含有酸漿提取物的個人護理產品的制作方法
【專利摘要】一種減少皮膚損傷和/或為受試者提供健康或美容益處的方法，包括向受試者的皮膚施用包含有效量酸漿(Physalis alkekengi)提取物的組合物。
【專利說明】含有酸漿提取物的個人護理產品
[00011本申請要求美國專利申請號61/915,300的優先權，其申請日為2013年12月12日， 通過引用并入本文。
【背景技術】
[0002] 本發明一般涉及含有酸衆(Physalis alkekengi)提取物的個人護理產品，更具體 地，涉及通過向個人護理產品添加酸漿提取物，以防止皮膚由于暴露于紫外線輻射受到損 害，舒緩皮膚，改善皮膚狀態，減少皮膚老化的影響。
[0003] 肌膚不斷暴露于包括紫外線(UV)照射的環境侵害之中。這種暴露的結果可導致衰 老角質細胞的積累。這些角質細胞可對皮膚的結構和功能產生負面影響。具體而言，施加于 皮膚上的UV輻射可導致細胞內活性氧(R0S)的產生，它能夠引起DNA損傷。這種DNA損傷能夠 刺激誘導細胞衰老。此過程的視覺結果就是皮膚老化。針對這種反應的第一道防線是利用 那些我們身體中發現的由健康飲食提供的抗氧化劑。另一個減少這種暴露造成的影響的機 會是利用經由個人護膚品施加于皮膚表面的抗氧化劑。抗氧化劑具有在環境誘發的自由基 引起下游效應之前將其猝滅的能力。
[0004] 皮膚對于每天不同類型的環境和物理壓力具有承受能力，包括暴露于刺激性化學 物質或紫外線輻射。作為人體的自然反應機制，表皮角化細胞能釋放大量細胞因子，如白細 胞介素6,8，1(1(11^-6，11^-8和11^-1€〇和腫瘤壞死因子(1(^即-€〇。這些細胞因子可作為人體對 抗環境暴露的免疫應答反應，并且與刺激性癥狀的發展有關。這些刺激性癥狀可導致皮膚 變得紅腫疼痛。抗氧化劑有助于舒緩皮膚受到的刺激。
【發明內容】
[0005] 酸漿的提取物被發現具有對皮膚護理具有一定影響的抗氧化作用。其好處在于可 減少皮膚因暴露于紫外線輻射而產生的炎癥標志物。向個人護理產品中加入酸漿提取物， 可向用戶提供一種對皮膚有益的護理方法，有益效果包括抗衰老作用。
[0006] 本發明的目的在于提供一種含有酸漿提取物的個人護理產品，以為用戶提供有益 效果。
[0007] 本發明的另一個目的是通過提供含有酸漿提取物的個人護理產品降低用戶的皮 膚傷害風險。
[0008] 本發明的目的還包括提供一種減少受試者皮膚損傷的方法，其包括將含有有效劑 量酸漿提取物的組合物施用于受試者皮膚的方法。
[0009] 本發明的目的還包括提供一種降低受試者炎癥標志物水平的方法，其包括將含有 有效劑量迷迭香(rosemary)提取物的組合物應用于受試者皮膚的方法。
[0010] 本發明的目的還包括提供一種降低減少一種或兩種炎癥標志物水平的方法，炎癥 標志物包括 IL-6、IL-8、IL-I 和 TNFa。
[0011] 這些和本發明的其他目的將通過本說明書、相關附圖和所附的權利要求書的闡 述，為本領域技術人員所理解。
【附圖說明】
[0012]圖1是實施例1中MTT比色結果。
[0013]圖2是實施例1中IL-6的測定結果。
[0014]圖3是實施例1中IL-8的測定結果。
[0015]圖4是實施例1中IL-Ia的測定結果。
[0016] 圖5是實施例1中TNFa的測定結果。
[0017] 圖6是0.05mg/mL水溶性維生素 E(Trolox)對DPPH的抑制作用（IC50 = 0.0010% )。
[0018] 圖7是0.05mg/mL LumiSalis SE對DPPH的抑制作用。
[0019] 詳細描述
[0020] 酸衆(Physalis alkekengi)是一種原產于亞洲的多年生草本植物，生產一種封閉 于亮橙紅色紙質基底萼中的橙紅色果子。酸漿是一種流行的觀賞植物，傳統醫學上用來作 為一種利尿、殺菌、正肝和鎮靜藥物。酸漿花萼含有高水平的抗氧化物，包括類胡蘿卜素。
[0021] 如本發明所述，"減少"是指治療，改善，減少不良外觀，降低嚴重程度，或減少不利 影響。
