），其通過引用整體并入本文，如同完全闡述一般。在一些實施方案中，免疫佐劑選自由以 下組成的組:鋁鹽、病毒顆粒和油基佐劑或其組合。
[0065] 在各個實施方案中，額外的藥劑是免疫調節劑。在一些實施方案中，免疫調節劑選 自由以下組成的組:mTOR抑制劑、STAT抑制劑、TGFP受體抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑或其組 合。
[0066] 在各個實施方案中，所述方法可以進一步包括向受試者施用mTOR抑制劑。根據本 發明，mTOR抑制劑可以是小分子、肽、抗體或其片段、核酸分子和/或大環內酯化合物中的任 何一種或多種。在一個實施方案中，所述抗體特異性結合mTOR，從而抑制mTOR。所述抗體可 以是單克隆抗體或其片段、多克隆抗體或其片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其片段 或單鏈抗體中的任何一種或多種。這些抗體可以來自任何來源，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、狗、 貓、兔、豬、牛、馬、山羊、驢或人。抗體的片段可以是FakFUl/UAv片段或它們的融合蛋白 中的任何一種或多種。
[0067] 在本發明的一個實施方案中，mTOR抑制劑是大環內酯化合物。可用于要求保護的 本發明的大環內酯化合物的實例包括但不限于:替西羅莫司(CCI-779)或其藥物等效物、類 似物、衍生物或鹽;依維莫司(RAD-001)或其藥物等效物、類似物、衍生物或鹽;和/或西羅莫 司（雷帕霉素)或其藥物等效物、類似物、衍生物或鹽。
[0068] 在各個實施方案中，額外的藥劑是STAT抑制劑。STAT抑制劑的實例包括但不限于： S0CS(細胞因子信號傳導遏制因子）；PIAS(活化stat的蛋白質抑制劑），包括PIAS1、PIAS2、 ?1八53、？1454、？14513、？145義13和？1457;硝呋齊特(附€1^(?32丨(16)(5-硝基-2-糠醛-對羥基 苯甲酰基腙）、N-[2-(1，3，4-噁二唑基）]-4-喹啉甲酰胺、非肽小分子抑制劑、Stattic抑制 齊 lJ、STA-21、LLL-3、LLL12、XZH-5、S31-201、SF-1066、SF-1087、17o、Cryptotanshinor^l]]$iJ 劑、FLL32、C188-9、LY5、BP-1108、BP-1075、GalielIalactone抑制劑、JQl、STX-Ol 19、 FLLL11、FLLL12、FLLL32、FLLL62、激素源性煙酰肼、IS3295、靶向STAT路徑的寡核苷酸、靶向 STAT 路徑的反義寡核苷酸(AS0)、AZD9150(ISIS-STAT3Rx 或 ISIS481464)、抗 STAT3 的合成 ASO、STAT3 誘捕寡核苷酸（ODN)、STAT3-S i RNA、STAT3-G-Quar te t、STAT5-0DN、STAT5-S i RNA、 0PB-31121、肽和擬肽抑制劑、XpYL、AC-pYLPQTV-NH3、ISS610、S31-M2001 和CJ-1383。附加信 息可以見于Furqan等人（STATinhibitorsforcancertherapy，JHematolOncol · 2013Dec5 ;6: 90 )，其通過引用整體并入本文，就如同完全闡述一般。
[0069] 在各個實施方案中，額外的藥劑是JAK抑制劑。JAK抑制劑的實例包括但不限于:酪 氨酸磷酸化抑制劑（Tyrphostin) AG 490、CP-690550、羅可索替尼（ruxolitinib， INCB018424)、TG101348(SAR30253)、來他替尼（lestaurtinib，CEP701)、CYT387、帕曲替尼 (pacritinib，SB1518)、AZD1480、XL019和LY2784544。附加信息可以見于Mascarenhas等人 (Biologyandclinicalmanagementofmyeloproliferativeneoplasmsanddevelopmentofthe JAKinhibitorruxolitinib，CurrMedChem. 2012; 19(26): 4399-413)，其通過引用整體并入 本文，就如同完全闡述一般。
[0070] 在各個實施方案中，額外的藥劑是TGFP受體抑制劑。TGFP受體抑制劑的實例包括 但不限于：顯性負型TGF-WI型受體(Τ?ΦΙΙ)、配體陷阱、可溶性TffiII胞外域、可溶性β聚糖 胞外域、含有TeRII(TeRII-Fc)或III型受體/β聚糖的可溶性胞外域的重組Fe融合蛋白、可 溶性人C12-巨球蛋白血漿蛋白；完全人源化的泛TGF-β單克隆中和抗體，包括勒地木單抗 (Lerde limumab，CAT-152 )、美特木單抗(Me te Iimumab，CAT-192)和GC-1008 (氣瑞索木單抗 (Fresolimumab))和IDll;旨在與其互補RNA序列雜交并加快mRNA降解的反義寡核苷酸 (ASO) APl2009 (Trabedersen)和AP-11014;受體激酶抑制劑SB505124、SB-431542、 1^550410、1^580276、1^215729、1^364937、1^2109761、1^26894、50-093和50-208 ;肽適體， ^x-SARA適體;通過RNA干擾使II型TGF-β受體基因表達沉默的編碼小發夾RNA的載體，以及 具有慢病毒載體或腺相關載體的shRNA。附加信息可以見于Conno Ily等人 (ComplexitiesofTGF-Ptargetedcancertherapy，IntJBiolSci·2012;8(7):964-78; Epub2012 年 7 月 12 日）和 Kaminska 等人 (TGFbetasignallinganditsroleintumourpathogenesis；ActaBiochimPol.2005；52(2)： 329-37.Epub2005Jun25)，所述文獻通過引用整體并入本文，就如同完全闡述一般。
[0071] 在各個實施方案中，額外的藥劑是酪氨酸激酶抑制劑。酪氨酸激酶抑制劑的實例 包括但不限于舒尼替尼（sunitinib)、埃羅替尼(erIotinib)、凡德他尼(vandetanib)、西地 拉尼（〇6(1；!_以11；!_13)、布立尼布(131'；!_￥311；!_13)、氟瑞替尼(：[ >0代七；!_11；!_13)和多韋替尼（(10￥；^；!_11；!_13)。 附加信息可以見于HuynhH. (MoIecuIarlytargetedtherapyinhepatocellularcarcinoma， 81001^1^1^^^(301.2010年9月1日 ；80(5):550-60上口汕2010年4月4日），其通過引用整體并 入本文，就如同完全闡述一般。
[0072] 在一些實施方案中，本文所述的方法進一步包括向受試者施用化療劑，所述受試 者正被施用包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物或包含CD4淋巴細胞耗竭劑和選自由免疫檢 查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的組的其它試劑的組合物。化療 劑的非限制性實例可以包括:烷化劑，諸如噻替哌（thiotepa)和CYTOXAN?環磷酰胺； 烷基磺酸酯類，諸如白消安（busu I f an )、英丙舒凡（improsu I f an )和哌泊舒凡 (piposulfan);氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌（carboquone)、 美胺替哌(meturedopa)和烏瑞替哌（uredopa);亞乙基亞胺類（ethylenimine)和甲基蜜胺 類(1116也713111613111；!_116)，包括六甲蜜胺（31以6七3111；!_116)、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺 (rietylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酉先胺（triethiyIenethiophosphoramide)和 三輕甲基蜜胺（trimethyIoIomeIamine);番蒸枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛 (bu llatac in)和布拉他辛酮(bu llatac inone));喜樹喊(campto thee in)(包括合成類似物 拓撲替康(^(^(^6〇311));苔蘚抑素（13巧〇8七3七；!_11);卡司他汀（〇31178七3七；!_11);(^-1065(包括 其阿多來新(8(1〇26168；!_11)、卡澤來新(〇3^6168；!_11)和比澤來新(1^26168；!_11)合成類似物） ； 隱藻素類(cryptophycin)(特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);多卡霉 素((111〇〇3!'1117(3；!_11)(包括合成類似物1(1-2189和081-1]\11);艾植素(6161^1161'〇13；!_11);水鬼蕉堿 (pancratistatin);匍枝珊瑚醇（sarcodictyin);海綿素（spongistatin);氮芥 (nitrogenmustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥（chlornaphazine)、膽磷酰胺 ((311〇1〇^1108口1^1111(16)、雌莫司汀(68奸3111118七；!