一種葉酸標記銅納米簇的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種葉酸標記銅納米簇的制備方法，它包括銅納米簇原液的制備、葉酸的活化、葉酸標記銅納米簇的制備等步驟。本發明制備的銅納米簇具有顯著的抑制MCF?7腫瘤細胞的增殖作用，并且能促進MCF?7細胞凋亡，證明其具有一定的抗乳腺癌腫瘤細胞的活性，動物實驗結果表明，本發明能抑制MCF?7細胞裸鼠成瘤，進一步證明了其抗腫瘤細胞活性。由于本發明的銅納米簇采用了葉酸進行標記，因此還具有明顯的靶向性，可用于乳腺癌的臨床靶向治療。
【專利說明】
一種葉酸標記銅納米簇的制備方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于藥物合成領域，具體涉及一種葉酸標記銅納米簇的制備方法。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌長期以來嚴重影響人類公共健康。目前，乳腺癌的治療方法有很多種，主要 包括內分泌治療、放化療、手術切除治療以及靶向治療。內分泌治療相對經濟，療效好，能被 大眾接受，但容易復發。放化療通常針對性較差，病人生活質量嚴重下降，非首選治療方案。 手術切除可以根治乳腺癌，療效非常好，安全性高，但影響美觀，難以接受。靶向治療和放化 療相比，提高了安全性和針對性，是目前較好的治療方案。
[0003] 葉酸受體是一種跨膜單鏈糖蛋白，在大部分人體腫瘤細胞表面過度表達，包括乳 腺癌，但其在正常細胞中表達水平很低甚至不表達。因此葉酸受體介導的抗腫瘤藥物分子 設計是目前腫瘤靶向治療的熱點。本發明設計合成了一種葉酸標記的銅納米簇，能在體外 體內抑制乳腺癌細胞的增殖，迀移，誘導乳腺癌細胞凋亡。為臨床靶向治療乳腺癌提供了新 的思路。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種葉酸標記銅納米簇的制備方法，采用該方法制備的銅納 米簇可抑制乳腺癌腫瘤細胞，可用于制備抗乳腺癌藥物。
[0005] 本發明提供的制備方法包括以下步驟：
[0006] 1)銅納米簇原液的制備:將BSA溶解在水中配成濃度為15~20mg/ml的澄清透明溶 液，按照BSAXu2+重量比為（10~40):(1~10)的比例加入銅離子，混合均勻，邊攪拌邊調節 pH至堿性，在37~60°C下攪拌反應6~8h，然后再調節溶液pH至酸性，生成銅納米簇沉淀，將 銅納米簇沉淀離心、分離、清洗后重新溶解在Tris-HCl緩沖液中并調節pH至堿性，即獲得銅 納米簇原液；
[0007] 2)葉酸的活化:將葉酸溶解在DMSO中配成濃度為0.2~0.5mg/ml的葉酸溶液，然后 按體積分別加入〇 . 5~2%的10~5〇11^/111]^/^0(]水溶液和10~5〇11^/1111的順5水溶液，在黑 暗、40~60°C條件下陳化10~15h，得活化的葉酸溶液；
[0008] 3)葉酸標記銅納米簇的制備：將活化的葉酸溶液與5~20倍體積的TriS-HCl緩沖 液混合，然后再與步驟1)得到的銅納米簇原液混合，所述銅納米簇原液的體積為活化的葉 酸溶液體積的15~30倍，在黑暗，40~60 °C下反應10~15h，然后調節pH至3~6，生成葉酸標 記的銅納米簇沉淀，將沉淀離心、分離、清洗后重新分散在Tris-HCl緩沖液中形成澄清透明 的溶液，調節溶液的PH值至9~12,即獲得葉酸標記銅納米簇。
[0009] 優選地，步驟1)中，所述的BSA: Cu2+重量比為25:5。
[0010] 優選地，步驟2)中，將葉酸溶解在DMSO中配成濃度為0.4mg/ml的葉酸溶液，然后按 體積分別加入1 %的30mg/ml的EDC水溶液和20mg/ml的NHS水溶液。
[0011]優選地，步驟3)中，所述銅納米簇原液的體積為活化的葉酸溶液體積的20倍。
[0012]本發明的有益效果是:本發明制備的銅納米簇具有顯著的抑制MCF-7腫瘤細胞的 增殖作用，并且能促進MCF-7細胞凋亡，證明其具有一定的抗乳腺癌腫瘤細胞的活性，動物 實驗結果表明，本發明能抑制MCF-7細胞裸鼠成瘤，進一步證明了其抗腫瘤細胞活性。由于 本發明的銅納米簇采用了葉酸進行標記，因此還具有明顯的靶向性，可用于乳腺癌的臨床 靶向治療。
[0013] 本發明提供的制備方法反應充分，產物收率和純度高，雜質少，周期短。
【具體實施方式】
[0014] 以下通過實施例對本發明進行詳細地說明。
[0015] 實施例1
[0016] 1)銅納米簇原液的制備:將BSA (牛血清白蛋白）溶解在水中配成濃度為16mg/ml的 澄清透明溶液，按照BSAXu2+重量比為25:5的比例加入銅離子，混合均勻，邊攪拌邊加氫氧 化鈉調節PH值至11，在50°C下攪拌反應8h，然后再用冰醋酸調節溶液pH至4，生成銅納米簇 沉淀，將銅納米簇沉淀離心、分離、去離子水清洗3次后重新溶解在Tris-HCl緩沖液中并用 氫氧化鈉調節溶液的PH值至11，即獲得銅納米簇原液；
