鳥苷酸結合蛋白5在制備抗病毒藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開了人源蛋白鳥苷酸結合蛋白(GBP5)蛋白的抗病毒作用。本發明證實流感病人臨床樣本血液及咽拭子中高表達GBP5，且流感病毒感染上調GBP5在A549細胞和PBMC中的表達；用過表達質粒pCMV?GBP5瞬時轉染人肺癌細胞，能誘導表達干擾素I型和III型干擾素，同時可以激活其下游基因OAS、PKR、Mx的表達。本發明首次發現GBP5具有抗病毒的生物學功能，為臨床上病毒感染誘發的細胞因子檢測提供了新靶標，也為臨床治療病毒感染提供潛在的策略。
【專利說明】
鳥苷酸結合蛋白5在制備抗病毒藥物中的應用
技術領域
[0001]本發明屬于醫藥技術領域，涉及鳥苷酸結合蛋白5(GBP5)的藥物新用途，具體是其 在制備抗病毒藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 鳥苷酸結合蛋白（guanylate binding proteins ,GBPs)最早發現由干擾素γ誘導 產生的，是干擾素誘導蛋白（interferon stimlate gene, ISG)的一員。干擾素γ誘導包括 Mx蛋白在內的大量三磷酸鳥苷酶(Guanosine triphosphate enzyme ,GTPase)，這些GTP酶 包括p47免疫相關GTP酶（immunity-related GTPase，IRG)和鳥苷酸結合蛋白（guanylate binding proteins,GBP) XBP蛋白家族目前已經鑒定出11種鼠源的GBP蛋白以及7種人源的 GBP蛋白。人源鳥苷酸結合蛋白5屬于干擾素γ誘導的p65三磷酸鳥苷酶家族，與GTP、⑶P和 GMP有較強的親緣關系，具有與鳥嘌呤結合的能力。GBP5被證明對γ磷酸基、β磷酸基有較強 的連續水解功能。近年來的一些研究表明GBP5能促進炎癥小體的形成，刺激炎癥因子的表 達。
[0003] I型干擾素包括IFNa、IFNP、IFN-δ、IFN-ε、IFN-ζ、IFN-K、IFN-v、IFN-τ、和IFN- ω。I 型干擾素運用兩條信號通路，Toll樣受體(TLRs)和胞衆受體(cytosolic receptor)。1型干 擾素有多種功能，例如抗病毒、抑制細胞生長和免疫調節作用。III型干擾素（Type III interferon，IFNs)，是一個新型的干擾素家族，位于第19號染色體ql3上，包括3種λ干擾素： IFN-λΙ (也被稱為 IL-29)、IFN-X2(也被稱為 IL-28A)和 IFN-X3(也被稱為 IL-28B)<JII 型干 擾素的信號轉導與I型干擾素類似，激活Jak/STAT信號通路，轉錄多種IFN相關的基因。III 型干擾素抑制病毒的復制保護宿主細胞免于病毒感染。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供鳥苷酸結合蛋白5(GBP5)在制備抗病毒藥物中的應用。
[0005] 本發明通過體外實驗發現流感病毒感染細胞后誘導GBP5上調，然后促進I型及III 干擾素表達;以及GBP5能刺激免疫細胞產生I型和III型干擾素而具有廣譜抗病毒功效。
[0006] 具體采用以下技術方案：
[0007] GBP5在細胞和分子水平上對流感病毒復制有抑制作用，預示GBP5可以做為臨床抗 病毒藥物而進一步研究開發。首先我們在季節性流感病人的臨床樣本包括血液PBMC和咽拭 子中發現了 GBP5的高表達，且與流感病毒呈正相關。然后我們在A549細胞、人外周血淋巴細 胞和人肺泡二型原代細胞系中，發現A型流感病毒感染時誘導GBP5在mRNA和蛋白水平上的 高表達。GBP5過表達能激活I型和III型干擾素以及干擾素誘導基因PKR、0AS、Mx的表達進而 抑制病毒的復制，包括EV71、VSV、IAV等病毒。總體實驗首次發現了 GBP5能促進免疫細胞產 生干擾素且激活下游通路而達到廣譜抗病毒效果的機制。
