一種高分子ca4鍵合藥及其制備方法

一種高分子ca4鍵合藥及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種高分子CA4鍵合藥及其制備方法，本發明提供的高分子CA4鍵合藥具有式(I)所示結構，本發明提供的鍵合藥通過將CA4接枝到特定的聚合物載體上，使得得到的鍵合藥可以富集在腫瘤血管處并緩慢釋放藥物，從而在腫瘤部位長期發揮破壞腫瘤血管的功效，實現出色的腫瘤抑制效果。有效的解決了CA4P作用時間短而療效欠佳的問題，在腫瘤治療領域具有廣闊的發展前景。而且，本發明提供的制備方法簡單，原料來源廣泛，可以實現批量生產，可以實現產業化。
【專利說明】
一種高分子CA4鍵合藥及其制備方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及醫藥合成領域，尤其涉及一種高分子CA4鍵合藥及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 康普瑞汀（考布他汀，（Z)-3，4，5，4 '，-四甲氧基-3 羥基二苯乙烯， Combretastatin A4，CA4)是最近開發的一種新型的抗腫瘤活性化合物，其結構式如下：
[0003]
[0004] 不同于傳統的細胞毒素類抗癌藥物，CA4并不直接殺死腫瘤細胞。CA4采用的是一 種新的抗癌機制:通過與腫瘤血管內皮細胞的微管蛋白相結合，破壞腫瘤內部的血管，切斷 對腫瘤的血液和養分供應，引發腫瘤內部嚴重的壞死。由于腫瘤血管和正常組織血管的結 構性差異，CA4選擇性破壞腫瘤血管，而對正常組織的血液供給基本沒有影響。因此，這類藥 物被抗癌領域寄予厚望。
[0005] 由于CA4的水溶性差，難以通過靜脈直接給藥，1995年，Pettit等設計合成了CA4的 磷酸酯化二鈉鹽前體藥物康普瑞汀磷酸二鈉(CA4P)，其結構如下：
[0006]
[0007] CA4P極大地改善了CA4水溶性和藥代動力學性質，利用磷酸酯酶在增殖的血管內 皮細胞中的濃度高于正常細胞的特點，使CA4P在腫瘤血管中被選擇性激活，靶向釋放出CA4 并發揮抗血管、抗腫瘤作用。在一系列的小鼠腫瘤模型中，CA4P全身給藥能快速和選擇性地 阻斷腫瘤血管，與傳統化療、放療和熱療等聯合運用時往往能取得更好的療效。目前，CA4P 的專利所有人美國OXiGENE公司已完成CA4P的二期臨床試驗，在抗甲狀腺癌上已經進入三 期臨床。但是，CA4P在臨床使用中仍然存在快速的血液清除速率、作用時間短、停藥后反復 等。研究發現，CA4的微管抑制作用是可逆的，其引起的血管內皮細胞改變在藥物移除后能 夠迅速恢復，并且小分子CA4P及CA4在組織內的停留時間較短。腫瘤不同于正常組織，由于 其過度的生長和促血管生長因子的大量表達，使得腫瘤表面血管生成速度很快，因此長期 有效的腫瘤血管抑制是必需的，否則腫瘤仍然可以快速生長。而CA4P快速的體內清除和不 充分的腫瘤部位駐留都嚴重影響了其發揮長期的腫瘤血管抑制的效果；因此得到能夠在腫 瘤部位作用時間長的CA4類血管阻斷劑抗腫瘤藥物是目前需要解決的問題。

【發明內容】

[0008] 有鑒于此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種高分子CA4鍵合藥及其制備 方法，本發明提供的高分子CA4鍵合藥可以長時間的在腫瘤部位駐留和蓄積。
[0009] 本發明提供了一種高分子CA4鍵合藥，具有式(I)所示結構，
[0010]
[0011] 其中，
[0012] R1選自C2-C10的直鏈烷基、C3-C10的支鏈烷基或C6~C20的芳基；
[0013] R2選自氫原子或者陽離子；
[0014] R3選自未取代的C1-C20的烷基或取代的C1-C20的烷基；
[0015] R4選自氫原子或者C1-C6的烷基酰基；
[0016] L1、L2、L3 獨立的選自-CH2-或-CH2CH2-;
[0017] x，y，z為聚合度，lCKx+y+z<5000，y>0，z>0;
[0018] η為聚合度，10彡η彡500。
[0019] 優選的，所述辦為0348的直鏈烷基、C5-C8的支鏈烷基或C8~C15的芳基。
[0020] 優選的，所述R2選自氫原子、金屬陽離子或有機陽離子。
[0021] 優選的，所述R2選自氫原子、鈉離子、鉀離子、銨離子或者帶正電荷的氨基酸離子。