_116)、異環磷酰胺、氮芥(1116(3111〇代也3111；!_116)、鹽 酉愛氧氮芥（me chi ore thamineoxi dehydro ch Ioride )、美法侖（melphal an)、新氮芥 (novembichin)、苯芥膽留醇（phenesterine)、潑尼莫司汀（prednimustine)、曲磷胺 (trofosfamide)、尿喃啶氮芥(uraciImustard);亞硝基脲類(nitrosourea)，諸如卡莫司汀 (carmus t ine )、氯脈菌素（chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司汀 (Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如稀二炔 (enediyne)抗生素類(例如卡里奇霉素，尤其是卡里奇霉素 γ II和卡里奇霉素 ω-Il (參見 例如Agnew，Chem. Intl.編Engl. ,33:183-186(1994));達內霉素，包括達內霉素 Α;二膦酸鹽 類，諸如氯膦酸鹽（clodronate);埃斯波霉素（esperamicin);以及新制癌素 (neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白稀二炔類抗生素發色團、阿克拉霉素 (aclacinomycin) >^j[^^^(actinomycin) >(authramycin) >Μ? (&2&861'；[116)、博來霉素(131601117(3；!_11)、放線菌素(03(^；!_1101117(3；!_11)、卡拉比星(03以13；!_(3；!_11)、洋 紅霉素（carminomycin)、嗜癌霉素（carzinophilin)、色霉素（chromomycinis)、更生霉素、 柔紅霉素、地托比星(d et0rubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRiAMYCFN?多柔 比星(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星）、表 柔比星（epirubicin)、依索比星（esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅霉素 (marcelIomycin)、絲裂霉素類如絲裂霉素 C、霉酷酸（mycophenolicacid)、諾加霉素 (noga Iamy c in )、橄欖霉素（olivomycin)、培洛霉素（peplomycin)、泊非霉素 (potfiromycin)、卩票呤霉素（puromycin)、三鐵阿霉素（quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、鏈黑菌素（streptonigrin)、鏈佐星（streptozocin)、殺結核菌素 (七油61'(^(1；!_11)、烏苯美司(油611；!_11161)、凈司他丁(2；!_1108七&七；!_11)、佐柔比星(201'1113；!_(3；!_11);抗代 謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿喃啶（5-FU);葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲 氨蝶呤、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);卩票呤類似物，諸如氟達拉濱 (f Iudarabine)、6_疏基卩票呤（6-mercaptopurine)、硫咪卩票呤（thiamiprine)、硫鳥卩票呤 (thioguanine);喃啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮 尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧 氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine);雄激素類，諸 如卡魯睪酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanoIonepropionate)、環硫雄醇 (epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內酯（testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯 米特(3111；!_110811^6也；!_1111(16)、米托坦(111；^(^3116)、曲洛司坦(奸；!_108七3116);葉酸補充劑，諸如 亞葉酸;醋葡醛內酯(306813如脫） ；醛磷酰胺糖苷(31(1(^1108口1^1111(16817(3081(16);氨基乙酰 丙酸（aminolevul inicacid);恩尿喃啶（eni Iuraci 1);安B丫定；bestrabuci 1;比生群 (bisantrene);依達曲沙（edatraxate);地磷酰胺（defofamine);地美可辛（demecolcine); 地口丫醌(diaziquone);依氟鳥氨酸(elformithine);依利醋鞍（elliptiniumacetate);埃博 霉素（6口0丨11；[10116) ;依托格魯(6丨(^111(^(1);硝酸鎵;羥基脲;香燕多糖（161^；[1^11) ;氯尼達 寧（Ionidainine);類美登素，諸如美登素和安絲菌素;米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌； 莫哌達醇(mopidamol);硝嗪；噴司他丁；苯來美特(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛 索蒽醌（losoxantrone);足葉草酸；2-乙基酰肼；甲基芐肼；PSK?多糖復合物 (JHSNaturalProducts，Eugene，Oreg.);雷佐生（razoxane);利索新（rhiζοχin);西佐喃 (s i zof uran);鍺螺胺（sp irogermanium);替奴佐酸（tenuazonicacid);三亞胺醌 (triaziquone) ;2,27，2〃_三氯三乙胺；單端孢霉烯類（尤其是T-2毒素、維拉可瑞A (verracurinA)、桿抱菌素 A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine));烏拉坦(urethan);長春 地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇（mi tolact01);哌泊溴烷 (pipobroman);加托因（gacytosine);阿拉伯糖苷(arabinoside)( "Ara-C"）；環磷酰胺；噻 替哌；紫衫燒類，例如 TAXOL?:紫杉醇（BristoI-MyersSquibbOncology，Princeton， N. J. )、ABRAXANE? (不含氫化蓖麻油的白蛋白改造納米顆粒制劑型紫杉醇） (AmericanPharmaceuticalPartners，Schaumberg，111 ·)，以及TAXOTERE? 多西他賽 (Rhone-PoulencRorer，Antony ,France);苯丁酸氮芥（chioranbucil); GEMZA.R? 吉西 他濱(gemcitabine) ;6_硫鳥噪呤;疏基噪呤；甲氨蝶呤；鉬類似物，諸如順鉬、奧沙利鉬和卡 鉑;長春堿;鉑;依托泊苷(VP-16);異環磷酰胺;米托蒽醌;長春新堿;NAVELBINE;長春瑞濱； 諾安托（novantrone);替尼泊苷；依達曲沙（edatrexate);柔紅霉素；氨噪呤；希羅達 (xeloda);伊班膦酸鹽（ibandronate);伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康結合 5-FU和亞葉酸的治療方案)拓撲異構酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMF0);類視色素， 諸如視黃酸；卡培他濱(03卩6(3；^313；[116) ;康普立停（001111^6丨38丨31：；[11);亞葉酸(1^0;奧沙利 鉬(oxaliplatin)，包括奧沙利鉬治療方案(FOLFOX);拉帕替尼（lapatinib) (Tykerb);減少 細胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，埃羅替尼(Tarceva?))和VEGF-A的抑制劑；以及 任何以上物質的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。此外，治療方法可以進一步包括使用放射 療法。
[0073] 癌癥的實例包括但不限于癌、母細胞瘤和肉瘤。此類癌癥的更具體的實例包括但 不限于:基底細胞癌、膽道癌;膀胱癌;骨癌;腦癌和CNS癌;乳腺癌;腹膜癌；宮頸癌;絨毛膜 癌;結腸和直腸癌;結締組織癌;消化系統癌癥;子宮內膜癌;食道癌;眼癌;頭頸癌；胃癌(包 括胃腸癌）；膠質母細胞瘤;肝癌;肝細胞瘤;上皮內腫瘤；腎臟癌或腎癌；喉癌；肝癌;肺癌 (例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌）；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤 和非霍奇金氏淋巴瘤；黑色素瘤;骨髓瘤;神經母細胞瘤；口腔癌(例如，唇癌、舌癌、口癌和 咽癌）；卵巢癌;胰腺癌;前列腺癌;視網膜母細胞瘤;橫紋肌肉瘤;直腸癌;呼吸系統癌癥;唾 液腺癌；肉瘤;皮膚癌;鱗狀細胞癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌;子宮或子宮內膜癌;泌尿系統 癌癥;外陰癌；以及其它癌和肉瘤。