[0008]進一步地，本發明提供GBP5在制備檢測病毒感染的試劑盒中的應用。
[0009]本發明揭示了 GBP5的一種新的生物學功能，能夠誘導免疫細胞產生干擾素且激活 干擾素下游通路進而發揮廣譜抗病毒的作用，這一新發現為研制抗病毒藥物提供理論基 礎。
[0010]本發明采用體內天然存在的蛋白GBP5,促進人體免疫細胞產生干擾素，不僅保證 了其完整的生物學功能，而且避免了因引入異源性的成分而導致產生毒副作用。
【附圖說明】
[0011] 圖IA型流感病毒可以上調GBP5在病人和原代細胞中的表達
[0012] A. A型流感病人和正常人咽拭子樣本中GBP5的檢測
[0013] B.臨床水平上，A型流感病人咽拭子中GBP5與NP mRNA相關性分析 [0014] C.A/Hong Kong/H3N2感染PBMC細胞后，激活GBP5的表達
[0015] D.A/Hong Kong/H3N2感染ATII細胞后，激活GBP5的表達 [0016] E.A/Hong Kong/H3N2感染A549細胞后，激活GBP5的表達 [0017] F.A/Hong Kong/H3N2感染A549細胞后，激活GBP5蛋白水平的表達 [0018]圖2 GBP5在A549細胞中能激活干擾素通路
[0019] A.瞬時轉染GBP5蛋白到293T細胞中，IFN0，IL29(IFNAl)，ISRE，NF-KB的啟動子活 性增強
[0020] B.瞬時轉染GBP5蛋白到A549細胞中，I和III型干擾素mRNA水平表達上升 [0021] C.瞬時轉染GBP5蛋白到A549細胞中，干擾素下游產物0ASl、PKR、MxA的mRNA和蛋白 水平表達上升
[0022]圖3 GBP5蛋白具有廣譜抗病毒功能
[0023] A.A549細胞瞬時轉染GBP5蛋白后感染A/Hong Kong/H3N2病毒，病毒三種RNA復制 水平均被抑制
[0024] B.Huh7細胞瞬時轉染GBP5蛋白后感染VSV病毒24小時后收集上清檢測VSV病毒含 量
[0025] C.Huh7細胞瞬時共轉染GBP5和HBVl. 3倍體，36小時后收集上清檢測HBV的表面抗 原和核心抗原，HBV的復制水平被抑制
[0026] D.RD細胞瞬時轉染GBP5蛋白后感染EV71病毒12小時后收集細胞檢測病毒VPl蛋 白，病毒復制水平被抑制
【具體實施方式】
[0027]通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施 例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。
[0028]【實施例1】流感病毒感染上調GBP5在A549細胞和PBMC中的表達
[0029] 實驗材料 [0030] 1、臨床樣本
[0031 ] 健康人全血和咽拭子來自獻血志愿者，流感病人血清、咽拭子來自醫院。
[0032] 2、細胞、病毒毒株及質粒
[0033] 人肺癌細胞系A549和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中國典型培養 物保藏中心(CCTCC)提供，由本實驗室保存。ATII細胞購自武漢原生原代生物醫藥科技有限 公司。
[0034] 3、生化試劑及試劑盒
[0035] F12K培養基，RPMI 1640培養基和胎牛血清(Gibco-BRL,Gaithersburg ,MD)購自武 漢生命生物技術公司
[0036] 4、逆轉錄酶等
[0037] M-MLV逆轉錄酶和RNA抑制劑(RNas in)購自Promega公司
[0038] Trizol、dNTP和Oligo dT(18T)購自 Invitrogen公司
[0039] SYBR Green PCR Master Mix，購自ABI公司
[0040] 5、耗材及儀器
[0041 ]細胞培養板、細胞培養皿和細胞培養瓶購自Corning公司
