異補骨脂二氫黃酮及其類似物的醫藥用圖

異補骨脂二氫黃酮及其類似物的醫藥用圖
【專利摘要】本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種活性成分的用途，所述活性成分為具有式(I)結構的化合物，或其二聚體，或其藥學上可接受的鹽、互變異構體、立體異構體或前藥：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地選自下組：氫、CH2-CH＝C(CH3)2、OC(CHOH)4CH2OH、ORa、OCOORa、OCONRaRb、OSO2Ra和OSO3Ra；所述的Ra和Rb各自獨立地選自下組：氫、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30雜芳基；所述活性成分用于制備Src激酶和/或Fyn激酶的活性抑制劑。
【專利說明】
異補骨脂二氫黃酮及其類似物的醫藥用途
技術領域
[0001] 本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種異補骨脂二氫黃酮及其類似物的醫藥用 途。
【背景技術】
[0002] Src家族激酶（Src family kinases，SFKs)包括c-Src、Lyn、Fyn、Lck、Hck、Fgr、 Blk、Yes和Yrk。根據氨基酸序列，SFKs可分為2個亞族:一族為c_Src、Fyn、Yes和Fgr，在不同 組織中廣泛表達；另一族為Lck、Blk、Lyn和Hck，與造血細胞密切相關。目前認為，SFKs是不 同細胞多樣信號傳輸和整合的關鍵點。Src激酶是目前研究最為深入同時也是與人類疾病 聯系最為密切的SFKs成員，其通過信號轉導調控細胞生長、分化和存活，影響細胞黏附、迀 移和侵襲，同時還參與突觸傳遞的調節。研究表明，腦缺血再灌注的發生與Src激酶的調節 有關。
[0003] 所有SFKs成員都由幾個特殊結構域組成，從N-末端至C-末端依次為SH4、SH3、SH2 和SHl結構域。SH4結構域含有豆蔻酰化位點，在某些情況下也發生棕櫚酰化，這2種脂類修 飾為Sr c激酶靶向細胞內膜并與其結合所必需。在SH4與SH3結構域之間存在1個特殊結構 域，其在不同SFK成員之間存在差異性并可能有著特殊的功能。SH3結構域由約60個氨基酸 殘基組成，在革G蛋白2型聚脯氨酸(polyproline typell，ΡΡΠ )中成螺旋序列，可與富含脯 氨酸的多肽位點結合，因此在蛋白質-蛋白質相互作用中起著非常重要的作用。SH2結構域 由約100個氨基酸殘基組成，可在短期內使靶蛋白中的特定氨基酸序列酪氨酸磷酸化。SHl 為催化結構域，其與ATP和底物肽結合并介導磷酸化。C-末端是1個含有酪氨酸殘基（人： Tyr530)或酪氨酸殘基(小鼠：Tyr527)的負性調控區域，當C-末端Src激酶(C-terminal Src kinase，Csk)磷酸化時可與SH2結構域相互作用。
[0004] Src激酶活性調節是通過一系列復雜的限制ATP親和性和激酶結構域活性位點分 子之間的相互作用引起的。Src激酶的激活通常發生于細胞膜，通過Csk誘導分子內SH2結構 域與C-末端Tyr530結合并發生磷酸化，使分子呈頭尾卷曲狀態，將酶活性中心遮蓋，使Src 激酶活性處于抑制狀態。Tyr419去磷酸化可促進Src激酶活化。SH3結構域結合SH2再與激酶 結構域的連接器連接，兩者的相互作用保證激酶無論是在關閉、失活和破壞時足以引起激 酶的激活。例如，SH2末端尾部的釋放促進SH2結構域與其他酪氨酸磷酸化蛋白如黏著斑激 酶(focal adhesion kinase，FAK)之間的相互作用可使Src激酶激活。
[0005] 現有的研究已經發現，Src激酶與多種疾病相關，并有可能成為其潛在的治療靶 占.
[0006] 1.與心腦血管疾病的關系
[0007] Src家族激酶與高血壓及肺動脈高壓密切相關。有研究報道[Qin B，Zhou J.PLoS One. 2015; 10 (5): e0127891. ]。Src家族激酶(SFKs)抑制劑SU6656在體內及體外實驗都可以 降低Ang II誘導的肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化和血管收縮。另外，Src激酶的磷酸化水平 在肺動脈高壓中表達增加。而Src激酶抑制劑達沙替尼可以通過抑制Src激酶的磷酸化進而 抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖。達沙替尼在體內還可以逆轉肺血管重構。c-Src還與骨形態 蛋白受體Π (BMPR-II)相互結合，而BMPR-II的突變可以導致Src活性的增加以及細胞生長。 因此，Src可以作為肺動脈高壓的作用靶點，為治療肺動脈高壓提供新思路[Pullamsetti SS,et al.Arterioscler Thromb Vase Biol.2012Jun；32(6):1354-65.；ffong WK1Knowles JA，Morse JH.Am J Respir Cell Mol Biol.2005Nov;33(5):438-46.]。
[0008] S r c家族激酶還與心肌梗塞和心臟肥大的形成密切相關。研究發現[W e i s S， Shintani S，Weber A et al.J Clin Invest.2004Mar;113(6):885-94·]，阻斷Src激酶可 以阻止內皮細胞的功能障礙，抑制血管滲透性以及梗死體積，提高心肌功能和存活。而阻斷 Src激酶對心肌梗塞的改善是通過穩定Flk/cadherin復合物實現的。另有研究發現 [Rutledge CA,et al.J Am Coll Cardiol.2014Mar ll;63(9):928-34.]，c-Src激酶的抑 制還可以促進結合蛋白43(Cx43)的表達，降低可誘發性心律不齊，可以作為治療心肌梗死 的新方法。Src家族激酶與心臟肥大也有密切關聯。長期壓力導致的心肌肥大中Src激酶的 活性是增加的[Takeishi Y，et al.J Mol Cell Cardiol .2001Sep;33(9) :1637-48; LSrc 激酶可能是通過內皮素依賴性的方式調控心肌肥大的[Kovacic B，et al.J Biol Chem.l998Dec 25;273(52) :35185-93.]。在2001 年Paul等人發現阻斷Src激酶活性或Src缺 失能夠保護小鼠腦中風引起的腦損傷;而后，另一研究小組運用Src激酶阻斷劑SKI-606或 SKS-927，在缺血再灌注小鼠模型中能夠有效地保護腦血管內皮和腦組織的損傷[Paul R， et al.Nat Med.2001Feb；7(2):222-7.Liang S,et al.J Pharmacol Exp Ther.2009Dec； 331(3):827-35.]〇
[0009] 2.與癌癥的關系
[0010] 原癌基因c-src的表達在時空上的紊亂使其蛋白產物發生質和量的改變，是腫瘤 發生的重要原因。
