瑪咖提取物的應用及含有瑪咖提取物的免疫佐劑和疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種瑪咖提取物的應用及含有瑪咖提取物的免疫佐劑和疫苗，瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用。本發明用瑪咖提取物作為流感疫苗佐劑，具有良好的有效性，能提高抗原的免疫原性，增強免疫效果，其安全性高、副作用小；解決了目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產供應量有限，難以滿足疫情爆發時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間慢等諸多問題。瑪咖提取物制備方法簡便，疫苗質量容易控制。
【專利說明】
瑪咖提取物的應用及含有瑪咖提取物的免疫佐劑和疫苗
技術領域
[0001]本發明涉及瑪咖提取物的應用及含有瑪咖提取物的免疫佐劑和疫苗，屬于生物技 術領域。
【背景技術】
[0002]瑪咖屬于十字花科獨行菜屬一年或兩年生草本植物，原產于秘魯海拔3500~ 4500m的南美安第斯山區。瑪咖因其可媲美人參的功效，在南美被稱為"秘魯人參"，在我國 又被稱為瑪卡，是藥食兼用的植物。瑪咖地下膨大多汁的儲藏根形似蘿卜，是具有商業價值 的主要食用部分。在過去的20年當中，世界各地對瑪咖的了解越來越深，關注日益增多，從 2005年開始，瑪咖成為了 7中秘魯標志產品之一，瑪咖的種植面積也逐漸擴張，我國西部部 分地區的自然條件適合瑪咖的生長，現在我國云南、新疆、吉林和西藏等省（區）都實現了引 種，并且經濟和社會效益很好。
[0003] 瑪咖含有豐富的碳水化合物、蛋白質、纖維、脂肪、礦物質、維生素等豐富的營養物 質，瑪咖干粉中組蛋白含量較高，達8.87%，云南栽培瑪咖根的蛋白質含量可達16.7 X l〇4mg/kg，顯著高于秘魯瑪咖的蛋白質含量。瑪咖中含有17種氨基酸，其中人體必需氨基酸 有8種，含量占氨基酸總量的32.8%。其中礦物質含量較多的為鉀、鈣、鐵、鋅。瑪咖所含有的 營養成分能全面、合理的供給人體所需的各種營養素。瑪咖中還含有許多次生代謝產物，瑪 咖生物堿、瑪咖酰胺、瑪咖烯、羥基吡啶衍生物、芥子油苷和異硫氰酸酯、留醇類、多酚類以 及其他微量成分，足以解釋瑪咖強大的生理功能和生物活性。
[0004] 現代許多研究證明，瑪咖具有抗氧化、增強生育能力、改善性功能、抗疲勞、調節內 分泌以及抗壓力和抗腫瘤等作用。并對風濕癥、呼吸疾病、抑郁癥、貧血癥等有很好的治療 效果。
[0005] 佐劑是一種加入疫苗后能顯著增強抗原的免疫原性，而本身無免疫原性的物質， 將其應用于流感疫苗，能顯著增強疫苗的免疫效果，減少抗原的用量，從而有利于流感疫苗 的生產效率的提高與生產成本的降低，擴大接種人群數量，更好的保護易感人群，降低疫苗 生產企業因產量不足而帶來的巨大壓力。以應對突然爆發的流感疫情，佐劑在新型流感疫 苗的研究與開發中具有極為重要的作用。目前應用較為廣泛的佐劑主要有：鋁佐劑(氧化 鋁、氫氧化鋁、磷酸鋁）、MF59(是一種包含1%的鯊烯）、0.5%的Tween80和0.5%的三油酸聚山 梨脂的水包油乳液）、LTK63和新型佐劑。
[0006] 目前上市流感疫苗使用的佐劑主要是鋁佐劑和MF59。但事實上鋁佐劑對蛋白亞單 位疫苗誘導抗體產生的能力較弱，不能有效地誘導免疫應答，其不能誘導產生Thl型反應， 干擾細胞免疫，并阻斷CD8 + CTL的激活，使得疫苗的免疫保護作用不全面，不持久，在某些 情況下還會產生與過敏反應有關的IgE，其副作用難以避免;MF59作為佐劑使用時，在增加 免疫原性的同時也增強了反應原性在成年人中出現了局部疼痛、發熱、紅斑、硬結、肌痛等 癥狀的增加。另外，一些新型佐劑正處于研發中，像多聚脫氧核苷酸類、抗菌肽類、細胞因子 類、多糖類佐劑，但進展都比較緩慢。因此，隨著各種新發流感在全世界的爆發和對人感染 性的增強，加快了新型流感疫苗的研究，尋求更高安全性和免疫原性的佐劑仍然是流感疫 苗發展的一個需要。
[0007] 佐劑發揮作用是由于能增強抗原的免疫原性、提高疫苗效果，因此佐劑一般可在 多種疫苗中進行使用，如目前的鋁佐劑。所以佐劑的研究不僅對流感，而且對其它感染性疾 病的防治也有很高的價值。
[0008] 流感是由流感病毒引起的一種可造成大規模流行的急性呼吸道傳染病，它的特點 是短期內爆發，然后迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發流行及散 發，發病率高并伴有一定的死亡率，一旦流感疫情爆發，將會對人類的生命健康帶來巨大的 威脅。預防流感疫情爆發的最主要也是最有效的手段就是接種流感疫苗。由于流感病毒變 異很快，通常每年的流行類型都有所不同，生產企業一般都在世界衛生組織(WHO)指導下選 擇流感病毒毒株進行疫苗生產，每年接種最新的流感疫苗才能達到預防的效果。一旦流感 病毒變異造成大規模流行或者是世界性流行，疫苗需求量必將猛增，但目前由于受流感疫 苗生產工藝的限制，短時間內難于提供大規模流行所需的足量疫苗，因此，應用免疫佐劑， 減少疫苗用量并提高免疫效果，是應對大規模流行期間疫苗量不足的途徑之一。
[0009] 經查閱文獻，目前未發現關于瑪咖提取物應用于免疫佐劑研究的報道。
【發明內容】