[0042] 4°C高速離心機、小型高速離心機、二氧化碳細胞培養箱和細胞操作臺購自Herus
[0043] 超純水系統購自mi Ilipore
[0044] 熒光定量 PCR 系統 LightCycler480II 購自 Roche
[0045] RNA提取所使用的RNase free的各種型號槍頭和EP管購自Eppendorf
[0046] ELx800?酶標儀購自 BioTek⑧.Instruments，Inc
[0047] 常規PCR儀購自東勝創新 [0048]實驗方法
[0049] 1、哺乳動物細胞(貼壁)的培養
[0050] 細胞復蘇
[0051] 1)預先準備好37°C_38°C溫水，從液氮罐中取出需要復蘇的細胞，用眼科手術鑷子 固定，迅速置于水中，保證凍存管完全浸沒于水中，使其均勻受熱，直到凍存管內的細胞完 全融化；
[0052] 2)用酒精消毒凍存管；
[0053] 3)用吸管預先吸取5ml細胞培養基于T25細胞培養瓶中，再用新的吸管將融化的細 胞轉移到細胞瓶中并輕輕吹打一遍；
[0054] 4)蓋好細胞瓶蓋，將細胞瓶放置于細胞培養箱中，37°C，5%C02靜置培養；
[0055] 5)約6-8小時后(取決于不同的細胞），更換新培養基以消除細胞凍存液中存留的 DMSO對細胞生長的影響。
[0056]細胞的傳代和凍存
[0057] 1)當細胞長滿T25細胞瓶后，用吸管吸取培養基并棄去；
[0058] 2)加入IOml的PBS，輕柔洗滌細胞后用吸管吸取并棄去；
[0059] 3)用吸管吸取1-1.5ml胰酶，使其覆蓋住細胞瓶底部，將細胞瓶放入37°C，5%⑶2 細胞培養箱靜止3_5min(消化時間的長短取決于細胞種類）；
[0060] 4)顯微鏡觀察，貼壁細胞變圓并且全部從細胞瓶壁脫離；
[0061] 5)在細胞操作臺內，用吸管吸取約4ml培養基，加入細胞瓶內，輕柔的吹打，以吹散 細胞和中和胰酶的消化效果；
[0062 ] 6)用吸管吸取吹勻的細胞懸液(體積約1 /3-2/3)到另一新的細胞瓶，再補加5ml的 培養基，放置于細胞培養箱中，37 °C，5 % CO2的環境下繼續靜置培養。
[0063] 2、H3N2 感染 A549細胞
[0064] H3N2感染A549前，將含有胎牛血清的完全培養基換成無血清培養基，H3N2感染的 劑量為IMOI，感染或處理24h后，收集培養上清進行下一步實驗。
[0065] 3、哺乳動物細胞的轉染（以Lipofectamine 2000轉染6孔細胞培養板為例）
[0066] 1)細胞轉染前，調整細胞密度，達到85%_90%，并將含胎牛血清的全培養基更換 為無血清培養基；
[0067] 2)按轉染6孔板所需的質粒DNA的量和轉染試劑的量分別稀釋質粒DNA和轉染試 劑；6空板每空需4yg質粒DNA，用250yL opti-MEM稀釋，轉染試劑需要8yL，用250M1 opti-MEM稀釋；
[0068] 3)將稀釋好的轉染試劑溶液逐滴滴加到稀釋好的質粒DNA溶液中，一邊滴加一邊 輕彈EP管，注意，滴加的順序一定不能反；
[0069] 4)滴加混合好質粒DNA/轉染試劑混合物后，放置室溫孵育15-20min;
[0070] 5)孵育完成后，將質粒DNA/轉染試劑混合物滴加到細胞培養基中，輕柔混勻，放置 37 °C，5 % CO2細胞培養箱靜置培養4-6h;
[0071] 6)如果細胞株很敏感，培養培養4_6h后應更換培養液，除去轉染復合物并加入新 鮮含胎牛血清的完全培養基；
[0072] 7)培養24_48h后，根據實驗設計進行下一步實驗。
[0073] 4、逆轉錄熒光定量PCR檢測目的基因mRNA的表達水平
[0074] 1)逆轉錄反應體系如下
[0076] 逆轉錄反應條件：37 °C Ih，75°C IOmin
[0077] 2)Real_time 反應體系
[0078] ①目的基因的檢測引物和內參引物