[0011] 研究發現，Src激酶在癌癥中扮演重要角色。Src激酶可以通過調控細胞生長及甲 狀旁腺激素相關蛋白的表達進而調控乳腺癌細胞的轉移[Myoui A，et al. Cancer Res. 2003Aug 15;63(16) :5028-33.]。而Src激酶的抑制可以降低癌細胞的轉移，降低乳腺 癌的發生，增加小鼠的存活[Rucci N，et al.J Pharmacol Exp Ther.2006Jul;318(l): 161-72.]。3代激酶抑制劑塞卡替尼以200530)可以通過調控1^此19和16?8?2的表達進而抑 制膜腺癌的生長[Rajeshkumar NV，et al.Clin Cancer Res.2009Jun 15;15(12):4138_ 46. ] Arc激酶抑制還能抑制胰腺癌的侵襲[Ito H，et al .Surgery .2003Aug; 134(2) :221- 6.]。而Src激酶抑制劑AZD0530和達沙替尼還可以抑制胃癌細胞的生長、迀移和侵襲[Nam HJ,et al.Mol Cancer Ther.2013Jan；12( I):16-26.；Okamoto ff,et al.Mol Cancer Ther.2010May;9(5):1188-97·]。
[0012] Src激酶的激活可以通過PI3K/Akt信號通路誘導上皮間質轉化，進而促進鼻咽癌 的轉移[Ke L，et al.0ncotarget.2016Apr 7.doi:10.18632/oncotarget.8634·]。有報道 表明[Chen J，et al.Clin Colorectal Cancer.2014Mar;13(l):5-13.;Mao W，et al. Oncogene. 1997Dec 18; 15(25): 3083-90. ]，Src激酶的過表達可以加速結腸癌的轉移， 對化學療法藥物產生抵制作用。而Src激酶的抑制可以降低免疫反應，進而消除癌細胞。神 經肽可以通過激活Pyk2和Src激酶進而促進肺癌細胞的增殖和存活[Roel Ie S，et al. Oncogene. 2008Mar 13; 27(12): 1737-48]。而Src激酶的小分子抑制劑可以抑制肺癌細 胞的生長，遷移[Lee D，et al .Clin Lung Cancer.2006May;7(6) :381-4. LSrc激酶還可以 作為前列腺癌的革巴點[Paronetto MP，et al.Am J Pathol.2004Apr;164(4):1243_51·]。另 有研究發現，Src激酶的抑制劑PP2，SU6656和達沙替尼可以降低Src激酶的活性，抑制甲狀 腺癌細胞的生長，其中達沙替尼又可以抑制甲狀腺腫瘤在體內的生長[Henderson YC, et al.Head Neck. 2014Mar; 36(3) :375-84. LSrc和p-Src的表達水平在骨肉瘤中表達增加[Hu C，et al .Med Sci Monit .2015Feb 28; 21:638-45 .]。而Src激酶的抑制劑SI-83可以作為潛 在的治療骨肉瘤的藥物[Bernardini G，et al.Mol Biosyst.2014Jun;10(6):1305-12.]〇
[0013] 3.與炎癥的關系
[0014] Src激酶的活性在潰瘍性結腸炎中表達顯著增加，為后期結腸癌的發生和發展提 出警不[Cartwright CA,et al. J Clin Invest. 1994Feb;93(2) :509-15.]。另有研究發現 [Nuche-Berenguer B,et al.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2016Mar31: ajpgi.00349.2015. LSrc家族激酶的激活在急性胰腺炎中也扮演重要角色，抑制凋亡，促 進壞死及細胞因子釋放。因此可以作為急性胰腺炎的潛在作用靶點。
[0015] 4.與血液性疾病及細胞增殖性病癥的關系
[0016] 研究表明，Src激酶可以引起血小板減少癥和慢性骨髓白血病等血液性疾病。研究 發現[Turro E，et al.Sci Transl Med.2016Mar 2;8(328):328ra30.]，Src激酶可以引起 血小板減少癥、出血等疾病。而Src激酶抑制劑可以作為治療該類疾病的有效手段。另外， Src激酶抑制劑SKI-606和達沙替尼都可以有效治療慢性骨髓白血病（Konig H，et al. Blood .2008Feb 15；111 (4):2329-38.；Quintas-Cardama A,et al.Future Oncol·2006Dec;2(6):655-65·)。
[0017] Src激酶的活性可以促進B細胞淋巴瘤的存活和生長[Ke J，et al.Mol Cancer. 2009Dec 31 ;8 :132 .]，而其抑制劑達沙替尼對彌漫性B細胞淋巴瘤具有抑制效果 [Hollmann CA, et al · Leuk Res · 2010May; 34(5): 585-93 ·]。而Src家族激酶的另一成員Fyn 與霍奇金淋巴瘤之間存在相關性，為霍奇金淋巴瘤的治療提供新靶點[Mart in P，et al.Leuk Lymphoma.2011Nov；52(11):2162-8.]〇 [0018] 5.與骨骼及臟器纖維化疾病的關系
[0019] siRNA沉默Src可以抑制由VEGF誘導的血管滲透性及破骨細胞的活性，進而修復骨 壞死[Cao HJ，et al · Bone · 2015May; 74:58-68 · ]。Src的沉默還可以阻止與皮質類固醇相關 的骨質疏松以及骨壞死[Zheng LZ，et al.Bone.2016;83:190_6.;Zheng LZ，et al.J Bone Miner Res. 2015; 30( 11): 2044-57.]。所以Src的抑制劑可以作為治療骨質疏松和骨壞死的 有效藥物。
[0020] Src激酶與臟器纖維化之間同樣存在密切聯系。研究發現[Yan Y，et al.Kidney Int · 20150ct 7 · doi : 10 · 1038/ki · 2015 · 293 · ]，Src激酶的抑制可以抑制TGF-βΙ信號通路， 激活表皮生長因子受體和STAT3信號通路，進而抑制腎纖維細胞的增殖，最終改善腎臟纖維 化。另有研究發現[Hu M，et al.J Pharmacol Exp Ther.20140ct;351(l):87-95.]，Src激 酶的抑制劑塞卡替尼可以阻斷由TGF-m誘導的Src激酶的激活，降低α-SMA的表達，對治療 肺纖維化提供新的靶點。Src激酶的抑制還能阻斷皮膚纖維化的發生。因此，Src激酶又可以 作為治療皮膚纖維化的革巴點[Skhirtladze C，et al.Arthritis Rheum.2008May;58(5): 1475-84.]。另外，Src激酶還參與囊性纖維化跨膜調控子(CFTR)和MUCl的連接，與囊性纖維 化密切相關[GonzSlez-Guerrico AM,et al. J Biol Chem.2002May 10;277(19) :17239-47·]。
[0021] 中藥補骨脂是一種常見的補腎中藥，有補腎壯陽、固精速尿、溫脾止瀉、納氣平喘 之效。異補骨脂二氫黃酮（Isobavachin)是從中藥補骨脂(Psoralea Corylifolia L.)中提 取分離出的一種異戊烯基黃酮類單體。

【發明內容】

[0022] 本發明的目的旨在提供異補骨脂二氫黃酮及其類似物的新用途。
