修飾SiO2納米載體的制備設備及制備方法
【專利摘要】本發明涉及修飾SiO2納米載體的制備設備及制備方法；其制備設備包括陶瓷材料制成的反應容器本體、超聲波換能器、轉子攪拌槳和高頻電磁線圈；制備方法是將SiO2納米粒投入反應容器的雙蒸水中；電磁攪拌混勻，重懸，加入十八烷基三甲基溴化銨（OTAB），室溫電磁攪拌，離心，靜置陳化去上清，雙蒸水洗滌，再次重懸，離心，冷凍干燥，即可制成修飾SiO2納米載體；本發明具有良好生物相容性、無免疫原性。所制備的修飾SiO2納米載體可有效解決現有腫瘤治療藥物副作用大，不能很好的抑制腫瘤細胞增殖的問題。
【專利說明】
修飾S i 〇2納米載體的制備設備及制備方法
技術領域
[00〇1]本發明涉及Si〇2納米粒載體的制備技術，特別涉及修飾Si〇2納米載體的制備設備和一種用十八烷基三甲基溴化銨修飾的Si02納米粒的制備方法;使用該制備設備可以方便制備修飾si〇2納米載體(OTAB-Si〇2_NP);用該方法制得的修飾Si〇2納米載體，可以用于對癌癥基因治療。【背景技術】
[0002]近年來，隨著基因轉移技術的日趨成熟，癌癥的基因治療已成為生物科學和臨床醫學的研究熱點之一。目前，基因治療研究和臨床應用中常用的病毒載體和非病毒載體，都存在無法克服的局限性。隨著納米技術的出現，納米粒載體以其高轉染效率、低毒性、無免疫原性等特點正引起越來越多的關注。癌癥和腫瘤已經成為威脅人類健康的殺手，但是目前還沒有一種藥物可以治愈癌癥和腫瘤，所用的治療癌癥的藥物多含有毒性，其對癌細胞有抑制作用的同時對正常細胞也有毒害作用。尋找或開發一種可以將抑制癌細胞和腫瘤細胞的藥物定向運輸到靶細胞的納米粒載體，且實現藥物的緩釋是目前研究的熱點和難點。在納米材料中，Si02具有良好的生物相容性、高反應活性表面、獨特的跨膜能力、大離域鍵及無免疫原性等優點，可以與許多生物醫藥分子之間形成較強的鍵相互作用，使其在生物醫藥領域的藥物傳遞和基因載體方面具有巨大的應用潛力。但是，Si02納米粒(參見附圖3)的表面能高，在使用中極易團聚，并且Si02納米粒與大多數聚合物材料相容性差，此夕卜，Si02納米粒表面電位為負值，不能攜帶負電荷的DNA分子。
[0003]因而十八烷基三甲基溴化銨修飾的Si〇2納米粒的制備和應用尚未有報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的，是要提供一種修飾Si02納米載體的制備設備;使用該制備設備可以在制備工藝中方便地操作制備修飾S i 〇2納米載體。
[0005]本發明的另一目的，是還要提供一種具有良好生物相容性、無免疫原性的修飾 Si〇2納米載體的制備方法。所制備的修飾Si〇2納米載體的應用，可有效解決現有腫瘤治療藥物副作用大，不能很好的抑制腫瘤細胞增殖的問題。
[0006]本發明所述一種修飾Si02納米載體的制備設備，包括陶瓷材料制成的反應容器本體、超聲波換能器、轉子攪拌槳和高頻電磁線圈；反應容器本體為有底的圓筒體，內底面正中央設置豎直向上的支撐軸；圓筒體上口有容器蓋;所述支撐軸下部分是軸座，上部分是軸桿，軸座和軸桿兩者之間有一軸臺階過度連接，且軸座直徑大于軸桿直徑;上述超聲波換能器固定在反應容器本體的外底面;上述轉子攪拌槳為金屬導體方框架和槳葉組成，方框架上下兩框邊的中部上下對稱地設有軸孔，左右兩框邊均分別固定有槳葉，方框架表面襯耐腐蝕材料;所述轉子攪拌槳放置在反應容器本體的容腔內，其方框架通過軸孔套在支撐軸的軸桿上可以自由旋轉；上述高頻電磁線圈由帶磁極靴的環形磁芯和線圈所組成;磁極靴有四個，對稱地分布在環形磁芯的內環；四個磁極靴上均纏繞有線圈，并緊貼在反應容器本體外筒壁上。
