一種靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法及其應用
【專利摘要】本發明公開一種靶向性普魯士藍納米粒子制備方法及其應用，將透明質酸、六氰合鐵酸鉀和氯化亞鐵、硫酸亞鐵銨或硫酸亞鐵經過一步法合成靶向性普魯士藍納米粒子。本發明的制備方法操作簡單、方便，原料安全易得，制備的納米粒細胞毒性小、生物相容性好、在水溶液中具有良好的分散性，在紅外及近紅外區域有良好吸收，具有良好的光熱轉換效率；且具有良好的光敏作用，在紅外或近紅外光的照射下，產生單線態氧。本發明制備的普魯士藍納米粒子可以靶向用于光熱、光動力治療，在癌癥治療領域具有廣闊的應用前景。
【專利說明】
一種靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法及其應用
技術領域
[0001]本發明涉及生物醫藥材料領域，特別是一種靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤光熱治療新療法(Photothermal therapy，PTT)和光動力療法(Photodynamictherapy，PDT)，一種通過光熱轉換劑將光能轉化為熱能，光動力試劑在光的照射下產生活性氧進而使腫瘤組織達到一定溫度或者活性氧水平提高，繼而殺死癌細胞的新型癌癥治療方法。光熱治療由于其具有選擇性高、全身性毒性低等獨特優點，成為一種有望替代傳統癌癥治療方法的新型癌癥治療手段。然而，這一新興領域的研究工作還存在一些問題和不足，傳統的光熱治療轉換劑主要是金納米材料和碳納米材料，這些納米材料一般具有成本高、制備復雜、生物安全性得不到保證、光熱穩定性和腫瘤靶向性較差等不足，大大限制了上述納米材料在光熱治療等領域的實際應用。因此，開發具有制備簡單、成本低、結構穩定、生物安全性可靠并且具有一定腫瘤靶向性的新型光熱轉換劑納米材料已近成為國內外學者的研究熱點，并正引領新一輪的研究熱潮。
[0003]普魯士藍，一種古老的藍色藍料，被美國食品藥品監督局認證臨床應用于放射性治療及解毒劑。普魯士藍在人體循環系統具有良好的穩定性，尤為重要的是其在近紅外區域具有強的吸收，良好光熱轉換穩定性，還具有毒性小、生物相容性好等優點，在光熱治療，藥物載體等方面擁有極大的應用前景，廣泛受到人們的關注。而這其中，通過簡單、經濟的方法高效地合成具有多功能性的普魯士藍納米粒子成為當代材料化學領域的研究熱點之一。近年來，多功能的普魯士藍納米粒子的合成取得了長足的發展，而大部分合成的普魯士藍納米粒子都未進行靶向性修飾，這使得在應用過程中普魯士藍納米粒子沒能準確到達癌細胞位置，光熱治療過程存在盲目性，同時，有關普魯士藍納米粒的光動力仍未報道，制備出一種具有主動靶向的普魯士藍納米粒子，并研究其光動力效果尤為重要。
[0004]透明質酸，一種酸性粘多糖，具有良好的CD44受體靶向性。而大部分的癌細胞是CD44過度表達的。利用其良好的CD44受體靶向性對普魯士藍納米粒子進行修飾具有廣闊的應用前景。透明質酸修飾的普魯士藍納米粒子不僅具有普魯士藍納米粒子本身具有的性質，還具有良好的靶向性，這個優勢將大大增強它在光熱治療中及其他領域的應用。
[0005]申請公布號為CN105477648A的發明專利申請“一種淋巴靶向的類普魯士藍納米顆粒及其制備方法”，該方法通過在二乙三胺五乙酸上交聯上透明質酸并螯合在釓離子上，形成穩定的表面帶有透明質酸的具有淋巴靶向的類普魯士藍納米顆粒。該納米顆粒表面包裹透明質酸，不僅具有保護類普魯士藍不受生理環境影響，而且具有淋巴靶向作用，但該方法反應過程較為復雜，對各環節的把控要求高，不易進行產業化推廣。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法及其應用，本制備方法操作簡單，有利于普魯士藍納米粒子的產業化推廣。
[0007]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0008]一種靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法，包括以下步驟:
[0009]S1.將六氰合鐵酸鉀和透明質酸水溶液混合均勻，得混合液A，備用；
[0010]S2.將亞鐵鹽和透明質酸水溶液混合均勻，得混合液B;
[0011 ] S3.將混合液B緩慢加入到混合液A中，加熱，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液。
[0012]進一步的，獲得含普魯士藍納米粒子的水溶液后制備靶向性普魯士藍納米粒子還包括以下步驟:
[0013]S4.含普魯士藍納米粒子的水溶液加入丙酮，離心，獲得固體A;
[0014]S5.將固體A用水洗，再離心，得到固體B;
