一種超支化hpma共聚物-dox偶聯物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種超支化N?(2?羥丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）共聚物?DOX偶聯物及其制備方法和應用，屬于生物材料領域。本發明采用一步RAFT聚合成功制備了一種超支化HPMA共聚物?DOX偶聯物。所述偶聯物中阿霉素（DOX）通過pH敏感鍵與超支化HPMA共聚物相連,所述超支化HPMA共聚物骨架中含有可降解的片段。所述偶聯物具有良好的生物相容性，具有pH敏感和酶敏感的雙敏感特性，作為智能給藥系統可以形成納米粒子在腫瘤部位高度聚集，并在腫瘤微環境下快速釋放藥物、降解成低分子量片段，從而提高抗腫瘤效果的同時保證良好的生物安全性，在腫瘤的治療中具有廣闊的應用前景。
【專利說明】
一種超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物材料領域，特別涉及一種超支化HPM共聚物-DOX偶聯物及其制備 方法和應用。 技術背景
[0002] 乳腺腫瘤是排名第一的女性常見惡性腫瘤，且發病率在我國呈逐年上升趨勢，尋 求有效的治療手段已成為當前最緊迫任務之一。目前，臨床上針對乳腺腫瘤的用藥主要為 小分子抗腫瘤藥物，但存在對正常組織和器官的毒副作用大、抗腫瘤效率低等缺陷。納米藥 物控釋系統具有被動革G向腫瘤以及通過實體瘤的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR效應)在腫瘤部位聚集等特點，有效改善化療藥 物給藥途徑，提高抗腫瘤效率，同時降低了藥物毒性。特別是基于脂質(脂質體)和聚合物藥 的物輸送系統(NDDSs)，如，聚合物納米粒子、膠束和枝狀載體，作為癌癥化療有潛在的治療 效果。
[0003] N-(2-羥丙基）甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物以其良好的水溶性、無致免疫性、體內 血液循環系統中的高穩定性和良好的生物相容性等特點，引起了國際上將其作為藥物載體 的廣泛關注和研究，并有一些藥物控釋系統已經進入了臨床前試。前期研究表明，基于HPMA 聚合物納米載藥系統的抗腫瘤效果與載藥系統的分子量和粒徑大小相關，分子量越高的 HPMA聚合物的載藥系統顯示出越好的抗腫瘤效果。然而，HPMA聚合物藥物控釋系統臨床應 用的最大障礙是HPM聚合物的不可降解性。
[0004] -種有效而安全的納米藥物控釋系統除了具有良好的生物降解性以外還應該在 溶液中具有適合分子量和三維結構，以及多價態和均一性。另外基于線形聚合物和支狀聚 合物的藥物控釋系統由于其獨特的拓撲結構以及良好的物化性能，也都被設計合成以提高 抗癌藥物治療效果。近來，基于支狀聚合物的納米藥物控釋系統，如星形聚合物，超支化聚 合物以及樹狀聚合物，作為癌癥治療的一種新型的納米藥物運輸載體已經被廣泛的研究。 而星形大分子可以通過將線形HPM聚合物與聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀分子偶聯合成，它能顯 著提高EPR效應，進而提高治療效果。基于此類星形大分子的藥物控釋系統由于其多支化特 征，可以明顯提高抗癌效果。然而，星形HPMA大分子-DOX聚合物的合成并不容易，需要涉及 到單體的合成，聚合物官能團的修飾，PAMM樹狀大分子表面的修飾，功能化PAMAM樹狀大分 子聚合物的偶聯，多步的提純等，合成需要一個多步的過程和提純，產率很低。這些多的合 成步驟將導致無法大規模的合成。另外，陽離子PAMAM樹狀大分子是非生物降解的，這也將 導致潛在的副作用。
【發明內容】
[0005] 本發明針對上述問題，結合樹支狀聚合物以及HPMA聚合物的特點，采用RAFT聚合 反應一鍋法合成了一種超支化HPMA共聚物，其與抗腫瘤藥物DOX偶聯，獲得超支化HPMA-DOX 偶聯物(branched polyHPMA copolymer-DOX conjugate)。所述偶聯物具有良好的生物相 容性，具有pH敏感和酶敏感的雙敏感特性，作為智能載藥遞送系統可以形成納米粒子在腫 瘤部位可以高度聚集，并在腫瘤微環境下快速釋放藥物、降解成低分子量片段，從而提高抗 腫瘤效果，在腫瘤的治療中具有廣闊的應用前景。
[0006] 本發明通過以下技術方案來實現：
[0007] 一種超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物，包括所述超支化HPMA共聚物和抗腫瘤藥物阿 霉素(DOX)，所述DOX通過pH敏感鍵與超支化HPMA共聚物相連，所述超支化HPMA共聚物骨架 中含有可降解的片段。與線性多聚合物的載藥系統相比，支狀聚合物具有三維球狀結構，較 低的溶解性，較小的流體半徑，提高了多功能化，增加了 EPR效應可以增強腫瘤治療系數。 HPMA聚合物的合成具有靈活性，可以有效的偶聯抗癌藥物，所述超支化HPMA共聚物具有較 高的分子量，可以形成納米粒子，通過EPR效應在腫瘤部位高度聚集從而實現被動靶向，同 時所述PH敏感鍵可在腫瘤組織和細胞中較低的pH條件下發生斷裂，從而釋放出抗腫瘤藥物 達到殺死腫瘤細胞的目的；同時所述含有可降解的短肽GFLG片段在腫瘤組織和細胞特定的 環境下發生降解使超支化HPMA共聚物降解成低分子量(低于腎小球過濾閾值50KDa)片段， 從而順利的排出體外。