[0007]本發明修飾S12納米載體的制備方法是:將S12納米粒投入反應容器的雙蒸水中；電磁攪拌混勻，超聲波振動使S12納米粒重懸于雙蒸水中；加入十八烷基三甲基溴化銨(OTAB)，室溫電磁攪拌3h;離心30min，靜置陳化12?20h去上清;沉淀物用雙蒸水洗滌三次，返回反應容器再次重懸，離心;所得離心沉淀物冷凍干燥，即可制成修飾S12納米載體;所述修飾Si02納米載體顆粒的平均直徑為20?50nm。
[0008]所述十八烷基三甲基溴化銨(別名OTAB或STAB;硬脂基三甲基溴化銨;溴化三甲基十八烷基錢;三甲基十八烷基溴化銨)是一種化學物質，分子式是C21H46BrN;原料為白色或微黃色固體;凝固點32°C，HLB值15.8;溶于水，穩定性好，耐熱，耐光，耐強酸、強堿，可微生物降解;一般用作表面活性劑，還應用于催化劑，乳化劑，消毒劑，殺菌基，抗靜電劑。
[0009]所述的雙蒸水是重蒸水的一種，重蒸水是將經過一次蒸餾后的水，再次蒸餾所得到的水。
[0010]本發明利用專門的修飾S12納米載體的制備設備;使比重與水相差較大的S12納米粒在充滿微泡且高速旋轉的雙蒸水中得以懸浮;提高了 S12納米粒的表面活性，利于十八烷基三甲基溴化銨中的氨基結合。當十八烷基三甲基溴化銨(OTAB)修飾S12納米粒后所形成的沉淀物，其修飾層并不是理想的均勻包裹海綿層，而是處于大小不一、部分殘缺粘連的團聚體;為了對該沉淀物整形，本發明設計了返回反應容器再次重懸工序;此時，開啟變頻器將高頻電流工作頻率調整為1000Hz，使轉子攪拌槳以28000r/min的旋轉速度攪拌雙蒸水；同時調整變頻器的高頻電流強度，使反應容器外加高頻電磁線圈所產生的磁場強度達5-8T;經高頻磁場中高速旋轉的雙蒸水吹打產生分散團聚體的剪切力，S12納米顆粒中和S12納米顆粒表面海綿層中所攜帶互異的電荷，在強交變磁場的洛倫茲力作用下，按照變頻器的電流頻率產生強力振動;兩力共同作用的結果，修飾S12納米團聚體迅速瓦解，變成一個個的S12納米顆粒表面均包裹特殊官能基團海綿體的球體。由此，可見，本發明使用專用的修飾S12納米載體的制備設備，不但能夠實現利用電磁攪拌和超聲波振動，使得S12納米顆粒重懸和修飾S12納米載體顆粒再次重懸;還可以利用攪拌雙蒸水的剪切力和強交變磁場的洛倫茲力實現修飾Si02納米團聚體瓦解，變成一個個的修飾Si02納米顆粒的球體。
[0011]本發明利用十八烷基三甲基溴化銨(OTAB)修飾S12納米粒，使S12納米粒的Zeta電位變為正值，S12納米粒因此可以通過靜電作用結合DNA，大大提高治療基因的轉染效率。
[0012]上述的Zeta電位又叫電動電位或電動電勢，是指剪切面的電位，是表征膠體分散系穩定性的重要指標。
[0013]與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在:用本發明獲得的修飾S12納米載體，平均直徑為20?50nm，Zeta電位變為正值，親水性強;通過修飾賦予了 S12納米粒表面特殊的官能基團；參見附圖4，該特殊的官能基團是帶正電荷的氨基;在水介質中負載含羰基的抗腫瘤藥物或腫瘤新生血管抑制劑具有兩親性質，不僅可有效結合DNA，而且可保護DNA免受破壞，并具有較高的體外基因轉運效率;本發明使用專用的修飾S12納米載體的制備設備操作簡單，無須加熱，成本低，易于規模生產，可以應用于對癌癥基因治療，它作為DNA結合載體材料安全，不存在毒性的風險，可有效解決現有腫瘤治療藥物副作用大，不能很好的抑制腫瘤細胞增殖的問題。【附圖說明】
[0014]圖1為本發明修飾Si〇2納米載體的制備設備示意圖。[0〇15]圖2為圖1的A-A剖視不意圖。[〇〇16] 圖3為Si02納米粒透視電鏡圖。[0〇17]圖4為本發明修飾Si〇2納米載體示意圖。
[0018]圖5為本發明修飾Si〇2納米載體材料透視電鏡圖。[0〇19]圖6為圖5局部放大不意圖。
