肺炎鏈球菌莢膜多糖及其綴合物的制作方法

肺炎鏈球菌莢膜多糖及其綴合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及活化的肺炎鏈球菌血清型10A、22F或33F多糖及其制備方法。本發明還涉及包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型10A、22F或33F多糖的免疫原性綴合物、其制備方法以及包含其的免疫原性組合物和疫苗。
【專利說明】肺炎鏈球菌芙膜多糖及其綴合物 發明領域
[0001 ] 本發明設及活化的肺炎鏈球菌（Sheptococcus pneumoniae)血清型10A、22F或 33F多糖及其制備方法。本發明還設及包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型10A、 22F或33F多糖的免疫原性綴合物、其制備方法W及包含其的免疫原性組合物和疫苗。
[000^ 背景
[0003] 肺炎鏈球菌為革蘭陽性、柳葉刀形球菌，其通常被成對地(雙球菌)看見，但也呈短 鏈或作為單個細胞存在。它們容易在血液瓊脂板上W閃光菌落生長，并且展示α溶血作用， 除非厭氧生長(其中它們顯示的容血作用）。大多數肺炎球菌血清型的細胞具有作為圍繞每 一個細胞的多糖包衣的芙膜。該芙膜是在人中的毒力的決定子，因為它通過阻止抗體附著 于細菌細胞來干擾吞隧作用。目前存在超過90種已鑒定的已知的肺炎球菌芙膜血清型，其 中23種最常見的血清型導致世界范圍內約90%的侵襲性疾病。作為疫苗，肺炎球菌多糖包 衣可在具有發達的或健全的免疫系統的個體中賦予合理程度的針對肺炎鏈球菌的免疫，但 綴合于合適的載體蛋白的芙膜多糖允許在還處于肺炎球菌感染的最高風險的嬰兒和老人 中產生免疫應答。
[0004] 由于在2000年引入第一種7-價肺炎球菌綴合物疫苗(PCV7或Prevnar)，來自屯種 血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的侵襲性疾病已幾乎消失。血清型1、3、5、6A、7F和19A 在Prevnar 13中的添加進一步減少了侵襲性肺炎球菌疾病的數量。
[0005] 目前市售的肺炎球菌疫苗均未在人中，尤其是不足2歲的兒童中提供針對血清型 10A、22F或33F肺炎鏈球菌的適當保護。因此，存在對可用于誘導針對血清型10A、22F或33F 肺炎鏈球菌的免疫應答的免疫原性組合物的需要。
[0006] 發明概述
[0007] 在一個方面，本公開內容提供了用于制備活化的肺炎鏈球菌血清型10AJ2F或33F 芙膜多糖的方法，所述方法包括W下步驟：
[000引（a)將分離的血清型10A、22F或33F芙膜多糖與氧化劑反應;和
[0009] (b)通過添加巧滅劑來巧滅氧化反應，從而導致活化的肺炎鏈球菌血清型10A、22F 或33F多糖。
[0010] 在其它方面，本發明設及通過或可通過本文中公開的活化方法獲得的活化的肺炎 鏈球菌血清型10A、22F或33F芙膜多糖。
[0011] 在其它方面，本公開內容提供了用于制備包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌 血清型10A、22F或33F多糖的免疫原性綴合物的方法，所述方法包括W下步驟：
[0012] (a)將通過或可通過本文中公開的方法獲得的活化的血清型10AJ2F或33F多糖與 載體蛋白混合;和，
[0013] (b)將混合的活化的血清型10AJ2F或33F多糖和載體蛋白與還原劑反應，W形成 血清型10A、22F或33F多糖:載體蛋白綴合物。
[0014] 在其它方面，本公開內容提供了通過或可通過本文中公開的方法獲得的血清型 10A、22F或33F多糖:載體蛋白綴合物。
[0015] 在其它方面，本公開內容提供了包含本文中公開的免疫原性綴合物的免疫原性組 合物和疫苗。
[0016] 在其它方面，本公開內容提供了治療或預防受試者的與血清型10A、22F或33F肺炎 鏈球菌相關的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，所述方法包括施用治療或預防有效量 的本文中公開的免疫原性組合物或疫苗的步驟。
[0017] 附圖簡述
[0018] 圖1顯示肺炎鏈球菌芙膜多糖血清型10A重復單元的結構。
[0019] 圖2顯示肺炎鏈球菌芙膜多糖血清型22F重復單元的結構。
[0020] 圖3顯示肺炎鏈球菌芙膜多糖血清型33F重復單元的結構。
[0021] 圖4顯示在23°C下在利用和不利用巧滅步驟的情況下作為氧化劑的量的函數的活 化的血清型22F多糖的分子量。
