分子成像探針的制作方法

分子成像探針的制作方法
【專利摘要】本發明涉及如下所示的式(I)的化合物：或其藥學上可接受的鹽。這些化合物可用作成像探針，例如，用于診斷纖維化或纖維發生。
【專利說明】
分子成像探針
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年12月3日提交的美國臨時申請號61/911,413的權益，該申請通 過引用全文納入本文。
技術領域
[0003] 本發明涉及可用作分子成像探針的化合物以及制備和使用這些化合物的方法。
[0004] 背景
[0005] 纖維化是對組織損傷的普遍反應性響應。疤痕組織作為傷口愈合的結果是纖維化 的積極示例。然而，在慢性組織損傷中，正在發生的損傷和修復循環導致疤痕組織積累以及 正常組織結構和功能破壞，其最終可能導致器官衰竭。無論其發生在腎臟、肝臟、肺或其他 地方并且無論其病因是病毒性、化學、物理或炎性，纖維化的細胞和分子生物學是相似的。 纖維化由成纖維細胞的過度活性導致并且殘余多種胞外基質蛋白，如I型膠原的上調。如果 在早期檢測到，許多治療干預可逆轉纖維化，然而現有的放射技術僅檢測組織破壞不可逆 轉的晚期疾病。
[0006] 發明概述
[0007] 本發明基于以下意外發現，含有可與膠原蛋白或彈性蛋白上的醛基反應以（例如， 通過共價鍵)將化合物連接至膠原蛋白的功能性基團和成像基團的某些化合物可用作用于 診斷疾病(例如，纖維化、纖維發生、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、或癌癥）的分子成像探針(例 如，磁共振(MR)成像探針）。
[0008] 在一個方面，本發明的特征是式(I)的化合物：
[0009]
[0010] 或其藥學上可接受的鹽，
[0011] 其中X是-C(RaRb)-、-C(S)-、或-c(0)-，其中RjPRb，各自獨立地是H、烷基、烯基、炔 基、環烷基、雜芳基、或芳基;Y是-N(R。)-或-0-，其中R。是H、烷基、烯基、炔基、或芳基；L是-(0?< 11〇11-、-順(0^^)11-、或-(0^^)11-芳基-，其中在各種情況中，1^、1^、1^、1^、他、和1^各自 獨立地是H、烷基、烯基、或炔基，并且η是1、2、或3;Z是包含金屬離子和第一絡合基團的螯合 基團，第一絡合基團與金屬離子形成金屬絡合物;并且Ri和R 2各自獨立地是HSCi-Cn)烷基。
[0012] 在另一個方面中，本發明的特征是一種方法，其包括向哺乳動物給予上述式（I)的 化合物;并且在給予該化合物之后獲取該哺乳動物的組織圖像。
[0013] 在一些實施方式中，該圖像是正電子發射斷層掃描圖像。
[0014] 在一些實施方式中，該圖像是單光子發射計算機斷層掃描圖像。
[0015] 在一些實施方式中，該圖像是磁共振圖像。
[0016] 在一些實施方式中，該圖像是計算機斷層掃描圖像。
[0017] 在一些實施方式中，該圖像是平面閃爍掃描圖像。
[0018] 在一些實施方式中，第一絡合基團是D0TA、N0TA、D03AX、D03AP、D0TP、D02A2P、 N0TP、N02AP、N02PA、TETA、TE2P、TE2A、TE1A1P、CBTE2P、CBTE1A1P、SBTE2A、SBTE1A1P、DTTP、 CHX-A"-DTPA、Desferal、HBED、PyD03P、PyD02AP、PyD03A、DIAMSAR、EDTA、DTPA、CB-TE2A、 SarAr、PCTA、pycup、DEDPA、0CTAPA、AAZTA、D0TAIa、CyPic3A、TRAP、N0P0、或CDTA部分。
[0019] 在一些實施方式中，金屬離子是Gd3+、Mn3+、Mn2+、Fe 3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Eu3+、Eu 2+、Tb3 +、〇73+4￥+、!1〇3+、1'111 3+、￥133+、(^3+，或選自下組的放射性同位素的離子: 6^1、686&、41-1￥、 64Cu、111 In、52Mn、89Zr、86Y、201TI、 94mTc、和 99mTc 〇
[0020] 在一些實施方式中，Y是-N(RC)-或-0-，其中Rc是烷基、C 2-C1Q烯基、C2_C10炔 基、或芳基。在一些實施方式中，Y是-NH-或-0-。
[0021] 在一些實施方式中，X是-C(RaRb)-、-C(S)-、或-c(0)-，其中RjPRb各自獨立地是H、 CrCio烷基、C2-C1Q烯基、C2-C1Q炔基、或芳基。在一些實施方式中，X是-CH 2-或-0- 〇
[0022] 在一些實施方式中，L其中L是-(CH2)n-、-NH(CH 2)n-、或_(CH2)n-芳基-，其中η是1、 2、或3。在一些實施方式中，L是-CH2CH2-、-NHCH2-、-CH2-Ph-、或-CH2CH2CH2- 〇 [0023] 在一些實施方式中，RjPRb各自獨立地是Η或CH3。
[0024] 在一些實施方式中，Z還包括與金屬離子絡合的水分子。
[0025] 在一些實施方式中，組織選自：乳腺組織、結腸組織、骨組織、肺組織、膀胱組織、腦 組織、支氣管組織、宮頸組織、結直腸組織、子宮內膜組織、室管膜組織、眼組織、膽囊組織、 胃部組織、胃腸道組織、頸部組織、心臟組織、肝臟組織、胰腺組織、腎臟組織、喉組織、唇或 口腔組織、鼻咽組織、口咽組織、卵巢組織、甲狀腺組織、陰莖組織、垂體組織、前列腺組織、 直腸組織、腎臟組織、唾液腺組織、皮膚組織、胃組織、睪丸組織、咽喉組織、子宮組織、陰道 組織、和外陰組織。
[0026]在一些實施方式中，所述哺乳動物是人。
[0027] 在一些實施方式中，RjPR2各自是H。
[0028]本文提供了評價生物樣品的胞外基質中賴氨酰氧化酶活性的方法，包括向胞外基 質給予包含-NR-NH2或-0-NH2基團的成像劑，其中R是Η、&-CK)烷基、C2-C 1Q烯基、C2-C1Q炔基、 或芳基;并且在給予該成像劑之后獲取胞外基質的圖像。
[0029 ]本文提供了評價哺乳動物中的腫瘤或組織中賴氨酰氧化酶活性的方法，包括向該 哺乳動物給予包含-NR-NH2或-0-NH2基團的成像劑，其中R是烷基、C2-C1Q烯基、C 2-C10 炔基、或芳基;并且在給予該成像劑之后獲取圖像。
[0030]本文還提供了對生物樣品的胞外基質、哺乳動物中的組織、或哺乳動物中的腫瘤 進行成像的方法，包括向胞外基質給予包含-NR-NH2或-〇-NH2基團的成像劑，其中R是Η、&-C 10烷基、C2-C1Q烯基、C2-C1Q炔基、或芳基;并且在給予化合物之后獲取胞外基質的圖像。
[0031 ]本文還提供了對哺乳動物中的腫瘤或組織進行成像的方法，包括向該哺乳動物給 予包含-NR-NH2或-0-NH2基團的成像劑，其中R是Η、&-CK)烷基、C2-C 1Q烯基、C2-C1Q炔基、或芳 基;并且在給予化合物之后獲取哺乳動物的圖像。
[0032] 本文還提供了評價哺乳動物中的組織中的纖維化水平的方法，包括向該哺乳動物 給予包含-NR-NH2或-0-NH2基團的成像劑，其中R是HA-Ck)烷基、C 2-C1Q烯基、C2-C1Q炔基、或 芳基;并且在給予化合物之后獲取哺乳動物的圖像。
[0033] 本文還提供了診斷哺乳動物中纖維化疾病的方法，包括向該哺乳動物給予包含-NR-NH2或-0-NH2基團的成像劑，其中R是Η、Ci-Cn)烷基、C 2-C1Q烯基、C2-C1Q炔基、或芳基;并且 在給予化合物之后獲取哺乳動物的圖像。
[0034] 在一些實施方式中，纖維化疾病選自：肺纖維化、慢性阻塞性肺病、肺高血壓、心力 衰竭、肥大型心肌病、心肌梗塞、心房纖顫、糖尿病腎病、系統性紅斑狼瘡、多囊性腎病、腎小 球腎炎、末期腎疾病、非酒精性脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病 毒感染、原發性硬化性膽管炎、炎性腸病、硬皮病、動脈粥樣硬化、青光眼、糖尿病視網膜病、 放射誘導纖維化、手術粘連、囊性纖維化、和癌癥。例如，纖維化疾病可以是特發性肺纖維 化。
[0035] 在一些實施方式中，纖維化疾病是選自下組的癌癥:乳腺癌、結腸癌、骨癌、肺癌、 膀胱癌、腦癌、支氣管癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、成視網膜細胞瘤、膽囊 癌、胃癌、胃腸癌、膠質瘤、頭頸癌、心臟癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、腎癌、喉癌、唇或口腔 癌、間皮瘤(mesothioma)、口腔癌、骨髓瘤、鼻咽癌、成神經細胞瘤、口咽癌、卵巢癌、甲狀腺 癌、陰莖癌、垂體癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、咽喉 癌、子宮癌、陰道癌、和外陰癌。
[0036] 在一些實施方式中，本文所述的方法中使用的成像劑是式(I)的化合物，或其藥學 上可接受的鹽。
[0037] 在一些實施方式中，本發明的方法還包括用對照的信號水平評價給予成像劑之后 的信號水平。
[0038] 在一些實施方式中，本發明的方法還包括用對照的信號水平評價給予成像劑之后 的信號水平之后確定腫瘤是否是癌性的。
[0039] 通過說明書、附圖和權利要求書，不難了解其它的特征、目的和優點。
【附圖說明】
[0040] 圖1A是給予探針化合物1(即Gd-Hyd)之前和之后30分鐘的纖維化小鼠的軸向肝MR 圖像(L =肝，S=胃）。該圖像顯示在給予化合物1之后強的MR信號增強。
[0041] 圖1B是給予對照探針化合物2(即Gd-Me2-Hyd)之前和之后30分鐘的纖維化小鼠的 軸向肝MR圖像。該圖像顯示纖維化的肝臟幾乎沒有信號增強。
[0042] 圖1C顯示在接受探針化合物1的纖維化小鼠中增強的肝/肌肉對比，而有健康肝并 接受化合物1的對照小鼠或接受對照探針化合物2的纖維化小鼠沒有該增強。
[0043]圖1D顯示天狼星紅染色確認纖維化小鼠中的晚期纖維化。
[0044]圖2A和2B分別是患有肺纖維化的小鼠和假對照（sham)小鼠的冠狀MR圖像。偽彩色 重疊是給予化合物1(0. lmmol/kg)后30分鐘的圖像和基線圖像之間的差異，其顯示纖維化 肺的廣泛增強，但是在假對照小鼠的肺部有非常少的增強。
[0045]圖2C和2D顯示分別在假對照小鼠和纖維化小鼠中給予化合物1之前（左）和之后2 分鐘（右)獲得的圖像。該圖像顯示混合血液中強且類似的初始MR信號增強，證明向兩種小 鼠中完全注射化合物1。
[0046]圖2E顯示在注射化合物1之后(注射后1小時處)肺/肌肉對于與噪音之比（CNR)的 變化。CNR的變化（△ CNR)在纖維化小鼠中大幅升高(p = 0.0001)。
[0047]圖2F顯示與假對照小鼠的正常肺(上部組圖）相比，在用博來霉素處理的小鼠中肺 纖維化(底部組圖）的H&E染色(左)和天狼星紅染色(右)結果。
[0048] 圖3顯示化合物1和化合物2與未修飾的牛血清白蛋白（BSA)或修飾的牛血清白蛋 白（BSA-ALD)的弛豫度特征。圖3a顯示各制備物的弛豫度(mT 1秒<)。圖3b顯示弛豫度(miT1 秒'變化％。
[0049] 圖4顯示在體外結合試驗中與未修飾的牛血清白蛋白（BSA)或修飾的牛血清白蛋 白（BSA-ALD)結合的Gd水平。圖4a顯示各制備物中與蛋白質結合的nmol Gd。圖4b顯示各制 備物中與蛋白質結合的Gd %。
[0050] 圖5A顯示分離后結合的未修飾的牛血清白蛋白（BSA)或修飾的牛血清白蛋白 (BSA-ALD)與游離溶液部分的弛豫時間變化％。
[0051 ]圖5B顯示分離前后修飾的牛血清白蛋白（BSA-ALD)中化合物1的1\弛豫度測量。 [0052]圖6顯示6或12周CC14-處理后的小鼠中肝纖維化進展的化合物1成像。圖6A顯示化 合物1注射前(前，左圖）和后15分鐘（后，右圖）的載劑對照小鼠的代表性圖像。L=肝臟，S = 胃，M =肌肉。在載劑中幾乎沒有看到前后圖像之間的增強。圖6B顯示6-周CC14-處理的小鼠 中看到的增強。圖6C顯示12-周CC1 4-處理的小鼠中看到的增強。
[0053]圖7顯示對肝纖維化進展的化合物1成像的定量。Δ CNR從載劑對照組(載劑，空心 柱）中0.1增加至6周CC14后（16w，增加2倍，灰色柱）的1.2,并且在12周（12w，黑色柱)進一步 增加至2 · 0(增加20倍）。**卩〈0 · 01，****p〈0 · 0001，AN0VA。
[0054] 圖8顯示了小鼠中的組織學和賴氨酰氧化酶表達。圖8A:天狼星紅染色顯示6-周 CC14-處理的動物中的肝門纖維化和偶發橋連(6滅）。12_周CC14-處理的動物有完全橋連纖 維化（12wk)。載劑顯示背景染色(veh)。圖8B:通過天狼星紅染色定量的膠原蛋白含量顯示 載劑中0.6 %在6-周動物中明顯增加至2.7 %，并且在12-周CC14肝臟中增加至4.0 %。賴氨 酰氧化酶表達的qRT-PCR顯示CC14處理的L0X (圖8C)、L0XL2 (圖8D)、和L0XL1 (圖8E)水平。在 圖 8B 中，***p〈0.001，****p〈0.0001，AN0VA。在 C-E 中，**p〈0.01，****p〈0.0001，t_ 檢驗。
[0055] 圖9顯示對肝纖維化抑制的化合物1成像的定量。接受6周CC14之后6周恢復期的小 鼠（6w-r)比在6周（6w)或12周（12w) CC14處理之后成像的小鼠顯示出更少的通過Gd-Hyd的 肝信號增強。雖然6w和12w組顯示出比載劑對照組(veh)明顯更高的Δ CNR，在6w_r組和veh 組之間沒有明顯差異，并且增加至1.2(6-周CC14)在去除CC14的6周后降至0.5。*葉〈 0.01，****p〈0.0001，ns =不顯著，AN0VA。
[0056] 圖10顯示在用博來霉素處理的小鼠中疾病進展的化合物1成像。肺中的信號增向 在本文顯示在解剖圖像上疊加。圖l〇A:PBS注射的假對照動物幾乎沒有乃至沒有化合物1攝 取。化合物1的攝取在1周博來霉素處理的動物中增加（圖10B)，并且在2周博來霉素處理的 動物中進一步增加(圖10C)。