[0008] 高度支化的結構和潛在自組裝行為促使所述偶聯物形成結構緊密納米粒子，所述 偶聯物粒徑約IOOnm，滿足EPR效應所需的納米系統粒徑30-150nm的要求，因此，此超支化納 米載藥系統可在腫瘤部位高度聚集。
[0009] 作為可選方式，所述偶聯物粒徑具有電負性。帶負電荷的納米載藥系統可以避免 巨吞噬細胞的吞噬、減少非特異性的相互作用、減弱與血清蛋白的相互作用，因此，帶負電 荷的納米載藥系統可以在血液循環中穩定存在。
[0010] 作為可選方式，在上述偶聯物中，所述PH敏感鍵為腙鍵。采用腙鍵連接使得所述偶 聯物可在pH約為7.4的血液循環中可以穩定存在，在pH=4.0~6.0顯酸性的溶酶體中可以 快速釋放DOX藥物。
[0011] 作為可選方式，在上述偶聯物中，所述超支化HPMA共聚物骨架中含有酶敏感的四 肽GFLG(Gly-Phe-Leu-Gly)。肽段GFLG在溶酶體組織蛋白酶的作用下可降解，且此酶在腫瘤 內皮細胞和大多數腫瘤細胞中過量表達，將可降解的片段GFLG引入了共聚物主鏈，一方面 可以使所述超支化HPMA共聚物具有較高的分子量(可超過IOOkDa)，從而提高抗癌效果，另 一方面，肽段GFLG在溶酶體組織蛋白酶的作用下降解使偶聯物可降解為低分子量的片段(〈 50kDa)，方便經腎排出體外，有效降低副作用。
[0012] 作為可選方式，在上述偶聯物中，所述超支化HPMA共聚物的支鏈與支鏈之間的骨 架中含有組織蛋白酶B敏感的肽段GFLG。通過在部分側枝骨架中加入GFLG，一方面更加有利 于所述偶聯物在溶酶體組織蛋白酶的作用下充分降解才低分子量片段而排出體外，同時， 更有利于偶聯物由結構緊密納米粒子轉變成松散的片段，使pH敏感鍵更容易與周圍的酸性 環境接觸并發生斷裂，從而釋放出藥物分子。
[0013] 作為可選方式，在上述偶聯物中，所述超支化HPMA共聚物是以HPMA和MA-GG-NHNHBoc為單體，以MA-GFLG-CTA為鏈轉移劑，以MA-GFLGK-MA為交聯劑共聚形成的超支化共 聚合物。加入M-GFLGK-M可以形成超支化聚合物。
[0014] 作為可選方式，所述偶聯物中的結構式為：
[0015]
[0016] 作為可選方式，在上述偶聯物中，所述超支化HPMA共聚物中各支鏈的平均分子量 小于50kDa。
[0017] 本發明還提供了上述的偶聯物的制備方法，包括以下制備步驟：
[0018] (1)采用RAFT-步反應制備超支化HPMA共聚物；
[0019 ] ⑵取步驟(1)制備的超支化HPMA共聚物與DOX通過pH敏感的共價鍵相連。
[0020] 作為可選方式，在上述制備方法中，包括以下制備步驟：
[0021] (1)以HPMA 和 MA-GG-NHNHBoc 為單體，以 MA-GFLG-CTA 為鏈轉移劑，以
[0022] MA-GFLGK-MA為交聯劑，以VA044為引發劑，采用RAFT-步反應制備含Boc保護集團 的超支化HPM共聚物；
[0023] (2)取步驟（1)制備的超支化HPMA共聚物用FTA脫Boc保護，然后在NH4OAc緩沖液中 通過共價鍵腙鍵將DOX · HCl與超支狀聚合物相偶聯。
[0024]作為可選方式，在上述制備方法中，所述步驟（1)中各物料的摩爾比為[HPMA ] / [MA-GG-NHNHBoc]/[MA-GFLGK-MA]/[CTA]/[VA044]=128:142:57:7:3:1。
[0025] 作為可選方式，在上述制備方法中，所述步驟(1)中以去離子水/甲醇為溶劑。
[0026] 本發明還提供了一種上述的偶聯物的應用，其特征在于，將其用于制備抗腫瘤藥 物，特別是用于制備治療乳腺癌的藥物。
[0027] 本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0028] 本發明的有益效果：
[0029] 本發明所述偶聯物具有良好的生物相容性，具有pH敏感和酶敏感的雙敏感特性， 作為智能載藥遞送系統可以形成納米粒子在腫瘤部位可以高度聚集，并快速釋放藥物、降 解成低分子量片段，從而提高抗腫瘤效果的同時保證良好的生物安全性，在腫瘤的治療中 具有廣闊的應用前景。
[0030] 本發明所述偶聯物的制備方法采用一步RAFT聚合成功制備了不含單體的超支化 聚合物，避免了合成線性聚合物需要的多步反應。制備方法簡單，產品性能穩定。
【附圖說明】：
[0031] 圖1為本發明所述超支化HPM共聚物-DOX偶聯物作為納米載藥遞送系統的簡要示 意圖。包括以下過程：1)超支化的聚合偶聯物自組裝成納米顆粒;2)納米顆粒通過EPR效應 在腫瘤部位聚集;3)納米顆粒在細胞內刺激響應裂解藥物釋放。
[0032] 圖2為實施例2中制備超支化HPMA共聚物-DOX(HPMAcopolymer-DOX)偶聯物以及偶 聯物自組裝成納米顆粒的示意圖。
[0033]圖3為超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物的SEC測試結果。