[0074] 根據本發明，病狀可以是惡性贅生細胞增生性病癥或疾病。仍根據本發明，病狀可 以是腎細胞癌或黑色素瘤。由治療劑靶向的疾病包括癌、肉瘤、生殖細胞腫瘤和/或母細胞 瘤。
[0075] 在各個實施方案中，感染性疾病是由感染性細菌所引起。感染性細菌的實例包括： 幽門螺桿菌(Helicobacterpyloris)、布氏疏螺旋體(Boreliaburgdorferi )、嗜肺軍團菌 (Legionellapneumophilia)、分枝桿菌物種(如結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、鳥分枝桿 菌(M.avium)、胞內分枝桿菌(M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)、戈登分枝 桿菌（M. gordonae))、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、淋球菌 (Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、單核細胞增多性李斯 特氏菌(!^8丨61^31110110〇71：0〖61168)、化膿性鏈球菌(4群鏈球菌）、無乳鏈球菌(13群鏈球菌）、 鏈球菌（綠色組（V iridansgroup ))、奠鏈球菌（Streptococcusfae cal is)、牛鏈球菌 (Streptococcusbovis)、鏈球菌屬（厭氧種（anaerobicsps ·))、肺炎鏈球菌 (Streptococcuspneumoniae))、致病彎曲桿菌屬種(pathogenicCampylobactersp ·)、腸球 菌屬種（Enterococcussp.)、流感嗜血桿菌（HaemophilusinfIuenzae)、炭疽芽抱桿菌 (BaciIIusanthracis)、白喉棒狀桿菌（corynebacteriumdiphtheriae)、棒狀桿菌屬種 (corynebacteriumsp ·)、紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrixrhusiopathiae)、產氣莢膜梭菌 (Clostridi ump erf r ingens)、破傷風梭菌（Clostridiumtetani )、產氣腸桿菌 (Ehterobacteraerogenes )、肺炎克雷伯菌（Klebsiel Iapneumoniae )、多殺巴斯德氏菌 (Pasturellamultocida)、擬桿菌屬種（Bacteroidessp .)、具核梭桿菌 (Fusobacteriumnucleatum)、念珠狀鏈桿菌（Streptobaci llusmoni Iiformis )、梅毒螺旋體 (Treponemapallidium)、雅司螺旋體（Treponemapertenue)、鉤端螺旋體（Leptospira)和以 色列放線菌(Actinomycesisraelli)。預期本文所述的組合物和方法用于治療由這些細菌 病原體引起的感染。其它感染性生物體（如原生生物）包括：惡性瘧原蟲 (Plasmodiumfalciparum)和弓形蟲（Toxoplasmagondii)。預期本文所述的組合物和方法用 于治療由這些病原體引起的感染。
[0076] 在各個實施方案中，病毒抗原可以是存在于感染性病毒中并誘導受試者中的免疫 反應的任何抗原。感染性病毒的實例包括:逆轉錄病毒科(例如，HIV);小核糖核酸病毒科 (例如，脊髓灰質炎病毒、A型肝炎病毒;腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒）；杯狀 病毒科(Calciviridae)(諸如導致胃腸炎的菌株）；披膜病毒科(例如，馬腦炎病毒、風疹病 毒）；黃熱病毒科(Flavir idae)(例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒）；冠狀病毒科(例 如，冠狀病毒）；彈狀病毒科(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病毒）；絲狀病毒科(例如，埃博拉 病毒）；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒）；正粘病毒 科(例如，流感病毒）；布尼亞病毒科(Bungaviridae)(例如，漢坦病毒、布尼亞病毒(bunga viruse)、白嶺病毒和Nairo病毒）；沙粒病毒科（出血熱病毒）；呼腸孤病毒科（如呼腸孤病 毒、環狀病毒和輪狀病毒）；雙核糖核酸病毒科;肝病毒科（乙型肝炎病毒）；細小病毒科(細 小病毒）；乳多空病毒科(乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒）；腺病毒科(大多數腺病毒）；皰疹病毒科 (單純皰疹病毒(HSV)I和HSV-2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、皰疹病毒）；痘病毒 科(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒）；和虹彩病毒科(如非洲豬瘟病毒）；和未分類的病毒（例 如，海綿狀腦病的病原體、三角洲肝炎的病原體(被認為是乙型肝炎病毒的缺陷衛星體）、非 甲型肝炎、非乙型肝炎的病原體（1類=內部傳播;2類=腸胃外傳播（即丙型肝炎）；諾瓦克 (Norwalk)病毒和相關病毒，以及星狀病毒）。預期本文所述的組合物和方法用于治療由這 些病毒病原體引起的感染。
[0077] 可以利用本文所述的組合物和方法治療的真菌感染的實例包括但不限于：曲霉 病;鵝口瘡（由白色念珠菌(Candidaalbicans)引起）；隱球菌病（由隱球菌引起）；和組織胞 衆菌病。因此，感染性真菌的實例包括但不限于:新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、 莢膜組織胞楽菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球抱子菌（Coccidioidesimmitis)、皮炎芽 生菌(Blastomycesdermatitidis)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、白色念珠菌。預 期本文所述的組合物和方法用于治療由這些真菌病原體引起的感染。
[0078] 在各個實施方案中，所述受試者是人。在各個實施方案中，所述受試者是哺乳動 物，包括但不限于人、猴、猿、狗、貓、牛、馬、山羊、豬、兔、小鼠和大鼠。
[0079] 在各個實施方案中，經靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、經口或經由吸入施用組合 物。根據本發明，可以利用各種途徑來施用要求保護的方法的組合物，包括但不限于氣霧 劑、經鼻、口服、經粘膜、經皮、腸胃外、可植入栗、連續輸注、局部施用、膠囊劑和/或注射。
[0080] 在各個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑是以100-200mg/天、200-300mg/天、300- 400mg/天、400-500mg/天、500-600mg/天、600-700mg/天、700-800mg/天、800-900mg/天、 900-1000mg/天、1000-1 IOOmg/天、1100-1200mg/天、1200-1300mg/天、1300-1400mg/天、 1400-1500mg/天、1500-1600mg/天、1600-1700mg/天、1700-1800mg/天、1800-1900mg/天或 1900-2000mg/天來施用。在各個實施方案中，其它藥劑是以0· l-〇.5mg/天、0· 5-1 .Omg/天、 1.〇-1.511^/天、1.5-2.〇11^/天、2.〇-2.511^/天、2.5-511^/天、5-1〇11^/天、1〇-1511^/天、15-20mg/天、20_25mg/天、25_30mg/天、30_35mg/天、35_40mg/天、40_45mg/天、45_50mg/天、50-55mg/天、55_60mg/天、60_65mg/天、65_70mg/天、70_75mg/天、75_80mg/天、80_85mg/天、85-90mg/天、90_95mg/天或 95-100mg/天來施用。 藥物組合物
[0081] 在各個實施方案中，本發明提供包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物。在各個實施方 案中，本發明提供包含免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑中的至 少一種的藥物組合物。免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑的實例 如本文所述。在各個實施方案中，包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物和包含其它藥劑的組合 物是兩種不同的組合物。
[0082] 根據本發明，可用于治療哺乳動物中的疾病的CD4淋巴細胞耗竭劑和/或其它藥劑 將經常被制備成大體上不含天然存在的免疫球蛋白或其它生物分子。當向哺乳動物施用 時，優選的CD4淋巴細胞耗竭劑和/或其它藥劑還將表現出最小的毒性。