[0057]圖11顯示確認博來霉素處理的小鼠的疾病嚴重程度的病理測量。圖11A顯示博來 霉素誘導的纖維化小鼠在博來霉素注射后1周時4.1，博來霉素注射后2周時5.3,以及在PBS 假對照中〇的平均艾氏評分(Ashcrof tscore)。圖11B:與PBS對照中0.09%相比，陽性天狼星 紅染色的面積在1周博來霉素組中稍有增加(0.17%)，并且在2周博來霉素動物中顯著增加 至0.30 %。圖11C:H&E染色限定的損傷面積在假對照中為0.3 %，在1周博來霉素中增加至 4· 6%，并且進一步增加至15 · 0%。***卩〈0 · 001，****p〈0 · 0001AN0VA。
[0058] 發明詳述
[0059] 通常，本發明涉及可用作分子成像探針的化合物以及制備和使用這些化合物的方 法。
[0060] 化合物
[0061] 術語"烷基"是指飽和、直鏈或支鏈烴部分，如-CH3或_CH( CH3) 2。術語"烯基"和"炔 基"指與上述烷基相似的取代或未取代的不飽和脂族基團，但分別含有至少一個雙鍵或三 鍵。術語"芳基"是指具有一個或多個芳環的烴部分。芳基的例子包括苯基(Ph)、亞苯基、萘 基、亞萘基、芘基、蒽基和菲基。除非另外說明，本文所述的烷基和芳基都包括取代和未取代 的部分。
[0062] 術語"雜芳基"包括取代或未取代的芳族5至7元環結構，更優選5至6元環，其環結 構包括1-4個雜原子。術語"雜芳基"也包括具有兩個或多個環的多環系統，其中兩毗鄰環共 用兩個或多個碳，其中至少一個環是雜芳族，例如其他環可以是環烷基、環烯基、環炔基、芳 基、雜芳基和/或雜環基。雜芳基包括，例如，吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、異噁唑、噁唑、噁二唑、 噻唑、噻二唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。
[0063] 本文所用術語"碳環"和"碳環基"是指非芳族取代或未取代的環，其中環的各原子 是碳。術語"碳環"和"碳環基"也包括具有兩個或多個環的多環系統，其中兩毗鄰環共用兩 個或多個碳，其中至少一個環是碳環，例如其他環可以是環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜 芳基和/或雜環基。
[0064] 本文所用術語"環烷基"是指飽和取代或未取代的環，其中環的各原子是碳。
[0065]本文所用術語"環烯基"和"環炔基"分別指環內含有至少一個雙鍵和三鍵的環烷 基基團〇
[0066]術語"雜環基"或"雜環烷基"指取代或未取代的非芳族3至10元環結構，例如，3至7 元環，它們的環結構中包括1-4個雜原子。環可以是完全飽和的或者可具有1個或更多個不 飽和鍵而環仍然是非芳族。雜環含有1-2個原子，其為下組的成員：ΝΗ、Ν、Ν((^ 6烷基）、0、和 S。術語"雜環基"或"雜環烷基"也包括具有兩個或多個環的多環系統，其中兩毗鄰環共用一 個或多個碳，其中至少一個環是雜環，例如其他環可以是環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜 芳基和/或雜環基。雜環基包括，例如，哌啶、哌嗪、吡咯烷、嗎啉、內酯、內酰胺等。雜環基可 任選地被獨立選自下組的1、2或3個取代基取代：鹵素、氰基、硝基、羥基Χη烷氧基、雜烷 基、C 6-1()芳氧基、&-6芳烷氧基、CF3、季銨離子、糖、 6烷基、-C (= 0) (&-6烷基）、-S02 (Ci-6烷 基）、-C( =0)0(&-6烷基）、-C( =0)0(雜烷基）、-C( =0)ΝΗ(&-6烷基）、-C( =0)ΝΗ(雜烷基）、-以=0)(苯基）、-502(苯基）、和磷酸酯（或其鹽）。多環雜環的示例包括6-氮雜雙環[3.1.1] 庚烷、3-氧雜-6-氮雜雙環[3.1.1 ]庚烷、5-氮雜螺[2.4 ]庚烷、2-氧雜螺[3.3 ]庚烷、八氫苯 并呋喃、1，2,3,4_四氫喹啉、和八氫-1H-喹嗪。
[0067]術語"取代的"指的是某部分具有替代主鏈的一個或多個碳上的氫的取代基。應理 解，"取代"或"用……取代"包括的隱含條件是這種取代符合被取代原子和取代基所允許的 化合價，并且取代得到穩定的化合物，例如不會通過重排、環化、消除或其它反應而發生自 動轉化。考慮本文所用術語"取代的"包括有機化合物的所有可允許取代基。就廣義方面而 言，可允許的取代基包括有機化合物的非環狀和環狀、分支和未分支、碳環和雜環、芳族和 非芳族取代基。可允許的取代基對合適的有機化合物而言可為一個或多個且相同或不同。 芳基上的可能取代基包括，但不限于Ci-Cio烷基、C 2_C1()烯基、C2_C1()炔基、C3-C 2〇環烷基、C3_ C20環烯基、&-C20雜環烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、氨基、&-&〇烷基 氨基、&-C20二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、Ci-Cio烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、 烷基亞氨基、芳基亞氨基、Q-Ck)烷基磺酰亞氨基、芳基磺酰亞氨基、羥基、鹵素、硫代、&-&〇 烷基硫代、芳基硫代、Ci-Cnj烷基磺酰基、芳基磺酰基、酰基氨基、氨基酰基、氨基硫代酰基、 脒基、胍基、脲基、氰基、硝基、亞硝基、疊氮基、酰基、硫代酰基、酰氧基、羧基、和羧酸酯。在 另一方面，烷基上的可能取代基包括上述所有取代基，除了 Q-Ck)烷基。烯基上的可能取代 基包括上述針對芳基的所有取代基，除了C2-C1Q烯基。炔基上的可能取代基包括上述針對芳 基的所有取代基，除了 C2-C1Q炔基。雜芳基、雜環烷基和碳環基上的可能取代基包括上述針 對芳基的所有取代基。
[0068] 在一些實施方式中，本發明涉及式(I)的化合物：
[0069]
[0070]或其藥學上可接受的鹽，
[0071] 其中X是-C(RaRb)-、-C(S)-、或-C(0)-，其中RjPRb，各自獨立地是H、烷基、烯基、炔 基、環烷基、雜芳基、或芳基;Y是-N(R。)-或-0-，其中R。是H、烷基、烯基、炔基、或芳基；L是-(□^^-、-^(□^^-、或-⑴此尺丄-芳基^其中在各種情況中心^為^^和心各自 獨立地是H、烷基、烯基、或炔基，并且η是1、2、或3;Z是包含金屬離子和第一絡合基團的螯合 基團，第一絡合基團與金屬離子形成金屬絡合物;并且Ri和R 2各自獨立地是11或&-&()烷基。 [0072] 在一些實施方式中，RjPR2各自是H。
[0073] 在一些實施方式中，式(I)的化合物具有式(la)的結構：
[0074]
[0075]或其藥學上可接受的鹽，
[0076] 其中X是-C(RaRb)-、-C(S)-、或-C(0)-，其中R4PRb，各自獨立地是H、烷基、烯基、炔 基、環烷基、雜芳基、或芳基;Y是-N(R。)-或-0-，其中R。是H、烷基、烯基、炔基、或芳基；L是-(□^^-、-^(□^^-、或-⑴此尺丄-芳基^其中在各種情況中心^為^^和心各自 獨立地是H、烷基、烯基、或炔基，并且η是1、2、或3;Z是包含金屬離子和第一絡合基團的螯合 基團，第一絡合基團與金屬離子形成金屬絡合物。
[0077] 在一些實施方式中，Y是-N(Rc)_或-0_，其中Rc是烷基、C2-C1Q烯基、C 2_C10炔 基、或芳基。在一些實施方式中，Y是-NH-或-0-。
[0078] 在一些實施方式中，X是-C(RaRb)-、-C(S)-、或-C(0)-，其中RjPRb各自獨立地是H、 &-&()烷基、C2-C1Q烯基、C2-C1Q炔基、或芳基。在一些實施方式中，X是-C(R aRb)_或-c(0)-，其 中RjPRb各自獨立地是HXi-Cio烷基、C2-C 1Q烯基、C2-C1Q炔基、或芳基。在一些實施方式中，X 是-CH2-或_0_。例如，X可以是_CH2 _。
[0079] 在一些實施方式中，L其中L是-(CH2)n-、-NH(CH 2)n-、或_(CH2)n-芳基-，其中η是1、 2、或3。在一些實施方式中，L是-CH2CH2-、-NHCH2-、-CH 2-Ph-、或-CH2CH2CH2- 〇
[0080] 在一些實施方式中，RdPRb各自獨立地是Η或CH3。
[0081 ] 在一些實施方式中，Z還包括與金屬離子絡合的水分子。
[0082]第一絡合基團通常包含可結合至金屬離子的氮和/或羧酸酯部分。本領域已知金 屬絡合基團，例如，如Hermann，P ·等，Dal ton Transactions 2008，3027-3047中Gd3+絡合物 所述，其通過引用全文納入本文。在一些實施方式中，第一絡合基團是D0TA、N0TA、D03AX、 D03AP、D0TP、D02A2P、N0TP、N02AP、N02PA、TETA、TE2P、TE2A、TE1A1P、CBTE2P、CBTE1A1P、 SBTE2A、SBTE1A1P、DTTP、CHX-A"-DTPA、De sfera1、HBED、PyD03P、PyD02AP、PyD03A、DIAMSAR、 EDTA、DTPA、CB-TE2A、SarAr、PCTA、pycup、DEDPA、OCTAPA、AAZTA、DOTAIa、CyPi c3A、TRAP、 NOPO、或CDTA部分。在一些實施方式中，第一絡合基團是DOTA、ΝΟΤΑ、EDTA、DTPA、CB-TE2A、 3&"1'、？(7^47〇卯、或^14部分。絡合基團的示例性代表包括以下，用波浪<|>線表示與分 子的其他部分附連的可能點。
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[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089] 在這些實施方式中，金屬離子可以是Gd3+、Mn3+、Mn2+、Fe 3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Eu3+、Eu 2 +、1133+、〇73^￥+、!1〇 3+、1'1113+、￥133+、03+，或選自下組的放射性同位素的離子 :6^1、686&、八1-18F、 64Cu、1111 η、52Mn、89Zr、86Y、2Q1TI、 94mTc、和99mTc; Y可以是順2 或0; X可以是CH2或0; L可以是-CH2CH2-、-NHCH2-、-CH2-Ph-、或-CH 2CH2CH2-;并且匕和辦可各自獨立地是Η或CH3。這類化合物 的示例包括：
[0090]
[0091]
[0092]
[0093] 或其藥學上可接受的鹽。
[0094]在一些實施方式中，化合物選自 [0095]
，
[0096]
[0097]
[0098] 或其藥學上可接受的鹽。
[0100]
[0099] 在一些實施方式中，Z還包括與金屬離子絡合的水分子。這類化合物的示例包括：
[0102] 在一些實施方式中，其中Z還包括與金屬離子絡合的水分子的化合物選自：
[0101]
[0103]
[0104]
纟其藥學上可接受的鹽。
[0105] 本文上述的式(I)和/或（la)的化合物包括化合物本身，及其鹽、前藥和溶劑合物， 如果可用。例如，在式（I)的化合物上，可形成介于陰離子和帶正電基團（例如，氨基)之間的 鹽。合適的陰離子包括氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、檸檬酸根、甲磺酸 根、三氟乙酸根、乙酸根、蘋果酸根、甲苯磺酸根、酒石酸根、富馬酸根、谷氨酸根、糖醛酸根、 乳酸根、戊二酸根、和馬來酸根。同樣地，在式(I)和/或(la)的化合物上，還可形成介于陽離 子和帶負電基團（例如，羧酸根)之間的鹽。合適的陽離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離 子和銨陽離子例如四甲基銨離子或N-甲基葡糖銨離子。式(I)和/或（la)的化合物也包括含 有季氮原子的那些鹽。前藥的例子包括酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯和其它藥學上可接受 的衍生物，其通過給予對象而能夠提供式（I)和/或（la)化合物。溶劑合物是指在式（I)和/ 或（la)的化合物和藥學上可接受的溶劑之間形成的絡合物。藥學上可接受的溶劑的示例包 括水、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
[0106] 本文所述的式(I)和/或（la)的化合物可含有非芳族雙鍵和一個或多個手性中心。 因此，它們可以外消旋物和外消旋混合物、單個對映異構體、個體非對映異構體、非對映異 構體混合物、和順式或反式異構體形式出現。考慮所有這些異構體形式。
[0107] 可通過本領域熟知的方法制備本文所述的式（I)和/或（I a)的化合物。以下的實施 例提供了對如何制備上述化合物的詳細描述。
[0108] 可使用其他合適的啟示材料通過實施例中所述的合成途徑或本領域已知的其他 合成途徑制備式（I)和/或（la)的其他化合物。在本文具體描述的步驟之前或之后，本文所 述的方法也可包括其他步驟以添加或去除合適的保護基團以最終允許合成式（I)和/或 (la)的化合物。另外，可以替代次序或順序進行各種合成步驟以得到所需的化合物。本領域 已知可用于合成式（I)和/或（la)的可用化合物的合成化學轉化和保護基團方法并且包括， 例如R · Larock，Comprehensive Organic Transformat ions (《綜合有機轉化》），VCH Publishers(1989);T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(《有機合成中的保護性基團》），第2版，約翰威利父子出版社(John Wiley and Sons)(1991);L·Fieser和Μ·Fieser，Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis(《有機合成的費氏試劑》），約翰威利父子出版社（1994);和L. Paquette編， Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis(《有機合成試劑百科全書》），約翰威 利父子出版社（1995)及其后續版本中所述的那些。
[0109] 本發明范圍內還有含有有效量的至少一種式（I)和/或（la)的化合物和藥學上可 接受的運載體的藥物組合物。
[0110] 方法