[0034]圖4為本發明所述超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物納米粒子的形貌尺寸檢測結果。 其中A:超支化HPM共聚物-DOX偶聯物的SEM形貌圖；B:超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物的DLS 粒徑;C:超支化HPM共聚物-DOX偶聯物降解12h后的DLS粒徑。
[0035] 圖5為本發明所述載藥納米系統在pH 5.4有酶、pH 5.4無酶和7.4無酶條件下藥物 體外累積釋放曲線(n = 3,37°C)。。
[0036] 圖6為本發明所述載藥納米系統的體外細胞毒性實驗結果。A:鹽酸阿霉素、超支化 HPMA共聚物-DOX偶聯物的IC50測定(n = 5); B:超支化HPM共聚物-DOX偶聯物的細胞毒性實 驗(n = 5);C:細胞攝取實驗。
[0037] 圖7為本發明實施例7中所述離體成像實驗結果。其中A-D:分別是時間點6、12、24、 48h熒光成像圖，從上到下依次為注射生理鹽水、載藥納米粒子、鹽酸阿霉素的成像圖;E-F: 分別為注射納米載藥粒子和鹽酸阿霉素后在不同時間點各臟器的熒光強度;G:注射納米載 藥粒子和鹽酸阿霉素，在不同時間點比較在腫瘤部位的熒光強度。
[0038]圖8為本發明實施例8中所述體內抗腫瘤效果實驗結果。A:荷瘤小鼠腫瘤體積變化 曲線;B:各組小鼠腫瘤重量的統計;C:腫瘤生長抑制的計算;D:各組小鼠體重變化的曲線。
[0039] 圖9為注射了生理鹽水、鹽酸阿霉素、載藥納米粒子的接有腫瘤的小鼠腫瘤部位 CD31(Al-4)、Ki-67(Bl-4)、TUNEL(Cl-4)的組織切片圖及統計(n = 5)。
[0040] 圖10為注射了生理鹽水、鹽酸阿霉素、載藥納米粒子的正常小鼠的血常規檢測結 果(n = 5)。
[0041]圖11為注射了生理鹽水、鹽酸阿霉素、載藥納米粒子的正常小鼠的心臟、肝臟、脾 臟、腎臟、肺的組織切片。
[0042]圖12為注射了生理鹽水、鹽酸阿霉素、載藥納米粒子的正常小鼠的體重變化曲線 (n = 7)〇
【具體實施方式】：
[0043]以下通過實施例的【具體實施方式】再對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。應 當理解，此處所描述的具體實例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。在不脫離本發 明的精神和原則之內做的任何修改，以及根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的等同 替換或者改進，均應包括在本發明的保護范圍內。
[0044]實施例1:功能化鏈轉移劑MA-GFLG-CTA的合成
[0045]
[0046] 將MA_GFLG-〇H( 1 · 84g，4mmol)、EDCI (764mg，4mmol)、H0Bt(676mg, 5mmol)溶于50mL 無水DMF，隨后加入DIPEA(3.5mL，20mmol)，在氮氣冰浴的條件下攪拌30min。之后加入N-Boc-ethylenediamine(800mg, 5mmol)在氮氣冰浴的條件下攪拌30min，在常溫下再攪拌 12h。攪拌之后，再加250mL的乙酸乙酯(EtOAc)到溶液中，用EtOAc (50 X 3)萃取出溶液中的 水。得到的新溶液分別用飽和的NaHCO3溶液、IMHCl溶液、NaHCO3飽和溶液洗滌，之后再用HCl 飽和液洗滌，其次用無水MgS04干燥，溶劑用旋轉蒸發儀除去，剩余產物在4°C試劑EtOAc/ ether (1:1)中再次結晶，得到產率為80 % (1.93g，3.2mmo 1)的MA-GFLG-NHBoc白色固體產 物。1H NMR(400MHz ,DMSOjin ppm) :0.80-0.85(dddd，6H，-CH(CH3)2)，1.34(s，9H，C(CH3)3)， I .46-1 .55(m，3H，-CH2CH(CH3)2)，1.81(s，3H，CH3-C(R)=CH2)，2.72-2.78(m，4H， NHCH 2CH2NH), 2.99 (m, 2H, CHCH2C6H5 ),3.34-3.61 (m, 4H, NHCH2CONH and NHCH2CONH) ,4.20-4.22(m,lH,C0CH(R)NH),4.49(m,lH,C0CH(R)NH),5.33(s,CH3-CH(R) = CH2-Ha),5.67(s, CH3-CH(R)= CH2-Ha'），6·79-6·82(m，IH，NH)，7·14-7·15(m，5H，Ar-H)，8·00-8·02(m，IH， NH),8.11(m,lH,NH),8.14(m,ΙΗ,ΝΗ)；LC-MS(ES+):m/z 503.4[M-Boc+H]+；MALDI-HRMS:m/ z503·2945([M-Boc+H]+),525·2749([M-Boc+Na]+),625·3250([M+H]+)and 641·2991([M+ K] + ).