[0022] 優選的，所述R3選自未取代的C2-C20的直連烷基、未取代的C3-C20的支連烷基、取 代的C2-C20的直鏈烷基或取代的C3-C20的支鏈烷基。
[0023] 優選的，所述取代的C2-C20的直鏈烷基中的取代基為羥基、醛基、氨基、巰基和糖 殘基中的一種或幾種；
[0024] 所述取代的C3-C20的支鏈烷基中的取代基為羥基、醛基、氨基、巰基和糖殘基中的 一種或幾種。
[0025]優選的，所述R4選自氫原子、乙酰基或丙酰基。
[0026] 優選的，所述x，y，ζ的取值范圍為3(Xx+y+z<300。
[0027] 本發明還提供了一種高分子CA4鍵合藥的制備方法，包括：
[0028] 將具有式（II)結構的共聚物與CA4在縮合劑的作用下反應得到式（I)結構的高分 子CA4鍵合藥，
[0029]
[0030]
[0031] 其中，
[0032] R1選自C2-C10的直鏈烷基、C3-C10的支鏈烷基或C6~C20的芳基；
[0033] R2選自氫原子或者陽離子；
[0034] R3選自未取代的C1-C20的烷基或取代的C1-C20的烷基；
[0035] R4選自氫原子或者C1-C6的烷基酰基；
[0036] L1、L2、L3 獨立的選自-CH2-或-CH2CH2-;
[0037] X，y，z為聚合度，lCKx+y+z<5000，y>0，z>0;
[0038] η為聚合度，10彡η彡500。
[0039] 優選的，所述縮合劑為2,4,6三氯苯甲酰氯，Ν，Ν_二異丙基碳二亞胺或二環己基碳 二亞胺。
[0040] 與現有技術相比，本發明提供的高分子CA4鍵合藥具有式（I)所示結構，本發明提 供的鍵合藥通過將CA4接枝到特定的聚合物載體上，使得得到的鍵合藥可以富集在腫瘤血 管處并緩慢釋放藥物，從而在腫瘤部位長期發揮破壞腫瘤血管的功效，實現出色的腫瘤抑 制效果。有效地解決了 CA4P作用時間短而療效欠佳的問題，在腫瘤治療領域具有廣闊的發 展前景。而且，本發明提供的制備方法簡單，原料來源廣泛，可以實現批量生產，可以實現產 業化。
【附圖說明】
[0041 ]圖1為實施例3制備得到的接枝聚乙二醇的聚L-谷氨酸的1HNMR;
[0042]圖2為實例10制備的聚谷氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥的1HNMR;
[0043]圖3為小分子CA4和實施例10制備的高分子CA4鍵合藥的HPLC圖；
[0044] 圖4為實施例10制備的高分子CA4鍵合藥以濃度0.2mg/mL在水中的動態光散射結 果；
[0045] 圖5為實施例10制備的鍵合藥在模擬體液中的釋放結果；
[0046]圖6為實施例23進行的高分子CA4鍵合藥和CA4P給藥后腫瘤組織中的CA4藥物濃 度；
[0047]圖7為實施例24測定的CA4P和高分子CA4鍵合藥單次給藥后的腫瘤病理分析；
[0048]圖8為實施例25測定的高分子CA4鍵合藥和CA4P對腫瘤的治療效果。
【具體實施方式】
[0049] 本發明提供了一種高分子CA4鍵合藥，具有式(I)所示結構，
[0050]
[0051] 其中，
[0052] R1選自C2-C10的直鏈烷基、C3-C10的支鏈烷基或C6~C20的芳基；
[0053] R2選自氫原子或者陽離子；
[0054] R3選自未取代的C1-C20的烷基或取代的C1-C20的烷基；
[0055] R4選自氫原子或者C1-C6的烷基酰基；
[0056] L1、L2、L3 獨立的選自-CH2-或-CH2CH2-;
[0057] x，y，z為聚合度，lCKx+y+z<5000，y>0，z>0;
[0058] η為聚合度，10彡η彡500。
[0059] 按照本發明，所述R1優選為C3-C8的直鏈烷基、C5-C8的支鏈烷基或C8~C15的芳 基，更優選為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、 正庚基、正辛基、苯基、萘基、聯苯基或蒽。
[0060] 所述R2優選為氫原子、金屬陽離子或有機陽離子，更優選為氫原子、鈉離子、鉀離 子、銨離子或者帶正電荷的氨基酸離子。