[0111] 賴氨酰氧化酶(L0X)和L0X-樣酶是殘余交聯膠原和/或彈性蛋白原纖維的胞外酶。 這些酶將賴氨酸氨基催化氧化成醛并且這些醛然后經過與其他氨基酸側鏈(或其他氧化的 賴氨酸)進行非催化縮合反應以產生穩定的共價交聯。本發明的化合物(例如，式（I)和/或 (la)的化合物)通過使用帶有基團如酰肼(-NH-NH2)或氨基-氧基(-〇-NH 2)的成像劑(Gd、Mn、 核等)靶向由L0X生成的這些醛，這些基團將與醛發生縮合反應以形成中性含亞氨基產物。 由于醛在體內稀少，并且因為本發明的化合物并不易于穿透細胞，化合物對于胞外基質中 具有高水平L0X活性的組織有選擇性。在動脈重塑并且在許多癌癥中，L0X活性在活性纖維 化(纖維發生）中上調。具有強纖維增生組分并且可包括增加的L0X活性的疾病包括，但不限 于，心力衰竭、心臟病、末期腎疾病、肝炎的所有形式、肺纖維化、硬皮病、動脈粥樣硬化、和 許多侵略性癌癥。
[0112] 本發明的一個方面是使用成像劑評價在生物樣品的胞外基質中、組織中、腫瘤中、 和/或哺乳動物中L0X活性的方法。在一些實施方式中，成像劑包括酰肼(-NR-NH 2)或氨基-氧基(-0-NH2)基團，其中R是H、Ci-Cio烷基、C2-C1Q烯基、C 2-C1Q炔基、或芳基，其可用于評價在 生物樣品的胞外基質中、組織中、腫瘤中、和/或哺乳動物中的L0X活性。在一些實施方式中， 成像劑是式(I)和/或（la)的化合物，或其藥學上可接受的鹽。
[0113] 本發明提供了對生物樣品的胞外基質進行成像的方法，包括將胞外基質與本文所 述的成像劑接觸。在一些實施方式中，胞外基質包括多種細胞。不希望受到理論限制，本發 明的化合物(例如，式⑴和/或（la)的化合物)可與由細胞周圍緊密的胞外基質中L0X生成 的醛選擇性結合并反應。在一些實施方式中，成像劑包括酰肼(-NR-NH 2)或氨基-氧基(-0-NH2)基團，其中R是HXi-Cn)烷基、C2-C 1Q烯基、C2-C1Q炔基、或芳基，可用于對細胞成像。在一 些實施方式中，成像劑是式(I)和/或（la)的化合物，或其藥學上可接受的鹽。在一些實施方 式中，接觸在體外進行。在一些實施方式中，在體內接觸。在一些實施方式中，細胞是血細 胞、癌細胞、免疫細胞(例如，巨噬細胞）、上皮細胞(例如，皮膚細胞）、細菌細胞或病毒感染 的細胞。
[0114] 在一些實施方式中，細胞是癌細胞。在一些實施方式中，癌細胞選自乳腺癌細胞、 結腸癌細胞、白血病細胞、骨癌細胞、肺癌細胞、膀胱癌細胞、腦癌細胞、支氣管癌細胞、宮頸 癌細胞、結直腸癌細胞、子宮內膜癌細胞、室管膜瘤癌細胞、成視網膜細胞瘤癌細胞、膽囊癌 細胞、胃癌細胞、胃腸道癌細胞、膠質瘤癌細胞、頭頸癌細胞、心臟癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌 細胞、黑素瘤癌細胞、腎癌細胞、喉癌細胞、唇或口腔癌細胞、淋巴瘤癌細胞、間皮瘤癌細胞、 口腔癌細胞、骨髓瘤癌細胞、鼻咽癌細胞、成神經細胞瘤癌細胞、口咽癌細胞、卵巢癌細胞、 甲狀腺癌細胞、陰莖癌細胞、垂體癌細胞、前列腺癌細胞、直腸癌細胞、腎癌細胞、唾液腺癌 細胞、肉瘤癌細胞、皮膚癌細胞、胃癌細胞、睪丸癌細胞、咽喉癌細胞、子宮癌細胞、陰道癌細 胞、和外陰癌細胞。
[0115] 本發明還提供了對組織成像的方法，包括給予組織成像劑。在一些實施方式中，成 像劑包括酰肼(-NR-NH2)或氨基-氧基(-0-NH2)基團，其中R是Η、Ci-Cn)烷基、C 2-C1Q烯基、C2-C1〇炔基、或芳基，可用于對組織成像。在一些實施方式中，成像劑是式（I)和/或（la)的化合 物，或其藥學上可接受的鹽。可使用本發明的方法成像的組織可以是以下任意的組織:乳腺 組織、結腸組織、骨組織、肺組織、膀胱組織、腦組織、支氣管組織、宮頸組織、結直腸組織、子 宮內膜組織、室管膜組織、眼組織、膽囊組織、胃部組織、胃腸道組織、頸部組織、心臟組織、 肝臟組織、胰腺組織、腎臟組織、喉組織、唇或口腔組織、鼻咽組織、口咽組織、卵巢組織、甲 狀腺組織、陰莖組織、垂體組織、前列腺組織、直腸組織、腎臟組織、唾液腺組織、皮膚組織、 胃組織、睪丸組織、咽喉組織、子宮組織、陰道組織、和外陰組織。在一些實施方式中，組織是 肝、肺、心或腎組織。
[0116] 纖維化疾病顯示已經由多個研究人員觀察到的增強的L0X表達和/或活性水平。例 如，Barker,H.E.等，Nature Reviews Cancer 2012,12,第543頁的表 1 詳細描述了在動脈粥 樣硬化、硬皮病(乳腺、肺、和/或舌）、肝硬化、阿爾茨海默病癡呆、非阿爾茨海默病癡呆、威 爾遜病、原發性膽汁性肝硬化、青光眼、剝脫性綜合征、子宮內膜異位、肺纖維化、肝纖維化、 和心力衰竭中一種或多種L0X家族成員的增強表達。本文所述的成像劑可用于可視化纖維 化疾病中受影響的組織。在一些實施方式中，纖維化疾病選自：肺纖維化、慢性阻塞性肺病、 肺高血壓、心力衰竭、肥大型心肌病、心肌梗塞、心房纖顫、糖尿病腎病、系統性紅斑狼瘡、多 囊性腎病、腎小球腎炎、末期腎疾病、非酒精性脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎、丙型肝炎病毒感 染、乙型肝炎病毒感染、原發性硬化性膽管炎、炎性腸病、硬皮病、動脈粥樣硬化、青光眼、糖 尿病視網膜病、放射誘導纖維化、手術粘連、囊性纖維化、和癌癥。例如，纖維化疾病可以是 特發性肺纖維化。
[0117] 癌癥可產生自任意細胞類型。這類癌癥包括，但不限于乳腺癌、結腸癌、白血病、骨 癌、肺癌、膀胱癌、腦癌、支氣管癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、成視網膜細胞 瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸癌、膠質瘤、頭頸癌、心臟癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、腎癌、喉癌、唇 或口腔癌、淋巴瘤、間皮瘤、口腔癌、骨髓瘤、鼻咽癌、成神經細胞瘤、口咽癌、卵巢癌、甲狀腺 癌、陰莖癌、垂體癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、咽喉 癌、子宮癌、陰道癌、和外陰癌。在一些實施方式中，本發明的化合物(例如，式(I)和/或（la) 的化合物)可用于對選自下組的癌癥成像:乳腺癌、結腸癌、骨癌、肺癌、膀胱癌、腦癌、支氣 管癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、成視網膜細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸癌、膠 質瘤、頭頸癌、心臟癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、腎癌、喉癌、唇或□腔癌、間皮瘤、口腔癌、骨 髓瘤、鼻咽癌、成神經細胞瘤、口咽癌、卵巢癌、甲狀腺癌、陰莖癌、垂體癌、前列腺癌、直腸 癌、腎癌、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、咽喉癌、子宮癌、陰道癌、和外陰癌。
[0118] 多份報告已經與癌癥中增加的L0X活性相關聯。參見例如Cox，T.R.等，Cancer Research 2013,73(6),1721-1732;Cox，T.R.和Erler，J.T·Careinogenesis&Mutagenesis 2013，S13;Erler，J.T.等，Nature 2006,440,1222-1226;Mayorca-Guiliani，A.和Erler， J.T.OncoTargets and Therapy 2013,6，1729_1735;Naba，A·等，BMC Cancer 2014,14， 518_529;Barker，H.E·等，Nature Reviews Cancer 2012，12,540_552;]\1〇〇11，!1.-]\等， Bioorganic Chemistry 2014,57,231-241，其各自通過引用全文納入本文。Moon等在第235 頁上陳述：
[0119] L0XL2與腫瘤進展之間的相關性取決于組織類型。L0XL2表達在卵巢腫瘤中降低。 然而，增加的L0XL2表達與結腸和食道腫瘤，以及口腔鱗狀細胞癌、喉鱗狀細胞癌、和頭頸鱗 狀細胞癌患者中的不良預后相關。另外，已經發現增加的L0XL2表達促進胃癌和乳腺癌轉 移。一些高度侵入性人乳腺癌細胞系被報告具有升高水平的L0XL2mRNA。（引用去除）
[0120] L0X家族成員與上皮細胞塑性和腫瘤進展相關，包括在小細胞癌(SCC)中。參見，例 如，Cano，Α·等，Future Oncology 2012,8(9)，1095-1108,其全文通過引用納入本文。Cano 等在第1101頁中陳述：
[0121] 已經在口腔SCC、頭頸癌、肺腺癌和乳腺癌中觀察到增加的L0X的mRNA水平。事實 上，L0X可被認為是肺癌中的不良預后因素。近來也已經發現L0X的多態性變體與卵巢癌的 風險增加相關。已經在轉移性乳腺癌細胞中檢測到L0XL1表達并且與增加的惡化可能相關。 相反，已經在膀胱癌中觀察到L0XL1和L0XL4基因的表觀沉默，以致提出它們可能在這種特 定腫瘤類型中起到腫瘤抑制物的作用。盡管關于人癌癥樣品中L0XL3的信息有限，L0XL3似 乎在一些特定腫瘤細胞系中過表達。（引用去除）
[0122] 其他報道與實體瘤和結直腸癌（CRC)中增加的L0X表達相關。參見，例如，Cox， T.R.；Erler,J.T.The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 2013,305 ,G659-G666，其通過引用全文納入本文。Cox和Erler在第G664頁陳 述：
[0123] L0X在一般實體瘤和CRC中的重要性是毫無疑問的。其在細胞增殖、入侵、和轉移、 驅動血管形成和惡性轉化中的意義使其提升至治療性介入的活性靶標的地位。事實上，在 多種實體瘤模型中表達高水平L0X蛋白質的癌細胞有增加的增殖、侵入和轉移傾向，并且來 自幾個實驗室的強力證據表明，在CRC中，靶向L0X不僅抑制癌細胞侵入和轉移，還減少了腫 瘤血管生成，因為L0X調節多個信號轉導網絡。
[0124] 因此，增加的L0X活性可用于在多種疾病，如癌癥中成像和/或診斷。
[0125] 通常，本文所述的式（I)和/或（la)的化合物可用于對疾病診斷的成像方法，如纖 維化(例如，肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、子宮纖維化、皮膚纖維化、或心臟纖維化）、纖維 發生、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、或癌癥（例如，肺癌、乳腺癌、結直腸癌、原發性肝癌、頭頸 癌、或胰腺癌）。該方法包括向哺乳動物(例如，人)給予式（I)和/或（la)的化合物(例如，其 中心和心各自是Η的那些)并且在給予該化合物之后獲取該哺乳動物的組織（例如，肝、肺、 心、乳腺、子宮、前列腺、皮膚或腎臟組織)的圖像。如本領域技術人員所知，根據待診斷的疾 病、給藥途徑、賦形劑使用、和與其他試劑共用的可能性，用于該方法的式（I)和/或（la)的 化合物的有效量可變化。
[0126] 在一些實施方式中，該方法還可包括在給予化合物之前獲取哺乳動物組織的圖 像。在這些實施方式中，該方法還可包括評估在給予化合物之前和之后獲取的圖像之間的 差異以確定該組織是否纖維化。
[0127] 各種成像技術可與本發明的化合物聯用并且為本領域所知。成像技術包括，但不 限于，正電子發射斷層成像（PET)、單光子發射計算體層成像（STOCT)、計算機斷層掃描 (CT)、平面閃爍掃描、和核磁共振成像(MRI)。本領域技術人員將認識到如何將合適的成像 劑與合適的成像技術匹配(例如，包括 64Cu、68Ga、18F、86Y、和94mT C的那些成像劑可用于PET成 像，包括99mTc、67Ga、 111In、和2Q1Tl的那些成像劑可用于SPECT成像，包括Gd3+、Mn 3+、Mn2+、Fe3+、 〇63+、？￥ +、恥3^113^112+、1133+、〇7 3^13+、!1〇3+、1'1113+、￥133+、0 3+的那些成像劑可用于]\?1)。
[0128] 在一些實施方式中，PET和SPECT成像劑導致纖維化組織或腫瘤比相鄰組織有更高 的活性(信號強度）。在一些實施方式中，目標組織或器官獲取的圖像與參照值比較。對于 PET，可獲得標準化的攝入值(SUV)，并且之前確定的值將指示纖維化。
[0129] 對于MRI，與在注射探針之前獲取的圖像中的信號相比，本發明的合適化合物(例 如，式（I)和/或（la)的化合物)可改變MRI信號。纖維化區在信號強度上可能有更大的變化 (在T1-加權的圖像上更高的信號強度，在T2-加權的圖像上更低的信號強度）。纖維化和相 鄰組織之間的對比可能更高（纖維化組織中的信號和相鄰信號中的信號之間的差異）。或 者，可在注射探針之后測量弛豫時間T1或T2的變化。比特定值大的弛豫速率（1/T1或1/T2) 變化將指示纖維化。在一些實施方式中，該方法可包括(a)在給予式(I)和/或（la)的化合物 后約1至約10分鐘時獲取哺乳動物的組織的T1-加權圖像。在這些實施方式中，該方法還可 包括(b)在給予式（I)和/或（la)的化合物后約10至約2小時時獲取哺乳動物的組織的第二 T1-加權圖像;并且評價步驟(a)和(b)中獲取的圖像之間的差異，其中與纖維化病變相比， 非纖維化病變顯示出從步驟(a)中獲取的圖像至步驟(b)中獲取的圖像增強的更大損失。 [0130] 不希望受到理論限制，賴氨酰氧化酶(L0X)和賴氨酰氧化酶樣酶(LOXL-η)被認為 將膠原蛋白和彈性蛋白底物中的肽基賴氨酸氧化成氨基己二酸-δ-半醛的殘基。肽基醛 然后可與未反應的氨基和相鄰的醛官能團發生自發縮合，由此形成共價交聯，其將彈性 蛋白和膠原蛋白轉化成不溶性纖維。不希望受到理論限制，式（I)和/或（la)的化合物（例 如，其中RjPR 2各自是Η的那些)可與由L0X在膠原蛋白上的作用生成的肽基醛發生反應以將 該化合物附連至該膠原蛋白。不希望受到理論限制，式（I)和/或（la)的化合物中的顯像基 團（即，形成金屬絡合物的環狀結構)被認為可隨后用于生成具有增強的MR信號的MR圖像。