[0010] 為解決目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產供應量有限，難以滿足疫情 爆發時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間慢等諸多問題，本發明提供瑪咖提取 物的應用及含有瑪咖提取物的免疫佐劑和疫苗，能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗抗原 用量。
[0011] 本發明通過下列技術方案實現:瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用。
[0012] 進一步地，瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用。
[0013] 所述瑪咖提取物為瑪咖乙醇提取物或者瑪咖水提取物，或者以常規溶劑提取的提 取物，常規溶劑如甲醇、丙酮、乙酸乙酯等。
[0014] 瑪咖乙醇提取物經以下操作提取： 將瑪咖粉碎成瑪咖粉，用乙醇經常規冷浸、溫浸或者加熱回流提取，再經過濾后取濾 液，對濾液進行減壓回收乙醇，剩余物經真空冷凍干燥或噴霧干燥，即得瑪咖乙醇提取物； 其中，乙醇的質量濃度為75~99.7%，乙醇加入量是瑪咖粉質量的5~50倍;冷浸是在室溫 下浸泡1~10天，溫浸是在40~60°C下浸泡1~3小時，提取次數為1~3次；加熱回流提取是 在30~75°C下，回流提取1~3次，每次30~180分鐘；真空冷凍干燥的冷凝溫度在-20~-50 °C下預凍3~16小時，真空度5~20KPa;噴霧干燥進風溫度100~300°C，出風溫度30~140 cC。
[0015]瑪咖水提取物經以下操作提取： 將瑪咖粉碎成瑪咖粉，用蒸餾水經常規冷浸、溫浸或超聲波輔助提取，再經過濾后取濾 液，進行噴霧干燥或冷凍干燥，得瑪咖水提取物;其中，蒸餾水的加入量是瑪咖粉質量的5~ 100倍，冷浸是在室溫下浸泡1~10天，溫浸是在40~60 °C下浸泡1~3小時，提取次數為1~3 次;超聲波輔助提取是在溫度20~60°C、超聲功率100~650W、超聲頻率19~23KHz、超聲波 輸出功率70~100%的條件下進行，提取次數1~3次，每次20~120分鐘；真空冷凍干燥的冷 凝溫度在-20~-50 °C下預凍3~16小時，真空度5~20KPa;噴霧干燥進風溫度100~300 °C， 出風溫度30~140 °C。
[0016] 本發明的另一目的在于提供一種含有瑪咖提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其特征 在于:所述含有瑪咖提取物的免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為50:1~150000:1。
[0017] 本發明提供的含有瑪咖提取物的免疫佐劑與傳統氫氧化鋁佐劑相比，具有以下優 占. 1)瑪咖是一種天然中草藥，常作為保健品使用。在以往的研究中展現出了多種保健功 效，將其作為流感疫苗佐劑應用，安全性高、副作用低。在研究中發現，用含瑪咖提取物的流 感疫苗注射小鼠，小鼠未見全身不良反應，活動及飲水進食未見明顯影響，而用含氫氧化鋁 佐劑的流感疫苗注射小鼠，則偶見注射局部出現紅斑、腫脹結節的現象。
[0018] 2)用瑪咖提取物制備的佐劑用在流感疫苗上，不僅佐劑效果明顯，而且疫苗質量 容易控制；而以氫氧化鋁為佐劑制備的流感疫苗，在制備和存儲過程中，影響因素較多，對 疫苗的質量較難控制。
[0019] 3)用瑪咖提取物作為流感疫苗佐劑，展現出了良好的有效性，能夠更好的提高抗 原的免疫原性，增強免疫效果。
[0020] 4)瑪咖提取物制備方法簡便，較為經濟、環保。
[0021] 本發明用瑪咖提取物作為流感疫苗佐劑，具有良好的有效性，能提高抗原的免疫 原性，增強免疫效果，其安全性高、副作用小;解決了目前免疫佐劑單一，副作用難以避免， 疫苗生產供應量有限，難以滿足疫情爆發時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間 慢等諸多問題。瑪咖提取物制備方法簡便，疫苗質量容易控制。
【附圖說明】
[0022] 圖1為不同接種組在56天內的血凝抑制抗體效價變化圖； 圖2為不同接種組在接種后7天內的體重增長情況。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合實施例對本發明做進一步說明，但并不以此來限定本發明。
[0024] 本發明實施例所用的流感病毒疫苗原液為本所自制，并且是按照《中國藥典》三部 2010版中所述流感病毒裂解疫苗制造方法制備的，按照《中國藥典》三部2010版所述項檢 定標準檢驗合格的流感病毒疫苗原液。
[0025] 本發明實施例中未特別指明的組分均為市購產品，所用設備或儀器均是常規的。
[0026] 實施例1 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用;其中，瑪咖提取物為瑪咖乙醇提取物，經以下操 作提取： 將瑪咖粉碎成瑪咖粉l〇〇g，用質量濃度為95%乙醇1000 ml經常規加熱回流提取，再經過 濾后取濾液，對濾液進行減壓回收乙醇，剩余物經真空冷凍干燥，即得瑪咖乙醇提取物；其 中，加熱回流提取是在50°C下，回流提取3次，每次60分鐘;真空冷凍干燥的冷凝溫度在-20 °C下預凍15小時，真空度6KPa。