[0023] 本發明的第一方面提供了一種活性成分的用途，所述活性成分為具有式（I)結構 的化合物，或其二聚體，或其藥學上可接受的鹽、互變異構體、立體異構體或前藥：
[0024]
[0025] 其中，1^、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、1?7、1?8和1?9各自獨立地選自下組:氫、〇1 2-〇1=(：(〇13)2、0〇 (CHOH) 4CH20H、ORa、0⑶ORa、OCONRaR b、0S02R4P0S03Ra;所述的RjPRb 各自獨立地選自下組： 氫、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12 炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30雜芳基；
[0026] 所述活性成分用于制備Src激酶和/或Fyn激酶的活性抑制劑。
[0027] 在一優選例中，所述R1選自氫、羥基或烷氧基，所述R2選自氫或CH2-CH=C(CH 3)2，R3 選自羥基、烷氧基或OC (CHOH) 4CH20H，R4為氫，R5選自氫或羥基，R6選自氫或CH2-CH=C (CH3) 2， R7選自氫或羥基，Rs選自氫或CH2-CH=C (CH3) 2，R9選自氫、羥基或烷氧基，且Riq選自氫或羥 基。
[0028]在另一優選例中，所述活性成分選自下列化合物：


[0033]在另一優選例中，所述Src激酶和/或Fyn激酶的活性抑制劑可用于防治下列疾病： 心肌梗塞、高血壓、肺動脈高血壓、腦卒中、心肌肥大、潰瘍性結腸炎、急性胰腺炎、血小板減 少癥、慢性骨髓白血病、腫瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、骨質疏松癥和骨壞死、腎纖維 化、肺纖維化、皮膚纖維化或囊性纖維化。
[0034]本發明各個方面的細節將在隨后的章節中得以詳盡描述。通過下文以及權利要求 的描述，本發明的特點、目的和優勢將更為明顯。
【附圖說明】：
[0035]圖1體現了異補骨脂二氫黃酮對體外血管內皮細胞Src家族激酶蛋白Fyn磷酸化的 抑制作用；圖IA顯示免疫印跡代表性結果；圖IB顯示磷酸化Fyn統計結果(N = 3)，與對照組 比較，##P〈0·01;與血管緊張素II(AngΠ )組比較廣P〈0·01或*P〈0·05;
[0036] 圖2體現了異補骨脂二氫黃酮對重組蛋白Src激酶的酶活性直接抑制效果；圖2A顯 示測得的發光信號單位(RLU);圖2B為異補骨脂二氫黃酮不同濃度對SRC激酶活性的影響 (%);與對照組比較，Ρ〈〇·〇1。
[0037] 圖3體現了異補骨脂二氫黃酮不同給藥劑量對大鼠MCAO模型腦梗死體積的影響； 圖3Α顯示TTC染色結果；圖3Β是對梗死體積的統計。與手術模型組相比，乍<0.05，#Ρ〈0.01。
[0038] 圖4體現了異補骨脂二氫黃酮對MCAO模型大鼠腦內血管內皮細胞Fyn和Src磷酸化 的抑制作用(Western Blot法）；圖4A、4C顯示免疫印跡代表性結果；圖4Β顯示磷酸化Fyn統 計結果；圖4D顯示磷酸化Src統計結果；與假手術組組比， ##P<0.01;與手術模型組相比， <0.01。
[0039] 圖5體現了異補骨脂二氫黃酮對MCAO模型大鼠腦內組織切片中Fyn和Src磷酸化的 影響(免疫組化和免疫熒光法）；圖5A顯示運用免疫組化檢測腦組織的Fyn磷酸化；圖5B顯示 免疫熒光法檢測腦內腦組織的Src磷酸化，DAPI染細胞核。A圖顯示，與假手術組相比，模型 組在再灌后6h時，染成棕褐色的細胞數最多;而與模型組相比，異補骨脂二氫黃酮組在再灌 后6h時被染成棕褐色的細胞數降低，表明在再灌后6h時異補骨脂二氫黃酮降低Fyn磷酸化 表達水平;B圖顯示，與假手術組相比，模型組的綠色熒光強度最強；與模型組相比，異補骨 脂二氫黃酮給藥組的綠色熒光量降低，且DAPI熒光量在各組間沒有明顯變化，表明在再灌 后6h，異補骨脂二氫黃酮降低Src磷酸化水平；圖6體現了異補骨脂二氫黃酮及類似物對Fyn 和Src蛋白磷酸化的影響；圖6A、6C顯示免疫印跡代表性結果；圖6B顯示磷酸化Fyn統計結 果；圖6D顯示磷酸化Src統計結果(N=3)。
【具體實施方式】
[0040] 本發明人經過長期而深入的研究，意外地發現，異補骨脂二氫黃酮能夠有效地調 節Src和Fyn激酶的活性，從而調控Src和Fyn激酶的信號傳遞。基于上述發現，本發明人完成 了本發明。
[0041] 如本發明所用，下列術語具有如下含義：
[0042]術語"Isobavachin"、"異補骨脂二氫黃酮"可互換使用，具體指如下化合物：
[0044] 術語"C1-C12烷基"是指具有1-12個碳原子的直鏈或支鏈烷基或環烷基，例如：甲 基、亞甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環丙基、環丁基、環戊基、環 己基、環庚基，或類似基團。
[0045] 術語"C2-C12烯基"是指具有2-6個碳原子的、具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈 的烯基或環烯基，例如：乙烯基、稀丙基、I -丙烯基、異丙烯基、I-丁烯基、2-丁烯基、環己稀 基、環庚烯基、1，3-環己二烯基、1，4-環己二烯基、或類似基團。
[0046]術語"C2-C12炔基"是指具有2-12個碳原子的、具有一個或多個三鍵的直鏈或支鏈 的炔基，例如：乙炔基、丙炔基、或類似基團。
[0047]術語"C6~C30芳基"是指具有6~30個碳原子的芳基，包括單環或二環芳基，例如： 苯基、萘基、或類似基團。
[0048]術語"C1~C30雜芳基"是指具有1~30個碳原子的雜芳基，例如：吡咯基、吡啶基、 呋喃基、或類似基團。
[0049] 術語"取代"是指基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基取代:Cl~ClO 烷基、C3~ClO環烷基、Cl~ClO烷氧基、鹵素、羥基、羧基(-⑶OH)、C1~ClO醛基、C2~ClO酰 基、C2~ClO酯基、氨基、苯基;所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3個取代基的取代苯 基，所述的取代基選自鹵素、Cl-ClO烷基、氰基、0H、硝基、C3~ClO環烷基、Cl~ClO烷氧基或 氨基。
[0050] 術語"藥學上可接受的"是指適用于人而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態 反應），即有合理的效益/風險比的物質。
[0051] 術語"藥學上可接受的鹽"是指所述化合物與藥學上可接受的無機酸或有機酸所 形成的鹽，所述的無機酸包括:鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸;所述的有機酸包括：甲酸、乙 酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸（1，5 )、亞細亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二 乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡 糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。