[0061 ]所述R3優選為未取代的C2-C20的直連烷基、未取代的C3-C20的支連烷基、取代的 C2-C20的直鏈烷基或取代的C3-C20的支鏈烷基，更優選為未取代的C4-C10的直連烷基、未 取代的C5-C10的支連烷基、取代的C4-C10的直鏈烷基或取代的C5-C10的支鏈烷基，其中，， 所述取代的C2-C20的直鏈烷基中的取代基為羥基、醛基、氨基、巰基和糖殘基中的一種或幾 種;所述取代的C3-C20的支鏈烷基中的取代基為羥基、醛基、氨基、巰基和糖殘基中的一種 或幾種。更具體的，所述R 3為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、 異戊基、正己基、正庚基、正辛基、羥甲基或羥乙基。
[0062]所述R4優選為氫原子、甲酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基。
[0063] 所述x，y，z，n為聚合度，x，y，z之間為無規形式；其中，y>0，z>0，x>0,優選的，x> 10;y>20;z>4;其中，所述X，y和z之和優選為3(Xx+y+z<300，更優選為5(Xx+y+z<250，最 優選為75<x+y+z<200，最優選為100<x+y+z< 150;所述η優選為20<n<400，更優選為30 <n<300,最優選 50<n<260,最優選為 80<n<180。
[0064] 本發明還提供了一種高分子CA4鍵合藥的制備方法，包括：
[0065] 將具有式（II)結構的共聚物與CA4在縮合劑的作用下反應得到式（I)結構的高分 子CA4鍵合藥。
[0066]
[0067]
[0068] 其中，
[0069] R1選自C2-C10的直鏈烷基、C3-C10的支鏈烷基或C6~C20的芳基；
[0070] R2選自氫原子或者陽離子；
[0071] R3選自未取代的C1-C20的烷基或取代的C1-C20的烷基；
[0072] R4選自氫原子或者C1-C6的烷基酰基；
[0073] L1、L2、L3 獨立的選自-CH2-或-CH2CH2-;
[0074] X，y，z為聚合度，lCKx+y+z<5000，y>0，z>0;
[0075] η為聚合度，10彡η彡500。
[0076] 按照本發明，本發明將具有式（II)結構的共聚物與CA4在縮合劑的作用下反應得 到式（I)結構的高分子CA4鍵合藥;其中，本發明對所述式（II)結構的共聚物的來源沒有特 殊限定，本領域技術人員根據本領域技術人員的公知常識制備得到;所述式（II)結構的共 聚物中，所述Ri優選為C3-C8的直鏈烷基、C5-C8的支鏈烷基或C8~C15的芳基，更優選為甲 基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛 基、苯基、萘基、聯苯基或蒽。所述R2優選為氫原子、金屬陽離子或有機陽離子，更優選為氫 原子、鈉離子、鉀離子、銨離子或者帶正電荷的氨基酸離子。所述R 3優選為未取代的C2-C20 的直連烷基、未取代的C3-C20的支連烷基、取代的C2-C20的直鏈烷基或取代的C3-C20的支 鏈烷基，更優選為未取代的C4-C10的直連烷基、未取代的C5-C10的支連烷基、取代的C4-C10 的直鏈烷基或取代的C5-C10的支鏈烷基，其中，，所述取代的C2-C20的直鏈烷基中的取代基 為羥基、醛基、氨基、巰基和糖殘基中的一種或幾種;所述取代的C3-C20的支鏈烷基中的取 代基為羥基、醛基、氨基、巰基和糖殘基中的一種或幾種。更具體的，所述R 3為甲基、乙基、正 丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、羥甲基或 羥乙基。所述R 4優選為氫原子、甲酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基。所述x，y，z，n為聚合度，X， 7,2之間為無規形式;其中，7>0,2>0，1彡0，優選的，1>10 ;7>20;2>4;其中，所述1，7和2之和 優選為30<x+y+z<300,更優選為50<x+y+z<250,最優選為75<x+y+z<200,最優選為 100彡x+y+z彡150;所述η優選為20彡η彡400，更優選為30彡η彡300，最優選50彡η彡260，最 優選為80<η<180。所述縮合劑優選為2,4,6三氯苯甲酰氯，Ν，Ν-二異丙基碳二亞胺或二環 己基碳二亞胺;所述反應的溶劑優選為Ν，Ν-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、氯仿和二氯甲烷中 的一種或幾種。所述反應的溫度優選為10~60°C，更優選為20~40°C;所述反應的時間優選 為2~60小時，更優選10~30小時。