[0022] 如本發明所述，"炎癥標志物"是指由身體產生的可以指示炎癥的發生或先于炎癥 產生的物質，包括但不限于白介素-6(IL_6)、白介素-8(IL_8)、白細胞介素-la(IL-Ia)和腫 瘤壞死因子a(TNFa)。
[0023] 如本發明所述，"皮膚損傷"包括但不限于產生細紋或粗糙的皺紋，不規則的色素 沉著，被稱為著色斑的大雀斑樣斑點，膚色暗黃，皮膚質感粗糙似皮革狀。皮膚損害還包括： (a)皮膚干燥，其中日光暴曬的皮膚會逐漸失去水分和油脂，使其顯得干燥，脫皮和/或過早 褶皺，甚至出現于年輕人群；（b)曬傷，對于皮膚暴露于UV輻射后立即出現的皮膚損害或傷 害的通用名稱，輕度曬傷僅引起皮膚疼痛發紅，但在更嚴重的病情可以產生微小的流體填 充腫塊(囊泡)或更大的水皰;和(c)光化性角化病，是一種細微的感覺像砂紙一樣的腫塊， 或由曬傷皮膚產生的細小鱗肩狀碎片，呈粉紅色、紅色、黃色或褐色;不像曬痕或曬傷，光化 性角化病通常不會自行消失，除非它被凍結、化學治療或由醫生清除;光化性角化病發病于 經歷了多次或長期陽光紫外線暴曬的皮膚區域，是皮膚癌風險增加的警告標志。
[0024] 如本發明所述，"有效治療劑量"是指本發明的化合物或組合物或其衍生物施用于 受試者時，能夠實現預期治療效果的劑量。一次標準劑量的給藥并不一定產生完全的治療 效果，只有一系列標準劑量的給藥可能實現上述效果。因此，有效治療劑量可以分一次或多 次給藥。受試者所需要的精確有效劑量將取決于以下因素，例如受試者的體型、健康和年 齡，病情的性質和程度，所選擇的治療方法或組合療法，以及給藥方式。本領域技術人員可 以容易地通過常規實驗確定給定情況的有效劑量。在一個實施方案中，當按照說明使用時， 如本文所述的被加入到個人護理產品的酸漿提取物，將以有效治療劑量施用于皮膚。
[0025] 如本發明所述，"調理或治療"是指，試圖改變所治療個體、動物或細胞的病情的干 預過程，并且可在預防或臨床病理階段進行。預期效果包括預防疾病的發生或復發，緩解癥 狀，消減疾病的任何直接或間接病理后果，降低疾病發展速度，改善或減輕疾病狀態，及提 高或改善預后。針對狀況或受試者進行治療是指采取措施以獲得有益的或預期的結果，包 括臨床結果。有益的或預期的臨床結果包括但不限于減少、減輕或改善與皮膚損傷有關的 一種或多種癥狀。
[0026]在本發明的優選實施方案中，酸漿提取物的劑量范圍為個人護理產品重量的 0.001 %至10%，其包括之間的所有值，而不限于或剔除以下數值，例如0.002%，0.003%， 0.004 %,0.01%,0.03 %,0.06 %,0.09 %,0.1%,0.25 %,0.7%,1%,2%,3%,4%, 4.15%，6.63%，和9.87 %。換而言之，在本發明的優選實施方案中，劑量可以取任何以 "ab. cde %重量"格式表示的值，其中a選自數字0和I，b、c、d和e各自獨立地選自數字0、1、2、 3、4、5、6、7、8和9,唯一例外是a，b，c，d和e不能全部為0。
[0027] 實施例1-成纖維細胞的IL-6，IL-8，IL-Ia和TNFa
[0028]目的：
[0029]本測試過程用于篩選材料的降低紫外線（280-315nm，通常被稱為UVB)誘導的兒- 6、IL_8、IL-Ia和TNFa增加的能力，采用培養的成纖維細胞作為實驗模型。
[0030] 測試材料的制備：
[0031] 新鮮的酸漿漿果冷凍干燥。將所得干漿果磨碎成粉末。粉末用于提取油狀物。采用 超臨界二氧化碳進行提取。提取條件如下:溫度45°c，壓力300bar;C0 2流速為100g/分鐘；溶 劑與進料之比為70。所得提取物為橙色油狀物。此油狀物（CLSC)將以濃度為0.01 %， 0.005 %，0.001 %的溶液形式，進行以下生物測試分析。
[0032]測試方法概述：
[0033] 皮膚細胞暴露于UVB可導致炎癥反應及相關炎癥標志物的釋放，如IL-6，IL-8，IL-Ia和ΤΝα。這些炎癥介質的釋放可能對皮膚的外觀和功能造成不利影響。因此，將可以防止 UVB誘導炎癥反應的材料作為化妝品成分是有益的。
[0034]在本研究中，人皮膚成纖維細胞在UVB照射后培養并處理處理24小時。在培養期結 束時，收集細胞培養基并采用ELISA方法測定其IL-6，IL-8，IL-Ia和TNFa含量。細胞活力的 變化采用MTT比色法進行評估。
