一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，白芨多糖經脫水劑及縮合劑反應接枝疏水材料，反應液經純沉、透析、冷凍干燥后制得疏水改性低分子量白芨多糖衍生物，通過調節疏水材料的種類及與白芨多糖的用量比，制備不同取代度的白芨多糖衍生物。所得衍生物與疏水性藥物在有機溶液中通過透析、磁力攪拌、超聲波分散自組裝成包載藥物的載藥聚合物膠束，粒徑范圍為50～500nm。結果表明，該方法能夠穩定制備載藥聚合物膠束，且粒徑分布均勻，該納米膠束可作為疏水性藥物的靶向遞送載體。
【專利說明】
一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法
技術領域
[0001]本發明屬于功能性醫藥材料與納米技術領域，本發明涉及一種可以用作藥物載體的疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，具體來說就是將白芨多糖通過接枝疏水材料改性生成聚合物，其在水溶液中自組裝成具有殼核結構的聚合物膠束，進一步通過藥物復合生成載藥聚合物膠束。
【背景技術】
[0002]多糖是自然界比較豐富的天然高分子聚合物，具有抑菌、消炎、抗腫瘤、抗氧化及調節免疫活性等療效，對多糖及其衍生物進行結構修飾使之形成兩親性嵌段共聚物是目前超分子自組裝研究的熱點之一。多糖類高分子化合物由于其生物相容性好、安全性高且易于化學改性的優點，被廣泛地應用于藥物載體，基于天然高分子材料制備自組裝聚合物膠束得到更加廣泛地關注。
[0003]白芨多糖是從中藥白芨中提取純化得到的一種多糖，由葡萄糖和甘露糖(比例為1:4)以辦唐苷鍵聚合而成的一種葡萄甘露聚糖，具有良好的生物相容性和可降解性。研究表明，白芨多糖具有止血、促進創傷愈合、抗潰瘍、促進骨髓造血等生物活性，臨床應用廣泛。作為天然高分子材料，有功能緩釋性、局部滯留性、自身降解性、無刺激性、無毒副作用，具有資源豐富，廉價易得等輔料的特性，在藥劑學領域越來越受到重視。但天然白芨多糖水溶性較強，其骨架易于溶蝕，控釋作用較差，并且分子結構中缺少疏水區域，不易于包載難溶性藥物，因此有必要對白芨多糖進行疏水改性。
[0004]近年來，國內外學者對于白芨多糖作為藥物載體的研究日益增多，可以將其單獨或與其他材料協同應用，如制備PLGA/白芨復合微球用于栓塞腫瘤血管，用于增加滴眼液粘稠度。其中化學改性白芨多糖作為載體是研究熱點之一。常用多糖疏水改性材料主要有脫氧膽酸、膽酸、&6-(:18脂肪酸等，硬脂酸改性的白芨多糖聚合物在水溶液中能自組裝成聚合物膠束，這種聚合物膠束內部為硬脂酸疏水中心、外部為多糖親水結構，具有良好的生物相容性，能夠起到包載疏水性藥物、起到緩控釋作用。
[0005]白芨多糖是極有發展前途的生物材料，其結構中含有大量的活性羥基，易于進行結構改造。目前，白芨膠硫酸酯與陽離子白芨膠已有相關報道。本發明在白芨多糖的基礎上進行硬脂酸疏水改性，制備疏水改性白芨多糖載藥體系，研究其釋藥性及靶向性，為此本發明公開一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法。本發明制備的一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束粒徑范圍為50?500nm。
[0007]本發明提供的一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束是以疏水材料硬脂酸、白芨多糖為原料，具體合成工藝為:
[0008]在催化劑與縮合劑存在下，硬脂酸與白芨多糖反應生成硬脂酸疏水改性白芨多糖，其取代度(每100個糖單位含有硬脂酸數量計)為5?15%。疏水改性的白芨多糖與疏水性藥物進一步自組裝成聚合物膠束，疏水性藥物包裹在疏水改性白芨多糖聚合物膠束中心。
[0009]所述的催化劑為:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1):4_二甲基吡啶(DMAP):硬脂酸，摩爾比為1.3:1:1。
[0010]所述的反應條件為:室溫下，恒溫磁力攪拌活化lh，在活化后的反應液中逐滴加入白芨多糖，38°C下反應48h。
[0011 ]所述的自組裝聚合物膠束是將疏水改性的白芨多糖用DMSO溶解，透析袋透析，超聲波分散，微孔濾膜過濾定容所得。
[0012]所述的疏水基團硬脂酸也可用脫氧膽酸、膽酸、軟脂酸生物替代。