[0047] 將1.2g(2mmol)MA-GFLG-NHBoc溶于20mL無水DCM/TFA( I: I)。將溶液依次在冰浴下 攪拌5min，室溫下攪拌3h直至將溶劑除去，之后加入無水乙醚再攪拌20min，過濾得到沉淀 物，用乙醚洗滌兩次，干燥Ih。將干燥得到的混合物溶解在50mL無水CAN中，將溶液在冰浴下 攬摔，同時依次加入2mmol的TEA、760mg(2mmol )2-cyan〇-5-〇x〇-5-(2_thioxothiazoIidin- 3-yl)pental_2_yl benzodithioate。之后在氮氣冰浴下繼續攪拌1011再在室溫下攪拌411。 反應完后，去掉溶劑，用硅膠（乙酸乙酯/正己烷= 3:1)柱色譜法分離，最終得到產率為42% (641mg，0.84mmol)的粉色固體。1H NMR(400MHz,CDCl3Jin ppm) :0.90-0.92(m，6H,-CH (CH3)2), 1.48(m, 1H,-CH2CH(CH3)2), I. 67(m,2H,-CH2CH(CH3)2) ,1.86( s,3H, CH3-C(R) = CH2)，I · 92-93 (m，3H，CH3-C(R)-CN)，2 · 35-2 · 50 (m，4H，NHCOCH2CH2C(R)-CN)，3 · 15-3 · 23 (m， 4H，NHCH2CH2NH)，3.48(m，4H，NHCH2⑶NH and CHCH2C6H5)，3.80(m，2H，NHCH2CONH)，4.27(m， 1H,COCH(R)NH),4.42(m,lH,COCH(R)NH) ,5.42(s,CH3-CH(R) =CH2-Ha) ,5.74(s,CH3-CH(R) = CH2-Ha，) ,6.81-8.85(m,2H,NH),7.14(m,4H,NH),7.29(m,5H,CH2-Ph-H),7.38(m,2H,C(S) Ph-H m),7.54-7.56(m, IH1C(S)Ph-Hp),7.88-7.90(m,2H,C(S)Ph-H0) ,LC-MS(ES+)382.8[(M+ 2H)/2]2+；764.3[M+H]+〇MALDI-HRMS:m/z 764.3260([M+H]+),786.3028([M+Na]+)and 802.2795([M+K]+).
[0048] 實施例2:超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物的制備
[0049] 如圖 2所示 d_HPMA(1.36g，9.5mmol)，MA-GG-NHNHBoc(126mg，0.4mmol),MA-GFLGK-MA(65·6mg,0· lmmol) ,MA-GFLG-CTA(29·6mg,38·8ymol)溶解在7mL含VA044(3·6mg， 12.9ymoI)的去離子水/甲醇（I: I，v/v)混合溶劑中。
[0050] HPMA共聚物在丙酮/乙醚（2:1)中析出，此操作重復兩次，其次通過離心將HPMA共 聚物分離，用先溶解-再析出的方法將HPMA共聚物提純兩次，最后真空干燥得到略帶粉紅色 的粉末。樣品進一步采用Akta (GE !^&11:11〇3^)高效液相色譜系統聯合5卯61'〇866冊10/ 30色譜柱(親水中性聚合物的分子量范圍15kDa-300kDa/14mL分離體積）、以含有30%乙腈 的乙酸鈉緩沖液(pH為6.5)為流動相通過尺寸排阻色譜法進一步純化，得到沒有單體的超 支化聚合物。純化之后冷凍干燥，最后得到635mg產物(40 %產率）。
[00511 取上述純化的HPMA共聚物500mg溶于IOmL的三氟乙酸（TFA)中，并攪拌2h。隨后用 截留分子量(MwCO)為3500Da的透析膜讓其溶液在水中完全透析去掉溶劑三氟乙酸，之后， 將HPMA共聚物再溶于IOmL的水中。通過透析和冰凍干燥后，得到一定數量的粉末。將350mg 的上述粉末和130mg的鹽酸阿霉素（D0X · HCl)分別溶于IOmL的0.1 M NMOAc緩沖液（pH 5.7)。其次將鹽酸阿霉素溶液加到粉末溶液中，使其在常溫黑暗的條件下反應24h。之后，在 黑暗的條件下，用截留分子量為(MwCO)為3500Da的透析膜使反應液在MilliQ水中完全透 析，最后冰凍干燥得到330mg的產物(超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物，Branched polyHPMA copolymer-DOX conjugate)。在480nm處的紫外可見吸收光譜測得阿霉素占超支狀載體的 質量為5.67 %。因藥物是通過共價鍵與載體相偶聯的，與其它自組裝納米載藥系統，如膠 束、脂質體、多聚體相比，這類支化聚合物前藥物可能在在PBS或血液循環中更加穩定。本實 施例成功合成了可降解的、可控的、有確定形態結構的支狀HPM共聚物，并且這種聚合物可 以形成納米粒子，可以作為用為有效而安全的納米藥物控釋系統。
[0052 ] 實施例3:納米粒子大小、形貌、Ze ta電位的表征
[0053]將所得超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物溶解在雙蒸水中，使其最終濃度為lmg/mL， 超聲30 秒。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments ,Worcestershire, UK)對其水相 尺寸以及zeta電位值進行測量。隨后，將含有納米粒子的溶液滴在適當大小的硅片上待溶 劑揮發完全后，使用field emission scanning electron micro-scope(FE-SEM)對其尺寸 進行進一步的確認。