[0035] 材料和方法：
[0036] 成纖維細胞的培養:
[0037] 人真皮成纖維細胞被接種到含有成纖維細胞生長培養基(FGM)的24孔板中，培養 條件為37 ± 2 °C和5 ± 1 % CO2，視實際需求每48至72小時更換培養基。細胞匯合收集經UVB照 射后需用測試材料進行處理。在UVB照射前的24小時內，僅使用DMEM培養基對細胞進行處 理。為完成UVB照射，采用PBS代替細胞培養基，細胞UVB照射的輻射劑量為40mJ/cm 2。采用在 DMEM中制備的測試材料對UVB照射后的細胞進行處理。在培養期結束時，收集細胞培養基并 測定IL-6，IL-8，IL-Ia和TNFa含量，而細胞活力的變化采用MTT比色法進行測定。
[0038] MTT 比色法:
[0039] 在UVB培養后，將細胞培養基移除（見上文），成纖維細胞用PBS洗滌兩次以去除任 何殘余的測試材料。最后一次洗滌后，將500μ1添加有0.5mg/ml MTT的DMEM培養基加入到每 個孔中，并將細胞在37±2°C和5±1%C02條件下培養1小時。培養后，除去DMEM/MTT溶液并 將細胞用PBS再洗滌一次，然后將0.5ml異丙醇加入到孔中，以提取紫色福爾馬肼晶體。將 200μ1異丙醇提取物轉移到96孔板中，并將板在540nm波長下讀取吸光值，以異丙醇作為空 白對照。
[0040] ELISA 測試板的制備（IL-6，IL-8, IL-Ia 和 INFa):
[0041 ]通過在PBS中稀釋適當量的捕獲抗體制備ELISA測試板。接著，將100μΙ稀釋的捕捉 抗體加入96孔ELISA板的孔中，并且將板在室溫下培養過夜。在第二天，用300μ1洗滌緩沖液 (PBS中加入0.05%吐溫20)將板沖洗3次，并向每孔加入300μ1封閉緩沖液(PBS中加入1% BSA)進行封閉。將板用封閉緩沖液孵育至少一個小時。孵育后，除去封閉緩沖液，并將板按 如上所述方法洗滌3次。
[0042] ELISA法測定步驟:
[0043] 制備一系列標準液，每個孔加入100μΙ標準液，每種標準液在96孔板合適的位置分 配兩孔(作為副本）。接著，將100μΙ的每種樣品加入到附加的孔中，并將板在室溫下溫育兩 小時。溫育后，用如上所述方法將板洗滌三次。將最后一次洗滌的溶液除去后，加入100μΙ生 物素聯合檢測抗體。將板在室溫下孵育2小時后，用如上所述方法將板再次洗滌。然后將100 μL HRP標記的鏈霉親和素加入每個孔中并將板在室溫下溫育20分鐘。將最后一次洗滌的溶 液除去后，將1〇〇μ1的底物溶液(過氧化氫+四甲基聯苯胺作為色原）加入到每個孔中。顯色 程度達到足夠水平時，將50μ1停止溶液(2Ν硫酸)加入到每個孔中，將板置于460nm波長下讀 取吸光值。
[0044] 結果：
[0045] MTT的測定結果如圖1所示。測定的值表示為平均生存能力土標準偏差。IL-6，IL-8，IL_la和TNFa的測定結果分別如圖2-5所示。這些測定的值均表示為平均濃度土標準偏 差。
[0046]討論：
[0047]本研究中，UVB照射成纖維細胞會導致活細胞的數目顯著減少，并伴隨有蛋白水解 作用和所有測得的炎癥標志物的顯著增加。經測試材料處理后，活細胞的數量的未出現任 何進一步的下降。
[0048]當CLSC在UVB照射后加入到成纖維細胞時，活細胞的數目沒有進一步下降，并且觀 察到此材料可以顯著降低IL-6，IL-8，IL-I α和TNFa的釋放水平。
[0049] 實施例2-微量滴定板DPPH法表征酸漿提取物的抗氧化活性 [0050] 材料和方法：
[0051 ] 試劑：HPLC所用試劑純級乙醇購自Fisher Scientific，目錄號六995-4。2,2_二苯 基1-苦基苯肼(DPPH)購自Fisher Scientific，目錄號AA4415003。水溶性維生素 E購自 Fisher Scientific，目錄號05-402-25。測試材料按實施例1所述方法制備獲得 (LumiSalisiwSE 批次 59214沙5,59214沙8 和 59214沙9)。