[0013]所述的疏水改性白芨多糖聚合物膠束粒徑為50?500nm，所述的白芨多糖純度為90%及以上，分子量為10000?200000。
[0014]本發明所述的一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法包括的步驟為:
[0015]I)室溫下，將4-二甲基氨基吡啶(DMAP)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)溶解于DMSO中，攪拌反應活化2h，滴加入白芨多糖的二甲亞砜(DMSO)溶液，反應36h，將反應液加入冰無水乙醇中，析出白色沉淀，靜置過夜，抽濾，分別用無水乙醇、乙醚洗滌產物，50 °C下干燥，得接枝材料疏水改性的白芨多糖;摩爾配比為EDC: DMAP:疏水材料=1.3:1:1。
[0016]2)將接枝材料疏水改性的白芨多糖聚合物用最少量DMSO溶解，溶液轉入透析袋，放入500mL蒸饋水中，100rpm/min磁力攪拌，每隔4h換水，透析36h，將DMSO透析干凈，透析完畢，超聲波細胞分散儀分散2min，用0.45μπι微孔濾膜過濾，定容，得接枝材料疏水改性的白芨多糖聚合物膠束溶液;透析袋的截留分子量為8?12kDa。
[0017]本發明提供了一種硬脂酸疏水改性白芨多糖包載抗腫瘤藥物粒子，硬脂酸疏水改性白芨多糖聚合物膠束作為藥物載體，抗腫瘤藥物與載體質量比為1:5?10，所述的包載抗腫瘤藥物為阿霉素、表阿霉素、吉非替尼、多西他賽等。
[0018]本發明提供了一種硬脂酸疏水改性白芨多糖包載抗腫瘤藥物粒子及其制備方法包括的步驟為:
[0019]將硬脂酸疏水改性白芨多糖、抗腫瘤藥物溶解于DMSO中，至于透析袋中避光保存，前8h，每隔2h換一次水，后24h每隔8h換一次水，直至DMSO透析干凈為止。
[0020]所述的透析袋截留分子量為8?20kDa。
[0021 ]所述的硬脂酸疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束粒徑為50?500nm。
[0022]本發明公開了一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，首先通過白芨多糖疏水改性生成一種兩親性的共聚物，以便于聚合物膠束的制備及疏水藥物的包載。
[0023]本發明公開了一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束粒子成球型，粒徑呈單峰分布，硬脂酸疏水改性白芨多糖能夠包載疏水性及兩親性藥物粒子，使其呈現緩控釋效果。
【附圖說明】
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[0024]圖1白芨多糖(a)和硬脂酸疏水改性白芨多糖衍生物(b)的紅外圖譜
[0025]圖2白芨多糖(a)和硬脂酸疏水改性白芨多糖衍生物(b)的1H-NMR圖譜
[0026]圖3白芨多糖衍生物聚合物膠束的透射電鏡圖及粒徑分布圖
[0027]圖4載藥白芨多糖衍生物聚合物膠束的透射電鏡圖及粒徑分布圖
[0028]圖5載藥聚合物膠束的包封率與載藥量
[0029]圖6載藥聚合物膠束的粒徑及其Zeta電位
[0030]圖7羅丹明B和包載羅丹明B聚合物膠束被HepG2細胞株攝入2h的熒光圖譜[0031 ]圖8羅丹明B和包載羅丹明B聚合物膠束被HepG2細胞株攝入4h的熒光圖譜
【具體實施方式】
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[0032]實施例1:硬脂酸疏水改性白芨多糖的合成與取代度的計算
[0033]取白芨多糖樣品400mg，溶解于4mL的DMSO當中，備用；準確稱取疏水材料硬脂酸62mg、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)55.1mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)96.9mg溶解于3mL DMSO中，室溫攪拌反應活化2h，滴加入白芨多糖的二甲基亞砜(DMSO)溶液，反應48h，將反應液加入冰無水乙醇中，析出白色沉淀，靜置過夜，抽濾，分別用無水乙醇、乙醚洗滌產物，50 0C下干燥，得接枝材料疏水改性的白芨多糖。