[0054]結果顯示：動態光散射(DLS)方法檢測得lmg/mL超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物納 米粒子水相粒徑為l〇2nm，粒徑分散度為0.397,如圖4B所示。納米級尺寸和窄的粒徑分散度 表明所制備的載藥系統可形成較均一粒徑的納米粒子。掃描電鏡檢測結果顯示可以形成粒 徑約95nm較均一的球形納米顆粒(如圖4B所示）。對于聚合物納米系統，DLS測得的水相粒 徑通常比SEM測得干燥狀態的粒徑大許多。本次合成的聚合載藥系統水相粒徑和干燥狀態 的粒徑相接近，差別不大，這說明合成的載藥系統較緊密。高度支化的結構可能是形成粒徑 大約IOOnm結構緊密納米粒子的原因之一，再者，潛在的自組裝行為也可能促進緊密納米粒 子的形成。自組裝是由有柔韌性HPMA的親水作用和DOX的基團之間的相互疏水作用的平衡 界面能最小化所驅動的，其次，由于組成阿霉素這部分由不同的化學成分(如：如疏水性脂 肪族和芳香族組）、一些驅動力（如氫鍵、π-JT疊加、偶極相互作用）以及未形成的分支結構組 成，因此，多分支結構和潛在自組裝行為促使形成緊密的納米載藥系統。所述納米載藥系統 的Zeta電位為-7.9mv，所述超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物因具有合適的納米粒徑和略帶負 電荷的特點不僅可以在血液中穩定存在，而且可以通過EPR效應在腫瘤部位高度聚集，達到 提高抗腫瘤效果的目的。
[0055] 實施例4:超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物（branched polyHPMA copolymer-DOX con jugate)體外降解
[0056] 用pH 5.4McIlvaine緩沖液將超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物配成3mg/mL的濃度在 37°C木瓜蛋白酶存在的條件下孵育12h。之后取出樣品，分別用SEM和DLS對材料的降解行為 平行檢測2次。
[0057]用SEC測得降解前超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物載藥系統的平均分子量(MW)為 165kDa，分散度為2.21，如圖3所示。與溶酶體組織蛋白酶活性相似的木瓜蛋白酶存在的情 況下，超支化載藥系統可降解成低分子量(約23kDa)的聚合物片段，可排出體外。此外，由 DLS測得納米載藥系統可由水相粒徑102nm降解成8.6nm的粒子，如圖4C所示。
[0058]實施例5:超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物體外釋藥
[0059]分別稱取三分質量接近的超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物將其分別溶于剛配好的 pH5.4有木瓜蛋白酶的PBS、pH5.4無木瓜蛋白酶的PBS、pH7.4無木瓜蛋白酶的PBS中，濃度為 3mg/mL。在預先設定的時間點，分別取出80yL樣品溶液注入RP-HPLC(Agilent Technologies IlOOseries)并分析其所含自由DOX含量。RP-HPLC色譜條件為：色譜柱為 Zorbax C8column 4.6mmX 150mm;流動相為水(0.1 %三氟乙酸)-乙腈(0.1 %三氟乙酸），乙 腈所占比例從2 %梯度變化至90 % ;流速為1.0mL/miη，洗脫時間為20分鐘；檢測器為UV-vis，檢測波長為480nm〇
[0060]結果如圖5所示:藥物遞送系統在不同pH條件下孵育釋放12h后，在pH 5.4條件下 的釋放量大于75 %，而在pH 7.4條件下的釋放量則少于20 %，這是由于遞送系統中的腙鍵 在低PH的條件下更易斷裂，所以使所制備的遞送系統與pH 7.4相比在pH5.4的條件下藥物 DOX釋放更快更高效；同時，載藥系統在pH5.4有木瓜蛋白酶和沒有蛋白酶條件下的釋放量 相似，這表明酶對藥物釋放行為沒有影響。體外的藥物釋放試驗表明：此納米載藥遞送系統 在pH約為7.4的血液循環中可以穩定存在，在PH在4.0-6.0顯酸性的溶酶體中可以快速釋放 DOX藥物。這表明基于聚合物合成的納米載藥粒子可作為pH響應的NDDs用于癌癥的治療。 [0061 ]實施例6:體外細胞毒性實驗
[0062] 細胞培養：鼠源乳腺癌細胞4T1 (中國科學院上海細胞庫購得）用RPMI-1640培養基 (加入10%FBS及lOOU/mL青霉素、100yg/mL的鏈霉素)37°C，5%C02的條件下培養