[0027] 瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用，是將瑪咖提取物直接作為佐劑（即瑪咖提 取物占100%)，制備含有瑪咖提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有瑪咖提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質量比為15984:1。
[0028] 實施例2 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用;其中，瑪咖提取物為瑪咖水提取物，經以下操作 提取： 將瑪咖粉碎成瑪咖粉100g，用1000 ml蒸餾水經常規超聲波輔助提取，再經過濾后取濾 液，進行噴霧干燥，得瑪咖水提取物;其中，超聲波輔助提取是在溫度60 °C、超聲功率130W、 超聲頻率20KHz、超聲波輸出功率100%的條件下進行，提取次數3次，每次35分鐘;噴霧干燥 進風溫度180°C，出風溫度120°C。
[0029] 瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用，是將瑪咖提取物直接作為佐劑（即瑪咖提 取物占100%)，制備含有瑪咖提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有瑪咖提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質量比為150000:1。
[0030] 實施例3 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用;其中，瑪咖提取物為常規溶劑提取的提取物。
[0031] 瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用，具體是制成含有瑪咖提取物的免疫佐劑的 流感疫苗，其中，含有瑪咖提取物的免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為2000:1，即 瑪咖提取物 5mg/ml、 流感疫苗血凝素 2.5μg/ml。
[0032] 實施例4 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用;其中，瑪咖提取物為瑪咖乙醇提取物。
[0033]瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用，具體是制成含有瑪咖提取物的免疫佐劑的 流感疫苗，其中，含有瑪咖提取物的免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為1000:1，即 瑪咖提取物 5mg/ml 流感疫苗血凝素 5μg/ml。
[0034] 實施例5 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用;其中，瑪咖提取物為瑪咖水提取物。
[0035] 瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用，是將瑪咖提取物直接作為佐劑（即瑪咖提 取物占100%)，制備含有瑪咖提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有瑪咖提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為333:1，即 瑪咖提取物 2mg/ml 流感疫苗血凝素 6μg/ml。
[0036] 實施例6 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用;其中，瑪咖提取物為以甲醇提取的提取物。
[0037] 瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用，是將瑪咖提取物直接作為佐劑（即瑪咖提 取物占100%)，制備含有瑪咖提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有瑪咖提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為111:1，即 瑪咖提取物 lmg/ml 流感疫苗血凝素 9μg/ml。
[0038] 實施例7 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用;其中，瑪咖提取物是以丙酮提取的提取物。
[0039] 瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應用，是將瑪咖提取物直接作為佐劑（即瑪咖提 取物占100%)，制備含有瑪咖提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有瑪咖提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為50:1，即 瑪咖提取物 0.5mg/ml 流感疫苗血凝素 10μg/ml。