[0015]S6.干燥固體B，即得到靶向性普魯士藍納米粒子。
[0016]作為優選，步驟SI中，透明質酸與鐵離子的摩爾比為1:1?4，鐵離子的濃度為0.2?0.4mol/L—1O
[0017]作為優選，步驟S2中，透明質酸與亞鐵離子的摩爾比為1:1?4，亞鐵離子的濃度為
0.2?0.4mol/L0
[0018]作為優選，所述亞鐵鹽為氯化亞鐵、硫酸亞鐵和硫酸亞鐵銨中的一種。
[0019]上述步驟S3中，更優選的具體操作步驟為:將混合液A緩慢加入到混合液B中，加熱并攪拌，加熱溫度為40?60°C，反應時間為4?6h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液。
[0020]上述步驟S4中，更優選的具體操作步驟為:向含普魯士藍納米粒子的水溶液加入丙酮20?60mL，用離心機離心，獲得固體A。
[0021]上述步驟S6中，干燥以采用真空干燥為佳。
[0022]本發明的另一個目的是提供通過以上所述的方法制備得到的具有靶向性的普魯士藍納米粒子。
[0023]本發明進一步提供了以上所述的靶向性普魯士藍納米粒子在靶向光熱治療藥物和/或光動力治療藥物中的應用。
[0024]進一步，所述藥物的適應癥為⑶44高表達的癌細胞腫瘤。
[0025]進一步的，所述藥物為液體制劑時，靶向性普魯士藍納米粒子濃度為25?10yg/
mlo
[0026]所述CD44高表達的癌細胞包括小鼠乳腺癌細胞、小鼠黑色素瘤細胞，實際應用時的光照時間為I?15min。
[0027]本發明的有益效果為:(I)通過本發明的方法制備得到的普魯士藍納米粒子細胞毒性小，在紅外及近紅外區域有良好吸收，具有良好的光熱轉換效率;在紅外或近紅外光的照射下，產生單線態氧，具有良好的光敏作用，另外還具有良好的靶向性；(2)本發明用透明質酸對普魯士藍納米粒子進行修飾，可增加普魯士藍納米粒子的生物相容性，優化其在水中的分散性，增強普魯士藍納米粒子的靶向性，這將進一步拓展普魯士藍納米粒子在光熱、光動力治療領域的應用范圍；(3)本方法制備普魯士藍納米粒子的原料來源豐富，且本方法操作簡單、方便，控制環節少，有利于普魯士藍納米粒子的產業化推廣；(4)本發明制備的普魯士藍納米粒子可以靶向用于光熱、光動力治療，在癌癥治療領域具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明的普魯士藍納米粒的水溶液與純水隨光照時間的對比溫度變化圖。
[0029]圖2為本發明的普魯士藍納米粒靶向性進入不同細胞的電感耦合等離子體質譜儀(ICP)定量檢測鐵元素含量圖。
[0030]圖3為I，3_二苯基異苯并呋喃(DPBF)檢測本發明的普魯士藍納米粒在光照條件下活性氧產生圖
【具體實施方式】
[0031]制備實施例1
[0032]預準備:稱取0.378g透明質酸，加入20ml水，溶解完全后平均分成兩份。
[0033]S1.稱取0.658g K3[Fe(CN)6]加入其中一份上述溶解后的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液A;
[0034]S2.稱取0.784g(NH4)2Fe(S04)2.6H20加入另一份上述溶解好的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液B;
[0035]S3.將混合液B緩慢滴加到混合液A中，加熱并攪拌，加熱溫度為60 V，反應5h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液；
[0036]S4.在制備的藍色溶液中加入40mL丙酮，采用離心機進行離心，得藍色固體A ；
[0037]S5.用蒸餾水將藍色固體A進行洗滌，再離心，重復3?8次，得到藍色固體B;
[0038]S6.采用真空干燥藍色固體B，即得到本發明的靶向性普魯士藍納米粒子。
[0039]制備實施例2
[0040]預準備:稱取0.378g透明質酸，加入20ml水，溶解完全后平均分成兩份。
[0041 ] S1.稱取0.658g K3[Fe(CN)6]加入其中一份上述溶解后的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液A;
[0042]S2.稱取0.556g FeSO4.7H20加入另一份上述溶解好的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液B;
[0043]S3.將混合液B緩慢滴加到混合液A中，加熱并攪拌，加熱溫度為60 V，反應5h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液；
[0044]S4.在制備的藍色溶液中加入40mL丙酮，采用離心機進行離心，得藍色固體A ；
