一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料及其制備方法，所述的脫細胞基質材料為自體脂肪干細胞膜片。本發明中利用維生素C促進脂肪干細胞膜片形成，然后利用反復凍融法聯合Triton×100脫細胞處理，構建一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料。該材料表面平整，質地均一，細胞外基質含量豐富，形成孔隙樣三維組織，具備較好抗牽拉特性，不易破裂，無免疫原性，能自體移植，具有臨床應用的可操作性。且其制備方法簡單，十分具有實用價值。
【專利說明】
一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料及其制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及組織工程與再生醫學領域，尤其涉及一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料及其制備方法。
【背景技術】
[0002]腫瘤手術、外傷或先天缺陷均可造成嚴重軟組織缺損，臨床常用修復方法包括人工材料填充和自體組織瓣移植，但這些方法存在組織相容性差、創傷大、移植物壞死吸收等局限性。隨著組織工程技術的發展，組織工程有望成為一種新型且有效的修復方法。
[0003]細胞支架是組織工程的主要研究內容之一，起到支撐種子細胞和引導組織再生的作用。理想的支架材料應具有無免疫原性、可塑性強以及良好的生物相容性，迄今仍未找到一種理想細胞支架材料用于組織工程。人工高分子材料雖具有足夠的機械強度和適當的降解速度，但免疫原性強，缺乏天然的細胞外基質，細胞識別位點不足，細胞親和力較弱，且具有一定生物毒性。脫細胞基質材料可以克服上述缺陷，脫細胞技術是指通過化學和物理的方法去除異體或異種組織器官中的細胞成分，細胞外基質在經過去除細胞和可溶性蛋白處理后，可以維持正常組織基質成分，形成一種由膠原蛋白、纖維連接蛋白和彈力蛋白組成的三維支架結構。另外，脫細胞支架保留了完整的血管網絡結構，易于營養物質及氧氣的運輸，三維的細胞外基質結構為細胞的貼附和增殖提供了一個合適的生物環境。目前的脫細胞基質材料來源主要為異種動物筋膜組織和器官，已有商品化生產脫細胞基質產品，如豬小腸黏膜脫細胞基質材料(SIS) AIS是一種美國Π)Α批準的可生物降解的、無細胞的、異于膠原組織基質的移植物，取材于豬小腸黏膜脫細胞組織，已經用于疝、尿道狹窄等疾病臨床治療。然而，研究表明，異種來源脫細胞外基質成分移植后不僅在局部產生炎癥反應，且仍具有一定的免疫原性，當異種脫細胞基質異體的膠原基質與宿主血液的接觸可直接激活一系列免疫級聯反應，產生免疫排斥，影響手術效果，甚至可引起患者死亡。
[0004]細胞膜片技術是上世紀90年代發展起來的一種組織工程新技術，該技術無須支架材料和酶消化，通過刺激細胞外基質分泌，能完整的保留細胞外基質和細胞間連接，形成由一種由細胞和細胞外基質組成的致密膜片狀組織。細胞膜片厚度與機械強度除了與培養基條件有關，還與細胞類型密切相關。當細胞活性和增殖能力越強，細胞膜片形成的速度和厚度明顯提高。與成體細胞相比，干細胞活性和增殖能力明顯更強。脂肪干細胞是一類具有自我更新、多向分化潛能的間充質干細胞，具有增殖能力強、來源廣泛、取材方便、培養簡單的特點，是一種常用組織工程種子細胞。目前常用的脫細胞方法包括滲透溶液法、去污劑法、酶消化法、細胞凍融法等，沒有一種方法適用于所有脫細胞材料類型。理想的脫細胞方法要求既能完全去除供體細胞，降低免疫原性，又能保留天然膠原纖維、彈力纖維等細胞外基質成分，以保持足夠的機械強度。針對細胞膜片的構成特點，對細胞膜片脫細胞處理應謹慎選擇，應避免細胞外基質成分破壞和降解。因此，區別于目前脫細胞基質材料來源，通過構建自體脂肪干細胞膜片，優化脫細胞方法，制備一種無免疫原性的脫細胞基質材料可用于機體軟組織缺損修復和作為組織工程支架材料。
【發明內容】
[0005]為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料及其制備方法。