[0077] 本發明提供的高分子CA4鍵合藥具有式(I)所示結構，本發明提供的鍵合藥通過將 CA4接枝到特定的聚合物載體上，使得得到的鍵合藥可以富集在腫瘤血管處并緩慢釋放藥 物，從而在腫瘤部位長期發揮破壞腫瘤血管的功效，實現出色的的腫瘤抑制效果。有效的解 決了 CA4P作用時間短而療效欠佳的問題，在腫瘤治療領域具有廣闊的發展前景。而且，本發 明提供的制備方法簡單，原料來源廣泛，可以實現批量生產，可以實現產業化。
[0078] 下面將結合本發明實施例的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范 圍。
[0079] 實施例1
[0080] 將42 · lg(160 · Ommol)的γ -苯甲基-L-谷氨酸酯-N-內羧酸酐單體(BLG-NCA)溶于 270mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌溶解后加入1 · OmL (1 · Ommo I/L DMF溶液）的正己胺 (n-HA)，密封，在溫度為25°C的條件下，攪拌反應72h。反應結束后，將得到的反應液沉降到 2.OL的乙醚中，依次經過濾和乙醚洗滌，在室溫下真空干燥24h，得到中間產物聚（γ-苯甲 基-L-谷氨酸酯）（PBLG)。
[0081] 將10.Og上述制備的聚（γ-苯甲基-L-谷氨酸酯）用IOOmL二氯乙酸溶解，在攪拌的 條件下，加入30mL質量含量為33 %的溴化氫/冰醋酸溶液，在溫度為30°C的條件下攪拌反應 lh。之后，將得到的反應液沉降到I.OL的乙醚中，離心，所得沉淀用DMF復溶，再用去離子水 透析，經凍干，得到聚(L-谷氨酸)均聚物(PLG)。
[0082] 對制備的聚(L-谷氨酸）均聚物進行核磁共振分析，用氘代水為氘代試劑，結果表 明，化學位移4.43ppm為主鏈上次甲基的信號峰，化學位移2.21ppm為側基上與羰基相連的 亞甲基的信號峰，化學位移1.91ppm和1.71ppm為側基上與主鏈相連的亞甲基的信號峰。根 據核磁計算，所得聚α-谷氨酸)的聚合度為135,綜合產率為81.2%。
[0083] 實施例2
[0084] 將42. lg(160.0mmol)的γ -苯甲基-L-谷氨酸酯-N-內駿酸酐單體(BLG-NCA)溶于 270mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌溶解后加入1 · OmL (1 · Ommo I/L DMF溶液）的正己胺 (11-私），密封，在溫度為25°(：的條件下，攪拌反應7211。之后，在上述反應體系中加入2.(^ (20.0 mmo 1)的乙酸酐，繼續反應6h。反應結束后，將得到的反應液沉降到2. OL的乙醚中，依 次經過濾和乙醚洗滌，在室溫下真空干燥24h，得到中間產物聚（γ-苯甲基-L-谷氨酸酯） (PBLG) 0
[0085]將10.Og上述制備的聚（γ-苯甲基-L-谷氨酸酯）用IOOmL二氯乙酸溶解，在攪拌的 條件下，加入30mL質量含量為33 %的溴化氫/冰醋酸溶液，在溫度為30°C的條件下攪拌反應 lh。之后，將得到的反應液沉降到I.OL的乙醚中，離心，所得沉淀用DMF復溶，再用去離子水 透析，經凍干，得到乙酰基封端的聚(L-谷氨酸)均聚物(PLG)。
[0086] 實施例3
[0087]向干燥的反應瓶中，加入實施例1制備的的聚(L-谷氨酸）（I.7g，13.2mmo 1谷氨酸 單元）、3.5g(79.5mmol乙二醇單元）的聚乙二醇單甲醚(5000Da)，再加入150mL的DMF溶解。 之后，加入17811^(1.4_〇1)的1'1，1'1-二異丙基碳二酰亞胺(01〇和19611^(1.6_〇1)的4-二甲 氨基吡啶(DMAP)，在溫度為25°C的條件下密封反應，48小時后，將得到的反應液用1.0 L的乙 醚沉降，所得固體用DMF復溶，再用去離子水透析3天，經凍干，得到具有式（II)結構的接枝 聚乙二醇的聚L-谷氨酸。