[0034]白芨多糖和硬脂酸修飾白芨多糖紅外光譜結果見圖1。白芨多糖含有多羥基在3350cm-l，硬脂酸修飾白芨多糖樣品在約3400cm-l處有較強的羥基(-0H)伸縮振動吸收峰，說明白芨多糖衍生物中有大量羥基存在。白芨多糖紅外圖譜中，892.98cm-l與810.2cm-l分別為-葡萄糖殘基與甘露糖殘基吸收峰，1035.7和1159.14cm-l則表明白芨多糖是吡喃糖苷。與白芨多糖相比，硬脂酸修飾白芨多糖在1730cm-l處出現酯羰基中C = O的特征伸縮振動峰、2926.35cm-l處為甲基-CH3的強吸收峰，結果表明硬脂酸已成功接枝到白芨多糖羥基上。
[0035]取2?3mg白芨多糖及合成的硬脂酸接枝白芨多糖聚合物，以DMSO-D6為溶劑，采用VARINAINOVA 400MHz型核磁共振儀測定接枝產物的核磁共振圖譜，如圖2相對于白芨多糖的核磁圖譜，白芨多糖接枝硬脂酸的圖譜上出現了波數在1.24ppm的亞甲基峰以及波數在0.85ppm出現甲基峰，表明硬脂酸基團成功的接枝到了白芨多糖分子的羥基上。根據亞甲基和α-1，6，α-1，4糖苷鍵的核磁共振圖譜峰下面積通過公式求算聚合物的硬脂酸的取代度為12.92%。
[0036]實施例2:硬脂酸疏水改性的白芨多糖聚合物膠束子制備方法及其表征
[0037]取不同取代度的白芨多糖疏水接枝材料(SA-BSPS)10mg，用3mL DMSO溶劑溶解。分別轉入透析袋中，置于10mL水中，前8h，每隔2h換水一次，后24h，每隔8h換水一次，直至DMSO透析完全為止。透析完成后，定容至10mL，120W功率超聲30s，用0.45μπι微孔濾膜過濾。從圖3可知，聚合物膠束呈球形分布，在動態光散射條件下，SA-BSPS聚合物膠束呈單峰分布，粒徑約150nm，Zeta電位約為_20mV。
[0038]實施例3:硬脂酸疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束子制備方法及其表征
[0039]取多西他賽(DTX)加乙醇超聲溶解，不斷攪拌條件下(lOOrpm/min)將多西他賽乙醇溶液逐滴加入到50mL白芨多糖衍生物聚合物膠束溶液中，滴加完成后繼續攪拌10min，40°(:條件下旋轉蒸發除乙醇，待載藥聚合物膠束(DTX-SA-BSPS)溶液冷卻至室溫后，加蒸餾水定容至50mL，即得。如圖4，通過投射電鏡觀察形態為均勻的球型，粒徑約50?500nm。
[0040]實施例4:硬脂酸疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束子載藥量與包封率表征[0041 ] 量取載藥聚合物膠束lmL，4°C超速離心(12000rpm/min)離心lOmin，取上清液，高效液相色譜儀(HPLC)測定，通過標準曲線方程計算藥物含量，記為Wfree;另量取ImL DTX-SA-BSPS聚合物膠束，加入2mL無水乙醇，渦旋振蕩2min，超聲5min，使藥物充分溶解在無水乙醇中，4°C超速離心(12000rpm/min)離心lOmin，取上清液，HPLC測定，通過標準曲線方程計算藥物含量，記為WtOtal，載體材料的質量記為Wc^rrier，通過如下公式計算載藥聚合物膠束中DTX的載藥量(Loading Content，LC)及包封率(Encapsulat1n Efficiency ,EE)。
[0042] LC(%) = ( fftotal-fff ree ) / ( fftotal-fff ree ) +ff carrier X 100 %
[0043 ] EE(%) = ( fftotal-fffree ) /fftotal X 100%
[0044]以峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，線性回歸方程為:Y= 11952X+9498.7(R2 =0.9998)。結果表明，多西他賽在10.12?100.53yg/mL濃度范圍內線性關系良好。日內精密度RSD為1.25%，日間精密度RSD為1.28%。從圖5可知，藥物與載體材料比從1: 20到1:9時，隨著投藥量的逐漸增加，載藥聚合物膠束的包封率與載藥量呈增加趨勢，當藥物與載體材料比為1:9時包封率與載藥量達到最高，此時載藥量為(9.13±0.17)%，包封率為(81.11 土
0.18) %。繼續增加藥物，載藥量與包封率均呈下降趨勢，但包封率下降明顯，其原因可能為疏水核心載藥能力有限，在藥物與載體材料1:9時達到最高，繼續增加的藥物無法進入聚合物膠束疏水核心，反而會引起粒子直接的碰撞導致藥物粒子析出。當藥物與載體材料比為1:5時在聚合物膠束溶液中，可明顯地觀察到有藥物粒子懸浮在聚合物膠束溶液中。通過動態光散射儀(DLS)測定粒徑分布與Zeta電位結果見圖6，由圖可見藥物與載體材料比從1:20至Ijl: 5時，藥物粒子的粒徑均小于100nm。載藥聚合物膠束Zeta電位在維持-20mV左右，未隨藥物與載體材料比值發生明顯變化，說明藥物的加入不會改變聚合物膠束的Zeta電位，從而保持載藥聚合物膠束水溶液維持在穩定狀態。