[0006]本發明第一方面提供了一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料，所述的脫細胞基質材料為自體脂肪干細胞膜片。
[0007]本發明第二方面提供了一種上述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]步驟一:將脂肪干細胞高密度的接種于細胞培養皿中；
[0009]步驟二:在所述的細胞培養皿中加入梯度濃度維生素進行刺激，得到細胞膜片；
[0010]步驟三:將所述的細胞膜片反復凍融，并在脫細胞液中振蕩后漂洗，得到漂洗后的脫細胞基質材料；
[0011]步驟四:將所述的漂洗后的脫細胞基質材料凍干處理，封裝后滅菌，得到所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料。
[0012]較佳地，所述的高密度為5 X 14個/cm2。
[0013]較佳地，所述的步驟二中加入梯度濃度維生素進行刺激為以lOOyg/ml維生素C強刺激3天，更換50yg/ml維生素C溫和刺激18天。
[0014]較佳地，所述的步驟三中反復凍融為在液氨和溫水中反復凍融。
[0015]較佳地，所述的脫細胞液為Triton X-100脫細胞液。
[0016]較佳地，所述的步驟三中，采用PBS緩沖液進行漂洗。
[0017]本發明中利用維生素C促進脂肪干細胞膜片形成，然后利用反復凍融法聯合TritonX 100脫細胞處理，構建一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料。該材料表面平整，質地均一，細胞外基質含量豐富，形成孔隙樣三維組織，具備較好抗牽拉特性，不易破裂，無免疫原性，能自體移植，具有臨床應用的可操作性。且制備方法簡單，十分具有實用價值。
【附圖說明】
[0018]圖1A與圖1B為脂肪干細胞及其表型鑒定圖；
[0019]圖2A和圖2B為脂肪干細胞膜片和脫細胞基質材料HE染色比較圖；
[0020]圖3A和圖3B為脂肪干細胞膜片和脫細胞基質材料掃描電鏡比較圖；
[0021 ]圖4A和圖4B為脂肪干細胞膜片和脫細胞基質材料I型膠原表達情況圖；
[0022]圖5A和圖5B為脂肪干細胞膜片和脫細胞基質材料纖連蛋白表達情況圖；
[0023]圖6A和圖6B為脫細胞基質材料與SIS分別移植皮下HE染色比較圖。
【具體實施方式】
[0024]下面參照附圖，結合具體的實施例對本發明作進一步地說明，以更好地理解本發明。
[0025]1、脂肪干細胞原代培養
[0026]比格犬，6-8個月，戊巴比妥全身麻醉后無菌切取腹股溝處1g脂肪組織，剔除肉眼可見筋膜及血管，0.25 %氯霉素浸泡30分鐘，I3BS漂洗3遍，眼科剪盡量剪碎成肉沫狀，加入
0.1 % I型膠原酶在37 0C中消化Ih，100目濾網過濾，300g離心5min，加入干細胞培養基重懸后接種于10mm細胞培養皿中繼續培養，每2-3天更換培養基。
[0027]脂肪干細胞培養基組成:450ml低糖DMEM培養基+50ml胎牛血清+100U/ml青霉素+100mg/ml硫酸鏈霉素，0.22μηι濾網過濾除菌。
[0028]如圖1A所示，通過酶消化法和梯度貼壁原代培養脂肪干細胞，細胞呈現螺旋形梭形分布(Χ100)。
[0029]2.脂肪干細胞純度鑒定
[0030]將原代培養脂肪干細胞傳代至Ρ2，流式細胞儀鑒定其干細胞純度，選取CD45、⑶90、⑶105作為表面抗原標志，0.25%胰蛋白酶+0.01 %EDTA消化后4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS清洗2遍，300g離心5min后加入250μ1 PBS重懸，分別加入2μ1 CD45-FITC抗犬抗體、Iμ? CD90-PE抗犬抗體、2μ1 CD105-FITC抗犬抗體，在4°C條件下避光孵育30分鐘，PBS清洗2遍，上機檢測。
[0031]如圖1B所示，流式細胞儀鑒定干細胞純度，其中⑶45陰性表達，CD90和⑶105陽性表達，證實其干細胞屬性。
[0032]3.脂肪干細胞膜片制備