[0052]術語"互變異構體"是指因分子中某一原子在兩個位置迅速移動而產生的官能團 異構體，例如:烯醇與相應的酮。
[0053]術語"立體異構體"是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體，例 如:順反異構體、對映異構體、構象異構體等。
[0054]術語"前藥"是指在體外無活性，但能夠在生物體內進行代謝或化學反應轉化為本 發明的活性成分，從而發揮其藥理作用的化合物。
[0055] 本發明的異補骨脂二氫黃酮（Isobavachin)是屬薔薇目豆科補骨脂（又名：破故 紙、婆固脂、胡韭子)的主要活性成分。其分子式:C2〇H2q〇4 ;分子量:324.37，化學結構式為：
[0056]
O
[0057] 如本發明所用，本發明優選的異補骨脂二氫黃酮的類似物包括但不限于下列化合 物：
[0058] 1 ·光甘草寧(Glabranin)，分子式:C2〇H2q〇4;分子量:324.37
[0059]
[0060] 2 · 8-異戊烯基柚皮素（8-PrenyInaringenin)，分子式：C2QH2QO5;分子量：340 · 4
[0061]
[0062] 3 .Leachianone G，分子式：C2〇H2q〇6;分子量：356.4
[0063]
[0064] 4 · Isoxanthohumol，分子式：C2iH22〇5;分子量：354.4
[0065]
[0066] 5 · Euchrestaflavanone B，分子式：C25H28O6;分子量：424 · 5
[0067]
[0068] R rk I~F1 ^ ΛΓ^ηπηρ . Ρ'?γΡ'· Fi
[0070] Y . b-hlydroxysophoranone，力、卞式：U3〇hl36(J5;力、卞重:4Yb · b
[0069]
[0071]
[0074] 9 · Flavapr in，分子式：C26H3〇Oiq ;分子量：502 · 6
[0072]
[0073]
[0078] 本發明的異補骨脂二氫黃酮及其類似物可通過本領域的常規方法從中藥補骨脂 等植物中提取獲得，亦可通過商業途徑購買或者利用市售原料，通過現有技術中傳統的化
[0075]
[0076]
[0077] 合物合成方法合成獲得。本領域的普通技術人員根據現有公知技術可以合成本發明的化合 物。合成的化合物可以進一步通過柱色譜法、高效液相色譜法或結晶等方式進一步純化。
[0079] 合成化學改造、保護官能團方法學(保護或去保護)對合成應用化合物是很有幫助 的，并且是現有技術中的公知的技術，如R.Larock ,Comprehensive Organic TransformationsjVCH Publishers(1989)；T.ff.Greene and P.G.M.ffuts,Protective Groups in Organic Synthesis ,3rd Ed., John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis1John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1995)中都有公開。
[0080] 經本發明人研究證實，本發明的異補骨脂二氫黃酮及其類似物可用于制備Src激 酶和/或Fyn激酶的活性抑制劑，進而防治相關疾病。
[0081] AngII刺激內皮細胞、血管平滑肌細胞產生過量的自由基，導致細胞損傷，引發炎 癥反應和功能障礙。而細胞損傷、功能障礙也是缺血性腦血管病發生發展的關鍵因素。在心 腦血管系統中，AngII主要通過調控NADPH氧化酶系統產生R0S，進一步激活Src家族激酶的 活性。因此，在體外實驗中，本發明人主要運用AngII造氧化應激模型，進而促進Src家族激 酶的活性。
[0082] 運用免疫印跡方法，可以發現:異補骨脂二氫黃酮對Fyn磷酸化水平的抑制具有濃 度依賴性（圖1)。激酶活性實驗(Kinase Assay)的結果顯示，在體外異補骨脂二氫黃酮可直 接抑制Src激酶的活性，并呈現濃度依賴性，其IC5q值為17.286μΜ(表1和圖2)。這些結果說 明，異補骨脂二氫黃酮是一個很好的Src家族激酶的抑制劑。
[0083] 動物實驗表明，不同給藥劑量的異補骨脂二氫黃酮可以有效改善MCAO模型大鼠的 腦梗死體積（表2和圖3)。另外，異補骨脂二氫黃酮可以有效降低MCAO模型中Src家族激酶 Fyn和Src的活性（圖4和圖5)。
[0084] 另外研究發現，異補骨脂二氫黃酮及其類似物還可以有效抑制Src及Fyn激酶的磷 酸化水平（圖6)。
[0085] 本發明的異補骨脂二氫黃酮及其類似物在組合物或藥物制劑中的含量例如 0.0001-50wt% ;較佳的0.001-30wt% ;更加的0.01-20wt%。
[0086] 治療有效量的本發明的組合物的用量介于0.001-500mg/kg體重/天之間，任何介 于上述范圍之內的用量皆為本發明的有效量。優選的，本發明的組合物的用量介于0.005-300mg/kg體重/天之間；更優選的，本發明的組合物的用量介于0.01-100mg/kg體重/天之 間。所述的"治療有效量"可用于相關疾病的單一用藥或聯合用藥治療。本領域的專業人員 能夠理解，在實際給藥時的用量可高于或低于上述劑量范圍。針對某一對象(如哺乳動物一 人)的"治療有效量"和具體治療方案可受諸多因素的影響，包括所用化合物或其前藥的藥 效活性、給藥對象的年齡、體重、一般情況、性別、飲食、給藥時間、疾病易感性、疾病進程以 及治療醫師的判斷等。所述"治療"指的是給予機體(患有疾病、具有疾病的癥狀、或者具有 疾病的前兆)本發明的異補骨脂二氫黃酮及其類似物，以治療、減輕、減緩、改變、治愈、影 響、改善其疾病、疾病的癥狀或疾病的前兆。
[0087] 本發明的異補骨脂二氫黃酮及其類似物或其組合物或其藥物制劑可以通過口服、 靜脈內、肌肉內、皮下、鼻腔內、直腸內等途徑給藥。固體載體如:淀粉、乳糖、磷酸二醇、微晶 纖維素、黑糖和白陶土，而液態載體如:無菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油 (如玉米油、花生油和芝麻油），只要適合活性成分的特性和所需要的特定給藥方式。在制備 藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，如，調味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如 維生素E、維生素C、BHT和BHA。
[0088] 本發明的異補骨脂二氫黃酮及其類似物也可胃腸外或腹腔內給藥。也可在適當混 合有表面活性劑(如羥丙基纖維素)的水中制備這些活性化合物(作為游離堿或藥學上可接 受的鹽）的溶液或懸浮液。還可在甘油、聚乙二醇及其在油中的混合物中制備分散液。在常 規儲存和使用條件下，這些制劑中含有防腐劑以防止微生物的生長。
[0089] 適用于注射的藥物形式包括:無菌水溶液或分散液和無菌粉（用于臨時制備無菌 注射液或分散液）。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器排出 流體。在制造和儲存條件下必須是穩定的，且必須能防止微生物如細菌和真菌的污染和影 響。載體可以是溶劑或分散介質，其中含有如水、醇、它們的適當混合物和植物油。