[0079] GBP5:57-TCCTCGGATTATTGCTCGGC-37(sense)
[0080] 5/-CCTTTGCGCTTCAGCCTTTT-37(antisense)
[0081 ] NP:5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，（ sense)，
[0082] 5'-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3'（antisense)
[0083] GAPDH:5，-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3,（sense)
[0084] 5，-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3,（antisense)
[0085]②反應體系
[0089] 5、H3N2拷貝數快速檢測方法(Real time PCR)
[0090] 1)質粒濃度與拷貝數換算
[0091] ①在分光光度計上，取2yL質粒溶液測定其濃度，重復幾次，要求測得濃度值穩定， 初步估計質粒純度以及是否有蛋白質污染的狀況。
[0092] ②配制瓊脂糖凝膠，檢測質粒純度及條帶亮度。
[0093] ③根據以下公式將濃度換算為質粒拷貝數： amount X 6.022 X Kr1
[0094] 拷貝數=----- length X ? X 10' X 650
[0095] amount:0D值（ng/yL);
[0096] length:質粒DNA堿基對數目（bp)。
[0097] 2)標準品制備
[0098]將上述已知拷貝數的質粒用滅菌去離子水進行稀釋，如稀釋到lX101()C〇pieSAiL， 然后再進行倍比稀釋，濃度依次為 IO9，IO8，IO7，IO6，IO6，IO 5，IO4，IO3，IO2，IO1CopiesAiL t3 以 此作為測定H3N2拷貝數的標準品。
[0099] 3)ReaI-time PCR
[0100] ①反應體系：
[0102] ②NP檢測片段引物：
[0103] NP:5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，（ sense)，
[0104] 5'-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3'（antisense)
[0105] ③反應程序：
[0107] 實驗結果和討論
[0108] 用檢測試劑盒檢測18份正常人和19份A型流感病人血清中的GBP5含量，發現流感 病人組血清中的GBP5含量要明顯高于正常人組（圖1A)。收集了 19份A型流感病人和正常人 的咽拭子樣本后，提取mRNA后用realtime PCR進行拷貝數絕對定量分析，發現A型流感的特 異性基因NP與GBP5有顯著的相關性（圖1B)。當A型流感病毒IMOI A/Hong Kong/H3N2感染 PBMC，ATII和A549細胞24小時發現GBP5的RNA水平（圖IC，ID，1E)和蛋白水平（圖IF)的表達 量都有顯著提高。
[0109] 該部分實驗表明臨床結果中A型流感病人血清中GBP5水平要高于正常人，且咽拭 子定量分析表明NP與GBP5具有相關性。而流感病毒感染A549細胞后也能上調GBP5的表達則 為我們的后續實驗，即A549細胞可以作為細胞模型來研究流感病毒誘導GBP5表達的分子機 制。
[0110]【實施例2】GBP5可以激活干擾素及其下游通路反應
[0111] 實驗材料
[0112] 1、細胞
[0113] PBMC來自獻血志愿者、人肺癌細胞系A549來自保藏中心
[0114] 2、生化試劑及試劑盒
[0115] Mx、PKR、0AS 和 IFNaR2 抗體購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc.