[0020]圖7為實施例2合成的修飾Si02納米載體加入抗腫瘤LivinlshRNA質粒后的顯微鏡成像示意圖。[0021 ]附圖標記是:1反應容器本體;2超聲波換能器;3轉子攪拌槳;4高頻電磁線圈；5容器蓋;6軸座;7軸桿;8方框架;9槳葉；10軸孔;11磁極靴;12環形磁芯；13線圈。【具體實施方式】[〇〇22]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。[〇〇23] 實施例1一種修飾Si02納米載體的制備設備，包括陶瓷材料制成的反應容器本體1、超聲波換能器2、轉子攪拌槳3和高頻電磁線圈4;反應容器本體1為有底的圓筒體，內底面正中央設置有豎直向上的支撐軸；圓筒體上口有容器蓋5;所述支撐軸下部分是軸座6，上部分是軸桿7，軸座6和軸桿7兩者之間有一個軸臺階過渡連接，且軸座6直徑大于軸桿7直徑;上述超聲波換能器2固定在反應容器本體1的外底面;上述轉子攪拌槳3為金屬導體方框架8和槳葉9所組成，方框架8表面襯耐腐蝕材料;方框架8上下兩框邊的中部分別設有上下對稱的軸孔10，左右兩框邊分別固定有槳葉9;所述轉子攪拌槳3放置在反應容器本體1的容腔內，其方框架8 通過軸孔10套在支撐軸的軸桿7上，由軸座6支撐可以自由旋轉;上述高頻電磁線圈4由帶磁極靴11的環形磁芯12和線圈13所組成;磁極靴11有四個，中心對稱地分布在環形磁芯12的內環；四個磁極靴11上均纏繞有線圈13,并緊貼在反應容器本體1外筒壁上。[〇〇24] 所述高頻電磁線圈4外接高頻移相電容和變頻器;變頻器輸出頻率1000-1200HZ可調的高頻電流;所述超聲波換能器2外接輸出功率60w的超聲波發生器;超聲波發生器工作頻率45-50kHz。[〇〇25]本發明修飾Si02納米載體的制備方法是:將Si02納米粒lg投入反應容器的雙蒸水中；電磁攪拌混勻，超聲波振動使Si02納米粒重懸于雙蒸水中；加入0.lg十八烷基三甲基溴化銨(0TAB)，室溫電磁攪拌3h，離心30min，靜置陳化12?20h去上清;沉淀物用雙蒸水洗三次，返回反應容器再次重懸，離心，所得離心沉淀物冷凍干燥，即可制成修飾Si02納米載體； 并進行透射電鏡掃描(JEOL JEM-1200EX)，結果見圖5、圖6;所述修飾Si02納米載體顆粒的平均直徑為20?50nm〇
[0026]上述的將Si02納米粒投入反應容器的雙蒸水中，Si02納米粒與雙蒸水的固液質量體積比為1:4?8g/L。[〇〇27]上述的重懸是使用修飾Si02納米載體的制備設備;開啟變頻器將高頻電流工作頻率調整為1100Hz，使轉子攪拌槳3以30000r/min的旋轉速度攪拌雙蒸水;開啟超聲波發生器產生超聲波振打，將S12納米粒分散均勻;所述的超聲波振動時間30min。
[0028]上述室溫攪拌轉速30000r/min。
[0029]上述的再次重懸是將洗滌收集的沉淀物返回修飾S12納米載體的制備設備中，開啟變頻器將高頻電流工作頻率調整為1000Hz，使轉子攪拌槳3以28000r/min的旋轉速度攪拌雙蒸水；同時調整變頻器的高頻電流強度，使反應容器外加高頻電磁線圈4所產生的磁場強度達5-8T;經高頻磁場中高速旋轉的雙蒸水吹打分散，使沉淀物顆粒表面形成特殊的官能基團海綿體。
[0030]上述的冷凍干燥是先將離心沉淀物在-60°C下凍結;然后將凍結的離心沉淀物在
0.9?I帕的真空下，再高速離心干燥;高速離心的轉速為30000-36000r/ min;干燥時間2-4h0
[0031]實施例2
將所得修飾S12納米載體可以進一步通過化學偶聯交聯攜帶負電荷的DNA分子、或攜帶含羰基的抗腫瘤藥物或腫瘤新生血管抑制劑，從而應用于腫瘤分子成像診斷和siRNA干擾治療見圖7 ;具體步驟是:將制備得到的修飾Si02納米載體30mg和抗腫瘤LivinlshRNA質粒6mg在50mL雙蒸水中混合均勻，在室溫下，600r/min攪拌24-48h使其充分反應，經靜置陳化8?1h沉淀后，再用雙蒸水洗凈后，在20-60°C，5?10帕的真空下，干燥12-20h，得到以修飾S12納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統。