[0088]以氘代水為溶劑，對得到的接枝聚乙二醇的聚L-谷氨酸進行核磁共振分析，結果 見圖1，圖1為實施例3制備得到的接枝聚乙二醇的聚L-谷氨酸的1HNMR，從圖中可以看出，峰 位置包括：δ4 · 25ppm(t，-CH〈），3 · 63ppm( t，-CH2CH2O-)，3 · 3lppm(s，-OCH3)，2 · 18ppm(m，-CH2COOH)，I · 96and I · 83ppm(m，>CHCH2-)，I · 10-1 · 02ppm(m，-CH2CH2-)，0 · 78ppm( t，-CH2-CH3)。可見，所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料具有式(II)結構。
[0089] 實施例4
[0090]向干燥的反應瓶中，加入實施例2制備的的聚(L-谷氨酸）（I.7g，13.2mmo 1谷氨酸 單元）、3.5g(79.5mmol乙二醇單元）的聚乙二醇單甲醚(2000Da)，再加入150mL的DMF溶解。 之后，加入17811^(1.4_〇1)的1'1，1'1-二異丙基碳二酰亞胺(01〇和19611^(1.6_〇1)的4-二甲 氨基吡啶(DMAP)，在溫度為25°C的條件下密封反應，48小時后，將得到的反應液用1.0 L的乙 醚沉降，所得固體用DMF復溶，再用去離子水透析3天，經凍干，得到接枝聚乙二醇的聚L-谷 氨酸。
[0091] 實施例5
[0092] 將24.9g(100.0mmol)的γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內羧酸酐單體(BLA-NCA)溶 于270mL無水二氯甲燒，攪拌溶解后加入1.0mL(l .Ommol/LDMF溶液）的正己胺(η-ΗΑ)，密封， 在溫度為25°C的條件下，攪拌反應72h。反應結束后，將得到的反應液沉降到2.OL的乙醚中， 依次經過濾和乙醚洗滌，在室溫下真空干燥24h，得到中間產物聚（γ -苯甲基-L-天冬氨酸 酯)(PBLA)0
[0093]將10.Og上述制備的聚（γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯）用IOOmL二氯乙酸溶解，在攪拌 的條件下，加入30mL質量含量為33%的溴化氫/冰醋酸溶液，在溫度為30°C的條件下攪拌反 應lh。之后，將得到的反應液沉降到I.OL的乙醚中，離心，所得沉淀用DMF復溶，再用去離子 水透析，經凍干，得到聚(L-天冬氨酸)均聚物(PLA)。
[0094] 實施例6
[0095] 將24.9g(100.0mmol)的γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內羧酸酐單體(BLA-NCA)溶 于270mL無水二氯甲燒，攪拌溶解后加入1.0mL(l .Ommol/L DMF溶液）的正己胺(η-ΗΑ)，密 封，在溫度為25°C的條件下，攪拌反應72h。之后，在上述反應體系中加入2.Og的乙酸酐，繼 續反應6h。反應結束后，將得到的反應液沉降到2.OL的乙醚中，依次經過濾和乙醚洗滌，在 室溫下真空干燥24h，得到中間產物聚（γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯）（PBLA)。
[0096] 將10.Og上述制備的聚（γ_苯甲基-L-天冬氨酸酯）用IOOmL二氯乙酸溶解，在攪拌 的條件下，加入30mL質量含量為33%的溴化氫/冰醋酸溶液，在溫度為30°C的條件下攪拌反 應lh。之后，將得到的反應液沉降到I.OL的乙醚中，離心，所得沉淀用DMF復溶，再用去離子 水透析，經凍干，得到乙酰基封端的聚(L-天冬氨酸)均聚物(PLA)。
[0097] 實施例7
[0098]向干燥的反應瓶中，加入實施例5制備的1.5g(13.2mm〇l天冬氨酸單元)的聚(L-天 冬氨酸）、3.0g(68. Immol乙二醇單元)的聚乙二醇單甲醚（1000 ODa)，再加入150mL的二甲基 亞砜/二氯甲燒的混合溶劑溶解。之后，加入17811^(1.41]11]1〇1)的1'1，1'1-二異丙基碳二酰亞胺 (DIC)和196mg(1.6mm 〇l)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在溫度為25°C的條件下密封反應，48小 時后，將得到的反應液用I.OL的乙醚沉降，所得固體用DMF復溶，再用去離子水透析3天，經 凍干，得到接枝聚乙二醇的聚L-天冬氨酸。