[0116]人外周血單核細胞（PBMC)分離試劑pyrogen-free saline over Histopaque (Sigma, St. Louis ,MO ,USA)購自武漢天源生物技術公司
[0117] 熒光素酶活性報告基因試劑盒購自Promega公司
[0118] 3、耗材及儀器
[0119] 超聲破碎儀購自Fisher公司
[0120]凝膠成像系統、電泳儀及Western轉膜儀購自北京君意東方公司 [0121] Western掃描系統購自日本富士公司
[0122] 實驗方法
[0123] 1、逆轉錄熒光定量PCR檢測目的基因mRNA的表達水平
[0124] 1)細胞RNA提取及逆轉錄方法同前所述
[0125] 2)熒光定量PCR引物
[0126] IFNa:5，-TTTCTCCTGCCTGAAGGACAG-3，（sense)，
[0127] 5，-GCTCATGATTTCTGCTCTGACA-3,（antisense)
[0128] IFN0:5 '-AAAGAAGCAGCAATTTTCAGC-3 '（ sense)，
[0129] 5，-CCTTGGCCTTCAGGTAATGCA-3,（antisense)
[0130] IFNAl:5，-CTTCCAAGCCCACCCCAACT-3，（ sense)，
[0131] 5'-GGCCTCCAGGACCTTCAGC-3'（antisense)
[0132] IFNA2:5 '-TTAAGAGGGCCAAAGATGC-3 '（ sense)，
[0133] 5，-TGGGCTGAGGCTGGATACAG-3,（antisense)
[0134] PKR:5 '-AGAGTAACCGTTGGTGACATAACCT-3 '(sense)，
[0135] 5，-GCAGCCTCTGCAGCTCTATGTT-3,（antisense)
[0136] OAS:5，-AGAAGGCAGCTCACGAAACC-3，（ sense)，
[0137] 5，-CCACCACCCAAGTTTCCTGTA-3,（antisense)
[0138] Mx:5，-GCCGGCTGTGGATATGCTA-3，（ sense)，
[0139] 5，-TTTATCGAAACATCTGTGAAAGCAA-3,（antisense)
[0140] 2、焚光素酶活性的測定（以Promega Luciferase試劑盒為例）
[0141 ] 1)取出Luciferase試劑盒，室溫平衡Ih;
[0142] 2)熒光測定儀開機自檢，并設定相應的參數；
[0143] 3)待測細胞樣品，棄去細胞培養基，并用預冷的I3BS洗滌一次，加入Luciferase細 胞裂解液，輕柔混勻，37 °C裂解15min;
[0144] 4)用移液槍吹打裂解物，并轉移到新的EP管中；
[0145] 5)4°C，12000rpm離心lmin，轉移上清至新的EP管中，棄去沉淀；
[0146] 6)取樣品IOOyU加入Luciferase底物IOOyU移液槍吹打混勻后，上機測定；
[0147] 7)每次測定設3個平行復孔，最后的數據以Lucif erase的讀值和Reni Ia讀值的比 值來表示。
[0148] 3、Western檢測蛋白表達水平
[0149] 1)蛋白制樣（以6孔細胞培養板培養細胞為例）：
[0150] ①貼壁細胞棄去培養基貼壁細胞棄去培養基，用預冷的PBS洗滌一次，再加入一定 量的PBS，細胞刮輕柔刮動細胞生長面，收集細胞；
[0151 ] ②4°C，2000rpm離心10min，收集細胞，棄去PBS上清；
[0152] ③加入60-80yL已預先加好蛋白酶抑制劑Cocktail和終濃度為0.5mMDTT，預冷的 細胞裂解液，用移液槍吹打，重懸細胞；
[0153] ④超聲破碎儀調至3檔，冰上超聲，每次3_5s，重復3次；
[0154] ⑤4°C，12000rpm離心10min，將上清轉移至另一新的EP管，即得到細胞總蛋白；
[0155] ⑥測定樣品蛋白濃度；
[0156]⑦按實驗設計的上樣量分裝，加入loading buffer，煮沸樣品5min制樣，2)SDS-PAGE分離蛋白和轉膜曝光：
[0157] ①SDS-PAGE膠上樣，Tris-gly緩沖液系統電泳分離蛋白，90V進濃縮膠，110V進分 離膠，以預染的蛋白質marker為指示；
[0158] ②將SDS-PAGE膠從電泳系統中取下，浸入轉膜緩沖液平衡，同時將相應大小的NC 膜也浸入轉膜緩沖液平衡；