[0032]所述抗腫瘤LivinlshRNA質粒和修飾Si02納米載體的質量含量比為1:3。
[0033]以修飾S12納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統的體內抗腫瘤活性測定:取小鼠S180腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3 mL，小鼠喂養7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X 16個/mL的細胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后，取其中24只腫瘤體積多100 mm3昆明小鼠，隨機分為3組，每組8只。具體分組如下:(I)對照組(NS組):生理鹽水；(2)未修飾S12納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統治療組;(3)修飾S12納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統治療組;3組均采用靜脈給藥的方式。每2 d給藥一次，每次對應組分別注射生理鹽水lmL、2mg未修飾Si02納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統、2mg/ Si02納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統ImL;共給藥7次。整個實驗過程中每日觀察小鼠生活狀態，每2 d稱其體重并使用游標卡尺測量小鼠肉瘤的長徑(A)與短徑(B)，按公式腫瘤體積V=1/2(AXB2)計算腫瘤體積。當給藥以未修飾或修飾Si02納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統時，小鼠的腫瘤體積的增加得到了明顯的抑制；與生理鹽水組和未修飾的納米載體組比較，修飾S12納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統組的效果更好。
[0034]由上業已經證實，以修飾S12納米載體的抗腫瘤藥物傳遞系統，提高了藥物的滲透性，可以作為抗腫瘤藥物的載體使用，能很好的抑制腫瘤細胞增殖的問題。同時測試結果表明，本發明的新的以修飾S12納米載體的抗腫瘤藥物傳遞系統，對生物體的毒性很低，物理以及化學穩定性良好，質量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。
[0035]本發明預期可以用于治療腫瘤的一種良好的載體，還可以作為化學藥物、蛋白質、核酸的轉運載體，是藥物制備上的一大創新。
【主權項】
1.一種修飾Si〇2納米載體的制備設備，包括陶瓷材料制成的反應容器本體(1);其特征 在于:還包括超聲波換能器(2)、轉子攪拌槳(3)和高頻電磁線圈(4);反應容器本體(1)為有 底的圓筒體，內底面正中央設置有豎直向上的支撐軸；圓筒體上口有容器蓋(5);所述支撐 軸下部分是軸座(6)，上部分是軸桿(7)，軸座(6)和軸桿(7)兩者之間有一個軸臺階過渡連 接，且軸座(6)直徑大于軸桿(7)直徑;上述超聲波換能器(2)固定在反應容器本體(1)的外 底面;上述轉子攪拌槳(3)為金屬導體方框架(8)和槳葉(9)所組成，方框架(8)表面襯耐腐 蝕材料;方框架(8)上下兩框邊的中部分別設有上下對稱的軸孔(10)，左右兩框邊分別固定 有槳葉(9);所述轉子攪拌槳(3)放置在反應容器本體(1)的容腔內，其方框架(8)通過軸孔 (10)套在支撐軸的軸桿(7)上，由軸座(6)支撐可以自由旋轉;上述高頻電磁線圈(4)由帶磁 極靴(11)的環形磁芯(12)和線圈(13)所組成;磁極靴(11)有四個，中心對稱地分布在環形 磁芯(12)的內環；四個磁極靴(11)上均纏繞有線圈(13)，并緊貼在反應容器本體(1)外筒壁 上。