[0099] 實施例8
[0100] 向干燥的反應瓶中，加入實施例6制備的1.5g(13.2mm〇l天冬氨酸單元)的聚(L-天 冬氨酸）、3.0g(68. Immol乙二醇單元）的聚乙二醇單甲醚（2000Da)，再加入150mL的DMF溶 解。之后，加入17811^(1.41111]1〇1)的1'1，1'1-二異丙基碳二酰亞胺(01〇和19611^(1.61111]1〇1)的4-二 甲氨基吡啶(DMAP)，在溫度為25°C的條件下密封反應，48小時后，將得到的反應液用1.0 L的 乙醚沉降，所得固體用DMF復溶，再用去離子水透析3天，經凍干，得到接枝聚乙二醇的聚L-天冬氨酸。
[0101] 實施例9-11
[0102] 聚谷氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥的制備
[0103] 分別向三個干燥的反應瓶內加入實施例3制備的聚谷氨酸接枝聚乙二醇(585mg)， 用20ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，之后加入干燥的三乙胺(0.153mL)和2,4,6_三氯苯 甲酰氯（0.172mL)，置于60°C的油浴中，攪拌lOmin。之后在氮氣氛圍下分別加入316mg、 253mg、190mg的CA4,以及135mg的4-二甲氨基吡啶，室溫下繼續反應12h。反應結束后，反應 液用乙醚沉降，過濾，收集固體并在室溫下真空干燥，DMF復溶固體，去離子水超濾，凍干，得 到聚谷氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥，稱量，計算產率。
[0104] 對得到的高分子CA4鍵合藥進行核磁共振分析，以氘代水作為氘代試劑，結果參見 圖2。圖2為實例10制備的聚谷氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥的核磁共振氫譜圖。通 過與圖1對比，可以發現明顯的CA4特征峰(6.29ppm，6.44ppm，6.60ppm)，表面CA4被成功地 鍵合到高分子上。
[0105] 利用紫外-可見光譜實施例9~實施例11得到的鍵合藥中的CA4的鍵合含量，CA4的 最大吸收峰在295nm，CA4的含量（％ )計算公式為:鍵合藥中的CA4質量/鍵合藥的總質量）X IOO %。結果參見表1，表1為本發明實施例9~11提供的鍵合藥的制備方法的收率以及得到 的鍵合藥中的CA4含量；
[0106]表1
[0108] 實施例12~14
[0109] 聚谷氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥的制備
[0110]分別向干燥的反應瓶內加入585mg的實施例4制備的聚谷氨酸接枝聚乙二醇， 316mg、252 · 8mg、190mg的CA4,用20ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，之后加入25mg的4-二 甲氨基吡啶和252.4mg N，N二異丙基碳二亞胺，室溫、氮氣氛圍下攪拌反應48h。乙醚沉 降，過濾，收集固體并在室溫下真空干燥，N，N-二甲基甲酰胺復溶、去離子水超濾，凍干，得 到聚谷氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥。CA4含量和產率參見表2。表2為本發明實施例 12~14提供的鍵合藥的制備方法的收率以及得到的鍵合藥中的CA4含量；
[0112] 實施例15~17
[0113] 聚天冬氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥的制備
[0114] 分別向干燥的反應瓶內加入552mg的實施例7制備的聚天冬氨酸接枝聚乙二醇， 316mg、252 · 8mg、190mg的CA4,用20ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，之后加入25mg的4-二 甲氨基吡啶和252.4mg二環己基碳二亞胺，室溫、氮氣氛圍下攪拌反應48h。過濾，乙醚沉降， 收集固體并在室溫下真空干燥，N，N-二甲基甲酰胺復溶、去離子水超濾，凍干，得到聚天冬 氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥。CA4含量和產率參見表3。表3為本發明實施例15~17 提供的鍵合藥的制備方法的收率以及得到的鍵合藥中的CA4含量；