[0022] 圖5顯示在4 °C下在利用和不利用巧滅步驟的情況下作為氧化劑的量的函數的活 化的血清型22F多糖的分子量。
[0023] 圖6顯示在2至8°C下在利用或不利用巧滅步驟的情況下或在23°C下在不利用巧滅 步驟的情況下作為氧化劑的量的函數的活化的血清型33F多糖的分子量。
[0024] 發明詳述
[0025] 通過參考本發明的優選實施方案和本文包括的實施例的W下詳細描述可更容易 地理解本發明。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬 的領域中的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。雖然可W在本發明的實踐或測試中 使用與本文所述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但本文中描述了某些優選方 法和材料。在描述實施方案和主張本發明中，將按照下文所示的定義使用某些術語。
[0026] 如本文中所用，除非另有說明，否則單數形式"一個/種(a)"，"一個/種(an)"和"該 (the r包括復數所指物。因此，例如，對巧法"的引用包括本文所述的和/或在閱讀本公開 內容后對于本領域普通技術人員來說將變得明顯的類型的一個或多個方法和/或步驟。
[0027] 如本文中所用，術語多糖或載體蛋白-多糖綴合物的"分子量"是指通過與多角度 激光散射檢測器(M化S)組合的尺寸排阻層析(SEC)計算的分子量。
[0028] 如本文中所用，術語"氧化程度"（DO)是指當用氧化劑活化分離的多糖時產生的每 醒基的糖重復單元的數目。可使用本領域中技術人員已知的常規方法測定多糖的氧化程 度。
[0029] 應當指出的是，在本公開內容中，術語如"包含"、"包括"、"含有"、"具有"、"擁有" 等可W具有在美國專利法中賦予它們的含義;例如，它們可意指"包括"、"包含"、"含有"等。 運樣的術語是指特定成分或成分的組的包含，而不排除任何其它成分。術語諸如"基本上 由......組成"和"基本上由……構成"具有在美國專利法中賦予它們的含義，例如，它們允 許包含不減損本發明的新型或基本特征的另外的成分或步驟，即，它們排除減損本發明的 新型或基本特征的另外的未引述的成分或步驟。術語"由···...組成"和"由......構成"具 有在美國專利法中賦予它們的含義；即，運些術語是封閉式的。因此，運些術語是指特定成 分或成分的組的包含W及排除所有其它組分。
[0030] 如本文中所用，術語"綴合物"或"糖綴合物"是指共價綴合于載體蛋白的多糖。本 發明的糖綴合物和包含其的免疫原性組合物可含有一定量的游離多糖。
[0031 ]如本文所用，術語"血清型lOA糖綴合物"或"血清型lOA綴合物"是指共價綴合于載 體蛋白的分離的肺炎鏈球菌血清型10A芙膜多糖。
[0032] 如本文中所用，術語"血清型22F糖綴合物"或"血清型22F綴合物"是指共價綴合于 載體蛋白的分離的肺炎鏈球菌血清型22F芙膜多糖。
[0033] 如本文中所用，術語"血清型33F糖綴合物"或"血清型33F綴合物"是指共價綴合于 載體蛋白的分離的肺炎鏈球菌血清型33F芙膜多糖。
[0034] 如本文中所用，術語"血清型10A多糖"是指肺炎鏈球菌血清型10A芙膜多糖。
[0035] 如本文中所用，術語"血清型22F多糖"是指肺炎鏈球菌血清型22F芙膜多糖。
[0036] 如本文中所用，術語"血清型33F多糖"是指肺炎鏈球菌血清型33F芙膜多糖。
[0037] 如本文中所用，術語"游離多糖"意指未共價綴合于載體蛋白，但仍然存在于芙膜 多糖-載體蛋白綴合物組合物中的芙膜多糖。游離多糖可與多糖-載體蛋白綴合物非共價地 締合(即，非共價結合于、吸附于或捕捉于或與其非共價結合、吸附或捕捉）。
[0038] 在血清型10AJ2F或33F芙膜多糖-載體蛋白綴合物的最終純化后，測量游離多糖 的百分比。優選地在最終純化后4周內測定其。將其表達為樣品中的總多糖的百分比。
[0039] 如本文中所用，"綴合"、"被綴合"和"綴合的"是指籍W將肺炎鏈球菌芙膜多糖籍 共價連接于載體蛋白的方法。
[0040] 術語"受試者"是指哺乳動物，包括人，或指鳥、魚、爬行類動物、兩棲動物或任何其 它動物。術語"受試者"還包括家庭寵物或研究動物。家庭寵物和研究動物的非限制性實例 包括：狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、豚鼠、雪貂、猴、鳥、蛇、姍賜、魚、龜和蛙。術語 "受試者"還包括家畜動物。家畜動物的非限制性例子包括：羊駝、美洲野牛、駱駝、牛、鹿、 豬、馬、駝馬、聽、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、巧牛、雞、碟和火雞。