[0131] 在一些實施方式中，式（I)和/或（la)的化合物可以與常規MRI診斷組合物相同的 方式使用，并且可用于對器官的胞外基質組分成像。例如，向患者(例如，哺乳動物如人)給 予式（I)和/或（la)的化合物并且獲得患者的MR圖像。通常，臨床醫師將獲取具有由試劑靶 向的胞外基質組分的區域的圖像。例如，臨床醫師可獲取心、肺、肝、腎、或其他器官或組織 類型的圖像，其中式（I)和/或（la)的化合物靶向疾病狀態中異常膠原蛋白或彈性蛋白累積 的位置或膠原蛋白。臨床醫師可在給予式（I)和/或（la)的化合物之前、期間或之后獲取一 個或多個圖像。已經描述了使用MRI診斷組合物的其他技術，例如，美國申請公開號2008/ 0044360和2013/0309170。
[0132] 為了實踐本文所公開的方法，可胃腸道外、口服、經鼻、直腸、局部、或口頰給予具 有一種或多種上述式（I)和/或（la)的化合物的組合物。本文所用術語"胃腸道外"是指皮 下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內、或顱內注射，以及 任意合適的輸注技術。
[0133] 無菌注射組合物可以是在胃腸道外可接受的無毒稀釋劑或溶劑中的溶液或混懸 液，例如，在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的運載體和溶劑是甘露醇、水、林格溶 液和等張氯化鈉溶液。此外，通常采用非揮發油作為溶劑或懸浮介質（例如，合成甘油單酯 或甘油二酯）。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于制備注射劑，天然藥學上可接受的 油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化形式也可用于制備注射劑。這些油溶液或混懸 液也可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或相似的分散試劑。其他常用的表面活 性劑如在藥學上可接受的固體、液體或其他劑型中常用的吐溫或司盤或其他類似乳化劑或 生物利用度增強劑也可用于配制目的。
[0134] 用于口服概要的組合物可以是任意口服可接受的劑型，包括膠囊、片劑、乳液和水 性混懸液、分散體、和溶液。在片劑的情況中，常用的運載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加 入潤滑劑，如硬脂酸鎂。對于膠囊形式的口服給藥，可用的稀釋劑包括乳糖和干燥玉米淀 粉。當口服給予水性混懸液或乳液時，活性成分可與乳化劑或混懸劑一起在油相中懸浮或 溶解。如果需要，可加入某些甜味劑、風味劑或著色劑。
[0135] 可按照藥物配制領域熟知的技術制備鼻氣溶膠或吸入組合物。例如，這類組合物 可采用苯甲醇或其他合適的防腐劑，吸收促進劑以增強生物可及性，碳氟化合物、和/或其 他本領域已知的增溶劑或分散劑制備成鹽水溶液。也可以用于直腸給藥的栓劑形式給予具 有一種或多種上述式(I)和/或（la)的化合物的組合物。
[0136] 藥物組合物中的運載體必須就與該組合物的活性成分相容并且對待治療的對象 無害而言是"可接受的"。一種或多種增溶劑可用作遞送本發明的化合物的藥物賦形劑。其 他運載體的示例包括氧化硅膠體、硬脂酸鎂、纖維素、月桂基硫酸鈉、和D&C Yellow#10。
[0137] 上述式(I)和/或（la)的化合物可通過體內試驗初步篩選其在疾病診斷中功效(參 見下文實施例3)。其它方法對于本領域技術人員也是顯而易見的。
[0138] 本文引用的所有公開文件(例如，專利、專利申請公開和文獻）的內容通過引用全 文納入本文。
[0139] 實施例
[0140] 以下實施例是說明性的而非旨在限制。
[0141] 實施例1:化合物1:2-(!〇-2-(4,7，10-三-羧甲基-1，4,7，10-四氮雜環十二碳-1-基)_戊二酸-1 -酰肼釓絡合物的制備
[0142] 一般過程
[0143] 探針合成
[0144] 如之前所述獲得2-(R)-2-(4,7，10-三-羧甲基-1，4,7，10-四氮雜環十二碳-1_ 基）_ 戊二酸 _1_ 叔丁酯（tBuDOTAGA)(Levy 等，Organic Process Research and Development ,2009,13(3)，535)。所有其他反應物和試劑是商品級并且在沒有進一步純化 下使用。
[0145] NMR
[0146] 在裝備了5mm寬帶探針的Varian 500匪R系統上記錄匪R譜（?匪R:499.81MHz， 13C: 125.68MHz，31P: 207.33MHz)。
[0147] 制備型 HPLC
[0148] 使用以下方法進行制備。合并含有純度>95%的產物的部分：
[0149] 方法1:柱：MetaChem Rechnologies公司，Polaris C18-A ΙΟμπι 250 X 212mm，流 速:25ml/分鐘，溶劑A:水中0.1 % TFA，B:MeCN中0.1 % TFA，5 %B持續5分鐘，在1分鐘內梯度 升至30 %B，之后在10分鐘內梯度升至55 %，在1分鐘內梯度升至100 %B，平穩狀態持續2分 鐘并且再平衡持續6分鐘。
[0150] 方法2:柱：Restek，UltraAqueous C18，5μηι 250 X 10mm，流速：5ml/分鐘，溶劑A:水 中NH4〇Ac(10mM，pH 6.9)，B:MeCN/NH4〇Ac(10mM，pH 6.9)9:1 中0.1%TFA，2%B持續4分鐘，在 11分鐘內梯度升至72 ，之后在1分鐘內梯度升至95 % B，平穩狀態持續2分鐘并且再平衡 持續2分鐘。
[0151] HPLC-MS
[0152] 使用以下方法在安捷倫1100系統上進行HPLC-MS純度分析：
[0153] 方法A:柱：Phenomenex Luna，C18(2)，100 X 2mm，流速：0 · 8ml/分鐘，220、254和 280nm處的紫外檢測，在0.1 %甲酸中5 %的MeCN(0.1 %甲酸)持續1分鐘，然后在9分鐘內梯 度升至95%MeCN(0.1 %甲酸），平穩狀態持續2分鐘，再平衡持續2分鐘。
[0154] 方法B:柱：Restek，UltraAqueous C18,5ym 250X4.6mm，流速：0.8ml/分鐘，220、 254和280nm處的紫外檢測，甲酸銨中5%的MeCN/NH4〇Ac(10mM，pH 6.9)9:1持續1分鐘，然后 在9分鐘內梯度升至95 %MeCN/NH4〇Ac (10mM，pH 6.9)9:1，平穩狀態持續2分鐘，再平衡持續 2分鐘。
[0155] 紫外滴定
[0156] 在1.5mL石英比色皿中放置10yL配體溶液和lmL偶氮砷III溶液(0.15M NH4〇Ac緩 沖液中1(^1偶氮砷111，？!17)。比色皿放入1^/^8分光光度儀并在656腦處歸零。1(^1^的 4.85mM Pb(N〇3)2溶液(或接近終點的0.485mM溶液)的等分在比色皿中滴定直至觀察到正吸 收。正吸收代表滴定終點。
[0157] 化合物1的制備方法
[0158]
[0159] 2-(!〇-2-(4,7，10-三叔丁基羧甲基-1，4,7，10-四氮雜環十二碳-1-基)-戊二酸- 1- N' -叔丁氧基羰基-N-酰肼
[0160] 在干DMF(25ml)中溶解2-(R)-2-(4,7，10-三叔丁基羧甲基-1，4,7，10-四氮雜環十 二碳-1-基)_戊二酸-1-叔丁酯(500mg，713ymol)和0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-Ν,Ν,ν，N: 四甲基脲鐵六氟磷酸鹽(HATU，325mg，856μηιο1)。5分鐘后，加入固體叔丁基-氨基脲（113mg， 856μπιο1)并且持續攪拌24小時。在溶劑蒸發之后，使用方法1純化殘留物得到574mg(704y mol，98.7%)的白色固體產物。
[0161] ΧΗ NMR(DMS0-d6,90°C):9.27(br s,1H),8.21(br s,lH),3.72-3.81(m,4H),3.47-3.56(m,3H),3.07-3.14(m,8H),2.90-2.93(m,8H),2.21(m,2H),1.87-1.95(m,2H),1.46, 1 · 44,1 · 40(3s ,45H) · LC:方法A, tR = 2 · 55分鐘· LC/MS(ESI + ): C4〇H74N6Oii :m/z ( % ):計算值 815· 54[MH+];發現：815.45(MH+).
[0162] 2-(R)-2-(4,7， 10-三-羧甲基-mn)-四氮雜環十二碳-丨-基)-戊二酸―丨-酰肼
[0163] 在TFA(1.5ml)、三異丙基硅烷(90μ1)和1-十二硫醇(90μ1)的混合物中溶解2-(R)_ 2- (4,7，10-三叔丁基羧甲基-1，4,7，10-四氮雜環十二碳-1-基)-戊二酸-1-N'-叔丁氧基羰 基-N-酰肼（100mg，123ymol)。反應混合物在室溫下攪拌過夜。真空中去除揮發物并且殘留 物在半濃縮的HC1中重新溶解。在室溫下攪拌溶液3小時后，凍干溶液。殘留物重新溶解于水 中并且使用氫氧化銨將pH調節至7。凍干后，固體在水(2.00ml)中重新溶解并且經過使用偶 氮砷III的紫外滴定(參見上文）以確定配體的濃度(36mM，72ym〇l，58.5%)。
[0164] ΧΗ NMR(D20,80°C ,pH9): 4.35(d, J= 16.7Hz , 2H) ,4.24(d,J=16.7Hz,2H),3.78-4.14(m,17H),3.65(br s,2H),2.95(br s,2H),2.61(br s,1H),2.47(br s,lH).
[0165] LC:方法B, tR = 2 · 51分鐘·LC/MS(ESI+): C4〇H74N6Oii :m/z( % ):計算值491 · 51 [MH+]; 發現:491.35(MH+).
[0166] 、(幻^^⑴-三-羧甲基-^⑴-四氮雜環十二碳-丨-基卜戊二酸-丨-酰肼 釓絡合物(化合物1)
[0167] 用 GdCl3*6H20(27.0mg，72.6ymol)處理上述獲得的 2-(R)-2-(4,7，10-三-羧甲基-1，4,7,10-四氮雜環十二碳-1-基)-戊二酸-1-酰肼的母液并且將溶液的pH調至6.2。在攪拌 溶液1小時后，加入MS-325配體(55mg，73. Ομπιο?)并且混合物的pH維持在4-8。1小時后，將pH 調至7并凍干溶液。殘留物溶解于方法2中使用的水性洗脫劑中并且使用該方法純化以在凍 干后產生30.0mg(46.5ym 〇l，64.1%)的標題化合物。偶氮砷III和二甲酚橙測試都是陰性， 證明沒有非螯合的Gd(III)。
[0168] LC:方法B，tR = 3 · 73分鐘· LC/MS(ESI + ): Ci9H3〇GdN6〇9:m/z( % ):計算值646 · 13[ΜΗ + ];發現:646.20(ΜΗ+).
[0169] 實施例2:化合物2:(R)-2,2'，2"-(10-(1-羧基_4_(2，2_二甲基肼基)_4_氧代丁 基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸釓絡合物的制備
[0170] -般過程
[0171] 制備型 HPLC
[0172] 使用以下方法進行制備。合并含有純度>95%的產物的部分：
[0173] 方法1:柱：Phenomenex Luna，C18(2) ΙΟμπι 250 X 21 · 2mm，流速：18ml/分鐘，溶劑A: 水中0.1 % TFA，B: MeCN中0.1 % TFA，5 % B持續5分鐘，在1分鐘內梯度升至30 % B，之后在10分 鐘內梯度升至75 %，在1分鐘內梯度升至100 %B，平穩狀態持續2分鐘并且再平衡持續6分 鐘。
[0174] 方法2:柱：Restek，UltraAqueous C18，5μηι 250 X 10mm，流速：4ml/分鐘，溶劑A:水 中0.1%TFA，B:MeCN中0.1%TFA，2%B持續4分鐘，在11分鐘內梯度升至72%B，之后在1分鐘 內梯度升至95 %B，平穩狀態持續2分鐘并且再平衡持續2分鐘。
[0175] HPLC-MS
[0176] 使用以下方法在安捷倫1100系統上進行HPLC-MS純度分析：
[0177] 方法A:柱：Phenomenex Luna，C18(2)，100X 2mm，流速：0 · 8ml/分鐘，220、254和 280nm處的紫外檢測，在0.1 %甲酸中5 %的MeCN(0.1 %甲酸)持續1分鐘，然后在9分鐘內梯 度升至95%MeCN(0.1%甲酸），平穩狀態持續2分鐘并且再平衡持續2分鐘。
[0178] 方法B:柱：Restek，UltraAqueous C18,5ym 250X4.6mm，流速：0.8ml/分鐘，220、 254和280nm處的紫外檢測，甲酸銨中5%的MeCN/NH4〇Ac(10mM，pH 6.9)9:1持續1分鐘，然后 在9分鐘內梯度升至95 %MeCN/NH4〇Ac (10mM，pH 6.9)9:1，平穩狀態持續2分鐘，再平衡持續 2分鐘。
[0179] 化合物2的制備方法
[0180]
[0181] (幻-2,2'，2"-(10-(1-(叔丁氧基)-5-(2,2-二甲基肼基)-1，5-二氧代戊-2-基)_ 1，4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸三叔丁酯
[0182] 在二氯甲烷(25mL)中溶解(R)-5-(叔丁氧基)- 5-氧代-4-(4,7，10-三(2_(叔丁氧 基)-2_氧代乙基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1-基)戊酸(500mg，713ymol)和Ν,Μ-二異丙 基碳二亞胺(01〇(11611^，9274111〇1)。5分鐘后，加入叱1二甲基甲烷二胺(70.541，9274111〇1) 并且持續攪拌24小時。在溶劑蒸發之后，使用方法1純化殘留物得到350mg(471ym 〇l，66%) 的白色固體產物。
[0183] LC/MS:方法A，tR = 5 · 05分鐘· LC/MS(ESI+): C37H7qN6〇9 :m/z ( % ):計算值743 · 99[MH + ];發現:743.5(MH+).