[0033]將P2代脂肪干細胞以5 X 104個/cm2接種于60mm細胞培養皿，待細胞融合至90%以上時，更換細胞培養基A繼續培養，3天后更換細胞培養基B連續培養18天，每2天更換細胞培養液，培養3周即可成制備脂肪干細胞膜片，可直接用鑷子輕輕撕下，大小約5X5cm。
[0034]細胞培養基A成分:450mL低糖DMEM培養基+50mL胎牛血清+100U/mL青霉素+10mg/mL硫酸鏈霉素+100yg/mL維生素C+3.7g/L NaHCO3
[0035]細胞培養基B成分:450mL低糖DMEM培養基+50mL胎牛血清+100U/mL青霉素+10mg/mL硫酸鏈霉素+50yg/mL維生素C+3.7g/L NaHCO3
[0036]4 J兌細胞
[0037]I)前期處理:連續培養3周至脂肪干細胞膜片形成，大小約5 X 5cm，PBS漂洗3次，每次3分鐘，備用。
[0038]2)反復凍融處理:制備的細胞膜片首先在_196°C液氮和37°C溫水中反復凍融3次，每次液氮凍存時間為30min，37°C溫水中lOmin。
[0039]3)TritonX100脫細胞處理:置于l%Triton X-100脫細胞液中，常溫下搖床振蕩24h，振蕩頻率為 150-200r/min，具體脫細胞液配置:1mM Tris-HCl，1mM EDTA ,1% Tri tonX-100溶解于去離子水中，PH值為7.8。上述處理后，繼續置于50ml PBS緩沖液中，搖床振蕩漂洗24h，漂洗頻率為100-150r/min。
[0040]4)殺菌消毒及包裝:采用冷凍干燥機將上述脫細胞基質材料凍干處理并封裝，C060 γ射線輻照滅菌，即得成品。
[0041 ] 5.脂肪干細胞膜片與脫細胞基質材料體外檢測
[0042]I )ΗΕ染色:將脂肪干細胞膜片與脫細胞基質材料切片脫蠟入水后蘇木素染色5分鐘，沖洗后鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗返藍30分鐘，伊紅染色I分鐘后乙醇梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，正置顯微鏡下觀察。
[0043]培養3周后收獲膜片狀物，如圖2Α所示，脂肪干細胞膜片由6-8層細胞構成，厚度約90-110μπι，細胞之間緊密連接形成致密片狀整體。脂肪干細胞膜片進行脫細胞處理后，如圖2Β所示，脫細胞基質材料內部無明顯細胞核殘留，蛋白膠原纖維未攣縮和破壞，厚度約30-
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[0044]2)掃描電鏡觀察:連續體外培養3周至細胞膜片形成，按上述脫細胞方法脫細胞處理后，分別取Icm2細胞膜片及脫細胞基質材料樣品，生理鹽水清洗3遍，1.25%戊二醛4°C預固定2h，0.1M磷酸緩沖液清洗3次，每次15分鐘，I %餓酸4°C固定2h，酒精梯度脫水，臨界點干燥儀中干燥約2h，雙面膠將干燥樣品粘貼于樣品臺上，噴金3分鐘，掃描電鏡觀察。
[0045]如圖3A所示，細胞膜片表面平坦，纖維蛋白和膠原大量分布，并連接各細胞形成致密整體。如圖3B所示，脫細胞基質材料內無細胞殘留，呈現網格狀多孔隙結構。
[0046]3)免疫組織化學分析:4%多聚甲醛將脂肪干細胞膜片和脫細胞基質材料固定12h，石蠟包埋，切片，55°C烘箱中過夜，脫蠟入水，檸檬酸鈉(PH 6.0)溶液水浴煮沸30min抗原修復，5%BSA封閉常溫30min，一抗(I型膠原1:800稀釋，纖連蛋白I: 200稀釋)4°C孵育過夜，PBS清洗5遍，HRP-二抗37°C孵育30min，DAB( 1:50)顯色15分鐘，終止后蘇木紫復染，酒精梯度脫水后中性樹膠封片。
[0047]免疫組化染色棕黃色為標記蛋白陽性表達，如圖4A所示，脂肪干細胞膜片中I型膠原廣泛分布，條索狀無序排列；圖4B中示脫細胞基質材料中I型膠原含量豐富；圖5A示脂肪干細胞膜片中纖連蛋白廣泛分布；圖5B示脫細胞基質材料中纖連蛋白布滿整個視野，膠原纖維結構完整。以上結果表明無論是脂肪干細胞膜片還是脫細胞基質材料中均包含豐富的細胞外基質成分-1型膠原和纖連蛋白，且脫細胞處理后未明顯流失。