[0041] 在用于預防由生物肺炎鏈球菌(也稱為肺炎球菌）引起的侵襲性疾病的多價綴合 肺炎球菌疫苗的制備中，將選定的肺炎鏈球菌血清型生長W提供產生疫苗所需的多糖。將 細胞在發酵罐中生長，在發酵結束時通過添加脫氧膽酸鋼或替代裂解劑來誘導裂解。隨后 收獲裂解肉湯W用于下游純化和包圍細菌細胞的芙膜多糖的回收。在活化和與載體蛋白綴 合后，多糖被包含在最終的疫苗產品中，并且在疫苗的目標人群中賦予針對所選定的肺炎 鏈球菌血清型的免疫。
[0042] 多糖:載體蛋白綴合物的免疫原性取決于幾個因素，包括多糖的大小。多糖大小是 在每一個制備批次中測定的質量屬性，并且必須受到適當地控制。高分子量芙膜多糖因存 在于抗原表面上的表位的較高效價而能夠誘導一定的抗體免疫應答。通常優選在綴合物的 制備過程中防止或限制多糖大小的不期望的減小，W保留多糖的免疫原性。此外，重要的是 在活化步驟和隨后的綴合過程中減小多糖分子量的批次間的變化性，W維持綴合物的質量 屬性的一致性。
[0043] 還原胺化化學(RAC)已被本發明人證明為用于制備肺炎鏈球菌血清型10AJ2F或 33F芙膜多糖-蛋白載體綴合物的合適方法。RAC法牽設通過氧化活化多糖和隨后通過還原 綴合活化的多糖與蛋白質載體。血清型l〇A、33F和22F多糖已被證明是特別敏感的多糖并且 在綴合物的制備的氧化步驟過程中易受降解和大小減小。另外，迄今已知的活化方法的使 用產生了具有可變分子量的活化血清型10A、33F和22F多糖。
[0044] 因此，存在對用于制備具有受控和一致的分子量的活化的肺炎鏈球菌血清型10A、 22F或33F多糖的方法的重要需要。
[0045] 本發明的目的是用于制備活化的肺炎鏈球菌血清型10A、22F或33F多糖的方法。具 體地，本發明的目的是用于制備活化的肺炎鏈球菌血清型10A、22F或33F多糖的方法，所述 方法包括W下步驟：
[0046] (a)將分離的血清型10A、22F或33F多糖與氧化劑反應;和，
[0047] (b)通過添加巧滅劑來巧滅氧化反應，從而導致活化的肺炎鏈球菌血清型10A、22F 或33F多糖。
[004引 血清型10A、22F或33F多糖的分離和純化
[0049] 血清型10A、22F和33F多糖的結構公開于文獻中（參見例如Kamerling J P C.Pneumococcal polysaccharides:a chemical view. I η : Tomasz A, editor.Streptococcus pneumoniae.molecular biology and mechanisms of disease.New York,N.Y:Ma;ry Ann Liebert,Inc. ;2000.第81-114頁）中。
[0050] 如在圖1中所示，血清型22F的多糖重復單元由分枝多糖骨架（一個葡糖醒酸 (GlcpA)、一個化喃葡萄糖(Glcp)和一個巧喃半乳糖(Galf)W及兩個化喃鼠李糖(化ap))組 成，其中aGlcp分支連于β化ap 45的〔3徑基。多糖重復單元中的β化ap殘基的約80%的〔2美圣 基是0-乙酷化的。
[0051] 如在圖2中所示，血清型10A的多糖重復單元由兩個D-巧喃半乳糖、Ξ個D-化喃半 乳糖、一個N-乙酷半乳糖胺W及通過一個D-核糖醇與糖鏈連接的憐酸鍵組成。
[0052] 如在圖3中所示，血清型33F的多糖重復單元由Ξ個D-化喃半乳糖、二個D-巧喃半 乳糖和一個D-化喃葡萄糖組成。值得注意的是，在約90%的33F多糖重復單元中5-D-巧喃半 乳糖殘基是0-乙酷化的。
[0053] 可使用本領域普通技術人員已知的分離方法（參見例如美國專利申請公開號 20060228380、20060228381、20070184071、20070184072、20070231340和20080102498或 W02008118752中公開的方法)直接從細菌獲得血清型10A、22F和33F芙膜多糖。另外，可使用 合成方案產生它們。
[0054] 用于產生用于本發明的免疫原性綴合物的各自多糖的血清型10A、22F和33F肺炎 鏈球菌菌株可從已建立的培養物保藏或臨床樣品獲得。
[0055] 純化的血清型10A、22F和33F多糖通過本領域技術人員公知的方法獲得。優選將細 菌細胞在基于大豆的培養基中生長。在產生肺炎鏈球菌血清型l〇A、22F或33F芙膜多糖的細 菌細胞的發酵后，裂解所述細菌細胞W產生細胞裂解物。使用任何裂解劑裂解細菌細胞。 "裂解劑"是有助于細胞壁破裂和釋放引起細胞裂解的自溶素的任何試劑，包括例如，去垢 劑。如本文中所用，"去垢劑"是指能夠誘導細菌細胞的裂解的任何陰離子或陽離子去垢劑。 用于在本發明的方法內使用的運樣的去垢劑的代表性的實例包括脫氧膽酸鋼(D0CKN-月 桂酷肌氨酸、碟脫氧膽酸鋼和皂巧。