[0184] (R)-2,2'J'-do-d-羧基-4-(2,2-二甲基肼基)-4-氧代丁基)-1，4,7,10-四氮 雜環十二烷_1，4,7-三基)三乙酸
[0185] 在TFA(9ml)、三異丙基硅烷（200μ1)、1-十二硫醇（200μ1)、水（200μ1)和甲磺酸 (200μ1)的混合物中溶解(R)-5-(叔丁氧基)-5-氧代-4-(4,7，10-三(2-(叔丁氧基)-2-氧代 乙基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1-基)戊酸(350mg，471ym 〇l)。室溫下攪拌該混合物2小 時。LC/MS顯示完全反應。真空中去除揮發物并且殘留物在5ml的1.0M HC1中重新溶解。在室 溫下攪拌溶液3小時后，凍干溶液，留下177.2mg的白色固體。
[0186] LC/MS:方法A，tR = 0 · 6分鐘· LC/MS(ESI + ): C2iH38N6〇9:m/z( % ):計算值519 · 56[MH + ];發現:519.2(MH+).
[0187] (R)-2,2'J'-do-d-羧基-4-(2,2-二甲基肼基)-4-氧代丁基)_1，4,7,10-四氮 雜環十二烷-1，4，7-三基)三乙酸釓絡合物(化合物2)
[0188] 在水（10mL)中溶解(R)-2，2'，2"-(10-(1-羧基-4-(2,2-二甲基肼基)-4_氧代丁 基)-1，4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基）三乙酸（5011^，96以111〇1)并且用0.謂恥0!1將溶 液的pH調至7。用GdCl 3*6H20(35 · Omg，92 · 2μπιο1)處理溶液并且pH調至6。在攪拌溶液1小時 后，加入EDTA(2ml，10mM)并且將pH維持在4-8。1小時后，將pH調至7并且將溶液加載到HPLC 上用于使用方法2純化以在凍干后得到14mg(20.8μπιο 1，21.6 % )的標題化合物。
[0189] LC:方法 B，tR = 4.5 分鐘.LC/MS(ESI+):C2iH34GdN6〇9:m/z(%):計算值674·78[ΜΗ+]; 發現:675.0(ΜΗ+).
[0190] 實施例3:化合物9(2,2'，2"-(10-(4-(2-((芐氧基)羰基)-1-異丙基肼基)-1-羧 基-4-氧代丁基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸釓)的制備
[0191]
[0192] 按照文獻方案（Org.Process Res.Dev. ,2009,13,535-542;ChemMedChem. ,2013， 8，1314-1321)制備2-(1〇-2-(4,7，10-三叔丁基羧甲基-1，4,7，10-四氮雜環十二烷-1-基)-戊二酸-1-叔丁酯(9-1)和2-異丙基肼-1-羧酸芐基酯(9-2)。
[0193] ^，，，-(…-"-^-((芐氧基彡羰基卜卜異丙基肼基卜^叔丁氧基卜^-二氧 代戊-2-基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸三叔丁酯(9-3)
[0194] 在干DMF(lOmL)中溶解2-(R)-2-(4,7，10-三叔丁基羧甲基-1，4,7，10-四氮雜環十 二碳-1-基)_ 戊二酸-1-叔丁酯(9-1)(0.2728,0.38!11111〇1)和0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-叱 N，YY -四甲基脲鑰六氟磷酸鹽(HATU，0.162g，0.43mmol)。在5分鐘后，加入2-異丙基肼-1-羧酸芐基酯(9-2)(0.161g，0.77mmol)并且持續攪拌24小時。蒸發溶劑并且通過制備型 HPLC純化殘留物以產生102mg(0.115mmol，30%)的白色固體產物。
[0195] 1H(d6-DMS0)：5 = 7.37(m,5H) ,5.13(s,2H),4.52(br.S,lH) ,3.80(m,4H),3.45(m, 3H),3.12-2.92(m,16H),2.28(m,2H),1.92(m,2H),1.51(m,36H),1.04(d,6H)
[0196] LC/MS(ESI+): C46H78N60ii :m/z ( % )計算值891 · 58[MH+];發現891 · 5(MH+) ·
[0197] ^，，，-(…-^-^-((芐氧基斤炭基卜卜異丙基肼基卜卜羧基^-氧代丁基卜丄， 4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸(9-4)
[0198] 在TFA(5mL)、三異丙基硅烷(900yL)和水(900yL)的混合物中溶解2,2'，2"-(10-(5-(2-((節氧基)羰基)-1-異丙基肼基)-1-(叔丁氧基)_1，5-二氧代戊-2-基)_1，4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（9-3)(40mg，44.9ymol)并且在室溫下該混 合物攪拌過夜。真空中去除揮發物并且在水中重新溶解殘留物并使用氫氧化銨將pH調至7。 在凍干后，向無水甲醇（5mL)中碳載鈀漿液(干重，1.9mg，10質量％ )加入殘留物。混合物經 過2次真空和氫氣吹掃循環，然后在氫氣氛圍下攪拌12小時。在排除氫氣系統之后，加入硅 藻土并且漿液過濾通過MeOH-潤濕的硅藻土床。濾液真空濃縮并且固體在水中重新溶解并 經過使用偶氮砷III的紫外滴定以確定配體濃度(7.67mg，14.4μπι 〇1，8.6mM)。
[0199] 步驟i)LC/MS(ESI+): C3qH46N6〇ii :m/z計算值667 · 33[MH+];發現667 ·4(MH+)
[0200] 步驟 ii)LC/MS(ESI+):C22H4QN6〇9:m/z 計算值533·29[ΜΗ+];發現 533·3(ΜΗ+)
[0201] ^，，，-(…-^-^-((芐氧基斤炭基卜卜異丙基肼基卜卜羧基^-氧代丁基^， 4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸釓絡合物(化合物9)
[0202] 用6(1(：13.6!120(5.4511^，14.664111〇1)處理2,2'，2"-(10-(4-(2-((芐氧基）羰基）-1-異丙基肼基)-1-羧基-4-氧代丁基)-1，4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸的母 液并且pH調至6.8。在12小時攪拌后，加入Na 2H2EDTA(0.27mg，0.72μπιο1)并且另外攪拌溶液2 小時。pH調至7并且通過制備型HPLC純化溶液以產生產物(4.711^，6.85以111〇1，48%)。偶氮砷 III和二甲酚橙測試都是陰性，證明沒有非螯合的Gd(III)。
[0203] LC/MS(ESI+):C22H36GdN6〇9:m/z 計算值687.19[MH+];發現687.1 (MH+)
[0204] 實施例4:化合物10(2,2'，2"-(10-(5-(2-(氨基氧基）乙酰胺基)-1-羧基戊基)-1， 4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸釓)的制備
[0205] 按照文獻方案（PCT國際申請號2006002873，2006 ; J · Org · Chem·，2008，73，983-991)制備化合物6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-溴己酸叔丁酯（10-1)和2-(((叔丁氧基羰基） 氨基)氧基）乙酸2,5-二氧代吡咯啶-1-基酯（10-6)。
[0206]
[0207] 6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-(1，4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基）己酸叔丁酯（10- 2)
[0208] 在乙腈（25mL)中溶解四氮雜環十二烷（0.842g，4.89mmol)和三乙胺（1.136mL， 8.13111111〇1)。向該溶液中加入6-(((芐氧基)羰基)氨基）-2-溴己酸叔丁酯（10-1)(0.65(^， 1.63mmol)并且隨時通過LC/MS跟蹤起始物質消耗。在6小時后，蒸發溶劑并且通過制備型 冊0：純化殘留物以產生0.7318(1.49111111〇1，91%)的白色固體產物 ：1!1匪1?(0)(：13)47.96 (br.s,4H),7.28(m,5H),5.37(br.s,lH),5.06(s,2H),3.28-2.88(m,18H),1.61(m,2H), 1.56-1.41(m，15H); 13C 匪R(CDC13) :δ172· 1,156.7,136.7,128.5,128.0,127.6,83.0， 66.4,63.2,47.0,44.6,43.3,42.4,40.4,29.3,28.4,27.9，24.1;LC/MS(ESI+):C26H45N5〇4: m/z計算值492.35[MH+];發現492.4(MH+).
[0209] ^，，^-(…-"-(((芐氧基斤炭基彡氨基卜^叔丁氧基卜卜氧代己^-基)-^， 7,10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（10-3)
[0210] 在干乙腈（20mL)中溶解6-(((芐氧基）羰基）氨基）-2-( 1，4,7,10-四氮雜環十二 烷-1-基）己酸叔丁酯（10-2) (0.955g，1.94mmol)和碳酸鉀(2.685g，19.4mmol)。逐滴加入溶 解在干乙腈(40mL)中的2-溴乙酸叔丁酯（1.100g，5.64mmol)并隨時通過LC/MS跟蹤起始物 質的消耗。在6小時后，蒸發溶劑并且通過制備型Η P L C純化殘留物以產生1 . 4 9 1 g (0 · 179mmo 1，92 % )的白色固體產物：LC/MS(ESI +): C44H75N5O1Q: m/z計算值834 · 56 [MH+ ];發 現835·5(ΜΗ+).
[0211] 2,2'，2"-(10-(6-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)-1，4,7，10-四氮雜環十二 烷-1，4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（10-4)
[0212] 向無水甲醇（15mL)中的碳載鈀（干重，61.3mg，10重量％)漿液中加入2,2'，2"_ (10-(6-(((芐氧基)羰基)氨基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)-1，4,7,10-四氮雜環十二 烷-1，4，7-三基)三乙酸三叔丁酯（10-3) (1.200g，1.44mmol)。混合物經過2次真空和氫氣吹 掃循環，然后在氫氣氛圍下攪拌12小時。在排除氫氣系統之后，加入硅藻土并且漿液過濾通 過MeOH-潤濕的娃藻土床。濾液在真空中濃縮成淡黃色油以產生0.896g(1.28mmo 1，89 % )產 物，其在下一步驟中使用而不需要進一步純化:LC/MS(ESI + ):C36H69N5〇8:m/z計算值700.52 []?1+] ;發現700.7(]\^+)·
[0213] 2,2'，2"-(10-(5_氨基-卜羧基戊基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三 乙酸（10-5)
[0214] 在TFA(5mL)、三異丙基硅烷（900yL)和水（900yL)的混合物中溶解2,2'，2"-(10_ (6-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸 三叔丁酯（10-4) (0.896g，1.28mmol)并且在室溫下該混合物攪拌過夜。真空去除揮發物以 產生油0.5728(1.20!11111〇1，94%)，其用于下一步驟而不需要進一步純化 ：1^(：/^3^31 + ): C20H37N5O8 :m/z計算值476 · 27[MH+];發現476.5(]\^+)·
[0215] 2,2'，2"-(10-(14_羧基-2,2-二甲基-4,8-二氧代-3,6-二氧雜-5,9-二氮雜十四 烷-14-基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸（10-7)
[0216] 在干燥DMF(lOmL)中溶解2,2'，2"-(10-(5_氨基-卜羧基戊基）-1，4,7，10_四氮雜 環十二烷-1，4,7-三基）三乙酸（10-5)(0.5728，1.20!11111〇1)和二異丙基乙胺（1.0511^， 1.26mm 〇l)。在5分鐘后，加入2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基）乙酸2，5-二氧代吡咯啶-1-基 酯（10-6) (0.416g，1.44mmol)并且持續攪拌24小時。蒸發溶劑并且通過制備型HPLC純化殘 留物以產生0.6528(1.00_〇1，84%)的白色固體產物: 1!1匪1?((16-0150):34.15(8,2!0,3.79 (m，4H)，3.61(m，2H)，3.56(dd，lH)，3.20-2.93(m，18H)，1.76(m，lH)，1.60(m，lH)，1.56-1 · 38(m, 13H);LC/MS(ESI+): C27H48N6O12 :m/z計算值649 · 34[MH+]，發現649.6(]\^+)·
[0217] 2,2'，2"-(10-(5-(2-(氨基氧基）乙酰胺基)-卜羧基戊基)-1，4,7，10-四氮雜環十 二烷-1，4,7-三基)三乙酸（10-8)
[0218] 在二噁烷(4mL)中的4M HC1 中溶解2，2 '，2" -(10-( 14-羧基-2，2-二甲基-4，8-二氧 代-3,6-二氧雜-5,9-二氮雜十四烷-14-基)-1，4,7，10_四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙 酸（10-7)(50.0mg，77.Uimol)并且在室溫下攪拌過夜。真空去除揮發性物質。殘留物重新溶 解于水中并且使用氫氧化銨將pH調節至7。凍干后，固體在水中重新溶解并經過使用偶氮砷 ΠI的紫外滴定以確定配體濃度(23.5mg，42.4μπιο 1，43mM)。
[0219] LC/MS: C22H4QN6O1Q :m/z計算值549 · 29[MH+];發現549 · 3(MH+)
[0220] 化合物10
[0221] 用6此13,6!120(16.111^，43.34111〇1)處理2,2'，2"-(10-(5-(2-(氨基氧基）乙酰胺 基)-1-羧基戊基)-l，4,7，10-四氮雜環十二烷-1，4,7-三基)三乙酸（10-8)(23.5mg，42.4y mol)的母液并且pH調至6.8。在12小時攪拌后，加入Na 2H2EDTA(0.79mg，2.12μπιο1)并且另外 攪拌溶液2小時。pH調至7并且通過制備型HPLC純化溶液以產生產物（21.4mg，30.4μπιο1， 72%)。偶氮砷III和二甲酚橙測試都是陰性，證明沒有非螯合的Gd(III)。
[0222] LC/MS(ESI+):C22H36GdN6〇io:m/z 計算值703·18[ΜΗ+];發現703·3(ΜΗ+)
[0223] 實施例5: ΝΟΤΑ化合物11-14的制備
[0224]
[0225] 按照文獻過程（Org.Process Res .Dev. ,2009,13,535-542)制備2-(R)-2-(4,7, 10-三叔丁基羧甲基-1，4,7_三氮雜環壬烷-1-基)-戊二酸-1-叔丁酯（11-1)。
[0226]
[0227] 2-(R)-2_(4,7，10-三叔丁基羧甲基-1，4,7_三氮雜壬烷-1-基)_戊二酸-1-N'-叔 丁氧基羰基-N-酰肼(11-2)
[0228] 在干DMF( 10ml)中溶解2-(R)-2-(4，7，10-三叔丁基羧甲基-1，4，7-三氮雜壬烷-1-基)-戊二酸-1-叔丁酯（11_1)(15211^，28(^111〇1)和0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)，，^，^- 四甲基脲鑰六氟磷酸鹽（私1'1]，125.511^，33(^111〇1)。5分鐘后，加入固體叔丁基-氨基脲 (43.6mg，330μπι〇1)并且持續攪拌24小時。蒸發溶劑并且通過反相制備型HPLC純化殘留物以 產生39mg(59ymol，21%)的白色固體產物。
[0229] LC/MS(ESI+): C32H6〇N5〇9:m/z計算值658 · 44[MH+];發現658 ·4
[0230] 2-(R)-2-(4,7，10-三羧甲基-1，4,7-三氮雜壬烷-1-基)-戊二酸-1，'-叔丁氧基 羰基-N-酰肼(11-4)
[0231] 在TFA(1.5ml)、三異丙基硅烷(90μ1)和1-十二硫醇(90μ1)的混合物中溶解2-(1〇-2-(4，7，10-三叔丁基羧甲基-1，4，7-三氮雜壬烷-1-基)-戊二酸-1-Ν' -叔丁氧基羰基-Ν-酰 肼（ll-2)(52mg，79ym〇l)并且該室溫下該混合物攪拌過夜。真空去除揮發物并且殘留如在 6M HC1中重新溶解。在溫室下攪拌3小時后，凍干溶液。殘留物重新溶解于水中并且使用氫 氧化銨將pH調節至7。
[0232] 1H(d6-DMS0)：5=4.41(s,4H),4.14(dd,lH),3.76-3.54(m,12H),3.06(t,2H),1.05 (ddt,2H)
[0233] 13C(d6-DMS0) :5 = 175.5,173.6,172.4,64.2,56.0,51.8,50.1,46.5,30.5,24.3.