[0090] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所 建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按重量計。
[0091] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載的內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。本 文所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0092] 本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本專利說明書所揭 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0093]實施例1.異補骨脂二氫黃酮抑制Src家族激酶蛋白Fyn磷酸化
[0094] 1.1目的:觀察異補骨脂二氫黃酮能否抑制Src家族激酶蛋白Fyn磷酸化，考察藥物 的活性
[0095] 1.2實驗材料：
[0096] 1.2.1實驗試劑
[0097] 1 · 2.1 · 1細胞株:HUVEC細胞株購自美國ATCC公司（HUVEC，CRL-1730)。
[0098] 1 · 2 · 1 · 2抗體：HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease(GAFOI^KC-SGS)購自上海康成生物有限公司；Goat anti-rabbit IgG-HRP(sc-2004)購自 SANTA CRUZ公司；Anti-Fyn antibody[FYN-OI ] (ab1881)、Anti-Fyn (phospho Y530)antibody(abl82661)購自abeam公司。
[0099] 1.2丄3試劑:1^4裂解液(弱，？00130);苯甲基磺酰氟?]\07(10〇111]\1，3了506)均購自 碧云天生物技術研究所;十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyI sulfate，SDS)、β_疏基乙醇、甘 氨酸(Glycine)、Tris堿、丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過硫酸胺(ammonium persulfate， APS)、四甲基乙二胺（tetrame thy lenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA)、Tween_20均貝勾自 Sigma公司；ECL Tmmobi I on Western Chemiluminescent HRP Substrate(WBKLS0500)購自Millipore公司；蛋白質轉印膜(硝酸纖維素膜，NC膜)購自 美國Pall公司；細胞培養基DMEM低糖，FCS，0.25%胰蛋白酶均購自美國GIBC0;氨芐青霉素 (A6140)、Ang Π、DMS0購自Sigma; EDTA購自上海生物工程;異補骨脂二氫黃酮購自上海源葉 生物有限公司。
[0100] 1.2.2實驗儀器
[0101] CO2細胞培養箱(HEPA CLASS 100,美國Thermo公司），生物安全柜(Delta series, 美國Labconco)，細胞培養皿，倒置相差顯微鏡（1X71，日本Olympus)，蛋白質電泳及轉印系 統（美國BIORAD公司），01^-901￥〇^61、1^-100手掌型離心機、1^-200迷你離心機、了3-1型脫 色搖床、TS-8轉移脫色搖床、TS_8Transference Decoloring Shaker均為江蘇海門市其林 貝爾儀器制造有限公司生產，塑料薄膜封口機(FS-200型，溫州正雄機械有限公司），JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），2600C自動X線膠片洗片機， incubator shaker恒溫搖床(ZHWY-211B、ZHffY-100B，上海智誠）。
[0102] 1.3實驗方法
[0103] 1.3.1細胞培養
[0104] HUVEC用含有10%FCS的L-DMEM(低糖)在IOcm培養皿中培養，含5%C02細胞培養箱 37 °C恒溫培養，隔日半量換液，待細胞密度達到80 % -90 %時進行細胞傳代，PBS洗2遍，每皿 加入ImLO. 25 %胰酶消化3min，加入5mL含有血清的L-DMEM培養基終止消化，收集細胞，室溫 lOOOrpm，離心5min，棄上清，加入含有10%FCS的培養基1:3傳代培養。取8-14代細胞用于實 驗。
[0105] 細胞凍存液含60 %完全培養基、30 % FCS、10 % DMSO。
[0106] 1.3.2蛋白免疫印跡分析
[0107] 1.3.2.1總蛋白的提取
[0108] 對于貼壁細胞，去除培養液，10-7mol/L AngII刺激細胞7min，用4°C預冷的PBS洗兩 遍，棄PBS，盡量吸干凈，依照60mm皿加入IOOyL裂解液的比例加入裂解液。將細胞用刮刀刮 下，收集細胞，放于滅菌的I . 5mL的離心管中。細胞超聲破碎儀破碎細胞。離心（4 °C、 12000rpm，15min)，取上清，轉移上清液至新的離心管中。
[0109] 1.3.2.2考馬斯亮藍法測定蛋白濃度
[0110] 考馬斯亮藍法測定蛋白濃度：
[0111] 1)配制考馬斯工作液:根據樣品數量，按體積比純水:考馬斯溶液= 4:1的比例將 考馬斯稀釋成適量工作液，充分混勻。完全溶解蛋白標準品，用PBS稀釋至0.5mg/mL的濃度；
[0112] 2)將標準品按0，1，2，4，8，12，16，20yL加到96孔板的標準品孔中，PBS補足到20yL。
[0113] 3)將蛋白樣品以20倍稀釋后取20yL到96孔板孔中。
[0114] 4)各孔加入200yL考馬斯工作液，于恒溫微孔板震蕩儀上反應(37°C，5min)。
[0115] 5)酶標儀測定:測定595nm處的吸光值，根據標準曲線計算蛋白濃度。
[0116] 1.3.2.3制備SDS-PAGE凝膠電泳蛋白樣品
[0?17] 根據蛋白濃度，用PBS調整上樣體積、上樣總量一致，用4 X的loading buffer按照 4:1體積加入上樣緩沖液，混勻。恒溫水浴鍋中95°C，5min變性，進行后續SDS-PAGE凝膠電泳 分離或儲存于_80°C冰箱。
[0118] 1.3.2.4ffestern Blot
[0119] 1)制膠:SDS-PAGE凝膠根據目的蛋白的分子量制備10%的聚丙烯酰胺分離膠，將 配制好的凝膠液體注入玻璃板，無水乙醇200yL封膠，待分離膠凝固后配制并注入4%的濃 縮膠，插入1.5mm厚度的10孔梳子。
[0120] 2)電泳:裝好凝膠板，加入I X電泳緩沖液，在凝膠泳道中加入蛋白預染Marker和 各組樣品，用BIORAD迷你型蛋白質電泳轉印系統分離蛋白，從80V開始電泳，40min后轉為 120V繼續電泳至溴酚藍染料接近凝膠底部，停止電泳。
[0121] 3)轉膜：濕轉法：把NC膜和4張濾紙及4張纖維墊浸泡在存有轉移緩沖液（甲醇 20% )的盤中，由下至上按照"2張纖維墊-2層濾紙-凝膠-NC膜-2層濾紙-2層纖維墊"的順序 做好三明治，注意排除氣泡，置于轉膜槽中，一側加冰，將整個轉膜槽埋于冰盆中，恒流 300mA，2h 轉膜。