[0056] 在本發明的一個實施方案中，用于裂解細菌細胞的裂解劑是DOCdDOC是膽汁酸脫 氧膽酸的鋼鹽，其通常來源于生物來源諸如母牛或牛。D0C活化LytA蛋白，所述LytA蛋白為 參與肺炎鏈球菌的細胞壁生長和分裂的自溶素。LytA蛋白在其C末端部分具有膽堿結合結 構域，并且已知lytA基因的突變產生抵抗使用D0C的裂解的LytA突變體。
[0057] 在本發明的一個實施方案中，用于裂解細菌細胞的裂解劑是非動物來源的裂解 劑。用于在本發明的方法內使用的非動物來源的裂解劑包括來自非動物來源的具有與DOC 的作用模式（即，影響LytA功能并導致肺炎鏈球菌細胞的裂解)類似的作用模式的試劑。運 樣的非動物來源的裂解劑包括，但不限于，D0C的類似物、表面活性劑、去垢劑和膽堿的結構 類似物。在一個實施方案中，非動物來源的裂解劑選自癸燒橫酸、叔-辛基苯氧基聚（氧乙 締）乙醇（例如Igep過l@CA-630，CAS#: 9002-93-1，可獲自 Si卵a A1化ich，St 丄ouis，M0)、 辛基酪環氧乙燒縮合物（例如Τη化η液X-100，，可獲自Sigma A1化ich，St丄ouis，M0)、N- 月桂酷肌氨酸鋼、月桂亞氨基二丙酸鹽、十二烷基硫酸鋼、碟脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘 氨脫氧膽酸鹽、牛橫脫氧膽酸鹽、牛橫碟脫氧膽酸鹽和膽酸鹽。在另一個實施方案中，所述 非動物來源的裂解劑為N-月桂酷肌氨酸。在另一個實施方案中，所述裂解劑為N-月桂酷肌 氨酸鋼。
[005引隨后可使用本領域中已知的純化技術從細胞裂解物純化芙膜多糖，所述技術包括 離屯、、深度過濾、沉淀、超濾、利用活性碳的處理、滲濾和/或柱層析的使用(參見例如美國專 利申請公開號 20060228380、20060228381、20070184071、20070184072、20070231340 和 20080102498或W02008118752)。隨后可將純化的血清型10A、22F或33F多糖用于免疫原性綴 合物的制備。
[0059] 優選地，為了產生具有有利的過濾性特征和/或產率的血清型22F綴合物或血清型 33F綴合物，在綴合于載體蛋白之前進行多糖至較低分子量(MW)范圍的裁剪。有利地，減小 純化的血清型22F多糖或血清型33F多糖的大小，同時保留多糖結構的關鍵特征，諸如例如 0-乙酷基的存在。優選地，純化的血清型22F多糖或血清型33F多糖的大小通過機械均化來 減小。
[0060] 在優選實施方案中，通過高壓均化來減小純化的多糖的大小。高壓均化通過將加 工流累送通過具有足夠小的尺寸的流路來實現高剪切率。剪切率通過使用較大的施加的均 化壓力來增加，并且可通過使進料流再循環通過均化器來增加暴露時間。
[0061] 高壓均化方法特別適合用于減小純化的血清型22F多糖或血清型33F多糖的大小， 同時保留多糖的結構特征，諸如0-乙酷基的存在。
[0062] 可通過不同的參數(包括例如分子量、每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數）來表 征通過從肺炎鏈球菌裂解物純化血清型22F芙膜多糖和任選地裁剪純化的多糖獲得的分離 的血清型22F多糖。
[0063] 在優選實施方案中，經裁剪的血清型22F多糖具有400W)a與700W)a之間的分子量。
[0064] 可通過不同的參數(包括例如分子量和每ml血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數)來表 征通過從肺炎鏈球菌裂解物純化血清型33F芙膜多糖和任選地裁剪純化的多糖獲得的分離 的血清型33F多糖。
[0(?日]可通過本領域已知的任何方法，例如，通過質子醒RlXemercinier和化nes( 1996) Carbohydrate Research 296;83-96,Jones和Lemercinier(2002)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247，W0 05/033148或WOOO/56357)測定多糖的0-乙酷化 的程度。另一種常用的方法描述于Hestrin(1949)J.Biol. Chem. 180:249-261中。優選地，0- 乙酷基的存在通過離子HPLC分析來測定。
[0066] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法獲得分離的血清型22F多糖：