[0063]在96孔培養板中以5 X IO3個細胞/孔接種細胞，用IOOyL含10%血清培養基，在5% CO2培養箱中37°C培養24小時。棄去96孔培養板中培養基，加入100μΙ的含不同濃度DOX的血 清培養基，每個濃度平行做5個孔，使孔中DOX濃度最終分別為0.002yg/mL、0.014yg/mL、 0·041yg/mL、0·123yg/mL、0·37yg/mL、I·Ilyg/mL、3·33yg/mL、10yg/mL、30yg/mL、90yg/mL， 作為陽性對照；另外將1〇〇此的含有polyHPMA copolymer-DOX con jugate的血清培養基加 入另一塊按照上述方法接種細胞的96孔板，使孔中折算成DOX的濃度為0.002yg/mL、0.014μ g/mL、0·041yg/mL、0·123yg/mL、0·37yg/mL、I·llyg/mL、3·33yg/mL、10yg/mL、30yg/mL、90y g/ mL，用作測試組;最后將兩塊板的剩余部分用100μΙ不含血清培養基填充，作為空白對照。 繼續培養48h后，將孔中培養基棄去，用10mmol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液清洗2遍，然后加 入IOOyL含10%CCK8試劑的培養基（不含FBS)再培養1.5-2.011，用酶標儀(55(?10-1^0)測 450nm處吸光度。根據吸光度計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組吸光度/空白對照組吸 光度X100%。
[0064] 實驗結果表明，超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物的細胞毒性小于D0X，D0X的半抑制 濃度IC50(inhibiting concentration)為0·34yg/mL，基于超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物 的納米粒子的半抑制濃度IC50為1.77yg/mL大于DOX的IC50(圖6A)。基于超支化HPMA共聚 物-DOX偶聯物納米粒子的毒性遠小于DOX的原因可能是:D0X是一個兩親性小分子容易通過 自由擴散穿過細胞膜進入腫瘤細胞;而對于載藥遞送納米粒子，納米顆粒較大，且DOX是通 過共價鍵腙鍵偶聯到載體上的，載藥遞送納米粒子要通過內吞作用進入細胞，進入溶酶體 才能從載體上釋放，進而對細胞產生殺傷力。
[0065]為了檢測自由藥載體的毒性，用TFA除去樹狀多聚HPMA聚合物上的保護基團Boc， 如圖2所示，再將濃度分別為20、100、200、400、600yg/mL的去掉保護集團Boc的樹狀多HPMA 聚合物與4T1細胞系共孵育48h，再用CCK-8檢測細胞的活性，每個濃度做5個平行。如圖6B所 示:所有被測自由藥物載體濃度的細胞活性都大于90%;如圖6A所示：當自由藥DOX的濃度 為30yg/mL時，細胞活性已接近為0。由于載藥遞送系統的載藥量為5.67%，所以結合3(^ 8/ mL自由藥DOX需要526.3yg/mL濃度的載體。如圖613所示:600yg/mL高于526.3yg/mL藥物載體 的細胞活性仍高于90%。這些實驗結果表明超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物納米載藥遞送系 統產生的細胞毒性是由釋放的自由藥DOX導致的，并非由沒有載藥的超支狀HPMA聚合物產 生的;超支化聚合物載體因沒有明顯的細胞毒性，可以作為安全的藥物遞送載體;而載體載 藥之后，有明顯的細胞毒性，這說明偶聯在載體上的藥物在溶酶體中釋放，進而產生細胞毒 性;這也進一步說明，一旦載藥遞送系統在腫瘤部位聚集進入腫瘤細胞后，可以產生高效的 體內抗腫瘤效果。
[0066]利用激光共聚焦掃描電鏡研究自由藥DOX和超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物載藥遞 送系統進入4T1細胞的情況，進一步驗證載藥系統的細胞吞噬和藥物在細胞內的釋放。首 先，將自由藥DOX和載藥納米遞送系統用RPMI 1640培養基都配成折算為DOX的濃度都為3μ g/mL的樣品，分別與4Τ1細胞孵育Ih和4h，孵育之后去掉培養基，用1 %的多聚甲醛PBS洗滌， 之后用DAPI對細胞核染色，再用I3BS洗滌除去多余的DAPI，最后加roS，利用CLSM觀察4T1細 胞。細胞對超支載DOX遞送系統和自由藥DOX的吞噬都會伴有紅色熒光的產生。如圖6C1-C3 所示:載藥系統孵育細胞Ih后，只在細胞核的周圍才能觀察到微弱的熒光，這說明只有少量 的納米載藥粒子進入了細胞;孵育4h后，如圖6D1-D3所示:在細胞核周圍和核內都能觀察到 熒光，說明在載藥系統或載藥系統釋放的DOX進入了細胞核。這主要是因為DOX是兩親性的 小分子，很容易穿過細胞膜，進入細胞。這些實驗結果都表明：制備的超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物納米載藥系統可以進入4T1細胞，產生抗腫瘤效果;載藥系統產生的細胞毒性是 由載藥系統釋放藥物所導致，藥物載體本身沒有明顯的毒性。
[0067]實施例7:離體成像實驗
[0068]實驗動物:將4T1細胞接種雌性的BALB/c小鼠身上，小鼠體重20 ± 2g，6-8周齡，購 自四川大學華西動物中心。
[0069]為評價超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物納米載藥系統在接有腫瘤的雌性的BALB/c 小鼠體內的分布以及納米載藥系統的EPR效應，利用Maestro in vivo imaging system (CRi，U.S.)對Balb/C荷瘤裸鼠進行主要臟器和腫瘤的離體熒光成像實驗。將雌性的BALB/c 小鼠隨機分為三組，每組3只，分別通過尾靜脈注入等體積的生理鹽水、鹽酸阿霉素生理鹽 水溶液、納米載藥系統生理鹽水溶液，其中每只老鼠注射鹽酸阿霉素與納米載藥系統當中 阿霉素的量相同，均為4mg/kg。