[0083] 根據本發明的藥物組合物可以含有任何藥學上可接受的賦形劑。"藥學上可接受 的賦形劑"意指可用于制備通常是安全、無毒和期望的藥物組合物的賦形劑，并且包括對于 獸用和人藥物使用而言可接受的賦形劑。此類賦形劑可以是固體、液體、半固體或在氣霧劑 組合物的情況下是氣體。賦形劑的實例包括但不限于:淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒 劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、潤濕劑、乳化劑、著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑、芳香 劑、防腐劑、抗氧化劑、增塑劑、膠凝劑、增稠劑、硬化劑、定型劑、懸浮劑、表面活性劑、保濕 劑、載體、穩定劑及其組合。
[0084] 在各個實施方案中，根據本發明的藥物組合物可以被配制成經由任何施用途徑來 遞送。"施用途徑"可以指本領域中已知的任何施用途徑，包括但不限于氣霧劑、經鼻、口服、 經粘膜、經皮、腸胃外、腸內、外用或局部。"腸胃外"是指通常與注射相關的施用途徑，包括 眼眶內、輸注、動脈內、囊內、心內、皮內、肌肉內、腹膜內、肺內、脊柱內、胸骨內、鞘內、子宮 內、靜脈內、蛛網膜下、囊下、皮下、經粘膜或經氣管。經由腸胃外途徑，組合物可以是用于輸 注或注射的溶液劑或混懸劑形式，或者作為凍干粉末。經由腸胃外途徑，組合物可以是用于 輸注或注射的溶液劑或混懸劑形式。經由腸內途徑，藥物組合物可以是片劑、凝膠膠囊、糖 衣片劑、糖漿劑、混懸劑、溶液劑、粉劑、顆粒劑、乳劑、允許控制釋放的微球或納米球或脂質 囊泡或聚合物囊泡形式。通常，通過注射施用組合物。用于這些施用的方法是本領域技術人 員已知的。
[0085] 根據本發明的藥物組合物可以含有任何藥學上可接受的載體。如本文中所使用， "藥學上可接受的載體"是指參與將目標化合物從身體的一個組織、器官或部分攜載或運送 到身體的另一個組織、器官或部分的藥學上可接受的材料、組合物或媒介物。例如，載體可 以是液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料或其組合。載體的每個組分必須 是"藥學上可接受的"，因為它必須與制劑的其它成分相容。它還必須適用于與它可能接觸 的任何組織或器官接觸，這意味著它不能攜帶毒性、刺激性、過敏反應、免疫原性或過度超 過其治療益處的任何其它并發癥的風險。
[0086] 根據本發明的藥物組合物還可以被封裝、壓片或制備成用于口服的乳劑或糖漿 劑。藥學上可接受的固體或液體載體可以被添加來增強或穩定該組合物，或便于該組合物 的制備。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水、醇和水。固體載體包括淀粉、乳糖、 硫酸鈣二水合物、石膏粉、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。所述載體 還可以包括持續釋放材料，諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯（單獨或與蠟一起使 用)。
[0087] 按照常規制藥技術制備藥物制劑，所述技術包括研磨、混合、制粒和在必要時壓縮 (對于片劑形式）；或研磨、混合和填充(對于硬明膠膠囊形式）。當使用液體載體時，制劑將 是糖漿劑、酏劑、乳劑或水性或非水性混懸劑形式。這樣的液體制劑可以直接口服或填充到 軟明膠膠囊中。
[0088] 根據本發明的藥物組合物可以以治療有效量遞送。精確的治療有效量是組合物將 在給定的受試者中產生就治療功效而言最有效的結果的量。這個量將根據多種因素而變 化，所述因素包括但不限于:治療化合物的特性(包括活性、藥代動力學、藥效學和生物利用 度）、受試者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體狀況、對給定劑量的反 應性和用藥類型）、制劑中的一種或多種藥學上可接受的載體的性質以及施用途徑。臨床和 藥理領域的技術人員將能夠通過常規實驗來確定治療有效量，例如，通過監測受試者對施 用化合物的反應并相應地調整劑量。有關其它指導，參見Remington: TheSc ienceandPracti ceofPharmacy (Gennaro 編輯，第20版，Wil liams&Wi IkinsPA，USA) (2000)。
[0089] 在向患者施用前，可以將助劑加入到組合物中。液體制劑可以是優選的。例如，這 些助劑可以包括油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖液、白蛋白、表面活性劑、 增量劑或其組合。
[0090] 碳水化合物助劑包括糖或糖醇，諸如單糖、二糖、或多糖或水溶性葡聚糖。糖類或 葡聚糖可以包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、 普魯蘭(pullulan)、糊精、α和環糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素或其混合 物。"糖醇"被定義為具有-OH基團的C4至C8烴，并且包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山 梨糖醇、丙三醇和阿拉伯糖醇。以上提及的這些糖或糖醇可以單獨或組合使用。對于使用量 沒有固定限制，只要糖或糖醇可溶于水性制劑中即可。在一個實施方案中，糖或糖醇的濃度 介于1 · Ow/v %與7 · Ow/v %之間，更優選介于2 · Ow/v %與6 · Ow/v %之間。
[0091] 氨基酸助劑包括肉毒堿、精氨酸和甜菜堿的左旋(L)形式;然而，可以添加其它氨 基酸。
[0092] 在一些實施方案中，作為助劑的聚合物包括平均分子量在2,000和3,000之間的聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量在3,000和5,000之間的聚乙二醇(PEG)。
[0093 ]還優選在組合物中使用緩沖劑來使凍干前或復水后的溶液中的pH變化最小化。可 以使用大多數任何生理緩沖劑，包括但不限于檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽和谷氨酸鹽緩沖 劑或其混合物。在一些實施方案中，濃度為〇.〇1至0.3摩爾濃度。可以添加到制劑中的表面 活性劑示于歐洲專利第270，799和268，110號中。
[0094] 用于增加循環半衰期的另一種藥物遞送系統是脂質體。制備脂質體遞送系統的方 法論述于 Gabizon等人，CancerResearch( 1982)42:4734; Cafiso，BiochemBiophysActa (1981 )649:129和Szoka，AnnRevBiophysEng( 1980)9:467中。其它藥物遞送系統是本領域中 已知的并且描述于例如 Poznansky 等人，DRUGDELIVERYSYSTEMS (R · L · Jul iano 編輯，Oxf ord， N.Y.1980)，第253-315頁；M.L.Poznansky，PharmRevs(1984)36:277〇
[0095] 在制備得到液體藥物組合物后，可以將其凍干以防止降解并保持無菌。用于凍干 液體組合物的方法是本領域普通技術人員已知的。在即將使用前，組合物可以用無菌稀釋 劑(例如，林格氏溶液(Ringei y ssolution)、蒸餾水或無菌鹽水)復水，該無菌稀釋劑可以包 括其它成分。復水后，使用本領域技術人員已知的那些方法將組合物施用給受試者。
[0096] 本發明的組合物可以通過眾所周知的常規滅菌技術進行滅菌。所得溶液可以包裝 待用或在無菌條件下過濾并凍干，凍干制劑在施用前與無菌溶液組合。組合物可以視需要 含有藥學上可接受的輔助物質以接近生理條件，諸如PH調節劑和緩沖劑、滲透調節劑等(例 如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣)和穩定劑(例如，1 -20 %麥芽糖等）。 本發明的試劑盒
[0097] 在各個實施方案中，本發明提供了用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展的試劑盒。所述試劑盒包括含有CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物和關于使 用該組合物來治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的說明書。
[0098] 在各個實施方案中，本發明提供了用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程 度和/或減緩其進展的試劑盒。所述試劑盒包括包含CD4淋巴細胞耗竭劑的組合物以及包含 選自由免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的組的至少一種 其它藥劑的組合物；以及關于使用該組合物來治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度 和/或減緩其進展的說明書。
[0099]試劑盒是材料或組分的集合件，其包括本發明組合物中的至少一種。因此，在一些 實施方案中，試劑盒含有包括與上述治療劑復合的藥物遞送分子的組合物。
[0100]在本發明試劑盒中配置的組分的確切性質取決于其預期目的。在一個實施方案 中，試劑盒被配置成特別用于治療哺乳動物受試者的目的。在另一個實施方案中，試劑盒被 配置成特別用于治療人受試者的目的。在進一步的實施方案中，試劑盒被配置成用于獸醫 應用，治療諸如但不限于農場動物、家畜和實驗室動物的受試者。