[0052]設備：吸光度米用Molecular Devices SpectraMax M5e型酶標儀(KH51-001)進行 測量，酶標儀配有一個清晰的平底96孔板，96孔板購自Advangene Life Science Plasticware，目錄號CC plate-PS-96S-F-C_S。質量米用Mettler Toledo分析天平（型號 XS204)測量。本測試中使用了多通道自動移液器（100μΙ ;Fisher Scientific公司目錄號 FBE800300)，單通道移液器（200μ1，1000μ1 和5000μ1 !Thermo Scientif ic 目錄號分別為 4642080,4642090和FBE 0500)。
[0053] 實驗過程:實驗過程如下。簡而言之，制備乙醇DPPH工作溶液(0.075mg/mL)。制備6 種濃度范圍0-0.006 %的水溶性維生素 E溶液(作為對照）。通過在乙醇中溶解LumiSal iS SE 制備樣品溶液，并將其稀釋到濃度范圍〇-〇. 35 %的6個不同的濃度，每種樣品溶液一式三 份。對于樣品的背景分析，將75μ1的樣品溶液移入一個清晰的平底96孔板中。空白標準試劑 純級乙醇(75μ1)同樣需要加入板中。每個空白孔和樣品孔均加入150μ1試劑純級乙醇。對于 樣品分析，將75μ1的樣品溶液移入一個清晰的平底96孔板中。空白標準試劑純級乙醇（75μ 1)同樣需要加入板中。每個空白孔和樣品孔均加入150μ1 DPPH溶液。對照孔和樣品孔均以 一式三份添加，結果采用平均吸光度值計算。搖振平板并在酶標儀內25°C下溫育5分鐘。在 517nm波長下測量吸光度值。
[0054]計算:針對樣品濃度(X軸)和其各自對應的517nm相對平均吸光度值(實測平均吸 光度減去背景平均吸光度）(y軸)作圖并計算最佳擬合線（多項式擬合）。基于多項式回歸直 線方程計算每個對照和樣品的IC50(50%受到抑制）。
[0055]結果：
[0056] DPPH法測定的水溶性維生素 E的抗氧化活性如圖6所示。DPPH測試中計算的水溶性 維生素 E的IC50為0.0010%。三批LumiSalis SE的DPPH法測試結果如圖7所示。這三批的回 歸方程和IC50見于表1。這些結果表明，在DPPH中LumiSalis SE具有抗氧化活性，其IC50為 0.14±0.02%。
[0057]表1 .DPPH法中LumiSalis SE的IC50的計算
[0059]討論：
[0060] DPPH分析的結果表明，LumiSalis(CLSC)是一種有效的抗氧化劑，當其加入個人護 理產品中并施加到使用者的皮膚上時，預期其能夠帶來抗氧化劑施加到皮膚上時通常可見 的益處，如幫助防止曬傷和皮膚癌，以及逆轉某些與皮膚老化有關的變色和皺紋。預期 LumiSalis能夠加速皮膚的自然修復系統，抑制進一步的損害發生。
[0061]前面的描述和附圖包括了本發明的說明性實施例。前述實施例和本發明描述的方 法可以基于本領域技術人員的能力、經驗和偏好做出改變。僅僅按一定的順序列出所述方 法的步驟，并不對所述方法步驟的順序構成任何限制。前面的描述和附圖僅僅用于解釋和 闡述本發明，并且本發明不限于此，除非權利要求有如此限制。本領域技術人員在本發明公 開之前對其作出的修改和變化并不脫離本發明的范圍。
【主權項】
1. 一種減少受試者皮膚損傷的方法，包括向受試者的皮膚施用包含有效量酸漿 (Physalis alkekengi)提取物的組合物。2. -種降低受試者炎癥標志物水平的方法，包括向受試者的皮膚施用包含有效量酸漿 提取物的組合物。3. 如權利要求2所述的方法，其中所述炎癥標志物選自：IL-6、IL-8、IL-la和TNFa。4. 一種治療受試者皮膚損傷的方法，包括向受試者的皮膚施用包含有效量酸漿提取物 的組合物。
【文檔編號】A61K36/81GK105979955SQ201480067899
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年12月12日
【發明人】韋書婷, M·溫特斯, S·納亞克
【申請人】凱敏工業公司