[0122] 4)封閉：將膜浸在含5%脫脂奶粉或5%BSA的封閉液（用TBS-Tween緩沖液溶解）， 室溫慢搖lh。
[0123] 5)蛋白質免疫檢測:將膜封閉于含有一抗(GAH)H抗體稀釋比例為1:5000; Src抗體 稀釋比例為1: 200;Fyn抗體稀釋比例為1:1000;P-Src抗體稀釋比例為1:1000;P-Fyn抗體稀 釋比例為I: l〇〇〇;〇cculidin抗體稀釋比例為1:1000;VE_Cadherin抗體稀釋比例為1:1000) 的孵育盒中，置于洗脫搖床上，4°C孵育過夜，然后用TBS-T緩沖液快速洗膜5min X 3次;再將 膜封入HRP偶聯的二抗(稀釋比例均為1: 5000)孵育盒中，室溫慢搖Ih;用TBS-T緩沖液快速 洗膜5minX4次。
[0124] 6)底物化學發光及顯影：用紙吸干膜上的水分，平放于保鮮膜上，加ECL(A:B=1:1 配制)反應2min，用紙吸去多余的ECL，蛋白面向上，電腦不同時間曝光，并保存圖片。
[0125] 7)結果與分析：用凝膠分析軟件Quantity One計算各條帶光密度值，進行統計分 析。
[0126] h 4實驗結果
[0127] 運用免疫印跡法實驗發現，異補骨脂二氫黃酮能夠濃度依賴性地抑制Src家族激 酶Fyn蛋白的磷酸化(見圖1)。
[0128] 1.5小結:結果說明補骨脂二氫黃酮對Src激酶家族Fyn蛋白的磷酸化有濃度依賴 性的抑制作用。
[0129] 實施例2.異補骨脂二氫黃酮直接抑制Src激酶活性
[0130] 2.1目的:觀察異補骨脂二氫黃酮能否直接抑制Src激酶家族Src激酶酶活性。
[0131] 2.2實驗材料
[0132] 2.2.1實驗試劑
[0133] 2 · 2 · 1 · 1試劑盒：Src Kinase Enzyme System(美國Promega V2921); ADP-Glo Kinase Assay(美國Promega V9101);異補骨脂二氫黃酮購自上海源葉生物有限公司。
[0134] 2.2.2實驗儀器
[0135] 96孔細胞培養板（美國Corning公司），全波長掃描式多功能讀數儀(Varioskan Flash,Thermo scientific，美國）。
[0136] 2.3實驗方法
[0137] 2.3. ISrc激酶活性測試
[0138] Src激酶活性直接測定參照ADP-Glo? Kinase Assay+Src Kinase Enzyme System (美國Promega V9741)說明書。
[0139] 1)分別用緩沖液稀釋酶（Src lOOng/yL、底物(Poly(Glu4，Tyrl)0.2ygAiL)、ATP (10μΜ)，并且加入ΙΒΑ(0 · 016，0 · 08，0 · 4，2，10，50，250μΜ)。
[0140] 2)向96孔板中每孔加入5yL藥物(對照組加入5yL溶劑）、IOyL酶、IOyL底物/ATP混 合物。
[0141] 3)室溫孵育60分鐘。
[0142] 4)加入25yLADP_GloTM Reagent。
[0143] 5)室溫孵育40分鐘。
[0144] 6)加入50yLKinase Detection Reagent。
[0145] 7)室溫孵育30分鐘。
[0146] 8)在全波長掃描式多功能讀數儀(Varioskan Flash，美國Thermo scientific)上 每間隔1秒檢測其化學發光信號值。
[0147] 2.4實驗結果
[0148] 在激酶的酶活性測定中，異補骨脂二氫黃酮使用濃度為16nM~250μΜ。如表1所示， 異補骨脂二氫黃酮濃度依賴性地抑制Src激酶的活性，其IC 5q值為17.286μΜ(又見圖2)。
[0149] 表1異補骨脂二氫黃酮對重組蛋白Src激酶的酶活性抑制效果結果統計
[0152] 2.5小結:異補骨脂二氫黃酮在體外對重組Src激酶有直接抑制作用。
[0153] 實施例3.異補骨脂二氫黃酮抑制大鼠MCAO腦缺血模型腦梗塞損傷
[0154] 3.1目的觀察異補骨脂二氫黃酮在體內藥物效果
[0155] 3.2實驗材料
[0156] 3.2.1實驗試劑
[0157]戊巴比妥鈉、多聚甲醛、DMSO:國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水:0.9%氯化 鈉注射液;2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC): Sigma;MCAO栓線（北京西濃科技有限公司）；手 術器械(上海醫療器械有限公司）。
[0158] 3.3實驗方法
[0159] 3.3.1實驗動物分組與給藥
[0160] 雄性SD大鼠120只，SPF級，體重260-270g，按照隨機區組分為6組，每組20只。分為 假手術組、模型組、異補骨脂二氫黃酮（IBA)高劑量組（lOOyg/kg)、異補骨脂二氫黃酮中劑 量組(50yg/kg)、異補骨脂二氫黃酮低劑量組(25yg/kg)、Src阻斷劑PP2組(30yg/kg)。
[0161] 3.3.2大鼠MCAO模型的制備
[0162] 所有實驗動物在動物房飼養一周，適應環境，室內溫度25°C ± 2°C，濕度50 ± 10 %， 自由飲食，晝夜交替，避免不良刺激。實驗前禁食不禁水。采用Zea-Longa改良線栓法制備大 鼠左側MCAO模型。3 %戊巴比妥鈉(39mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在鼠板上，剪去頸 部絨毛，在旁正中切口處切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露左側頸總動脈(CCA)，并在左頸 外動脈(ECA)遠端Icm處進行分離、結扎ECA分支，在近CCA分叉處結扎ECA，于CCA近心端夾一 動脈夾，將絲線在ECA近分叉處打結，勿收緊線結，將線栓輕輕插入，收緊線結，松開動脈夾， 將線栓順ECA經ICA送入顱內，直到感到有輕微抵抗為止，收緊絲線，縫合大鼠切口。缺血Ih 后，輕輕將線栓退出至有阻力感，使其頭端回至IjCCA分叉處，即可使大腦中動脈恢復血供，實 現再灌注，至此左側MCAO模型制備完成。假手術組只進行麻醉和血管分離術，不結扎血管， 也不插入線栓。術后大鼠保溫，自由飲食。注意觀察大鼠呼吸狀況。
[0163] 3.3.3測定腦梗死體積
[0164] 大鼠神經功能缺陷評分完成后，每組實驗隨機取6只大鼠。20%烏拉坦(350mg/kg) 腹腔注射麻醉取腦，_80°C速凍7min，切除額極和枕極，取冠狀面將整腦均勻切成6張薄片， 每張約2mm厚，置于事先配置好的1%TTC溶液中，37°C避光孵育16min，顯色后置于4%多聚 甲醛固定24h。然后用數碼相機(Olympus，日本）照相，圖像輸入計算機，采用圖像處理軟件 (Image Pro Plus，IPP 6.0)計算腦梗死面積(正常腦組織為粉紅色，梗死區為白色），根據 公式V = t (A1+A2+A3+A4+A5+A6)計算腦梗死體積，其中t為腦片厚度，A為梗死面積。
[0165] 本研究采用梗死體積占全腦體積百分值(v%)表示。
[0166] V% =梗死體積/全腦體積xlOO%。
[0167] 3.4實驗結果