[0101]試劑盒中可以包括使用說明書。"使用說明書"通常包括描述在使用試劑盒的組分 來影響所需結果時所采用的技術的有形表達。任選地，試劑盒還含有其它有用的組分，諸如 稀釋劑、緩沖液、藥學上可接受的載體、注射器、導管、涂藥器、移液或測量工具、包扎材料或 本領域技術人員將容易認識到的其它有用的用具。
[0102]集合在試劑盒中的材料或組分可以以保持其可操作性和實用性的任何方便和合 適的方式儲存起來提供給從業人員。例如，組分可以是溶解、脫水或凍干的形式;它們可以 在室溫、冷藏或冷凍溫度下提供。組分通常包含在適當的包裝材料中。如本文中所使用，短 語"包裝材料"是指用于容納試劑盒的內容物如本發明的組合物等的一個或多個物理結構。 包裝材料通過熟知的方法來構建，優選用于提供無菌無污染的環境。如本文中所使用，術語 "包裝"是指能夠容納個別試劑盒組分的合適的固體基質或材料，諸如玻璃、塑料、紙、箱等。 因此，例如，包裝可以是用于容納合適量的含有CD淋巴細胞耗竭劑的組合物或含有CD淋巴 細胞耗竭劑和選自由免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的 組的至少一種其它藥劑的組合物的玻璃小瓶。包裝材料通常具有指示試劑盒和/或其組分 的內容物和/或目的的外部標簽。 本發明的劑量
[0103] 在一些實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑在要求保護的方法、組合物和/或試劑盒 中的有效量可以在約 100_200mg/天、200-300mg/天、300-400mg/天、400-500mg/天、500-600mg/天、600-700mg/天、700-800mg/天、800-900mg/天、900-1000mg/天、1000-1 IOOmg/天、 1100-1200mg/天、1200-1300mg/天、1300-1400mg/天、1400-1500mg/天、1500-1600mg/天、 1600-1700mg/天、1700-1800mg/天、1800-1900mg/天或 1900-2000mg/天的范圍內。在本發明 的一個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑是人源化抗CD4抗體(例如扎木單抗）。
[0104] 在其它實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑在要求保護的方法、組合物和/或試劑盒 中的有效量可以在約 100_200mg/周、200-300mg/周、300-400mg/周、400-500mg/周、500-600mg/周、600-700mg/周、700-800mg/周、800-900mg/周、900-1000mg/周、1000-1 IOOmg/周、 1100-1200mg/周、1200-1300mg/周、1300-1400mg/周、1400-1500mg/周、1500-1600mg/周、 1600-1700mg/周、1700-1800mg/周、1800-1900mg/周或 1900-2000mg/周的范圍內。在本發明 的一個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑是人源化抗CD4抗體(例如扎木單抗）。扎木單抗可 以以980mg/周的劑量施用。
[0105] 在一些實施方案中，其它藥劑在要求保護的方法、組合物和/或試劑盒中的有效量 可以在約0 · 1_〇 · 5mg/天、0 · 5-1 · Omg/天、1 ·0-1 · 5mg/天、1 · 5_2mg/天、2 ·0-2 · 5mg/天、2 · 5_ 511^/天、5-1〇11^/天、1〇-1511^/天、15-2〇11^/天、2〇-2511^/天、25-3〇11^/天、3〇-3511^/天、35-40mg/天、40_45mg/天、45_50mg/天、50_55mg/天、55_60mg/天、60_65mg/天、65_70mg/天、70-75mg/天、75_80mg/天、80_85mg/天、85_90mg/天、90_95mg/天、95-1 OOmg/天、0 · 75-1 Omg/天 或2-10mg/天的范圍內。在各個實施方案中，其它藥劑是免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療 劑、免疫佐劑或免疫調節劑中的任一種。
[0106] 在一些實施方案中，其它藥劑在要求保護的方法、組合物和/或試劑盒中的有效量 可以在約 l-5mg/周、5-lOmg/周、10_15mg/周、15_20mg/周、20_25mg/周、25_30mg/周、30-35mg/周、35_40mg/周、40_45mg/周、45_50mg/周、50_55mg/周、55_60mg/周、60_65mg/周、65-70mg/周、70_75mg/天、75_80mg/mg、80_85mg/mg、85_90mg/周、90_95mg/周或 95-1 OOmg/周的 范圍內。在各個實施方案中，其它藥劑是免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑或 免疫調節劑中的任一種。
[0107] 在一些實施方案中，所述至少一種其它藥劑包括以每周25mg的劑量施用30-60分 鐘的替西羅莫司、以每天〇.75-10mg的劑量施用的依維莫司和/或以每天2-10mg的劑量施用 的雷帕霉素。
[0108] 在本發明所要求保護的方法的一個實施方案中，CD4淋巴細胞耗竭劑和其它藥劑 可以使用適當的施用方式(例如，由制造商針對CD4淋巴細胞耗竭劑和其它試劑中的每種所 推薦的施用方式）以上述劑量同時施用。
[0109] 或者，CD4淋巴細胞耗竭劑和其它藥劑可以以上述劑量依序施用。例如，其它藥劑 可以例如每天以上述劑量施用，且CD4淋巴細胞耗竭劑（例如，人源化抗CD4抗體)可以例如 每天、每周、每兩周、每兩星期和/或每月以上述劑量施用。或者，其它藥劑可以例如每天、每 周、每兩周、每兩星期和/或每月以上述劑量施用，且CD4淋巴細胞耗竭劑（例如，人源化抗 CD4抗體)可以例如每天以上述劑量施用。此外，其它藥劑和CD4淋巴細胞耗竭劑(例如，人源 化抗CD4抗體）中的每種可以每天、每周、每兩周、每兩星期和/或每月施用，其中以上述劑量 施用其它藥劑的日期與以上述劑量施用CD4淋巴細胞耗竭劑的日期不同。
[0110] 癌癥疫苗劑量將取決于所使用的疫苗。癌癥疫苗的有效劑量可以由本領域技術人 員（如醫生)確定，或者其可以根據制造商的建議進行施用。在一個實施方案中，癌癥疫苗的 第一劑量是在第〇天施用，且第二劑量是在第7天施用。其它藥劑可以在第2-32天以上述劑 量施用。另外，可以在第10天開始以上述劑量施用2-3個周劑量的抗CD4耗竭劑。例如，如果 使用基于熱激蛋白的疫苗，則熱激蛋白（例如，hspllO或grpl70)可以與腫瘤抗原（如gplOO) 復合并且隨后施用。在一個實施方案中，對于黑色素瘤疫苗來說，可以皮內施用2.5mg/kg的 118口110和8口100的復合物。
[0111] 有效量的CD4淋巴細胞耗竭劑或其它藥劑的典型劑量可以在制造商所推薦的范圍 內（其中使用已知的治療化合物），并且另外如通過在細胞中的體外反應或在動物模型中的 體內反應向本領域技術人員所指示。
[0112] 例如，替西羅莫司的FDA批準劑量為每周歷時30-60min靜脈內施用25mg，對于依維 莫司是每天口服0.75mg-10mg，對于雷帕霉素是每天口服約2-10mg，并且對于扎木單抗是每 周靜脈內施用約980mg。可以根據本發明的各個實施方案使用相同或相似的劑量，或者可以 結合本發明的替代實施方案使用替代劑量。實際劑量可以取決于醫生的判斷、患者的狀況 和治療方法的有效性，該有效性基于例如相關的培養細胞或組織培養的組織樣本的體外反 應性或在適當的動物模型中所觀察到的反應。 實施例
[0113] 以下實施例只是為了說明目的而提供并且無意以任何方式限制本發明的范圍。 實施例1:實驗方法 小鼠和腫瘤細胞
[0114] 雌性C57BL/6J、BALB/c小鼠和Pmel-1 小鼠（6-8周齡）購自 Jacksonlaboratory (BarHarbor，ME)并圈養在無病原條件下。FoxP3-GFP轉基因小鼠在小鼠 Foxp3 (叉頭框P3)啟 動子的控制下表達綠色熒光蛋白。DEREG(調節性T細胞耗竭)轉基因小鼠根據T. S. LahlK、 LoddenkemperC、DrouinC、Freyer J、AmasonJ、Eber IG 等人，JExpMed. 2007; 204:57-63 描述來 產生。所有涉及動物的實驗均符合聯邦和州標準，所述標準包括聯邦動物福利法案 (federalAnimalWelfareAct)和NIH實驗室動物照護和使用指南。
[0115]用人gplOO(人黑色素瘤抗原）轉導B16細胞（小鼠黑色素瘤細胞系）（B16-gp100 )。 RENCA是鼠腎細胞癌(RCC)細胞系。將所述細胞維持在補充有10%熱滅活型胎牛血清(FBS; LifeTechnologies，GrandIsland，NY)、2mmol/LL_谷氨酰胺、100個單位/mL青霉素和IOOyg/ mL鏈霉素的DMEM或RPMI1640培養基中。
[0116] 通過皮下注射2xl05個細胞至側腹中產生小鼠腫瘤:B16腫瘤注射至C57BL/6小鼠 中以及RENCA腫瘤注射至Balb/C小鼠中。用卡尺每周測量腫瘤直徑兩次，并且計算腫瘤體積 (最短直徑2X最長直徑/2)。在肺轉移模型中，通過尾靜脈靜脈內注射腫瘤細胞。使用解剖 顯微鏡對肺轉移計數。 抗體和試劑