[0159]③按轉膜墊、三層濾紙、NC膜、SDS-PAGE膠、三層濾紙、轉膜墊的三明治模型制備轉 膜芯體系，放入轉膜槽，負極對SDS-PAGE膠，正極對NC膜，并且NC膜和SDS-PAGE膠的接觸面 事先做好標記；
[0? 60]④4°C，70V恒壓轉膜2h;轉膜結束，撤下NC膜，用圓珠筆根據預染的蛋白質marker 的位置，劃定標識，用麗春紅預染，粗略判斷目的蛋白是否轉膜成功；
[0161] ⑤PBS洗去麗春紅，5 %的脫脂牛奶室溫封閉1-2h; PBS洗去脫脂牛奶，用PBS根據說 明書的介紹稀釋一抗，室溫孵育Ih;
[0162] ⑥TBS-T洗膜緩沖液，搖床洗膜5次，每次5min;用PBS根據說明書的介紹稀釋二抗， 室溫孵育30min;
[0163] ⑦TBS-T洗膜緩沖液，搖床洗膜5次，每次IOmin;
[0164] ⑧濾紙吸干膜上的洗膜緩沖液，按比例加入曝光底物，暗處孵育5min;
[0165] ⑨Western掃描系統采集信號分析
[0166] 實驗結果和討論
[0167] 通過前面的實驗我們已經證明，A型流感病毒感染A549細胞后會上調GBP5,作為一 種炎癥因子，在病毒刺激后高水平的表達，必然會激活下游的特定的通路來調節體內炎癥 因子網絡以達到一種動態的平衡或者起到抑制病毒復制的效果。在A549中瞬時轉染GBP5蛋 白，在啟動子水平檢測了IFN0，IFNAl (IL29)，ISRE和NF-κΒ啟動子的活性，在mRNA水平檢測 了 IFNa、IFNi3、IFNAl (IL29)三種干擾素的表達水平，發現GBP5能激活干擾素啟動子的表達 (圖2A)以及mRNA水平的表達（圖2B)。于是為了進一步確定GBP5是否能促進干擾素通路的激 活，我們做了干擾素下游產物OASl、PKR、MxA的mRNA水平和蛋白水平的檢測，發現GBP5蛋白 確實能夠在A549細胞中促進I型干擾素的表達并激活其下游的通路（圖2C)。
[0168] 綜合這部分的實驗，我們可以得出A型流感病毒感染細胞后促進GBP5表達，從而上 調干擾素，激活干擾素下游通路，這可能為后續研究GBP5在免疫炎癥網絡中的新的生物學 功能提供了前提。
[0169] 【實施例3】GBP5具有廣譜抗病毒的功效
[0170] 實驗材料
[0171] 1、細胞、病毒株及質粒
[0172] 人肺癌細胞系A549、橫紋肌肉瘤RD細胞、Huh7細胞和A型流感病毒毒株A/ HongKong/498/97H3N2均由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)提供，由本實驗室保存；
[0173] EV71(C4型）：由湖北省襄樊市一例EV71感染死亡幼兒腦內分離得到，本實驗室保 存；
[0174] VSV-eGFP:由武漢大學陳明周實驗室提供，本實驗室保存；
[0175] pBlue-HBVl .3-NE0質粒由本實驗室任文丹構建并保存；
[0176] 2、生化試劑及試劑盒
[0177] 轉染試劑Lipofectamine 2000 reagent( Invitrogen)
[0178] 高純度轉染用質粒提取試劑盒購自博大泰克公司
[0179]乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒和乙型肝炎病毒s抗原診斷試劑盒購自上海科華 生物工程股份有限公司 [0180] 3、耗材及儀器
[0181] 熒光顯微鏡
[0182] 熒光定量PCR儀
[0183] ELx800? 酶標儀
[0184] 實驗方法
[0185] 1、熒光定量PCR測定H3N2病毒各種RNA含量(Real-Time PCR)
[0186] 1)H3N2感染A549細胞前，將含有胎牛血清的完全培養基換成無血清培養基，H3N2 感染的劑量為IMOI，感染或處理3h后，收集細胞進行下一步實驗；
[0187] 2)按照說明書提取RNA，并進行逆轉錄以及Real-time PCR，方法同前所述;3)熒光 定量PCR中所使用的引物：
[0188] 逆轉錄:1111?熟（5'-1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'-3'），
[0189] CRNA(5 '-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3 '），
[0190] VRNA(5 '-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3 '），