[0115] 表3
[0117] 實施例18-20
[0118] 聚天冬氨酸接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥的制備
[0119] 分別向干燥的反應瓶內加入552mg的實施例8制備的聚天冬氨酸接枝聚乙二醇，用 20ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，之后加入0.191mL干燥的三乙胺和0.215mL 2,4,6_三 氯苯甲酰氯，置于60°C油浴中攪拌1〇111；[11，之后在氮氣氛圍下分別加入31611^、25311^、19011^ 的CA4，以及135mg的4-二甲氨基吡啶，室溫下繼續反應12h。反應結束后，反應液用乙醚沉 降，過濾，收集固體并在室溫下真空干燥，DMF復溶固體，去離子水超濾，凍干，得到聚谷氨酸 接枝聚乙二醇-CA4高分子鍵合藥，稱量，計算產率。CA4含量和產率參見表4。表4為本發明實 施例18~20提供的鍵合藥的制備方法的收率以及得到的鍵合藥中的CA4含量；
[0120] 表4 L0123J 實施例21
[0124] 高分子CA4鍵合藥的表征
[0125] 利用HPLC分析確定無未鍵合的CA4存在于產物之中。HPLC的流動相為乙腈/水=4/ 1，小分子CA4出峰時間在3.5分鐘。結果見圖3，圖3為小分子CA4和實施例10制備的高分子 CA4鍵合藥的HPLC圖，從圖中可以看出，實施例10制備的高分子CA4鍵合藥中無游離的CA4存 在。
[0126] 對所得到的高分子CA4鍵合藥進行動態光散射分析，測定在水中自組裝形成的膠 束的流體力學半徑。圖4為實施例10制備的高分子CA4鍵合藥以濃度0.2mg/mL在水中的動態 光散射結果，從圖中可以看出，自組裝膠束的流體力學半徑在20~60nm之間，粒徑分布均 勻。
[0127] 實施例22
[0128] 高分子CA4鍵合藥的體外模擬釋放
[0129] 準確稱取3mg實施例10制備的高分子CA4鍵合藥，溶于5mL的磷酸鹽緩沖液 (PH7.4)，裝于透析袋后置于45mL的磷酸鹽釋放液中，于37°C恒溫振蕩箱中振搖。在第2,4， 8，12，24，36，48，72小時時間點，取出3mL釋放液，紫外測定CA4含量。最后計算CA4在72小時 內的累積釋放量，結果見圖5,圖5為實施例10制備的鍵合藥在模擬體液中的釋放結果;從圖 5可以看出，CA4的高分子鍵合藥在模擬體液中緩慢釋放CA4,無暴釋突釋現象。
[0130] 實施例23
[0131 ] 高分子CA4鍵合藥與CA4P對比的腫瘤分布
[0132] 取Balb/C小鼠（5~6周，雌性，體重約為20g)24只，分別于右側腋下種植C26鼠源結 腸癌細胞2.0 X IO6/只。待腫瘤體積長至200mm3左右時，將小鼠均分為2組，分別尾靜脈注射 CA4P、實施例10制備的高分子CA4鍵合藥。給藥劑量為:4. Omg CA4/kg體重。1，4，24小時后， 處死小鼠，收集腫瘤，勻漿處理，HPLC測定其中的CA4濃度。所得2組樣品的腫瘤內藥物/kg重 量如圖6所示，圖6為實施例23進行的高分子CA4鍵合藥和CA4P給藥后腫瘤組織中的CA4藥物 濃度。從圖中可以看出，CA4高分子藥物與小分子CA4P的瘤內CA4藥物滯留和富集存在顯著 差別，CA4高分子藥物能夠維持腫瘤內在很長一段時間內的CA4藥物含量，從而能夠對腫瘤 的生長起到持續抑制作用。這一結果顯示了該CA4高分子藥物在腫瘤治療上的優越性。
[0133] 實施例24
[0134] 高分子CA4鍵合藥單次給藥的腫瘤治療效果
[0135] 取Balb/C小鼠（5~6周，雌性，體重約為20g)6只，分別于右側腋下種植C26鼠源結 腸癌細胞2.0 X IO6/只。待腫瘤體積長至200mm3左右時，將小鼠均分為2組，分別尾靜脈注射 CA4P、實施例10制備的高分子CA4鍵合藥。給藥劑量為:50mg CA4/kg體重。72小時后，處死小 鼠，收集腫瘤，進行病理H&E分析。結果如圖7所示，圖7為實施例24測定的CA4P和高分子CA4 鍵合藥單次給藥后的腫瘤病理分析;從圖中可以看出，在給藥治療72小時后，CA4P治療組的 腫瘤出現大面積復發，而CA4高分子藥物則能夠持續抑制腫瘤的生長。這充分證明了本發明 所設計的CA4高分子藥物在治療上的優勢。