[0117]以下單克隆抗體(mAb)(含或不含焚光綴合物)從Biolegen d(SanDiego)獲得:抗 〇04(61(1.5和1^4-5)、抗0)8(53-6.7)、抗〇016/〇032(9.3)、抗〇090.1(0父-7)、抗0)11〇 (N418)、抗Bcl2(BCL/10C4)、抗T-bet(4B10)、抗CD62L(MEL-14)、抗CD279(PD-1，29F.1A12)、 抗FoxP3(FJK-16s)、抗IFN-γ(XMG1.2)、抗IL-2(JES6.5H4)、抗IL-4(11B11)、IL-17A (eBi〇1787).CellTraCe5-(和6_)羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)細胞增殖試劑 盒購自MolecularProbes(Eugene，OR)。替西羅莫司購自 LCLaboratory(Woburn，MA) 〇 T細胞富集和Treg分選
[0118]收集小鼠脾和淋巴結并處理成單細胞懸浮液。使用小鼠 CD8或CD4回收柱試劑盒 (CedarlaneLabs，Burlington，NC)負性富集CD8和CD4T細胞。陰性選擇后的CD8和CD4細胞的 純度大于85%。通過MoFlo細胞分選儀(FortCollins，C0)分選FoxP3-GFP細胞或抗體染色的 CD4+CD25+細胞。 DC的制備和T細胞刺激
[0119]已經描述了 DC 制備（WangY、WangXY、SubjeckJR、ShrikantPA、 KimHL. Br JCancer. 2011; 104: 643-52)。簡單地說，從股骨和脛骨收獲小鼠骨髓，然后以 IxlO6個細胞/孔的密度連同10%FBS和10ng/ml小鼠 GM-CSF-起放置在12孔板中。每2天供 養細胞一次并在7-9天后收獲。75-90%的細胞是CDl Ic陽性的。為了制備用于治療小鼠的DC 疫苗，DC用腫瘤細胞裂解物脈沖，并用10ug/mlCpG激活。將DC皮下注射到小鼠中。對于Pmel-1細胞的體外激活，用l〇ng/ml小鼠 gplOO肽（氨基酸25-33,其由H2-Dbl類分子呈現， AlphaDiagnosticInternational，SanAntonio，TX)使DC脈沖，并用 10ug/mlCpG活化2小時。 用PBS洗滌DC，并與CFSE標記的Pmel-I細胞共培養。通過FACscan分析Pmel-I細胞增殖。 過繼轉移、CD4細胞耗竭和mTOR抑制
[0120]從初次用于實驗的Pmel-I小鼠的淋巴結和脾分離出Pmel-I淋巴細胞。使用 Cedarlane純化柱通過陰性選擇使⑶8淋巴細胞富集。所得細胞的至少85%是⑶8+。將5xl05 個細胞轉移至B57BL/6小鼠中。在過繼轉移后的第二天，小鼠接受經腫瘤裂解物脈沖的DC疫 苗。為了使CD4細胞耗竭，在約7和9天后施用aCD4;對小鼠腹膜內注射250ugCD4mAb(克隆 GKl. 5)。為了使CD8細胞耗竭，小鼠接受250ugCD8mAb(克隆2.43)。為了使DEREG小鼠中的 FoxP3細胞耗竭，注射5ygDT。使用流式細胞術來確認靶細胞的耗竭。對于mTor抑制劑治療而 言，每天腹膜內注射15yg替西羅莫司，持續2周。使用流式細胞術來分析記憶細胞和Treg細 胞。 體內CTL分析
[0121]已經描述了體內 CTL 測定（WangY、WangXY、SubjeckJR、ShrikantPA、 KimHL.BrJCancer. 2011; 104:643-52)。簡言之，從初次用于實驗的小鼠獲得脾細胞的單細 胞懸浮液（IxlO7個細胞/ml)并在含有10%FBS的DMEM中于37°C下用或不用ΙΟμΜ肽脈沖 30min。然后用不同濃度的CFSE(0.5或12.5uM)以2χ10 7個細胞/mlPBS/0.1 %BSA標記每個細 胞群體。通過添加等體積的FBS歷時Imin來停止CFSE標記，并用RPMI完全培養基洗滌3次。將 來自每個肽脈沖或未脈沖的群體的5xl0 6個細胞混合并靜脈注射到免疫的和未免疫的小鼠 中。在轉移后16小時，處死小鼠，并收集脾細胞。制備脾細胞的單細胞懸浮液，并通過流式細 胞術進行分析。熒光供體脾細胞的特異性裂解百分比計算如下：[(未脈沖目標數xA-脈沖目 標數)/未脈沖目標數xA] X 100，其中A =未免疫受體小鼠中的[脈沖目標數/未脈沖目標 數]。 統計學
[0122] 使用重復測量ANOVA評估腫瘤生長的差異。通過雙尾學生T檢驗評價肺轉移數量、 體內CTL殺傷率和來自流式細胞術的平均百分比之間的統計差異。使用StataS. 0 (StataCorp，Col IegeStat ion，Texas)進行所有統計分析。P值<0.05被認為是顯著的。 實施例2 :mT0R抑制增強抗腫瘤克疫
[0123] 在動物模型中，藥理學mTOR抑制可以增強免疫記憶的形成，這可有助于清除感染 和減少腫瘤生長。這是一個出乎意料的發現，因為mTOR抑制劑被用來抑制已經接受實體器 官移植的患者的免疫系統。替西羅莫司是雷帕霉素類似物以及被美國食品藥品管理局 (FDA)批準作為癌癥治療的最初mTOR抑制劑之一。在臨床前模型中，使用替西羅莫司進行 mTOR抑制增強腫瘤裂解物脈沖的DC(在此被稱為DC疫苗）的抗腫瘤免疫（圖la)。替西羅莫司 可以直接抑制一些腫瘤的生長，因此，進行腫瘤預防研究來評估替西羅莫司的免疫作用。通 過在腫瘤激發前13天施用DC疫苗和替西羅莫司，不存在直接抗腫瘤作用的可能性，并且腫 瘤生長的任何減少可以歸因于免疫刺激。單獨施用DC疫苗減少小鼠中的B16腫瘤細胞的生 長，然而大多數小鼠最終由于腫瘤生長而死亡。相反地，DC疫苗和替西羅莫司的組合獲得 100%的存活率，并且完全防止B16腫瘤細胞的生長。
[0124] 為了評估替西羅莫司對特定⑶8淋巴細胞的免疫作用，將Thyl. IPmel-I淋巴細胞 過繼轉移到Thyl. 2B6小鼠中（圖lb) Jmel-I轉基因小鼠攜帶識別由H2-DbMHCI類分子呈現 的gplOO表位(氨基酸25-33)的重排T細胞受體。在B6小鼠用DC疫苗和替西羅莫司處理，從中 收獲淋巴細胞。當與DC疫苗一起施用時，替西羅莫司既有免疫刺激作用，又有免疫抑制作 用。替西羅莫司略微降低是Pmel-I淋巴細胞的CD8細胞的百分比(p值0.08)，然而，Pmel-I淋 巴細胞具有增加的Eomes表達，Eomes是記憶細胞形成的早期標記物。潛在的免疫遏制作用 包括Pmel-I淋巴細胞中Tbet表達的減少以及Treg的增加。這些觀察結果主要由體外混合淋 巴細胞培養研究反映（圖lc)。在體外研究中，替西羅莫司顯著降低由DC疫苗誘導的Pmel-I 淋巴細胞的增殖。 實施例3: CD4耗竭增強mTor抑制的抗腫瘤作用
[0125] 替西羅莫司產生凈抗腫瘤免疫反應，然而Treg增加。此外，腫瘤本身的存在也增加 Treg(圖8)。因此，我們假設由mTOR抑制誘導的抗腫瘤免疫力可以通過靶向Treg進一步增 強。目前還沒有選擇性地消除Treg的臨床策略;然而，使所有CD4淋巴細胞耗竭是可行的。然 而，免疫激活需要CD4效應細胞。因此，在小鼠模型中，在由腫瘤植入物進行免疫刺激之后的 第6天開始用aCD4抗體(aCD4)耗竭CD4淋巴細胞（圖2)。圖1示出了小鼠黑素瘤模型的結果。 在腎細胞癌(另一種經典的免疫敏感性腫瘤)的第二模型中測試這種方法。在腫瘤治療模型 中，在Balb/c小鼠中建立可觸及的RENCA腫瘤。替西羅莫司已經顯示直接抑制體外RENCA腫 瘤細胞的生長（WangY、WangXY、SubjeckJR、ShrikantPA、KimHL.BrJCancer · 2011; 104:643-52)并且在小鼠模型中能有效地減少腫瘤生長（圖2a)。向替西羅莫司治療中添加 aCD4進一 步減少腫瘤生長，而單獨aCD4是沒有效果。令人感興趣地注意到，即使當不使用癌癥疫苗并 且植入腫瘤是特異性免疫刺激的唯一來源時，α⑶4和替西羅莫司的組合仍然減少腫瘤生 長。
[0126] 在相同的實驗中，在第45天收獲淋巴細胞并且評估其腫瘤特異性IFN-Y反應（圖 2b)。在沒有接受處理的荷瘤小鼠中，沒有IFN- γ反應。使用aCD4或替西羅莫司進行處理產 生了一些IFN-γ反應;然而，組合處理產生最大的IFN-γ反應。為表征響應于aCD4的⑶4淋 巴細胞耗竭，用單劑量的aCD4處理初次用于實驗的小鼠。幾乎所有CD4細胞第二天都從外周 血、脾和淋巴結中耗竭（圖2c )，而⑶8細胞被保存（圖2d)。重要的是，FoxP3+⑶4+細胞被耗竭 并且甚至在施用aCD4后的10天仍然很低（圖2e)。單劑量aCD4減少所有CD4子集的群體（圖 9) 〇 實施例4: CD4耗竭和替西羅莫司的組合產生依賴于記憶CD8細胞的抗腫瘤免疫
[0127] 由于替西羅莫司可以具有直接抗腫瘤作用，重要的是確定aCD4和替西羅莫司的組 合產生依賴于CD8淋巴細胞的有效抗腫瘤免疫。用替西羅莫司單獨處理具有RENCA腫瘤的 Balb/c小鼠10天，然后用第二RENCA腫瘤激發（圖3a)。被注射aCD8抗體(aCD8)以耗竭CD8效 應細胞的小鼠具有增加的第二RENCA腫瘤的生長，這表明即使單獨的替西羅莫司也至少部 分通過刺激免疫反應起作用。替西羅莫司和aCD4的組合完全阻止第二RENCA腫瘤的生長;然 而，aCD8消除了對第二腫瘤的抗腫瘤作用，這表明細胞免疫對腫瘤控制的重要性(圖3b)。
[0128] 為了在更具侵襲性的腫瘤模型中進一步確立免疫系統的作用并測試我們提出的 治療，我們評估了抗腫瘤免疫力是否可以轉移來防止轉移性肺沉積物的生長。aCD4和替西 羅莫司的組合被用來處理確立的皮下RENCA腫瘤（圖3c)。將來自這些小鼠的淋巴細胞過繼 轉移到用RENCA細胞靜脈內激發的初次用于實驗的小鼠中。如通過比較肺重量（圖3d)和肺 沉積物計數（圖3e)所量化，組合處理顯著降低肺沉積物的建立和生長（圖3c)。因此，記憶細 胞被成功轉移到初次用于實驗的小鼠中，在其中它們有助于控制腫瘤生長。通過使CD8細胞 耗竭，證明抗腫瘤活性依賴于CD8細胞。通過將CD8淋巴細胞從經過治療的小鼠轉移到初次 用于實驗的小鼠中進一步確認了免疫刺激。在非常具有侵襲性的腫瘤模型中，轉移的淋巴 細胞能有效地控制轉移沉積物的生長。 實施例5:CD4耗竭和替西羅莫司處理的組合增強CD8記憶細胞的功能