[0045]S5.用蒸餾水將藍色固體A進行洗滌，再離心，重復3?8次，得到藍色固體B;
[0046]S6.采用真空干燥藍色固體B，即得到本發明的靶向性普魯士藍納米粒子。
[0047]制備實施例3
[0048]預準備:稱取0.378g透明質酸，加入20ml水，溶解完全后平均分成兩份。
[0049]S1.稱取0.658g K3[Fe(CN)6]加入其中一份上述溶解后的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液A;
[0050]S2.稱取0.398g FeCl2.4H20加入另一份上述溶解好的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液B;
[0051 ] S3.將混合液B緩慢滴加到混合液A中，加熱并攪拌，加熱溫度為60 V，反應5h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液；
[0052]S4.在制備的藍色溶液中加入40mL丙酮，采用離心機進行離心，得藍色固體A ；
[0053]S5.用蒸餾水將藍色固體A進行洗滌，再離心，重復3?8次，得到藍色固體B;
[0054]S6.采用真空干燥藍色固體B，即得到本發明的靶向性普魯士藍納米粒子。
[0055]制備實施例4
[0056]預準備:稱取1.512g透明質酸，加入20ml水，溶解完全后平均分成兩份。
[0057]S1.稱取0.658g K3[Fe(CN)6]加入其中一份上述溶解后的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液A;
[0058]S2.稱取0.784g(NH4)2Fe(S04)2.6H20加入另一份上述溶解好的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液B;
[0059]S3.將混合液B緩慢滴加到混合液A中，加熱并攪拌，加熱溫度為60 V，反應5h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液；
[0060]S4.在制備的藍色溶液中加入40mL丙酮，采用離心機進行離心，得藍色固體A ；
[0061]S5.用蒸餾水將藍色固體A進行洗滌，再離心，重復3?8次，得到藍色固體B;
[0062]S6.采用真空干燥藍色固體B，即得到本發明的靶向性普魯士藍納米粒子。
[0063]制備實施例5
[0064]預準備:稱取1.512g透明質酸，加入20ml水，溶解完全后平均分成兩份。
[0065]S1.稱取0.658g K3[Fe(CN)6]加入其中一份上述溶解后的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液A;
[0066]S2.稱取0.556g FeSO4.7H20加入另一份上述溶解好的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液B;
[0067]S3.將混合液B緩慢滴加到混合液A中，加熱并攪拌，加熱溫度為60 V，反應5h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液；
[0068]S4.在制備的藍色溶液中加入40mL丙酮，采用離心機進行離心，得藍色固體A ；
[0069]S5.用蒸餾水將藍色固體A進行洗滌，再離心，重復3?8次，得到藍色固體B;
[0070]S6.采用真空干燥藍色固體B，即得到本發明的靶向性普魯士藍納米粒子。
[0071 ] 制備實施例6
[0072]預準備:稱取1.512g透明質酸，加入20ml水，溶解完全后平均分成兩份。
[0073]S1.稱取0.658g K3[Fe(CN)6]加入其中一份上述溶解后的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液A;
[0074]S2.稱取0.556g FeCl2.4H20加入另一份上述溶解好的透明質酸水溶液，攪拌溶解，得混合液B;
[0075]S3.將混合液B緩慢滴加到混合液A中，加熱并攪拌，加熱溫度為60 V，反應5h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液；
[0076]S4.在制備的藍色溶液中加入40mL丙酮，采用離心機進行離心，得藍色固體A ；
[0077]S5.用蒸餾水將藍色固體A進行洗滌，再離心，重復3?8次，得到藍色固體B;
[0078]S6.采用真空干燥藍色固體B，即得到本發明的靶向性普魯士藍納米粒子。
[0079]上述制備實施例1?6制備的產物都能良好分散于水溶液中，且能穩定存在。
[0080]應用實施例1