[0040] 免疫接種及檢測： 1)含有瑪咖提取物免疫佐劑的流感疫苗的制備，用上述實施例6所得的流感疫苗進行 免疫接種，具體制備方法為： a) 稱瑪咖提取物IOOmg，溶于2ml生理鹽水中，得濃度為50mg/ml的瑪咖提取物溶液，備 用； b) 取1)的濃度為50mg/ml的瑪咖提取物溶液Iml加入到4ml生理鹽水中，得濃度為IOmg/ ml的瑪咖提取物溶液，備用； c) 取2)濃度為10mg/ml瑪咖提取物溶液Iml加入到4ml生理鹽水中，得濃度為2mg/ml的 瑪咖提取物溶液，備用； d) 取Iml血凝素含量為126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液加入到6ml生理鹽水中，得到 濃度為18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液，備用； e) 取3)濃度為2mg/ml的瑪咖提取物溶液2ml加入到2ml血凝素含量為18ug/ml的H3N2流 感病毒抗原稀釋液中，制得瑪咖提取物免疫佐劑的流感疫苗A。
[0041] 2)制備下列不同的佐劑或溶液： a) 取0.5ml血凝素含量為126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液加入到5.98ml生理鹽水 中，得到濃度為9.72ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液，備用； b) 取Iml血凝素含量為126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液加入到6ml生理鹽水中，得到 濃度為18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液，備用； c) 2ml生理鹽水，備用； d) 5ml生理鹽水，備用； 3)制備下列不同的疫苗： A) 取14mg/ml的氫氧化鋁佐劑0.25ml加入到3.25ml步驟a)所得濃度為9.72ug/mlH3N2 流感病毒抗原稀釋液中，混勻，得到含有氫氧化鋁佐劑的流感病毒疫苗樣品B; B) 取步驟b)所得濃度為18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液2ml與步驟c)生理鹽水混合， 得到無佐劑的流感疫苗樣品C; C) 步驟d)的生理鹽水為不加疫苗抗原的生理鹽水對照組D。
[0042] 所配置的上述樣品A、B、C疫苗中血凝素含量均為9ug/ml，其中瑪咖提取物佐劑流感疫 苗樣品A中：瑪咖提取物的質量比為100%，瑪咖提取物免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比 為 111:1〇
[0043] 用上述A、B、C、D四個不同的樣品分別免疫標準體重雄性BALB/c小鼠，每組10只，每只肌 肉注射200ul，第1天接種一針，第21天補種一針。于首次免疫后7天、14天、21天、28天、35天、 42天、56天取尾血，分離血清測定血凝抑制效價，結果顯示不同時間點瑪咖提取物佐劑組與 單獨疫苗組相比差異有統計學意義，說明瑪咖提取物作為疫苗佐劑具有較好的佐劑效果； 在抗體最高時即35天時瑪咖提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組相比差異無統計學意義，說明 在抗體產生的峰值時瑪咖提取物佐劑與氫氧化鋁佐劑效果相當，但在初免后的第一周即第 7天時以及二免后的第一周即第28天時，瑪咖提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組相比有顯著 差異，可初步說明瑪咖提取物佐劑的免疫增強作用產生的時間先于氫氧化鋁佐劑組以及單 獨疫苗組。具體結果見表1、表2及附圖1。
[0044]表1不同接種組在56天內的血凝抑制抗體效價變化
表2不同接種組在56天內的血凝抑制抗體效價變化的單因素方差分析多重比較結果
于初免之日起7d內對各組小鼠進行體重測量，并對7天內各組平均增長的體重進行計 算，所測結果顯示瑪咖提取物免疫佐劑組小鼠體重增長正常，與其他組相比，體重增長無顯 著性差異，具體結果見表3、表4及附圖2。
[0045]表3不同接種組在接種后7天內的體重增長情況
【主權項】
1. 瑪咖提取物在制備免疫佐劑中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述瑪咖提取物在制備流感疫苗中的應 用。3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于:所述瑪咖提取物為瑪咖乙醇提取物或 者瑪咖水提取物，或者以常規溶劑提取的提取物。4. 一種含有瑪咖提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其特征在于:含有瑪咖提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為50:1~150000:1。
【文檔編號】A61P31/16GK105963693SQ201610468707
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月25日
【發明人】李映波, 朱喆
【申請人】中國醫學科學院醫學生物學研究所