[0129] 替西羅莫司抑制腫瘤生長的重要機制是提高特異性⑶8記憶的質量。因此，我們表 征CD8記憶細胞的質量，目的是評估aCD4是否進一步增強在mTOR抑制的存在下形成的特異 性CD8記憶。我們使用了其中DC疫苗刺激免疫反應而不是腫瘤本身的模型，因為使用荷瘤小 鼠的實驗的持續時間受對照組中的迅速腫瘤生長的限制。通過使用DC疫苗，可以評估長期 記憶，包括回憶應答。將Thyl. IPmel-I淋巴細胞過繼轉移到B6小鼠中，然后用B16-DC疫苗激 發B6小鼠并用aCD4和替西羅莫司進行處理（圖4a)。
[0130] 為了評估記憶細胞，在于第46天用DC疫苗再激發小鼠之前（圖4b)或之后（圖4c)收 獲脾細胞。在即將再激發之前，實驗組中的Pmel-I淋巴細胞的百分比沒有顯著差異（圖4b)。 然而，來自經過aCD4和替西羅莫司二者處理的小鼠的⑶8淋巴細胞具有顯著更高的記憶標 記物Eomes和BCL2的表達。這個組中的⑶8淋巴細胞具有顯著更高的⑶62L表達，CD62L是高 度有效的中央記憶細胞的標記物。與高質量記憶細胞相一致，在用DC疫苗再激發后，組合處 理組中的Pmel-I細胞具有最大的擴增并且⑶8細胞具有最高的Tbet和IL2表達（圖4c)。有趣 的是，即使在再激發后，組合處理組中的擴增的⑶8細胞仍具有最高的Eome S(早期記憶標記 物)表達。組合治療產生的⑶8淋巴細胞具有能夠響應于重復抗原激發迅速擴增的最強記憶 表型。在我們的模型中，Treg存在于免疫致敏期間，因為在免疫刺激后的至少6天開始CD4耗 竭。
[0131] 其他人已經報道，Treg在免疫致敏期間對⑶8記憶形成是必要的。因此，在我們的 治療模型中，在初次免疫刺激的至少6天后使Treg耗竭。然而，我們已經核實了在免疫致敏 期間具有CD4細胞的重要性。當在免疫致敏之前進行CD4耗竭時，CD8記憶形成是不良的，如 在刺激記憶細胞后的弱腫瘤特異性CD8擴展和低Eomes表達所指示(圖10)。 實施例6:耗竭或置換F〇Xp3Treg細胞改變體內CTL功能
[0132] 我們最初的假設是通常由替西羅莫司誘導的Treg耗竭將增強抗腫瘤免疫力。我們 選擇CD4耗竭作為使Treg耗竭的策略，因為CD4耗竭在患者中是可行的。然而，我們想要測試 ⑶4耗竭的影響是否可以直接歸于Treg耗竭。因此，我們使用DEREG(調節性T細胞耗竭)轉基 因小鼠，它攜帶在Foxp3啟動子控制下的DTR-eGFP轉基因，從而允許通過施用白喉毒素 (DT) 特異性耗竭 Treg(LahlK、LoddenkemperC、DrouinC、Freye;rJ、A;rnasonJ、Ebe;rlG 等人， JExpMed. 2007; 204:57-63.)。在與圖2中所示的實驗類似的實驗中，在第6天和第10天施用 DT來代替aCD4(圖5a)。用DC疫苗刺激免疫系統并且在第35天通過體內CTL評估特異性免疫 記憶（圖5c) JT施用消除了幾乎所有的⑶4+FoxP3+淋巴細胞（圖5b)。當與對照組相比時，在 經過DT和替西羅莫司處理的小鼠中特異性殺傷顯著提高（圖5c，最右邊的一組）。因此，去除 Treg具有類似于CD4耗竭的免疫作用。
[0133] 為了充分確定Treg耗竭作為CD4耗竭后的免疫刺激的潛在機制，在CD4耗竭后置換 Treg(圖6a)。如通過體內CTL所評估，經過aCD4和替西羅莫司處理的小鼠發展出最佳的特異 性免疫記憶（圖6b)。然而，當來自經過DC疫苗處理的小鼠的Treg被過繼轉移時，特異性殺傷 下降到僅接受DC疫苗的對照小鼠的水平（圖6b，最右邊的圖）。這些實驗證實:在利用aCD4的 情況下，是Treg耗竭增強了特異性免疫記憶形成。 實施例7:在CD4耗竭后，最終恢復的Treg群體的免疫抑制性較低
[0134] 在使用DC疫苗、a⑶4和替西羅莫司進行處理后，Treg群體最終恢復（圖7a)。在不同 實驗組之間，脾中的Treg絕對數量的差異并非是統計顯著的。然而，所述治療可以對Treg具 有長期影響。因此，我們評估了恢復的Treg的免疫抑制功能。基于CD25狀態分選CD4淋巴細 胞（圖7b)。絕大多數⑶4+⑶25+細胞都是FoxP3陽性的并且被認為是Treg，且絕大多數⑶4+ CD25-細胞是FoxP3陰性的并且被認為是⑶4效應細胞。在功能研究中，對照⑶4+⑶25+細胞 遏制CD8淋巴細胞的增殖。然而，在CD4耗竭后恢復的CD4+CD25+的免疫抑制性較低，這可能 是因為它們不太可能是腫瘤特異性Treg(圖7d)。有趣的是，在CD4耗竭后，恢復的CD4效應細 胞也不太有效，如由較低的IFNy和IL4分泌所指示（圖7c)。可能的是，CD4效應細胞和Treg 都不太可能是腫瘤特異性的。
[0135] 免疫治療方法已證明可有效地治療實體瘤。FDA批準了 sipuleucel-T，其成為用于 治療實體瘤的第一個市售的癌癥疫苗。易普利單抗(靶向CTLA4的單克隆抗體)最近被批準 用于治療黑色素瘤。靶向CTLA4和PD-I的免疫檢查點抑制劑正在針對各種惡性疾病的大量 臨床試驗中積極進行研究。一直存在跡象表明基于免疫的療法甚至可以治愈患有轉移性疾 病的患者的亞群，但免疫療法的最新進展重新確認持久的完全反應是可能的。因此，免疫療 法是癌癥治療的最有前途的方法之一。 實施例8: CD4淋巴細胞耗竭劑和過繼免疫治療劑的組合增強抗腫瘤作用
[0136] 將B16腫瘤細胞植入到DREG小鼠中，DREG小鼠是被工程改造來在FoxP3啟動子之后 表達白喉毒素受體的B6小鼠。小鼠在第2天接受用腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗。用白喉毒素使 Treg特異性耗竭并且在第6天和第10天利用aCD4抗體去除⑶4細胞。監測腫瘤生長。*p = 0.05，#p = 0.0009。如圖11中所示，當與單獨的DC疫苗相比時，CD4淋巴細胞耗竭和DC疫苗 的組合增強抗腫瘤效果。 實施例9: CD4淋巴細胞耗竭劑和免疫檢查點抑制劑的組合增強抗腫瘤作用
[0137] 將B16腫瘤細胞植入到B6小鼠中。在第0天。在第6天和第10天用aCD4抗體使⑶4細 胞耗竭。在第10至第24天用aF>D-l抗體處理小鼠。監測腫瘤生長。*p = 0.02。如圖12中所示， 當與單獨的抗ro-i抗體相比時，CD4淋巴細胞耗竭和抗ro-i抗體的組合增強抗腫瘤效果。 實施例10:抗CD4抗體展現抗腫瘤活性
[0138] 在第0天，將RENCA-CA9腫瘤細胞植入到Balb/C小鼠中（η = 5/組）。在第6天和第10 天用aCD4抗體使⑶4淋巴細胞耗竭（圖13Α)。在第45天收獲淋巴細胞，用CA9肽再刺激，并且 針對CD8和IFNy染色。結果代表重復實驗（圖13B)。對于體外CTL測定，在第45天收獲脾細胞 并用IL2、RENCA裂解物和CA9肽進行培養。通過用CFSE標記RENCA細胞制備靶細胞。以50:1的 比率共培養效應細胞和靶細胞，并通過FACS分析為7-AAD陽性和膜聯蛋白V陰性的CFSE+細 胞的百分比（圖13C)。直方圖提供平均值+SEMjpS0.0 5316腫瘤生長曲線顯示:抗⑶4抗體 具有抗腫瘤作用（圖13D)。如圖13中所示，CD4耗竭產生能夠在腫瘤抗原的存在下激活和殺 傷腫瘤細胞的腫瘤特異性CD8細胞。 實施例11: CD4淋巴細胞耗竭劑、過繼免疫治療劑和mTOR抑制劑的組合增強抗腫瘤作用
[0139] 在第0天，將B16腫瘤細胞皮下注射到B6小鼠的側腹中（n = 5/組）。小鼠在第3天接 受用腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗，并且在第6天和第9天進行CD4淋巴細胞耗竭(使用抗 體）。在第9天至第20天，每天腹膜內注射替西羅莫司。示出了具有SEM的B16腫瘤生長曲 線。**p<0.001。如圖14中所示，CD4淋巴細胞耗竭劑、樹突細胞疫苗和mTOR抑制劑（替西羅 莫司）的組合有效地控制腫瘤的生長。
[0140] 上述的各種方法和技術提供了用于實施本申請的多種方式。當然，應當理解的是， 根據本文所描述的任何特定實施方案并不一定能夠實現所描述的所有目標或優點。因此， 例如，本領域技術人員將認識到，可以以實現或優化如本文所教導的一個優點或一組優點 而不一定實現如本文所教導或表明的其它目標或優點的方式來執行所述方法。本文中提及 了多種替代方案。應該理解的是，一些優選的實施方案明確地包括一種、另一種或若干特 征，而其它實施方案明確地排除一種、另一種或若干特征，而還有其它實施方案通過包括一 種、另一種或若干有利特征而緩和一種具體特征。
[0141]此外，熟練的技術人員將認識到來自不同實施方案的各種特征的適用性。類似地， 以上所討論的不同的要素、特征和步驟以及對于每個此類要素、特征或步驟的其它已知等 效物可以由本領域的普通技術人員以各種組合使用，以根據本文所述的原則執行方法。在 不同的實施方案中，在不同的要素、特征和步驟之中，一些將明確地被包括，而其它明確地 被排除。
[0142] 雖然已經在某些實施方案和實施例的上下文中公開了本申請，但本領域技術人員 應該理解，本申請的實施方案超出明確公開的實施方案而涵蓋其它替代性實施方案和/或 其用途和修改和等效物。
[0143] 本文描述了本申請的優選實施方案，包括發明人已知的用于實施本申請的最佳模 式。在閱讀上述描述后，那些優選實施方案的變型對于本領域的普通技術人員將變得顯而 易見。預期熟練的技術人員可以視情況采用這些變型，并且本申請可以以除本文明確描述 之外的方式來實踐。因此，如適用法律所允許的，本申請的多個實施方案包括所附權利要求 中列舉的主題的所有修改物和等效物。此外，除非本文中另外指示或顯然與上下文矛盾，否 則在其所有可能變型中的上述要素的任何組合均包括在本申請中。