[0168] 如表2所顯示，異補骨脂二氫黃酮在體內在不同給藥水平均抑制大鼠MCAO腦缺血 模型腦梗塞損傷體積(每組η = 20)<^κ激酶阻斷劑PP2(30yg/kg)顯示了相似的抑制效果 (又見圖3)。
[0169] 表2異補骨脂二氫黃酮不同給藥劑量對大鼠 MCAO模型腦梗死體積的結果統計
[0171] 3.5小結:與Src激酶阻斷劑PP2相似，異補骨脂二氫黃酮也具有抑制大鼠MCAO腦缺 血模型腦梗塞損傷體積。
[0172] 實施例4.異補骨脂二氫黃酮抑制MCAO腦缺血模型腦內血管內皮細胞Fyn和Src激 酶的磷酸化
[0173] 4.1目的：觀察在體內異補骨脂二氫黃酮能否具有抑制Fyn和Src激酶的磷酸化的 能力
[0174] 4.1.1實驗材料
[0175] 4.1.1.1 實驗試劑
[0176] 4· 1 · 1 · 1 · 1抗體：Anti-Src antibody(ab7950)、Anti_Fyn antibody[FYN_01 ] (abl881)、Anti_Src(phospho Y529)antibody[Y232](ab32078)、Anti_Fyn(phospho Y530) antibody(abl82661)購自abeam公司、HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraIdehyde-3-phosphate Dehydrogease(GAf3DI^KC-SGS)購自上海康成生物有限公 司；Goat anti-rabbit IgG-HRP(sc_2004)、Goat anti-mouse IgG-HRP(sc_2005)均購自 SANTA CRUZ公司。
[0177] 4.1.1.1.2試劑:戊巴比妥鈉、多聚甲醛、DMSO:國藥集團化學試劑有限公司；生理 鹽水:0.9%氯化鈉注射液;2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC): Sigma;MCA0栓線（北京西濃科 技有限公司）；手術器械（上海醫療器械有限公司）；RIPA裂解液（弱，P0013D)、Triton X-100/曲拉通X-100(ST795)、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術研究所， 十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS)、β_疏基乙醇、甘氨酸(Glycine)、Tris堿、 丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過硫酸胺（ammonium per sulfate，APS)、四甲基乙二胺 (tetramethylenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA)、Tween_20 均購自 Sigma公司；PageRulerTM Prestained Protein Ladder(#SM0671)購自Fermentas公 司；ECL Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(WBKLS0500)購自 Millipore公司；蛋白質轉印膜(硝酸纖維素膜，NC膜)購自美國Pall公司。
[0178] 4.2實驗方法
[0179] 4.2.1實驗動物分組與給藥
[0180] 雄性SD大鼠30只，SPF級，體重260-270g，隨機區組分為3組，每組10只。組別分別是 假手術組、模型組、異補骨脂二氫黃酮50yg/kg組。
[0181 ] 4.2.2大鼠MCAO模型的制備方法同實施例3.3.2節。
[0182] 4.2.3大鼠MCAO模型腦內血腦屏障微血管內皮細胞的富集
[0183] 1)大鼠脫頸椎處死，打開顱腔取出全腦，放于D-Hanks液中，去除小腦、間腦(包括 海馬），用D-Hanks液漂洗3次，于15ml離心管，150g，3min。
[0184] 2)每側皮質加入分離液(分離液：蛋白酶抑制劑:PMSF= 100:4:1 )，冰上輕 緩勻漿，上下10次即可，切記不可用力研磨，以免血管碎裂破壞。
[0185] 3)勻漿倒入IOml離心管中，再用裂解液沖洗勻漿器。
[0186] 4)所有勻漿 4 度離心，5600g/10min。
[0187] 5)沉淀加入2ml 26%葡聚糖，振蕩lmin，5600g/10min離心。
[0188] 6)剪去離心管上層脂質，留下紅色血管層沉淀。
[0189] 7)用Iml BBB裂解液沖洗沉淀，吸取時注意槍頭上吸附的血管。
[0190] 8)5600g/10min離心，下層沉淀加入200ul BBB裂解液，振蕩混勻后-20度裂解1小 時。
[0191 ] 9)超聲裂解，將樣本超聲2min，離心14000rpm/min，15min。
[0192] 10)吸取上清，蛋白定量備用。
[0193] 4.2.4蛋白免疫印跡分析同實施例1.3.2節。
[0194] 4.3實驗結果
[0195] 運用免疫印跡法顯示，異補骨脂二氫黃酮能夠抑制MCAO腦缺血模型腦內血管內皮 細胞的Fyn和Src激酶的磷酸化(見圖4)。
[0196] 4.4小結異補骨脂二氫黃酮能夠在體內抑制Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化。
[0197] 實施例5.異補骨脂二氫黃酮抑制腦組織的Fyn和Src激酶的磷酸化
[0198] 5.1目的：觀察異補骨脂二氫黃酮在體內是否能夠抑制腦組織的Fyn和Src激酶的 磷酸化
[0199] 5.2實驗材料
[0200] 5.2.1實驗試劑同實施例4.1
[0201] 5.2.2實驗動物分組與給藥同實施例4.2
[0202] 5.3實驗方法
[0203] 5.3.1免疫組織化學染色
[0204] 5.3.1.1石蠟切片制作
[0205] 1)固定:處理大鼠腦組織，用PBS沖洗，放入4%多聚甲醛內固定24h。
[0206] 2)脫水:倒去固定液，用蒸餾水沖洗三次，再用50 %、70 %、80 %、95 %酒精和無水 酒精沖洗2次，用酒精逐級脫水。
[0207] 3)透明：無水酒精和二甲苯1:1比例，45min，二甲苯（I)、（ Π )各30min。
[0208] 4)包埋:浸入石蠟，包埋組織。
[0209] 5)切片:包埋后的組織用切片機切成5_7μπι。
[0210] 6)貼片:將組織蠟塊在水中展開，載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上。
[0211] 7)烤片:68°C恒溫箱內烤片。
[0212] 5.3.1.2S-P免疫組化染色
[0213] 1)石蠟切片置于60°C烤箱烘烤30分鐘；2)將切片浸入二甲苯I、Π、ΙΠ中各脫蠟30 分鐘;3)切片按順序浸入100%、100%、95%、95%、90%梯度酒精中水化各1分鐘，然后置于 超純水中待用;4)配制檸檬酸鹽抗原修復液，將切片放入，使其沸騰，室溫下冷卻;5)純水沖 洗1次，PBS沖洗3分鐘3次;6) 3 % H2O2處理10分鐘，PBS洗3次，3min/次。7) 10 %正常山羊血清 封閉，室溫孵育10分鐘。棄血清，滴加一抗P-Fyn (1:1000 )，37 °C孵育1~2小時或4 °C過夜;8) PBS洗3次，2min/次;9)滴加生物素標記二抗，37°C孵育30min; 10 WBS洗3次，2min/次；11)滴 加辣根酶標記鏈霉卵白素，37°C孵育30min; 12)PBS洗3次，2min/次；13)顯色劑顯色(DAB或 AEC); 14)自來水沖洗，復染，脫水透明，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色效果。對照設 計:設計空白對照代替一抗，其他步驟相同。