[0070] 結果如圖7所示:在注射超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物6小時后，在腫瘤部位有強 的熒光信號，隨著時間的不斷增加，腫瘤部位的熒光強度不斷增加在12h達到了最大，之后 緩慢的降低到一個穩定的值，同時在其它器官也檢測到了熒光信號，但與腫瘤部位相比，熒 光信號要弱，這表明載藥納米粒子在器官內的藥代動力速度快;相比之下，注射自由藥DOX 的老鼠，熒光信號較弱，而且大部分來自器官;注射生理鹽水的對照組，在實驗過程中未觀 察到熒光信號。這些實驗結果表明：此載藥納米系統可以通過EPR效應在腫瘤部位快速聚 集，并保持相對穩定的濃度，通過釋放自由藥DOX達到抑制腫瘤生長的目的；載藥系統在內 具有快的藥代動力，因此可以降低系統毒性。
[0071] 實施例8:體內抗腫瘤效果
[0072] 將4T1細胞（5\105)接種雌性的從1^八小鼠身上。當腫瘤體積達到250-300!111113將 BALB/c小鼠隨機分為三組，每組7只，每只都適當做好標記。這三組通過小鼠尾靜脈注射接 受不同的藥劑治療，分別為生理鹽水、鹽酸阿霉素(4mg/kg)和為負載阿霉素的納米載藥系 統(4mg/kg)，注射的體積均為200μΜ每五天注射一次，一共四次。每兩天稱取小鼠的體重， 用于繪制體重變化曲線;每兩天測量腫瘤的大小（即腫瘤的長和寬），并通過公式計算出腫 瘤的體積(體積= 1/2Χ長X寬X寬），用于繪制腫瘤體積變化曲線。第19天，采用頸椎脫臼 法處死小鼠，將每只小鼠的腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟取出。稱取每組腫瘤的重量，并 記錄，用于統計腫瘤重量變化。通過公式計算腫瘤生長抑制TGI(TGI = [l-(實驗組腫瘤的平 均重量)/(對照組腫瘤的平均質量）]*1〇〇%。
[0073] 如圖8A所示：從圖中可以觀察到，相對于對照組，DOX組和載藥納米粒子組的腫瘤 生長被抑制。而從統計上看載藥納米粒子組的腫瘤體積明顯小于對照組(P〈〇.001)。在實驗 的最后，所有小鼠都被處死，摘取腫瘤進行稱重。如圖8B所示:載藥納米系統組的腫瘤重量 明顯小于其他兩組。如圖8C所示：DOX具有中度的抗腫瘤效果，腫瘤生長抑制率（TGI)為 27%。而載藥納米粒子組的腫瘤生長抑制率顯著的提高到了 48%，這說明載藥納米粒子是 一種具體良好抗腫瘤效果的載藥系統。相當高的抗腫瘤活性可能歸功于其具有負表面電 荷，更長的血液循環時間以及通過EPR效應在腫瘤組織高度聚集。
[0074]同時，為了探究抗腫瘤藥物對于機體的副作用，我們還對實驗小鼠的體重變化進 行了監測。如圖8D所示：與對照組相比，載藥納米粒子組的小鼠的體重沒有明顯的差異，說 明納米粒子具有較高藥物耐受性。而DOX施藥組卻出現了明顯的體重下降，相對平均體重 下降了約15%。因而，這表實驗結果表明納米粒子具有較低的系統毒性并且可以明顯的降 低副作用。
[0075]實施例9:免疫組化分析試驗
[0076] 利用Ki-67及TUNEL法分別對腫瘤組織當中細胞增殖與凋亡情況進行檢測。過程如 下：（1)常規脫蠟水化組織切片（將石蠟切片浸于二甲苯中5min，三次，取出切片置于100% 無水乙醇中3min兩次，再依次置入90 %~70 %各級酒精各3min;流水沖洗3min，置入雙蒸水 中3min，再用PBS沖洗3次，每次3min)。（ 2)切片經PH 6枸櫞酸抗原修復液95 °C水浴修復 40min。（3)修復完畢后自然冷卻切片，用PBS沖洗3次，每次3min。（4)進行相應抗體染色操作 (5)用緩沖甘油封片，熒光顯微鏡采圖。用LEICA DM 4000B熒光顯微鏡觀察取圖。在顯微鏡 200倍下觀察拍照。
[0077]結果如圖9所示，光密度分析顯示注射納米粒子的小鼠的平均微血管密度明顯的 小于對照組(P〈〇.001)和D0X(p〈0.05)組。在腫瘤生長的過程中常常伴隨有血管的生成，可 以通過抑制血管的產生達到抑制腫瘤的目的。這表明納米粒子對于血管生成具有良好的抑 制作用從而達到較高抗腫瘤的效果。
[0078] 為了評價各施藥組在抑制腫瘤增殖方面的治療效果，我們利用廣泛用于標記處于 Gl，G2，S細胞周期腫瘤增殖細胞的Ki-67對組織切片進行染色分析。如圖9所示，Ki-67的在 腫瘤組織的密度可以通過Ki-67染色面積/整個面積估計。相比較于對照組和DOX組，載藥納 米粒子組具有Ki-67陽性細胞最少，說明載藥納米粒子對腫瘤細胞的增生有抑制作用，具有 相對比較高的抗腫瘤活性，相應的也具有較高的TGI，如圖8C所示。另外，我們利用得到廣泛 應用的TUNEL法（terminal deoxynucIeotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)對各個試驗組腫瘤組織中細胞凋亡情況進行了研究。如圖9所示:給藥DOX組出現 了約33%的細胞凋亡，對照組約22%的細胞凋亡，載藥納米粒子組卻有著非常明顯地細胞 凋亡水平約為78%。綜合CD31和Ki-67以及TUNEL的分析結果，可以看出我們所制備的基于 超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物納米粒子的納米載藥系統在折算成藥物同等劑量的前提下 能夠大幅度加快腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖，有比單純的自由DOX更為優良的抗 腫瘤效果。可能原因有:癌癥是一種細胞增殖失調的疾病，納米載藥粒子優良的抑制細胞增 殖的特性會帶來良好的抗癌效果;此外，納米載藥粒子可以通過EPR效應在腫瘤組織高度累 積，同時由于其具有PH敏感的特性，當納米粒子進入腫瘤細胞DOX就會很快的釋放，這也將 進一步提高DOX在腫瘤細胞內的濃度，提高抗腫瘤效果。