[0234] LC/MS(ESI+): C15H27N5O7:m/z計算值390 · 20[ΜΗ+];發現390 · 1
[0235] 2，2'-(7-(1-(叔丁氧基)-5-(2,2-二甲基肼基)-1，5-二氧代戊-2-基)-1,4,7-三 氣雜壬燒 _1，4_二基）（S)-二乙酸二叔丁酯（11_3)
[0236] 在干DMF( 10ml)中溶解2-(R)-2-(4，7，10-三叔丁基羧甲基-1，4，7-三氮雜壬烷-1-基)-戊二酸-1-叔丁酯（11_1)(15211^，28(^111〇1)和0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)，，^，^-四甲基脲鑰六氟磷酸鹽(HATU，125 · 5mg，330ymol)。5分鐘后，加入N，N-二甲基肼（19 · 8mg， 330μπι〇1)并且持續攪拌24小時。蒸發溶劑并且通過反相制備型HPLC純化殘留物以產生 0.123g(0.21mmol，75%)的白色固體產物。
[0237] LC/MS(ESI+): C29H55N5O7:m/z計算值586 · 42[MH+];發現586 ·6
[0238] (S)-2，2 ' -(7-( 1-羧基-4-(2，2-二甲基肼基)-4-氧代丁基)-1，4，7-三氮雜壬烷-1，4_ 二基）二乙酸（11-5)
[0239] 在TFA (1.5mL)、三異丙基硅烷(90yL)和1 -十二硫醇（90μ1)的混合物中溶解2，2 ' -(7-(1-(叔丁氧基)-5-(2,2-二甲基肼基)-1，5_二氧代戊-2-基)-1，4,7_三氮雜壬烷-1，4_ 二基）（S)-二乙酸二叔丁酯（11-3) (80mg，0.137mmol)并且在室溫下該混合物攪拌過夜。真 空去除揮發物并且殘留如在6MHC1中重新溶解。在溫室下攪拌3小時后，凍干溶液。殘留物重 新溶解于水中并且使用氫氧化銨將pH調節至7。凍干溶劑并且通過反相制備型HPLC純化殘 留物以產生22.0mg(0.053mmol，38%)的白色固體產物：
[0240] 1H(d6-DMS0)：5=4.35(s,4H),4.12(dd,lH),3.75-3.52(m,18H),3.04(t,2H),2.64 (ddt,2H)
[0241] LC/MS(ESI+): C17H32N5O7:m/z計算值418 · 23[MH+];發現418 · 1
[0242] 64Cu_標記的偶聯物：
[0243] 乙酸鈉緩沖液（1Μ，ρΗ 4.5)中lmCi的64CuC12加入含10yg化合物1-4的小瓶中并且 在室溫下標記20分鐘。通過在酸性條件下Restek Ultraaqueous C18柱(250mm X 3mm X 5μ m)上的RP-HPLC評價放射化學純度（溶劑A: Η20+0.1 % TFA，溶劑Β:MeCN+0.1 % TFA; 0-10分 鐘，0-20%B; 10-15 分鐘，20-95%B; 15-17 分鐘，95%B，17-18 分鐘，95-0%B; 18-20 分鐘，0% B)〇
[0244] 64Cu-N0DAGA-Hyd(化合物 12) ;Rt:8.23分鐘（76% )
[0245] 64Ga_標記的偶聯物：
[0246] 用0.5mL的HC1 6N洗脫68Ge/68Ga發生器。洗脫液（15mCi)用0.2mL乙酸鈉緩沖液 (3M，pH 4.0)中和并且加入含10yg化合物11-4或化合物11-5的小瓶中。2種配體在60°C下標 記15分鐘。
[0247] 通過在酸性條件下Restek Ultraaqueous C18柱（250mm X 3mm χ 5μηι)上的RP_ HPLC 評價放射化學純度(溶劑 A: H20+0.1 % TFA，溶劑 B: MeCN+0.1 % TFA; 0-10 分鐘，0-20 % B; 10-15 分鐘，20-95%B; 15-17 分鐘，95%B，17-18 分鐘，95-0%B; 18-20 分鐘，0%B)。
[0248] 68Ga-N0DAGA-Hyd(化合物 11); Rt: 5 · 60分鐘(73 % )
[0249] 68Ga-N0DAGA-diMe (化合物 13); Rt: 8 · 57分鐘（100 % )
[0250] 實施例6:化合物與BSA的體外結合
[0251] 為了證明化合物1在生物環境中與醛官能度的選擇性結合，制備具有增強的醛官 能度水平的牛血清白蛋白（BSA)并且測量了在與化合物1和化合物2孵育后h弛豫度變化的 比較。
[0252] 向溶于磷酸鹽緩沖鹽水(2mL，pH 7.4，0.25mM)的牛血清白蛋白中加入戊二醛溶液 (100yL，水中25重量％溶液）并且在室溫下攪拌5分鐘。向該溶液中加入氰基硼氫化鈉 (25mg)并且溶液在4 °C下過夜攪拌。平行運行不添加戊二醛的BSA蛋白質標準品作為對照。 在FO-lOSephadex G25脫鹽柱(GE醫療集團（GE healthcare))上純化2種蛋白質混合物，用 水洗脫，以去除過量的戊二醛。使用"BCA蛋白試驗試劑盒"（熱科學公司（Thermo Scientif ic))評估蛋白質濃度。戊二醛官能化的蛋白質(BSA-ALD)的濃度為20mg/mL，而對 照蛋白質（BSA)的濃度為18.4mg/mL。使用標準DNPH文獻方案來估計各蛋白質的醛濃度。 BSA-ALD的醛濃度為16nmol醛/mg蛋白質，BSA的醛濃度為1 · 2nmol醛/mg蛋白質。
[0253] 在37°C下用一定濃度范圍（0.1_1.〇111]\1，等同于1:1、2:1、3:1、4 :1和5:1的[6(1]: [醛]比率的濃度)的化合物1或化合物2處理BSA(3mg，163yL)或BSA-ALD(3mg，150yL)的等分 持續24小時，所有樣品維持總體積300μ1。在24小時后，在0.47T和37°C下使用Bruker mq20Minispec記錄縱向（Τι)弛豫測量值。通過0.05χ Τι至10χ Τι范圍持續時間的10次反轉 上的反轉恢復實驗獲取縱向（h)弛豫。從5個濃度的Gd(III)的1 /^對[Gd]的曲線的斜率確 定弛豫度(ri)。
[0254] 在測量后，向各樣品加入完全氰基硼氫化鈉（10mg)以減少腙官能度并且不可逆地 將探針結合至蛋白質。在37°C下另外孵育2小時后，再次測量所有樣品的縱向（??弛豫測量 值。
[0255] 化合物1和化合物2的溶液(濃度范圍：0.1 mM-1. OmM，水中）不含蛋白質的平行運行 作為對照。
[0256] 通過超濾（5,000Da截止PLCC纖維素膜）實現游離和任意BSA-結合的Gd探針的分 離。在分離后，測量蛋白質和游離溶液部分的縱向（TD弛豫測量值，并且使用安捷倫 8800ICP-QQQ系統來確定各部分中的Gd含量的定量。
[0257] 圖3A和3B中分別給出了化合物1和化合物2與BSA-ALD和BSA的弛豫度測量值及其 相對于溶液（水）中化合物1和化合物2標準品的弛豫度的變化。在溶液中的化合物1 (4.0711^_18_1，3101(，？!17)與化合物1與834(4.171111_ 18_1，3101(，？!17)測量的1'1弛豫度之間沒 有觀察到統計學上顯著的差異。觀察到與BSA-ALD孵育的化合物1的1^弛豫度相比溶液中的 化合物1在統計學上顯著增加(4.5711^ 1^1，310K，pH 7)并且該增加在加入氰基硼氫化鈉還 原劑之后（5.5911^_18_1，3101(，？!17)顯示出更大的統計學顯著性。化合物2對834(4.2〇1111一 18 ΛβΙΟΚ,ρΗ 7)或BSA-ALDHjSmM^dlOLpH 7)樣品相對于標準化合物2溶液測量值 (4.0911^^^3101(,pH 7)在弛豫度上沒有看到統計學上顯著的差異。
[0258]在從游離溶液中分離后與各蛋白質部分結合的Gd的量示于圖4A并且圖4B顯示總 初始[Gd]濃度的百分比。對于化合物2,沒有統計學上顯著量的Gd顯示與BSA或BSA-ALD結 合。與 BSA(0.24nmol，總[Gd]的0.58%)相比，85厶4〇)(2.52腦〇1，總[6(1]的5.72%)觀察到 與蛋白質結合的化合物1的10倍增加。在加入還原劑之后，與BSA-ALD結合的化合物1的量增 加至 6.78nmol (總[Gd]的16.63%)〇
[0259] 蛋白質結合和游離溶液部分的縱向（TO弛豫測量值的比較顯示，與溶液對照相 比，對于蛋白質部分，化合物1顯示出在弛豫時間上的顯著增加（圖5A)，以及在游離溶液弛 豫時間中的相關降低，支持增加的蛋白質結合。對于BSA-ALD或BSA，化合物2弛豫時間并不 與標準品有顯著差異。與溶液中化合物1的4. (^πιΜ^?Γ1 (31 OK，pH 7)的弛豫度相比，分離后 與BSA-ALD孵育的化合物1的蛋白質結合弛豫度為13.7411^1^ (31 OK，pH 7)并且游離溶液 弛豫度為4 · 02mM-V1 (310K，pH 7)(圖 5B)。
[0260] 醛賴氨酸定量
[0261] 為了使體內成像數據與醛賴氨酸濃度相關聯，開發了 HPLC分析方法來對肺組織中 存在的醛賴氨酸的量進行定量。
[0262] 肺組織在2-萘酚-6-磺酸鈉水合物存在下水解以形成2-氨基-5-( P，32-二羥基-4， 4,6,6-四氧-5-氧雜-4,6-二噻-1，3(1，6)-二蔡環己酸（(1;[11&卩]11：]1&1611&〇5^1〇]16叉&卩]1&116)-2_基)戊酸，一種醛賴氨酸的熒光衍生物，以允許通過HPLC進行檢測和定量。
[0263]
?w.s
[0264] 在含2-萘酚-6-磺酸鈉水合物（2 %w/v)、熒光素（20yL，ImM)、肌氨酸（100yL，4mM) 和己醛(50yL，8mM)的6M HC1 (2mL)的溶液中對博來霉素處理的小鼠或對照小鼠的肺水解24 小時。在110°C下孵育24小時后，在通過HPLC分析之前，將溶液冷卻至室溫并且用6M NaOH (100yL)中和等分（100yL)并且用0.6M硼酸鹽緩沖液(100yL，pH9)緩沖。
[0265] HPLC 方法
[0266] 溶劑A:含0.2mM EDTA和ImM MgCl2的0.5M磷酸鹽緩沖液，pH6.5,溶劑B:60%乙腈， 40%含0.2mMEDTA和lmMMgCl2的0.5M磷酸鹽緩沖液，pH6.5。
[0267] 方法:0-15分鐘，100-82.5%A; 15-18分鐘，82 ·5-50%Α; 18-21 分鐘，50-0 %A; 21-28 分鐘，0%Α;28-28·5 分鐘，0-100%Α;28·5-35 分鐘，100%A。
[0268] 波長：〇-16分鐘，人(^ = 285]1111，人(3111=31311111;16-20分鐘，人(^ = 46〇11111，人(3111=51511111;2〇-35 分鐘，Xex = 285nm，Xem=313nm
[0269] 保留時間：按照熒光素和己醛標準品來校正2-氨基-5-(12，32-二羥基-4，4，6，6-四 氧-5-氧雜-4，6-二噻-1，3(1，6)-二萘環己酚-2-基)戊酸的峰面積(保留時間：14.1分鐘）。 包括己醛與2-萘酚-6-磺酸鈉水合物形成I 2，32-二羥基-2-戊基-5-氧雜-4，6-二噻-1，3(1， 7)-二萘環己酚4,4,6,6_四氧化物的反應作為反應對照(保留時間：26.9分鐘）。
[0270] 在相同樣品上進行羥脯氨酸HPLC試驗以對各組織樣品中存在的膠原蛋白的量進 行定量以使醛賴氨酸濃度與膠原蛋白濃度相關聯。
[0271 ]與對照動物相比，在博來霉素處理的動物的肺中觀察到多2.7倍的醛賴氨酸。這與 膠原蛋白的水平增加相關聯(博來霉素處理的動物91.7yg/肺對比對照動物54. lyg/肺）。
[0272] 實施例7 :化合物1的生物分布
[0273] 為了測試化合物1是否在注射后保留在體內，用100μ mol/kg的化合物1靜脈內注射 正常A/J小鼠 （n = 3)。注射后24小時處死小鼠，并且組織被取出、稱重、在硝酸中消化并且通 過IC P - M S分析G d含量。注射后2 4小時在各組織中保留的注射劑量的百分比如下：血液 (0.00015 ±0.00003)、肺（0· 17 ±0.08)、心臟（0.0052±0.0015)、肝臟（0.31 ±0.09)、脾 (0.029±0.009)、胃（0.0076±0.0026)、小腸（0.0024±0.0003)、腎（0.092±0.018)、肌肉 (0.068±0.014,估計肌肉占體重的40% )。總之，這些組織中的殘留Gd占注射劑量的不到 0.7%，表明Gd-Hyd在靜脈內注射后幾乎完全消除。
[0274] 實施例8:纖維化的小鼠模型中的磁共振(MR)成像
[0275] 動物模型
[0276] 肝纖維化:通過每周三次口服灌胃持續18周向品系A/J雄性小鼠（緬因州巴港的杰 克森實驗室公司（Jackson Laboratories))給予0. lmL的橄欖油中40%CC14溶液(密蘇里州 圣路易斯的西格瑪公司（Sigma))來誘發纖維化。對照僅接受純橄欖油。在最后一次注射后 一周對動物成像以避免CC1 4的急性作用。