[0191 ]定量PCR:NP(sense 5 ' -GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3 '
[0192] antisense 5'-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3'）
[0193] γ-actin(sense 5'-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3'
[0194] antisense 5'-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3'），
[0195] 2、哺乳動物細胞的轉染
[0196] 同前所述。
[0197] 3、乙型肝炎病毒e/s抗原診斷試劑盒(酶聯免疫法）
[0198] 1)每孔加入待測樣品50yL，設陰、陽性對照各2孔，每孔加入陰性對照（或陽性對 照）各50yL，并設空白對照1孔；
[0199] 2)每孔加入酶結合物50yL(空白對照孔除外），充分混勻，封板，置37度孵育30分 鐘；
[0200] 3)手工洗板:棄去孔內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復5次后拍干；
[0201] 4)每孔加顯色劑A液、顯色劑B液各50yL，充分混勻，封板，置37度孵育15分鐘；
[0202] 5)每孔加入終止液50yL，混勻；
[0203] 6)用酶標儀讀數，取波長450nm，參考波長630nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔 OD值；
[0204] 實驗結果和討論
[0205] 已有很多研究結果報道干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對多種病毒如DNA病毒和 RNA病毒均有抑制作用，而前面的實驗已經證明GBP5能夠在A549細胞中上調干擾素并激活 其下游通路。所以我們進一步研究GBP5是否能夠通過介導干擾素而發揮廣譜抗病毒的功 效。
[0206]為了驗證是否sGBP5激活的I型干擾素能夠發揮抗病毒作用，我們首先瞬轉GBP5到 A549細胞中，然后用IMOI A/Hong Kong/H3N2感染A549細胞1.5h，孵育6h后收集細胞，檢測 病毒3種RNA的表達水平。結果顯示，瞬時轉染了GBP5蛋白與對照相比，細胞感染病毒后的 mRNA、cRNA、vRNA水平均被明顯抑制（圖3A)，這說明GBP5在A549細胞中對A/Hong Kong/H3N2 病毒復制有抑制作用。
[0207] 其次，Huh7細胞瞬時轉染GBP5蛋白后，用IMOI的VSV病毒感染24小時后收集上清， 接著同時用上清稀釋成不同濃度感染vero細胞2小時候洗去，用病毒噬斑檢測VSV病毒含 量，發現轉染了GBP5的huh7細胞能抑制VSV的復制（圖3B)。然后，我們用構建的HBV侵染性克 隆質粒pBlue-HBVl. 3-NE0瞬時轉染Huh7細胞同時瞬轉GBP5蛋白，收集上清用ELISA法檢測 HBeAg和HBsAg的表達量，發現GBP5在Huh7細胞中對乙肝病毒有抑制作用（圖3C)。最后，RD細 胞瞬時轉染GBP5蛋白后，加入IMOI EV71 (C4型）病毒感染12h，再收集細胞，western檢測病 毒VPl蛋白，發現病毒VPl蛋白含量同樣減少，表明轉染GBP5后在RD細胞中對EV71 (C4型）病 毒復制有抑制作用。（圖3D)。
[0208] 以上實驗結果表明，GBP5對H3N2、EV71、HBV和VSV病毒復制都具有一定程度的抑制 作用，對GBP5具有廣譜抗病毒效果做了驗證，為進一步研究其抗病毒機制以及生物醫藥應 用提供了依據。
【主權項】
1. 鳥苷酸結合蛋白5在制備抗病毒藥物中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述鳥苷酸結合蛋白5用于制備激活I型和 III型干擾素的藥物。3. 鳥苷酸結合蛋白5在制備檢測病毒感染的診斷試劑中的應用。
【文檔編號】A61K49/00GK105963682SQ201610303268
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】朱應, 馮暕, 佘應龍
【申請人】武漢大學