[0079] 實施例10:體內毒性實驗
[0080] 將正常BALB/c小鼠20只，小鼠體重20 ± 2g，6-8周齡，購自四川大學華西動物中心， 隨機分為三組，每組7只，每只都適當做好標記。這三組通過小鼠尾靜脈注射接受不同的藥 劑治療，分別為生理鹽水、鹽酸阿霉素(4mg/kg)和為負載阿霉素的納米載藥系統(4mg/kg) 注射的體積均為200yL;每五天注射一次，一共四次。16天后停止注射，繼續觀察4天。每兩天 稱取小鼠的體重，在第19天，采用頸椎脫臼法處死小鼠，將每只小鼠的主要臟器如心臟、肝 臟、脾臟、肺、腎臟取出進行組織學檢驗，并收集血液以便進行血液檢驗。
[0081] 結果顯示，在整個19天的實驗期間，注射生理鹽水以及載藥納米粒子組的小鼠并 沒有觀察到明顯的毒性，例如脫水、運動性損傷、肌肉萎縮、厭食以及其他的相關癥狀。同 時，兩組小鼠也表現出相似的體重變化曲線，沒有明顯的體重降低，如圖12,也并沒有出現 反常的身體特征以及行為。但是注射自由藥DOX組的體重則有較大的降低。
[0082] 為了更深入研究基于超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物（branched polyHPMA copo lymer-DOX con jugate)納米粒子對正常小鼠的毒性，我們將實驗的小鼠進行血常規和 組織化切片分析，進一步確定究基于超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物HPMA copolymer-DOX conjugates納米粒子是否引起了相關的副作用，例如骨髓抑制，組織損傷和炎癥等。圖10表 示了各種血液指標，如紅細胞數(RBC )、血紅蛋白含量(HGB )、紅細胞比積(HCT )、血小板數 (PLT)、平均血小板體積(MPV)、白細胞數(WBC)。從中可以看出，和對照組相比，注射載藥納 米粒子組的各項血液指標都處于正常的范圍內，并沒有明顯的異常。這表明并沒有溶血性 貧血以及凝血功能受損等并發癥出現。以上結果證明基于超支化HPMA共聚物-DOX偶聯物納 米粒子載藥納米粒子具有良好的血液相容性。通過對正常小鼠的主要器官，如心臟、肝臟、 脾臟、肺、腎臟，進行組織切片分析也并沒有發現明顯的組織病理性的異常和病變，如圖11 所示，說明載藥納米粒子對于組織沒有明顯的損害。納米顆粒的作為一種酶、PH敏感的功能 化超支化大分子具有的良好的生物相容性可歸因于它合理設計的結構以及適當的分子量。 然而，DOX組的組織切片分析也沒有明顯的毒性，這可能是因為小鼠的最后一次給藥和處死 的時間間隔較長(4天），導致DOX的對于組織的損害已經被自我修復。
[0083] 以上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言，僅僅是說明性的，而非限制性 的；本領域普通技術人員理解，在本發明專利要求所限定的范圍內，可對其進行許多改變、 修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種超支化ΗΡΜΑ共聚物-DOX偶聯物，其特征在于，所述阿霉素(DOX)通過抑敏感鍵與 超支化HPM共聚物相連，所述超支化HPM共聚物骨架中含有可降解的片段。2. 根據權利要求1所述的偶聯物，其特征在于，所述pH敏感鍵為腺鍵。3. 根據權利要求1所述的偶聯物，其特征在于，所述超支化HPMA共聚物主鏈骨架中含有 組織蛋白酶B敏感的四膚GFLG。4. 根據權利要求1所述的偶聯物，其特征在于，所述超支化HPMA共聚物是WHPMA和MA- GG-NHNHBoc為單體，WMA-G化G-CTA為鏈轉移劑，WMA-GFLGK-MA為交聯劑共聚形成的超支 化聚合物。5. 根據權利要求1所述的偶聯物，其特征在于，其結構式為：6. 根據權利要求1所述的偶聯物，其特征在于，所述超支化HPMA共聚物中各線性支鏈聚 合物的平均分子量小于50 kDa。7. -種如權利要求1所述的偶聯物的制備方法，其特征在于，包括W下制備步驟： (1) 采用RAFT-步反應制備超支化HPM共聚物； (2) 取步驟(1)制備的超支化HPMA共聚物與D0X通過pH敏感的腺鍵共價鍵偶聯。8. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，包括W下制備步驟： (1) WHPMA和MA-GG-NHNHBoc為單體，WMA-G化G-CTA為鏈轉移齊Ij，WM-G化GK-MA為交 聯劑，WVA044為引發劑，采用RAFT-步反應制備含Boc保護集團的超支化HPM共聚物； (2)取步驟(1)制備的超支化ΗΡΜΑ共聚物用FTA脫Boc保護，然后在NH4〇Ac緩沖液中通過 共價鍵腺鍵將D0X · HC1與超支化聚合物相偶聯。9. 根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中各物料的摩爾比為 [HPMA]/ [MA-GG-NHNHBoc]/[MA-GFLGK-MA]/[CTA]/[VA044]=128: 142: 57: 7: 3: 1〇10. -種如權利要1所述的偶聯物的應用，其特征在于，將其用于制備抗腫瘤藥物，特別 是用于制備治療乳腺癌的藥物。
【文檔編號】A61P35/00GK105963706SQ201610237966
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月15日
【發明人】龔啟勇, 羅奎, 朱紅艷, 魏小麗
【申請人】四川大學