2.根據權利要求1所述的一種修飾Si02納米載體的制備設備，其特征在于:所述高頻電 磁線圈(4 )外接高頻移相電容和變頻器;變頻器輸出頻率1000-1200Hz可調的高頻電流;所 述超聲波換能器(2)外接輸出功率60w的超聲波發生器;超聲波發生器工作頻率45-50kHz。3.—種修飾Si〇2納米載體的制備方法，其特征是將Si〇2納米粒投入反應容器的雙蒸水 中；電磁攪拌混勻，超聲波振動使Si02納米粒重懸于雙蒸水中；加入十八烷基三甲基溴化 銨，室溫攪拌3h;離心30min，靜置陳化12?20h去上清;沉淀物用雙蒸水洗滌三次，返回反應 容器再次重懸，離心;所得離心沉淀物冷凍干燥，即制成修飾Si02納米載體;所述修飾Si02納 米載體顆粒的平均直徑為20?50nm〇4.根據權利要求3所述的修飾Si〇2納米載體的制備方法，其特征在于:所述的將Si〇2納 米粒投入反應容器的雙蒸水中，Si02納米粒與雙蒸水的固液質量體積比為1:4?8g/L。5.根據權利要求3所述的修飾Si02納米載體的制備方法，其特征在于:所述的重懸是使 用修飾Si02納米載體的制備設備;開啟變頻器將高頻電流工作頻率調整為1100Hz，使轉子 攪拌槳(3)以30000r/min的旋轉速度攪拌雙蒸水;開啟超聲波發生器產生超聲波振打，將 Si02納米粒分散均勻;所述的超聲波振動時間30min。6.根據權利要求3所述的修飾Si〇2納米載體的制備方法，其特征在于:所述室溫攪拌轉 速30000r/min。7.根據權利要求3所述的修飾Si02納米載體的制備方法，其特征在于:所述的再次重懸 是將洗滌收集的沉淀物返回修飾Si02納米載體的制備設備中，開啟變頻器將高頻電流工作 頻率調整為1000Hz，使轉子攪拌槳(3)以28000r/min的旋轉速度攪拌雙蒸水；同時調整變頻 器的高頻電流強度，使反應容器外加高頻電磁線圈(4)所產生的磁場強度達5-8T;經高頻磁 場中高速旋轉的雙蒸水吹打分散，使沉淀物顆粒表面形成特殊的官能基團海面體。8.根據權利要求3所述的修飾Si〇2納米載體的制備方法，其特征在于:所述的冷凍干燥 是先將離心沉淀物在-60 °C下凍結;然后將凍結的離心沉淀物在0.9?1帕的真空下，再高速 離心干燥;高速離心的轉速為30000_36000r/ min;干燥時間2_4h。9.一種修飾Si〇2納米載體的應用，其特征在于:將制備的修飾Si〇2納米載體進一步通過 化學偶聯交聯攜帶負電荷的DNA分子、或攜帶含羰基的抗腫瘤藥物或腫瘤新生血管抑制劑， 從而應用于腫瘤分子成像診斷和siRNA干擾治療；具體步驟是:將制備得到的修飾Si02納米載體30mg和抗腫瘤LivinlshRNA質粒6mg在50mL雙蒸水中混合均勾，在室溫下，600r/min攪拌24-48h使其充分反應，經靜置陳化8?1h沉淀后，再用雙蒸水洗凈后，在20-60°C，5?10帕的真空下，干燥12-20h，得到以修飾S12納米載體介導的抗腫瘤基因治療系統;所述抗腫瘤LivinlshRNA質粒和修飾S12納米載體的質量含量比為1:3。
【文檔編號】A61K47/48GK105944116SQ201610518509
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月5日
【發明人】雷世澤
【申請人】雷世澤