[0048]6.脫細胞基質材料與SIS皮下移植:
[0049]常規麻醉后，消毒鋪巾，在比格犬腹股溝處切開2cm長度切口，分離皮下結締組織，使其存在一個皮下間隙，將脫細胞基質材料2 X 2cm自體回植入皮下間隙處，同時將2 X 2cm大小SIS植入另一條比格犬皮下同等部位。移植I周后，將包圍周圍結締組織的皮下移植物取出，HE染色評價中性粒細胞和淋巴細胞浸潤情況。
[0050]圖6A示SIS移植后結構完整，區域內部大量中性粒細胞或淋巴細胞浸潤。圖6B示脫細胞基質材料移植后僅見極少量中性粒細胞或淋巴細胞浸潤現象。
[0051]本發明提供的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料及其制備方法，完整保留細胞外基質成分，無免疫原性，能自體移植，可用于機體軟組織缺損修復和作為組織工程支架材料。維生素C在細胞外基質形成過程中起著關鍵作用，可顯著促進細胞膠原合成，形成細胞-基質連接以及細胞間連接三維立體結構，在既往報道的細胞膜片構建中廣泛使用。通過優化維生素C使用劑量，構建足夠厚度和機械強度的細胞膜片。針對細胞膜片特性，選擇最佳脫細胞方案。非離子去垢劑(TritonX 100)通過溶解脂質以增加細胞膜的通透性，進而破壞細胞膜，使細胞溶解，使細胞成分易溶，提高去除DNA效率，對膠原纖維和基質蛋白活性影響小，可以避免對細胞外基質中的蛋白成分造成嚴重損害。同時，采用反復物理凍融方法脫細胞對細胞外基質無損傷，能完整保留膠原和纖維結構，有利于非離子去垢劑滲入進行充分作用。最后，將這種脫細胞基質材料與商品化生產的SIS分別移植入皮下，HE染色觀察對比兩者中性粒細胞和淋巴細胞浸潤情況。
[0052]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1.一種基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料，其特征在于，所述的脫細胞基質材料為自體脂肪干細胞膜片。2.—種根據權利要求1所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:將脂肪干細胞高密度的接種于細胞培養皿中； 步驟二:在所述的細胞培養皿中加入梯度濃度維生素進行刺激，得到細胞膜片； 步驟三:將所述的細胞膜片反復凍融，并在脫細胞液中振蕩后漂洗，得到漂洗后的脫細胞基質材料； 步驟四:將所述的漂洗后的脫細胞基質材料凍干處理，封裝后滅菌，得到所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料。3.根據權利要求2所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料的制備方法，其特征在于，所述的高密度為5X 14個/cm2。4.根據權利要求2所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料的制備方法，其特征在于，所述的步驟二中加入梯度濃度維生素進行刺激為以lOOyg/ml維生素C強刺激3天，更換50yg/ml維生素C溫和刺激18天。5.根據權利要求2所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料的制備方法，其特征在于，所述的步驟三中反復凍融為在液氨和溫水中反復凍融。6.根據權利要求2所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料的制備方法，其特征在于，所述的脫細胞液為Triton X-100脫細胞液。7.根據權利要求2所述的基于脂肪干細胞膜片的脫細胞基質材料的制備方法，其特征在于，所述的步驟三中，采用PBS緩沖液進行漂洗。
【文檔編號】A61L27/36GK105963785SQ201610458110
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】傅強, 周術奎
【申請人】上海市第六人民醫院