[0017] 2)葉酸的活化:將葉酸溶解在DMSO (二甲基亞砜）中配成濃度為0.4mg/ml的葉酸溶 液，然后按體積分別加入1 %的30mg/ml的EDC (碳二亞胺)水溶液和20mg/ml的NHS (N-羥基硫 代琥珀酰亞胺)水溶液，在黑暗、50°C條件下陳化12h，得活化的葉酸溶液；
[0018] 3)葉酸標記銅納米簇的制備:將活化的葉酸溶液與10倍體積的TriS-HCl緩沖液混 合，然后再與步驟1)得到的銅納米簇原液混合，所述銅納米簇原液的體積為活化的葉酸溶 液體積的20倍，在黑暗，50°C下反應12h，然后再用冰醋酸調節pH至4,生成葉酸標記的銅納 米簇沉淀，將沉淀離心、分離、去離子水清洗3次后重新分散在Tri s-HCl緩沖液中形成澄清 透明的溶液，用氫氧化鈉調節溶液的PH值至11，即獲得葉酸標記銅納米簇。
[0019] 實施例2P十酸標記銅納米簇體外抑制MCF-7細胞增殖試驗
[0020] 取生長良好的對數生長期MCF-7細胞，胰蛋白酶消化后接種到96孔板，置細胞培養 箱37度，5 %二氧化碳條件培養24小時。設計5個藥物濃度，每個濃度4個復孔，以空白培養基 為對照。給藥后48小時按照MTT實驗標準步驟，酶標儀測定OD值，計算細胞生長抑制率。結果 如表1所示。
[0021 ]表1葉酸標記銅納米簇對MCF-7細胞增殖的抑制作用
[0023]以上實驗結果表明：本發明制備的銅納米簇對MCF-7細胞的增殖具有顯著抑制作 用，抑制率隨濃度增加而增加，當濃度達到20μg/ml時，抑制率顯著增加。
[0024]實施例3葉酸標記銅納米簇促進MCF-7細胞凋亡試驗
[0025] 培養MCF-7細胞，分別以lμg/ml、5μg/ml、10μg/ml葉酸標記銅納米簇處理細胞24小 時，采用Annexin V-FITC/PI染色的方法，經流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。凋亡率見表2。
[0026] 表2葉酸標記銅納米簇誘導MCF-7細胞凋亡
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[0029]實施例4體內裸鼠成瘤實驗
[0030]造模:取對數生長期的MCF-7細胞，用PBS調整細胞濃度為IO8Ail。在無菌條件下將 0.2ml細胞接種于Balb/c裸鼠右腋下皮下。接種后觀察腫瘤生長狀況，腫瘤體積長到IOOmm3 左右進行分組，每組6只，包括模型對照組，低（lμg/ml)中（5μg/ml)高（lOμg/ml)計量組。實 驗組每周兩次瘤內注射給藥，三周后剝離腫瘤組織，考察相關參數。
[0031 ]表3葉酸標記銅納米簇對MCF-7細胞裸鼠成瘤的抑制
[0033]實驗結果表明：本發明制備的銅納米簇給藥組腫瘤重量明顯低于對照組。
【主權項】
1. 一種葉酸標記銅納米簇的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 銅納米簇原液的制備:將BSA溶解在水中配成濃度為15~20mg/ml的澄清透明溶液， 按照BSA:Cu2+重量比為（10~40):(1~10)的比例加入銅離子，混合均勻，邊攪拌邊調節pH至 堿性，在37~60°C下攪拌反應6~8h，然后再調節溶液pH至酸性，生成銅納米簇沉淀，將銅納 米簇沉淀離心、分離、清洗后重新溶解在Tris-HCl緩沖液中并調節pH至堿性，即獲得銅納米 簇原液； 2) 葉酸的活化:將葉酸溶解在DMSO中配成濃度為0.2~0.5mg/ml的葉酸溶液，然后按體 積分別加入0.5~2%的10~50mg/ml的EDC水溶液和10~50mg/ml的NHS水溶液，在黑暗、40 ~60 °C條件下陳化10~15h，得活化的葉酸溶液； 3) 葉酸標記銅納米簇的制備:將活化的葉酸溶液與5~20倍體積的Tris-HCl緩沖液混 合，然后再與步驟1)得到的銅納米簇原液混合，所述銅納米簇原液的體積為活化的葉酸溶 液體積的15~30倍，在黑暗，40~60 °C下反應10~15h，然后調節pH至3~6,生成葉酸標記的 銅納米簇沉淀，將沉淀離心、分離、清洗后重新分散在Tris-HCl緩沖液中形成澄清透明的溶 液，調節溶液的pH值至9~12,即獲得葉酸標記銅納米簇。2. 如權利要求1所述的葉酸標記銅納米簇的制備方法，其特征在于：步驟1)中，所述的 85八:(：112+重量比為25:5。3. 如權利要求1所述的葉酸標記銅納米簇的制備方法，其特征在于：步驟2)中，將葉酸 溶解在DMSO中配成濃度為0.4mg/ml的葉酸溶液，然后按體積分別加入1 %的30mg/ml的EDC 水溶液和20mg/ml的NHS水溶液。4. 如權利要求1所述的葉酸標記銅納米簇的制備方法，其特征在于：步驟3)中，所述銅 納米簇原液的體積為活化的葉酸溶液體積的20倍。
【文檔編號】A61P35/00GK105963709SQ201610401909
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】陳勇, 梁繼超, 駱愛玲
【申請人】湖北大學