[0081]將上述實施例1?3制備所得的普魯士藍納米粒配置成不同濃度水溶液，用808nm激光(lW/cm—2)照射，用紅外熱像儀記錄溶液的溫度隨光照時間的變化。記錄結果見圖1。
[0082]由圖1看出，隨著光照時間的增加，當濃度為100yg/ml時，普魯士藍納米粒溶液的溫度顯著升高，并在10分鐘內溫度升高了 38.3°C，而純水在相同光照條件下僅升高不到I°C，且普魯士藍納米粒的光熱效果呈現濃度依賴性。證實本發明的普魯士藍納米粒應用于光熱治療具有良好的光熱效果。
[0083]應用實施例2
[0084]將上述實施例1?3制備所得的普魯士藍納米粒配置成濃度為100yg/ml的水溶液，在不同時間段加入到貼壁狀態良好的CD44高表達的小鼠乳腺癌細胞(4T1)、小鼠黑色素瘤細胞(B16)和CD44低表達的小鼠成纖維正常細胞(L929)細胞中，孵育培養不同時間，然后收集細胞，并采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP)對其細胞內鐵元素含量進行分析，分析結果見圖2。
[0085]由圖2可以看出，透明質酸修飾過的普魯士藍納米粒對CD44高表達的癌細胞具有良好的靶向性，進入細胞內的量明顯高于CD44低表達的L929正常細胞。證實本發明制備的普魯士藍納米粒具有良好的靶向性。
[0086]應用實施例3
[0087]將上述實施例1?3制備所得的普魯士藍納米粒配置成濃度為50yg/ml的水溶液，加入活性氧檢測試劑DPBF，在近紅外或者紅外激光(808nm或者650nm)的照射下進行紫外測試，測試結果見圖3。
[0088]由圖3可以看出，隨著光照時間的增加，DPBF在418nm處的特征吸收峰逐漸下降，這是由于DPBF在活性氧的條件下被活性氧氧化造成的，實驗結果說明，合成的普魯士藍納米粒具有光敏作用，在光的照射下具有光動力效應。
【主權項】
1.靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 51.將六氰合鐵酸鉀和透明質酸水溶液混合均勻，得混合液A，備用； 52.將亞鐵鹽和透明質酸水溶液混合均勻，得混合液B; 53.將混合液B緩慢加入到混合液A中，加熱，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液。2.根據權利要求1所述的靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法，其特征在于: 獲得含普魯士藍納米粒子的水溶液后還包括以下步驟: 54.含普魯士藍納米粒子的水溶液加入丙酮，離心，獲得固體A; 55.將固體A用水洗，再離心，得到固體B； 56.干燥固體B，即得到靶向性普魯士藍納米粒子。3.根據權利要求1所述的靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法，其特征在于: 步驟SI中，透明質酸與鐵離子的摩爾比為1:1?4，鐵離子的濃度為0.2?0.4mol/L。4.根據權利要求1所述的靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法，其特征在于: 步驟S2中，透明質酸與亞鐵離子的摩爾比為1:1?4，亞鐵離子的濃度為0.2?0.4mol/L05.根據權利要求1所述的靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法，其特征在于: 所述亞鐵鹽為氯化亞鐵、硫酸亞鐵和硫酸亞鐵銨中的一種。6.根據權利要求1所述的靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法，其特征在于: 步驟S3的具體操作步驟為:將混合液B緩慢加入到混合液A中，加熱并攪拌，加熱溫度為40?60°C，反應時間為4?6h，得到含普魯士藍納米粒子的水溶液。7.權利要求1?6任一項所述的靶向性普魯士藍納米粒子的制備方法制備得到的靶向性普魯士藍納米粒子。8.如權利要求7所述的靶向性普魯士藍納米粒子在靶向光熱治療藥物和/或光動力治療藥物中的應用。9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述藥物的適應癥為CD44高表達的癌細胞腫瘤。10.根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于:所述藥物為液體制劑時，靶向性普魯士藍納米粒子濃度為25?100yg/ml。
【文檔編號】A61K47/36GK105963696SQ201610291826
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】蔣邦平, 沈星燦, 周波
【申請人】廣西師范大學