[0045]實施例5:細胞攝入初步考察
[0046]取適量熒光染料羅丹明B與0.5mg/mL硬脂酸修飾白芨多糖聚合物膠束混合，室溫攪拌5h ；將混合液轉移至透析袋(分子量約500)，置500mL蒸饋水中透析，磁力攪拌速率為100rpm/min。透析8h，每2h換蒸饋水一次，每次500mL。將透析后得到的羅丹明聚合物膠束用基礎培養基定容至5yg/mL(羅丹明B濃度)。將密度為2 X 14個/mL胰酶消化的HepG2肝癌細胞，以ImL/孔接種于24孔板，每孔ImL，5 %⑶2 37 °C培養過夜，分別于Oh、2h、4h在對應孔中加入游離羅丹明B、羅丹明B聚合物膠束(羅丹明B終濃度均為5yg/mL)。孵育結束后用冷PBS沖洗3次，再加入ImL PBS后加入2yL Hoechest33342染料染核，靜置15min，采用熒光倒置顯微鏡初步檢測了包載羅丹明B聚合物膠束和羅丹明B被HepG2細胞株攝入的情況。紅色熒光(亮色細胞核的周圍細胞質部分熒光)表示藥物攝取進入細胞的分布及強度，熒光強度越大攝取量越多。細胞株攝入2h時情況見圖7，從熒光強度上比較，孵育2h時二者在細胞質的熒光強度相近，說明攝入程度相當。細胞株攝入4h時情況見圖8，從圖可知，孵育4h后羅丹明B聚合物膠的熒光強度強于游離羅丹明B，且在整個過程中，熒光強度隨孵育時間的延長而增強。載藥膠束細胞攝取的熒光強度大于游離羅丹明B，可能是硬脂酸修飾白芨多糖聚合物載體具有較好的生物相容性，增強了羅丹明B與細胞的融合，促進細胞的攝取。
【主權項】
1.一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，其特征在于它的步驟包括: 1)室溫下，將4-二甲基氨基吡啶(DMAP)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)溶解于少量二甲亞砜(DMSO)中，磁力攪拌活化lh，向活化反應液中逐漸滴入白芨多糖(BSPS) DMSO溶液，38 V條件下反應48h; 2)反應結束后，將反應液加入10倍量冰無水乙醇，靜置過夜，濾過，沉淀物用無水乙醇與乙醚各10mL分別交替洗滌3次后，50 °C烘干得接枝材料疏水改性的白芨多糖；摩爾配比為 EDC: DMAP:疏水材料= 1.3:1:1; 3)將接枝材料疏水改性的白芨多糖聚合物用最少量DMSO溶解，超聲使其全部溶解，轉移至透析袋(8?12kDa)，置500mL蒸饋水中透析，磁力攪拌速率為10rpm/min ；透析過程中前8h，每2h更換蒸餾水一次，后24h，每8h更換蒸餾水一次，空白聚合物膠束經0.45μπι微孔濾膜濾過，濾液用蒸餾水定容至50mL，得接枝材料疏水改性的白芨多糖聚合物膠束溶液;透析袋的截留分子量為8?12kDa。2.根據權利要求1所述的一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，其特征在于:一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，步驟I)中所述接枝材料可以是脫氧膽酸、C16?C18脂肪酸中的任意一種，所述疏水材料的取代度為5?15%。3.根據權利要求1所述的一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，其特征在于:所述白芨多糖的純度大于90%。4.根據權利要求1所述的一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，其特征在于:所述溶解EDC、DMAP、疏水材料及接枝材料疏水改性的白芨多糖聚合物的溶劑為DMSO05.根據權利要求1所述的一種疏水改性白芨多糖載藥聚合物膠束及其制備方法，其特征在于:所述的疏水改性白發多糖聚合物膠束子的粒徑為50?500nm;所述的白發多糖分子量為 10000 ?200000。
【文檔編號】A61K31/5377GK105963255SQ201610550443
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月13日
【發明人】管清香, 孫士淋, 孫丹丹, 張廣遠, 王苗, 孫誠
【申請人】吉林大學