[0214] 5.3.2免疫熒光染色
[0215] 將切好的切片從-80 °C冰箱放至-20 °C冰箱中約4小時，再放至4°C冰箱泡在PBS中， 使大鼠腦處于正常狀態下。蔗糖-二甲胂酸鹽緩沖液(0.1 M二甲胂酸鈉，0.1 M蔗糖，0.25%戊 二醛）固定 15分鐘。PBS清洗一次。0.5%Triton X-100透化處理S-ISminc3PBS洗5次，5min/ 次。濾紙吸干周圍液體，免疫組化筆將切片處畫圈，滴加封閉液(I〇 %血清)約IOOyL，濕盒中 封閉2小時。用封閉液稀釋熒光抗體。封閉完后，棄去封閉液，滴加一抗p_Src( 1:1000)，室溫 孵育2小時或4°C孵育過夜。PBS洗5次，5min/次。加二抗避光孵育1小時。PBS洗5次，5min/次。 滴加封片液(甘油:PBS = 9:1)，避光拍照。
[0216] 5.4實驗結果
[0217] 腦組織切片免疫化學染色和熒光染色顯示，在MCAO腦缺血模型中，異補骨脂二氫 黃酮能夠抑制腦內組織中的Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化(見圖5)。
[0218] 5.5小結：同實施例4相同，異補骨脂二氫黃酮能夠在體內抑制Src激酶家族Fyn和 Src激酶的磷酸化。
[0219]實施例6.異補骨脂二氫黃酮及其類似結構化合物具有相似的抑制Src激酶家族 Fyn和Sr c激酶的磷酸化的能力
[0220] 6.1目的:觀察相似結構化合物是否與異補骨脂二氫黃酮相似具有抑制Src激酶家 族Fyn和Src激酶的磷酸化的能力。
[0221] 6.1實驗材料
[0222] 6.1.1實驗試劑
[0223] 6.1.1.1細胞株:HUVEC細胞株購自美國ATCC公司(HUVEC，CRL-1730)。
[0224] 6 · 1 · 1 · 2抗體：HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease(GAFOI^KC-SGS)購自上海康成生物有限公司；Goat anti-rabbit IgG-HRP(sc-2004)、Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)均購自 SANTA CRUZ公司4帥卜 Src antibody(ab7950)、Anti_Fyn antibody[FYN_01](abl881)、Anti_Src(phospho Y529) anti body [ Y232] (ab32078)、Anti-Fyn (phospho Y530) anti body (ab 182661)購自 abeam 公 司。
[0225] 6丄1.3試劑:1^4裂解液（弱，？00130);苯甲基磺酰氟?]\〇 7(100111]\1，3了506)均購自 碧云天生物技術研究所;十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyI sulfate，SDS)、β_疏基乙醇、甘 氨酸(Glycine)、Tris堿、丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過硫酸胺(ammonium persulfate， APS)、四甲基乙二胺（tetrame thy lenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA)、Tween_20均貝勾自 Sigma公司；ECL Tmmobi I on Western Chemiluminescent HRP Substrate(WBKLS0500)購自Millipore公司；蛋白質轉印膜(硝酸纖維素膜，NC膜)購自 美國Pall公司；細胞培養基DMEM低糖，FCS，0.25%胰蛋白酶均購自美國GIBC0;氨芐青霉素 (A6140)、Ang Π、DMS0購自Sigma; EDTA購自上海生物工程;異補骨脂二氫黃酮購自上海源葉 生物有限公司。
[0226] 6.1.2實驗儀器同實施例1.2
[0227] 6.2實驗方法同實施例1.3
[0228] 6.3實驗結果
[0229]運用免疫印跡法測試顯示，光甘草寧、異補骨脂二氫黃酮均具有抑制Src激酶家族 Src和Fyn激酶蛋白磷酸化的作用(見圖6)。
[0230] 6.4小結:異補骨脂二氫黃酮及其類似物均具有抑制Src激酶家族Fyn和Src激酶的 磷酸化的能力。
[0231]本發明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應理解的是，在不偏離本發明精神 之前提下，本領域專業人員可對其進行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請 所附權利要求的覆蓋范圍。
【主權項】
1. 一種活性成分的用途，所述活性成分為具有式（I)結構的化合物，或其二聚體，或其 藥學上可接受的鹽、互變異構體、立體異構體或前藥：其中，扣、1?2、1?3、1?4、1?5、1?6、1?7、1?8和1?9各自獨立地選自下組：氨、細2-畑=(：(畑3)2、00 (C冊H) 4C此0H、ORa、OCOORa、OCONRa化、OS〇2Ra和0S0濁a ;所述的Ra和化各自獨立地選自下組： 氨、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12締基、取代的或未取代的C2-C12 烘基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30雜芳基； 其特征在于，所述活性成分用于制備Src激酶和/或巧η激酶的活性抑制劑。2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述Ri選自氨、徑基或烷氧基，R2選自氨或 C出-CH = C (C曲)2，R3選自徑基、烷氧基或0C (C冊Η) 4C此0H，R4為氨，Rs選自氨或徑基，R6選自氨 或C此-CH = C (C曲）2，R?選自氨或徑基，1?8選自氨或C此-CH = C (C曲）2，R9選自氨、徑基或燒氧 基，且Rio選自氨或徑基。3. 如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述活性成分選自下列化合物：4.如權利要求1所述的用途，所述Src激酶和/或巧η激酶的活性抑制劑可用于防治下列 疾病：屯、肌梗塞、高血壓、肺動脈高血壓、腦卒中、屯、肌肥大、潰瘍性結腸炎、急性膜腺炎、血 小板減少癥、慢性骨髓白血病、腫瘤、霍奇金氏淋己瘤、Β細胞淋己瘤、骨質疏松癥和骨壞死、 腎纖維化、肺纖維化、皮膚纖維化或囊性纖維化。
【文檔編號】A61P19/10GK105963291SQ201610387981
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】許錦文, 馬婧, 凌霜
【申請人】上海中醫藥大學