[0144] 本文所參考的所有專利、專利申請、專利申請的公開以及其它材料如文章、書籍、 說明書、出版物、文件、事物和/或類似物在此通過引用整體并入本文以用于所有目，除了與 此有關的任何起訴文件歷史、與本文件不一致或沖突的任何等同物、或對與本文件目前或 以后相關的最廣泛的權利要求范圍可能具有限制性影響的任何等同物。舉例來說，如果在 與任何并入的材料相關和與本文件相關的術語的說明、定義和/或用途之間存在任何不一 致或沖突，則應當以本文件中的說明、定義和/或用途為準。
[0145] 應該理解，在本文中公開的本申請的實施方案說明了本申請的實施方案的原則。 可以采用的其它修改可以在本申請的范圍內。因此，通過舉例，但不是限制，可以根據本文 中的教導來利用本申請的實施方案的替代配置。因此，本申請的實施方案不限于精確地如 所示出和描述的那些。
[0146] 在上文的【具體實施方式】中描述了本發明的各個實施方案。雖然這些說明直接描述 了上述實施方案，但應該理解，本領域技術人員可以設想針對本文所示出和描述的具體實 施方案的修改和/或變型。落在本說明的范圍內的任何此類修改或變型也旨在被包括在其 中。除非明確說明，否則發明人希望在本說明書和權利要求書中的字詞和短語對適用領域 的普通技術人員指定普通和習慣的含義。
[0147]
【申請人】在提交本申請時已知的本發明的各個實施方案的前述描述已經被呈現并 且旨在用于說明和描述的目的。本描述無意為詳盡性的，也無意將本發明限制于所公開的 精確形式，并且許多修改和變型根據上述教導的是可能的。所述的實施方案是用來解釋本 發明的原則和其實際應用并允許本領域的其它技術人員在各個實施方案中以適于預期的 特定用途的各種修改利用本發明。因此，希望本發明不限于為了實施本發明所公開的具體 實施方案。
[0148] 雖然已經示出和描述了本發明的具體實施方案，但對于本領域技術人員而言顯而 易見的是，基于本文中的教導，可以在不脫離本發明和其更寬廣方面的情況下作出改變和 修改，并且因此，所附的權利要求將在其范圍內包括所有此類改變和修改，它們也在本發明 的真實精神和范圍內。
【主權項】
1. 一種治療、預防有需要的受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的方 法，其包括： 提供CD4淋巴細胞耗竭劑； 提供選自由免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的組的 至少一種其它試劑；以及 向所述受試者施用治療有效量的所述CD4淋巴細胞耗竭劑和所述其它藥劑，從而治療、 預防所述受試者中的所述病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展。2. -種治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的方法，其包括： 提供包含⑶4淋巴細胞耗竭劑的組合物；以及 向所述受試者施用治療有效量的所述組合物，從而治療、預防所述受試者中的病狀、減 輕其嚴重程度和/或減緩其進展。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述病狀是感染性疾病或癌癥。4. 根據權利要求3所述的方法，其中所述癌癥是腎癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、膠 質母細胞瘤、肺癌、結腸癌或膀胱癌。5. 根據權利要求2或1所述的方法，其中所述受試者是人。6. 根據權利要求2所述的方法，其中所述受試者已被診斷為患有癌癥或感染性疾病。7. 根據權利要求2或1所述的方法，其中所述CD4淋巴細胞耗竭劑選自由以下組成的組： 小分子、肽、抗體或其片段和核酸分子。8. 根據權利要求2或1所述的方法，其中所述CD4淋巴細胞耗竭劑是單克隆抗體或其片 段、多克隆抗體或其片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其片段或單鏈抗體。9. 根據權利要求2或1所述的方法，其中所述CD4淋巴細胞耗竭劑是人源化抗CD4抗體。10. 根據權利要求2或1所述的方法，其中所述CD4淋巴細胞耗竭劑是扎木單抗。11. 根據權利要求2或1所述的方法，其中所述CD4淋巴細胞耗竭劑以100-200mg/天、 200_300mg/天、300-400mg/天、400-500mg/天、500-600mg/天、600-700mg/天、700-800mg/ 天、800-900mg/天、900-1000mg/天、1000-1100mg/天、1100-1200mg/天、1200-1300mg/天、 1300-1400mg/天、1400-1500mg/天、1500-1600mg/天、1600-1700mg/天、1700-1800mg/天、 1800-1900mg/天或 1900-2000mg/天施用。12. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述過繼免疫治療劑是樹突細胞疫苗。13. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述免疫檢查點抑制劑是抗PD-1抗體。14. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述組合物進一步包含mTOR抑制劑。15. 根據權利要求2或1所述的方法，其中所述組合物經靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、 經口或經由吸入施用。16. 根據權利要求1所述的方法，其中所述CD4淋巴細胞耗竭劑和所述其它藥劑同時施 用。17. 根據權利要求1所述的方法，其中所述CD4淋巴細胞耗竭劑在施用所述其它藥劑之 前、期間或之后施用。18. 根據權利要求1所述的方法，其中所述其它藥劑以0.1-0.5mg/天、0.5-1 .Omg/天、 1 · 0-1 · 5mg/天、1 · 5-2 · Omg/天、2 · 0-2 · 5mg/天、2 · 5_5mg/天、5-lOmg/天、10_15mg/天、15-20mg/天、20_25mg/天、25_30mg/天、30_35mg/天、35_40mg/天、40_45mg/天、45_50mg/天、50- 55mg/天、55_60mg/天、60_65mg/天、65_70mg/天、70_75mg/天、75_80mg/天、80_85mg/天、85-90mg/天、90_95mg/天或 95-100mg/天施用。19. 根據權利要求1所述的方法，其中所述其它藥劑是免疫檢查點抑制劑。20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述免疫檢查點抑制劑選自由以下組成的組:抗 ro-1抗體、抗ro-L 1抗體、抗ro-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗KIR抗體、抗IDO 1抗體、抗ID02抗 體、抗??Μ-3抗體、抗LAG-3抗體、抗0X40R抗體和抗PS抗體或其組合。21. 根據權利要求1所述的方法，其中所述其它藥劑是過繼免疫治療劑。22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述過繼免疫治療劑選自由以下組成的組:樹突 細胞疫苗、肽疫苗、基于嵌合T細胞抗原的療法、免疫細胞因子、基于熱激蛋白的疫苗、基于 腫瘤溶解物的疫苗、攜帶腫瘤抗原的病毒載體、病毒疫苗、細菌疫苗和真菌疫苗或其組合。23. 根據權利要求1所述的方法，其中所述其它藥劑是免疫佐劑。24. 根據權利要求23所述的方法，其中所述免疫佐劑選自由以下組成的組:鋁鹽、病毒 顆粒和油基佐劑或其組合。25. 根據權利要求1所述的方法，其中所述其它藥劑是免疫調節劑。26. 根據權利要求25所述的方法，其中所述免疫調節劑選自由以下組成的組:mTOR抑制 劑、STAT抑制劑、TGF0受體抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑或其組合。27. 根據權利要求14所述的方法，其中所述mTOR抑制劑選自由以下組成的組:小分子、 肽、抗體或其片段、核酸分子和大環內酯化合物。28. 根據權利要求27所述的方法，其中所述mTOR抑制劑選自由以下組成的組：（i)替西 羅莫司(CCI-779)或其藥物等效物、類似物、衍生物或鹽；（ii)依維莫司(RAD-001)或其藥物 等效物、類似物、衍生物或鹽;和（iii)西羅莫司（雷帕霉素)或其藥物等效物、類似物、衍生 物或鹽。29. -種組合物，其包含⑶4淋巴細胞耗竭劑。30. -種組合物，其包含CD4淋巴細胞耗竭劑以及選自由免疫檢查點抑制劑、過繼免疫 治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的組的至少一種其它藥劑。31. 根據權利要求29或30所述的組合物，其進一步包含藥學上可接受的載體。32. -種用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的試劑盒， 其包括： 包含⑶4淋巴細胞耗竭劑的組合物；以及 關于使用所述組合物來治療、預防所述受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其 進展的說明書。33. -種用于治療、預防受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其進展的試劑盒， 其包括： CD4淋巴細胞耗竭劑； 選自由免疫檢查點抑制劑、過繼免疫治療劑、免疫佐劑和免疫調節劑組成的組的至少 一種其它藥劑；以及 關于使用所述組合物來治療、預防所述受試者中的病狀、減輕其嚴重程度和/或減緩其 進展的說明書。
【文檔編號】A61K39/00GK105979961SQ201580007415
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年2月5日
【發明人】H·基姆, 王艷萍
【申請人】西達-賽奈醫療中心