[0277] 肺纖維化:在10周齡的雄性C57/BL6小鼠中通過經氣管給予PBS中的博來霉素(BM， 2.5U/kg)來引發肺纖維化。假對照動物僅接受PBS。
[0278] MR 成像
[0279] 肝成像(CC14小鼠）
[0280]在推注(尾靜脈)注射探針(化合物1或化合物2)前后使用4.7T掃描儀通過T1-加權 的成像對小鼠進行成像。使用DICOM viewer Osirix來進行圖像可視化和定量。感興趣區域 (R0I)置于整個肝截面上同時避開主要血管。分析了覆蓋整個肝臟的軸向切片(>1〇切片/小 鼠）。也通過單獨的R0I對各切片內的肌肉信號強度進行定量。為了評價噪音，測量動物外空 氣的R0I并且獲取該測量值的標準偏差。在注射前和后30分鐘圖像上進行相同的分析（3D FLASH順序） 。
[0281] 使用等式（1)計算對比噪音比（CNRhSIz信號強度，SD =標準偏差，并且ACNR是 前和后圖像之間的絕對差(2)。
[0282] CNR=(SI 賺-SI 細）/SDs^ (1)
[0283] Δ CNR = {CNR后-CN%} (2)
[0284] 結果見圖1A-1D。圖1A顯示向CCL4-處理的小鼠給予化合物1前后的經軸MR圖像 (Ishak 5纖維化）。化合物1給藥后的MR圖像顯示在肝臟中MR信號強度的強烈強化。在另一 方面，在具有健康肝臟的年齡匹配的對照小鼠中幾乎沒有觀察到強化。對照探針，化合物2， 其為化合物1的甲基化形式，顯示出相似的藥代動力學，但是不與膠原蛋白中的肽基醛結 合。圖2B顯示這種甲基化的對照，即化合物2幾乎沒有顯示出纖維化肝臟的強化。圖2C顯示 肝臟和骨骼肌之間MR對比的增加。僅在接受化合物1的纖維化小鼠，但不在具有健康肝臟的 對照小鼠或接受對照探針化合物2的纖維化小鼠中看到大且顯著的影響。圖2D顯示天狼星 紅染色確認纖維化小鼠中的晚期纖維化。
[0285] 肺成像(博來霉素處理的小鼠）
[0286] 在推注(尾靜脈)注射探針(化合物1或化合物2)前后使用4.7T掃描儀通過T1-加權 的成像對小鼠進行成像。針對呼吸運動門選圖像。成像方案包括1)多層2D快速獲取再聚焦 回波(RARE)成像以描述解剖學;2)帶呼吸門選的基線3D超短TE (UTE)順序;3)基線3D快速小 角度激發(FLASH)血管造影順序;4)推注注射100μ mol/kg化合物1 ;5)3D FLASH順序重復5 次;6)30 17^順序重復3次。使用程序08；[1^(￥￥￥.08；[1^-￥16￥61'.(30111/)來分析圖像。使用 注射后3D FLASH圖像來使肺部脈管系統可視化。將感興趣區域(R0I)手工置于排除主要血 管的肺組織上。一個R0I置于肺的左葉上，而另一個置于肺的右葉上。然后將R0I精確復制到 UTE圖像上以對探針強度進行定量。分析了覆蓋整個肺的皮質切片(>10切片/小鼠）。也通過 單獨的R0I對各切片內的肌肉信號強度進行定量。這對探針前和探針后UTE圖像進行。獲得 各切片的肺和肌肉中的信號強度（SI)。使用與動物相鄰的空氣中的信號強度的標準偏差 (SD)來估計噪音。如上述等式(1)和(2)計算CNR和△ CNR。
[0287] 結果見圖2A-2F。獲得2只小鼠的MR圖像:一個在成像前10天氣管內給予博來霉素 以誘發肺纖維化，并且第二小鼠僅給予磷酸鹽緩沖鹽水(假對照)并且具有正常的肺結構。 這些小鼠在基線處成像，然后注射化合物1并另外成像。圖2A和2B分別顯示患有肺纖維化的 小鼠和假對照小鼠的MR圖像。圖2C和2D是在注射化合物1之前和之后立即拍攝的圖像并且 證明在2只小鼠中血液池中相似的強化。然而，隨著時間推移，化合物1被正常小鼠清除（圖 2A)，但是在纖維化組織中保留明顯的MR圖像信號強化（圖2B)。對肺組織和相鄰骨骼肌之間 的對比變化(CNR)進行定量。圖2E顯示2只小鼠注射化合物1后1小時測量的CNR增加。對比在 纖維化小鼠中高6倍。圖2F顯示組織學確認纖維化小鼠中存在纖維化。
[0288] 實施例9:在CC14處理6周或12周的小鼠中的磁共振成像
[0289] 動物模型
[0290] 通過每周三次口服灌胃持續6周(n=14)或12周(n=10)向品系A/J雄性小鼠（緬因 州巴港的杰克森實驗室公司（Jackson Laboratories))給予0. lml的40%CCl4溶液(密蘇里 州圣路易斯的西格瑪公司（Sigma))來誘發不同階段的纖維化。對照僅接受純橄欖油(n = 12)〇
[0291] 在注射成像探針之前和之后立即對動物進行成像。成像后，處死動物并且取出肝 臟用于組織病理學分析。
[0292] 用異氟烷(1-2%)麻醉動物并且置于專門設計的容器中，體溫保持在37°C。尾靜脈 插管用于靜脈內（iv)遞送造影劑同時將動物置于掃描儀中。在4.7T處使用帶定制構造容積 線圈（custom-built volume coil)的小口徑動物掃描儀(Bruker Biospec)來進行成像。在 推注靜脈內注射化合物l(l〇〇ym〇l/kg)前后對小鼠進行成像。圖像順序是三維快速低角度 照射（3DFLASH)采集：重復時間（TR= 15 · 3ms)，回波時間（TE = 1 · 54ms)，翻轉角=15°，視場 48x24x24mm并且基質尺寸192x96x96針對250μπι各向同性的分辨率并使用4次平均。
[0293]圖像分析
[0294]使用Osirix軟件進行圖像分析。手動追蹤感興趣區域(R0I)，包括肝實質同時避開 主要血管。第二R0I置于同一圖像切片中可見的背肌上以對肌肉中的信號強度進行定量用 于比較。將7個R0I置于沒有任何組織的視場（空氣）中以測量圖像中的噪音。以這種方式分 析超過20個貫穿整個肝臟的縱向切片/小鼠。在注射前和注射后15分鐘圖像上進行相同的 分析。
[0295] 為了對肝臟中的信號強化進行定量，使用以下等式1計算對比噪音比（CNRhSIi 信號強度，SD =標準偏差。對于注射前圖像(CNR前)和注射后圖像(CNR后)計算所有圖像切片 的平均。各小鼠的肝臟強化表示成A CNR，注射前CNR與注射后CNR之間的差(等式2)。
[0296] CNR=(SI 賺-SI 腦)/SDs^ (1)
[0297] Δ CNR = CNR后-CNR前(2)
[0298] 用重復測量AN0VA，之后是SNK(Student-Newman_Keuls post hoc test)事后檢驗 來檢驗組間差，P〈〇. 05被認為是顯著的。
[0299] 組織分析
[0300]福爾馬林固定的樣品包埋在石蠟中，切成5μπι厚的切片并且按照標準過程用天狼 星紅染色。使用ImageJ(rsbweb. nih.gov/ij/)分析天狼星紅染色的切片來對染成紅色的載 玻片的百分比進行定量。通過使用Taqman引物（紐約州格蘭德島的生命技術公司（Life Technologies))的實時PCR來對肝臟組織中L0X、L0XL1、和L0XL2的mRNA表達進行定量。 Taqman 引物組是針對L0X的Mm00495386_ml，針對L0XL1 的MmOl 145738_ml和針對L0XL2的 Mm00804740_ml。各基因的表達標準化至基因18s的表達。
[0301]結果示于圖6。在載劑處理的動物中，在注射后15分鐘時肝臟中幾乎沒有信號強 化，但是對于接受6或12周的CC14的小鼠有對于基線圖像的明顯強化。這示于圖6,其中軸向 圖像在化合物1注射前后顯示。注射前圖像顯示載劑（圖6A，左圖）、6周CC1 4處理（圖6B，左） 和12周CC14處理（圖1C，左)之間類似的對比。在12周CC14-處理的動物的化合物1注射后圖像 中看到的對比強化（圖6C，右圖）沒有在載劑處理的對照中看到（圖6A，右）。強化在6周CC1 4-處理的動物中是中等的（圖6B，右）。肝臟:肌肉對比噪音比的變化ACNR從載劑處理的假對 照動物中的0.1±0.2增加至6周〇：14-處理的動物中的1.2±0.8(?〈0.01，圖7)。么〇順進一 步增加至12周組中的2.0±1.3(相比載劑p〈0.0001，圖7)。在6周CC14-處理的動物中化合物 1誘導的A CNR增加12倍，并且在12周CC14-處理的動物中增加20倍。
[0302] 實施例10:6_周或12-周CC14-處理的小鼠的組織學
[0303]與載劑對照相比，在6周和12周CC14組中觀察到增加的天狼星紅染色。圖8A(中圖） 顯示具有廣泛肝門纖維化但是偶發橋連纖維化的6-周動物中的彌漫性纖維化（圖8A，中）。 在12-周組中看到具有完全橋連纖維化的天狼星紅染色（圖8A，右）。天狼星紅染色定量地從 載劑中的〇.6±0.2%增加至6-周動物中的2.7±0.8%，增加至12-周CCU肝臟中的4.0 土 1.2% (圖8B)。由qRT-PCR確定的賴氨酰氧化酶mRNA表達確認在這些動物中，CC14處理增加 了 LOX(圖 8C)、L0XL2(圖 8D)、和 L0XL1 (圖 8E)基因表達。
[0304]實施例11:肝纖維化回歸的化合物1成像 [0305] 動物模型
[0306]通過每周三次口服灌胃持續6周向品系A/J雄性小鼠（緬因州巴港的杰克森實驗室 公司）給予0.1ml的40%CC14溶液(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司），然后允許恢復另外6 周(ri = 7)。使用與之前的實施例相同的方案在注射成像探針之前和之后立即對動物進行成 像。
[0307] 結果
[0308]與在6周CC14處理后成像的小鼠（6w，圖9)相比，用6周CC14處理接著6周恢復期的小 鼠（6w-r，圖9)顯示降低的Δ CNR，其從6-周僅CC14處理的動物的1.2±0.8(與載劑對照相比 ?〈0.01)降低至0.5±0.9(與載劑對照沒有統計學顯著差異）。化合物1強化降低58%。持續 12周接受CC1 4的小鼠顯示更高的ACNR。成像研究與組織學相一致。與持續接受CC14的小鼠 (3.8±0.7%，卩〈0.00001)相比，天狼星紅染色在去除組（1.4±0.4%)中減少，但是高于載 劑對照組（0 · 5 ± 0 · 2 %，P〈0 · 00001)。
[0309]實施例12:化合物2成像
[0310]我們就其對纖維化成像的能力比較了化合物2與化合物1。化合物2的結構與化合 物1非常相似，但是酰肼官能團已經二甲基化。化合物2中所得的二甲基酰肼不能發生與醛 部分的不可逆反應。使用與之前實施例中所述相同的動物模型和成像范例，對持續12周 CC14處理的小鼠或持續12周接受載劑的小鼠進行成像。
[0311] 對于用化合物2對小鼠成像，在載劑處理（Δ CNR = 0.6±0.9)和12-周CC14-處理的 動物（Δ CNR = 0.5±0.5)中觀察到肝臟的稍許強化，但是在載劑處理和CC14-處理的小鼠之 間Δ CNR沒有差異。然而，對于化合物1，與載劑組（Δ CNR = 0.1 ±0.2)相比，Δ CNR在CC14-處 理的組（ACNR = 2.0±1.3)中高20倍。
[0312] 實施例13:小鼠組中博來霉素誘導的肺纖維化的化合物1成像 [0313] 動物模型
[0314] 在10周齡的雄性C57/BL6小鼠中通過經氣管給予PBS中的博來霉素（博來霉素； 2.5U/kg)來引發肺纖維化。假對照動物僅接受PBS。在注射成像探針之前和之后立即對動物 進行成像。成像后，處死動物并且取出肺用于組織病理學分析。對3組進行成像：1)僅載劑(η =16)，2)博來霉素后1周(11 = 18)，3)博來霉素后2周(11 = 12)。
[0315] 用異氟烷(1-2%)麻醉動物并且置于專門設計的容器中，體溫保持在37°C。尾靜脈 插管用于靜脈內（iv)遞送造影劑同時將動物置于掃描儀中。在4.7T處使用帶定制構造容積 線圈的小口徑動物掃描儀(Bruker Biospec)來進行成像。在推注靜脈內注射Gd-Hyd(100y mol/kg)前后對小鼠進行成像。使用2種成像順序:三維快速低角度照射(3D FLASH)采集:重 復時間（TR= 15 · 3ms)，回波時間（TE = 1 · 54ms)，翻轉角(FA = 40°)，視場48x24x24mm并且基 質尺寸192x96x96針對250μπι各向同性的分辨率，1次平均;和三維超短回波時間（3D UTE)采 集：TR/TE/FA = 8.0ms/0.02ms/40°，視場48x24x24mm并且基質尺寸 192x96x96針對250μπι各 向同性的分辨率，1次平均。
[0316]圖像分析
[0317] 使用Osirix軟件進行圖像分析。在左和右肩肌肉上，手動追蹤左和右肺實質上的 R0I，同時避開主要血管，并且將7個R0I置于沒有任何組織的視場(空氣）中以測量圖像中的 噪音。分析了覆蓋整個肺的皮質切片（>1〇切片/小鼠）。在注射前和注射后30分鐘圖像上進 行相同的分析。