[0136] 實施例25
[0137] 高分子CA4鍵合藥的抑瘤效果
[0138] 取Balb/C小鼠（5~6周，體重20g左右）18只，分別于右側腋下種植2.0 X 106C26細 胞，待腫瘤長至IOOmm3時，均分為3組(生理鹽水組，CA4P組，實施例10所制備的CA4高分子藥 物組），記為第0天，之后分別于第1，5,9天給藥3次。給藥劑量為:50.0mg CA4/kg體重。每周 量瘤三次，記錄小鼠體重，直至第17天結束觀察。腫瘤體積圖分別如圖8所示，圖8為實施例 25測定的高分子CA4鍵合藥和CA4P對腫瘤的治療效果，從結果可見，到結束觀察時，CA4高分 子藥物組取得了73.6%的出色腫瘤抑制率，而CA4P組的腫瘤抑制率為24.0%。這一結果表 明，本發明所提供的CA4高分子藥物安全有效，并且優于同劑量下CA4P的治療效果，在用于 實體腫瘤治療方面具備巨大潛力。
[0139] 以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對 于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行 若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種高分子CA4鍵合藥，具有式(I)所示結構，其中， 化選自C2-C10的直鏈烷基、C3-C10的支鏈烷基或C6~C20的芳基； 化選自氨原子或者陽離子； 化選自未取代的C1-C20的烷基或取代的C1-C20的烷基； R4選自氨原子或者C1-C6的烷基酷基； b、L2、L3獨立的選自-C出-或-C出C出-; x，y，z為聚合度，10《x+y+z《5000，y〉0，z〉0; η為聚合度，10《n《500。2. 根據權利要求1所述的鍵合藥，其特征在于，所述化為C3-C8的直鏈烷基、C5-C8的支鏈 烷基或C8~C15的芳基。3. 根據權利要求1所述的鍵合藥，其特征在于，所述R2選自氨原子、金屬陽離子或有機陽 離子。4. 根據權利要求1所述的鍵合藥，其特征在于，所述R2選自氨原子、鋼離子、鐘離子、錠離 子或者帶正電荷的氨基酸離子。5. 根據權利要求1所述的鍵合藥，其特征在于，所述R3選自未取代的C2-C20的直連烷基、 未取代的C3-C20的支連烷基、取代的C2-C20的直鏈烷基或取代的C3-C20的支鏈烷基。6. 根據權利要求5所述的鍵合藥，其特征在于，所述取代的C2-C20的直鏈烷基中的取代 基為徑基、醒基、氨基、琉基和糖殘基中的一種或幾種； 所述取代的C3-C20的支鏈烷基中的取代基為徑基、醒基、氨基、琉基和糖殘基中的一種 或幾種。7. 根據權利要求1所述的鍵合藥，其特征在于，所述R4選自氨原子、乙酷基或丙酷基。8. 根據權利要求1所述的鍵合藥，其特征在于，所述x，y，z的取值范圍為30《x+y+z《 300。9. 一種高分子CA4鍵合藥的制備方法，包括： 將具有式（II)結構的共聚物與CA4在縮合劑的作用下反應得到式（I)結構的高分子CA4 鍵合藥，其中， 化選自C2-C10的直鏈烷基、C3-C10的支鏈烷基或C6~C20的芳基； 化選自氨原子或者陽離子； 化選自未取代的C1-C20的烷基或取代的C1-C20的烷基； R4選自氨原子或者C1-C6的烷基酷基； b、L2、L3獨立的選自-C出-或-C出C出-; x，y，z為聚合度，10《x+y+z《5000，y〉0，z〉0; η為聚合度，10《n《500。10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述縮合劑為2，4，6Ξ氯苯甲酯氯， N，N-二異丙基碳二亞胺或二環己基碳二亞胺。
【文檔編號】A61P35/00GK105963707SQ201610379051
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】湯朝暉, 宋萬通, 于海洋, 牛月偉, 張大為, 馬勝, 張瑜, 陳學思
【申請人】中國科學院長春應用化學研究所