[0318] 為了對肺中的信號強化進行定量，使用以下等式1計算對比噪音比（CNRhSIi信 號強度，SD =標準偏差。對于注射前圖像(CNR前)和注射后圖像(CNR后)計算所有圖像切片的 平均。各小鼠的肺強化表示成Δ CNR，注射前CNR與注射后CNR之間的差(等式2)。
[0319] CNR=(SI 賺-SI 腦)/SDs^ (1)
[0320] Δ CNR = CNR后-CNR前(2)
[0321 ]用重復測量AN0VA，之后是SNK事后檢驗來檢驗組間差，P〈0.05被認為是顯著的。
[0322] 組織分析
[0323] 福爾馬林固定的樣品包埋在石蠟中，切成5μπι厚的切片并且按照標準過程用天狼 星紅和蘇木精和曙紅(Η&Ε)染色。使用ImageJ(rsbweb. nih.gov/ij/)來分析天狼星紅染色 的切片來對染成紅色的載玻片的百分比進行定量。同時由病理學家對載玻片進行分析并且 使用艾氏標準進行評分，并且也評價肺部損傷程度。
[0324]在PBS假對照動物中，在注射后30分鐘時肺中有最小的信號強化，但是對于用博來 霉素處理的小鼠，在博來霉素灌注后7或14天成像時都有相對基線圖像的顯著強化。這示于 圖10,其中冠狀解剖學圖像以灰度表示，化合物1的信號強化以偽彩色覆蓋。A CNR從PBS假 對照動物中的0.8±1.1增加至1周博來霉素動物中的2.5±1.5(?〈0.05)，并且進一步增加 至2周博來霉素組中的4.3±1.3(?〈0.001)(圖10)。
[0325] 離體組織分析確認與博來霉素灌注后7天相比，博來霉素14天后小鼠中的疾病進 展。平均艾氏評分，作為纖維化嚴重性的測量，在1周博來霉素動物中為4.1±0.9,在2周博 來霉素動物中為5.3±3.5,并且在PBS假對照動物中為0(圖11A)。天狼星紅染色陽性面積的 肺組織染色分數在假對照中為0.09 ±0.06 %，在1-周博來霉素中為0.17 ± 0.07 %，并且在2 周博來霉素組中為〇. 30 ± 0.04 % (圖11B)。損傷面積從0.3 ± 0.7 % (假對照），增加至4.6 土 1.3% (1-周博來霉素），并且在2周博來霉素動物中進一步增加至15.0± 12.3% (圖11C)。所 有三個病理測量確認從假對照至1周博來霉素灌注后動物的纖維化發展，并且在2周動物中 進一步發展。
[0326] 實施例14:博來霉素處理時間
[0327] 博來霉素模型已知產生明顯纖維化，其在博來霉素灌注后約2周達到峰值。在之后 的時間點上，小鼠開始恢復。經氣管灌注博來霉素(2.5u/kg)處理的C57B16小鼠在博來霉素 處理后2周和4周時成像。使用與之前的實施例相同的成像方案，發現ACNR在博來霉素后2 周時為2.3，但是這在博來霉素后4周時降低至0.9，Gd-Hyd強化降低61 %。
[0328] 其他實施方式落在本文權利要求書的范圍內。
【主權項】
1. 一種式(I)的化合物：或其藥學上可接受的鹽， 其中， X是-C(RaRb)-、-C(S)-、或-c(0)-，其中Ra和化各自獨立地是H、烷基、締基、烘基、環烷基、 雜芳基、或芳基； Y是-N(Rc)-或-0-，其中Rc是H、烷基、締基、烘基、或芳基； L 是-(CRdRe)n-、-NH(CRfRg)n-、或-(邸hRi)n-芳基-，其中各情況中，3<1、1?日、1?:、1?8、化、和私 各自獨立地是H、烷基、締基、或烘基，并且η是1、2、或3; Ζ是包含金屬離子和第一絡合基團的馨合基團，所述第一絡合基團與所述金屬離子形 成金屬絡合物;并且 虹和R2各自獨立地是Η或Ci-Cio烷基。2. 如權利要求1所述的化合物，其特征在于，所述第一絡合基團是D0TA、N0TA、D03AX、 D03AP、D0TP、D02A2P、N0TP、N02AP、N02PA、TETA、TE2P、TE2A、TE1A1P、CBTE2P、CBTE1A1P、 SBTE2A、SBTE1A1P、DTTP、CHX-A" -DTPA、De sf era 1、皿邸、PyD03P、I^yD02AP、巧 D03A、DIAMSAR、 抓TA、DTPA、CB-TE2A、SarAr、PCTA、pycup、D抓PA、OCTAPA、AAZTA、DOTAIa、CyPi c3A、TRAP、 NOPO、或 CDTA 部分。3. 如權利要求1-2中任一項所述的化合物，其特征在于，所述金屬離子選自Gd3+、Mn3\ 1112+、化3+、〔63\?'3+、炯 3+、化3\化2+、化3+、〇73\化 3+、化3+、時13\孔3+、和化3%或是選自下組的 放射性同位素的離子:67Ga、68Ga、A^"F、64Cu、111 In、52Mn、89Zr、86Υ、2叫 I、94?Tc、種9?Tc。4. 如權利要求1-3中任一項所述的化合物，其特征在于，X是-C(RaRb)-、-C(S)-、或-C (0)-，其中Ra和化各自獨立地是Η、Ci-Cio烷基、C2-C10締基、C2-C10烘基、或芳基。5. 如權利要求1-4中任一項所述的化合物，其特征在于，X是-C出-或-0-。6. 如權利要求1-5中任一項所述的化合物，其特征在于，Y是-N(Rc)-或-0-，其中Rc是H、 打-ClO烷基、C2-Cl0締基、C2-Cl0烘基、或芳基。7. 如權利要求1-6中任一項所述的化合物，其特征在于，Y是-NH-或-0-。8. 如權利要求1-7中任一項所述的化合物，其特征在于，L是-(C出)n-、-NH(C此)η-、或- (C出、-芳基-，其中η是1、2、或3。9. 如權利要求1-8中任一項所述的化合物，其特征在于，L是-C出C出-、-NHC出-、-CH- 化-、或-C出CH2C出-。10. 如權利要求1-9中任一項所述的化合物，其特征在于，Ra和化各自獨立地是Η或C出。11. 如權利要求1-10中任一項所述的化合物，其特征在于，所述化合物是或其藥學上可接受的鹽。12. 如權利要求1-10中任一項所述的化合物，其特征在于，Z還包括與所述金屬離子絡 合的水分子。13. 如權利要求12所述的化合物，其特征在于，所述化合物是或其藥學上可接受的鹽。14. 如權利要求1-13中任一項所述的化合物，其特征在于，Ri和R2各自是H。15. -種評價生物樣品的胞外基質中賴氨酷氧化酶活性的方法，包括 向所述胞外基質給予包含-NR-N此或-0-N出基團的成像劑，其中R是H、Ci-Ci偏基、C2-C10 締基、C2-C10烘基、或芳基;并且在給予所述成像劑之后獲取所述胞外基質的圖像。16. -種評價哺乳動物組織中賴氨酷氧化酶活性的方法，包括向所述哺乳動物給予包 含-NR-N出或-0-N出基團的成像劑，其中R是H、Ci-Cio烷基、C2-C10締基、C2-C10烘基、或芳基;并 且在給予所述成像劑之后獲取所述組織的圖像。17. -種評價哺乳動物中的腫瘤中賴氨酷氧化酶活性的方法，包括向所述哺乳動物給 予包含-NR-N出或-0-N出基團的成像劑，其中R是Η、Ci-Cio烷基、C2-C10締基、C2-C10烘基、或芳 基;并且在給予所述成像劑之后獲取所述腫瘤的圖像。18. -種對生物樣品的胞外基質進行成像的方法，包括： 向所述胞外基質給予包含-NR-N此或-0-N出基團的成像劑，其中R是H、Ci-Cio烷基、C2-C10 締基、C2-C1G烘基、或芳基;并且 在給予化合物之后獲取所述胞外基質的圖像。19. 一種對哺乳動物中的組織進行成像的方法，包括： 向哺乳動物給予包含-NR-N出或-0-N出基團的成像劑，其中R是H、Ci-Cio烷基、C2-C10締 基、C2-C10烘基、或芳基;并且 在給予化合物之后獲取所述哺乳動物的組織的圖像。20. -種對哺乳動物中的腫瘤進行成像的方法，包括： 向哺乳動物給予包含-NR-N出或-0-N出基團的成像劑，其中R是H、Ci-Cio烷基、C2-C10締 基、C2-C10烘基、或芳基;并且 在給予化合物之后獲取所述哺乳動物的腫瘤的圖像。21. -種評價哺乳動物的組織中纖維化水平的方法，包括向所述哺乳動物給予包含- NR-N出或-0-N出基團的成像劑，其中R是Η、Ci-Cio烷基、C2-C10締基、C2-C10烘基、或芳基;并且 在給予所述成像劑之后獲取所述哺乳動物的圖像。22. -種診斷哺乳動物中纖維化疾病的方法，包括向所述哺乳動物給予包含-NR-N出或- 0-N此基團的成像劑，其中R是H、Ci-Cio烷基、C2-C10締基、C2-C10烘基、或芳基;并且在給予所 述成像劑之后獲取所述哺乳動物的圖像。23. 如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述纖維化疾病選自：肺纖維化、慢性阻塞 性肺病、肺高血壓、屯、力衰竭、肥大型屯、肌病、屯、肌梗塞、屯、房纖顫、糖尿病腎病、系統性紅斑 狼瘡、多囊性腎病、腎小球腎炎、末期腎疾病、非酒精性脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎、丙型肝 炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、原發性硬化性膽管炎、炎性腸病、硬皮病、動脈粥樣硬化、 青光眼、糖尿病視網膜病、放射誘導纖維化、手術粘連、囊性纖維化、和癌癥。24. 如權利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述纖維化疾病是特發性肺纖維化。25. 如權利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述纖維化疾病是選自下組的癌癥： 乳腺癌、結腸癌、骨癌、肺癌、膀脫癌、腦癌、支氣管癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、室管 膜瘤、成視網膜細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸癌、神經膠質瘤、頭頸癌、屯、臟癌、肝癌、膜腺癌、 黑色素瘤、腎癌、喉癌、唇或口腔癌、間皮瘤、口腔癌、骨髓瘤、鼻咽癌、成神經細胞瘤、口咽 癌、卵巢癌、甲狀腺癌、陰莖癌、垂體癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、胃 癌、睪丸癌、咽喉癌、子宮癌、陰道癌、和外陰癌。26. 如權利要求15-25中任一項所述的方法，其特征在于，所述成像劑是權利要求14所 述的化合物。27. 如權利要求15-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述圖像是正電子發射斷層 掃描圖像。28. 如權利要求15-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述圖像是單光子發射計算 機斷層掃描圖像。29. 如權利要求15-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述圖像是磁共振圖像。30. 如權利要求15-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述圖像是計算機斷層掃描 圖像。31. 如權利要求15-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述圖像是平面閃爍掃描圖 像。32. 如權利要求15-31中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括用對照的信 號水平評價給予所述成像劑之后的信號水平。33. 如權利要求16、19或21所述的方法，其特征在于，所述組織選自：乳腺組織、結腸組 織、骨組織、肺組織、膀脫組織、腦組織、支氣管組織、宮頸組織、結直腸組織、子宮內膜組織、 室管膜組織、眼組織、膽囊組織、胃部組織、胃腸道組織、頸部組織、屯、臟組織、肝臟組織、膜 腺組織、腎臟組織、喉組織、唇或口腔組織、鼻咽組織、口咽組織、卵巢組織、甲狀腺組織、陰 莖組織、垂體組織、前列腺組織、直腸組織、腎臟組織、唾液腺組織、皮膚組織、胃組織、睪丸 組織、咽喉組織、子宮組織、陰道組織、和外陰組織。34. 如權利要求16、17、19-32中任一項所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。35. 如權利要求17和20中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在用對照的 信號水平評價給予所述成像劑之后的信號水平后確定腫瘤是否是癌性的。
【文檔編號】A61K49/10GK105939732SQ201480074752
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月3日
【發明人】P·卡拉文
【申請人】通用醫療公司