[0067] -制備血清型22F肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物；
[0068] -裂解所述發酵培養物中的細菌細胞;和，
[0069] -從發酵培養物純化血清型22F多糖。
[0070] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法獲得分離的血清型22F多糖：
[0071] -制備血清型22F肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物；
[0072] -裂解所述發酵培養物中的細菌細胞；
[0073] -從發酵培養物純化血清型22F多糖;和，
[0074] -通過機械裁剪，優選通過高壓均化來裁剪血清型22F多糖。
[0075] 在優選實施方案中，分離的血清型22F多糖通過包含W下步驟的方法獲得：
[0076] -制備血清型22F肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物；
[0077] -裂解所述發酵培養物中的細菌細胞；
[0078] -從發酵培養物純化血清型22F多糖;和
[0079] -通過機械裁剪，優選通過高壓均化來裁剪血清型22F多糖，
[0080] 其中所述分離的血清型22F多糖具有400W)a與700W)a之間的分子量。
[0081] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法獲得分離的血清型33F多糖：
[0082] -制備血清型33F肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物；
[0083] -裂解所述發酵培養物中的細菌細胞;和，
[0084] -從發酵培養物純化血清型33F多糖。
[0085] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法獲得分離的血清型33F多糖：
[0086] -制備血清型33F肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物；
[0087] -裂解所述發酵培養物中的細菌細胞；
[0088] -從發酵培養物純化血清型33F多糖;和，
[0089] -通過機械裁剪，優選通過高壓均化來裁剪血清型33F多糖。
[0090] 可通過不同的參數(包括例如分子量)來表征通過從肺炎鏈球菌裂解物純化血清 型10A芙膜多糖和任選地裁剪純化的多糖獲得的分離的血清型10A多糖。優選地，不裁剪分 離的血清型10A多糖。
[0091] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法獲得分離的血清型10A多糖：
[0092] -制備血清型10A肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物；
[0093] -裂解所述發酵培養物中的細菌細胞;和，
[0094] -從發酵培養物純化血清型10A多糖。
[00巧]血清型10A、22F或33F多糖的活化
[0096] 通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型10A、22F或33F多糖：
[0097] (a)將分離的血清型10A、22F或33F多糖與氧化劑反應;和，
[0098] (b)通過添加巧滅劑來巧滅氧化反應，從而導致活化的肺炎鏈球菌血清型10A、22F 或33F多糖。
[0099] 在優選實施方案中，步驟(a)中的血清型10A、22F或33F多糖的濃度在O.lmg/mL與 lOmg/mL之間。在優選實施方案中，步驟(a)中的血清型10A、22F或33F多糖的濃度在0.5mg/ mL與5mg/mL之間。在優選實施方案中，步驟(a)中的血清型10A、22F或33F多糖的濃度在Img/ mL與3mg/mL之間。在優選實施方案中，步驟(a)中的血清型22F或33F多糖的濃度為約2mg/ mL。在優選實施方案中，步驟(a)中的血清型10A多糖的濃度為約2.5mg/mL。
[0100] 在優選實施方案中，所述氧化劑為高艦酸鹽。所述高艦酸鹽氧化鄰位徑基W形成 幾基或醒基，并引起C-C鍵的斷裂。
[0101] 術語"高艦酸鹽"包括高艦酸鹽和高艦酸。該術語還包括偏高艦酸鹽（I化?和正高 艦酸鹽(Ι065?。術語"高艦酸鹽"還包括高艦酸鹽的各種鹽，包括高艦酸鋼和高艦酸鐘。在優 選實施方案中，氧化劑為高艦酸鋼。在優選實施方案中，用于血清型l〇A、22F或33F多糖的氧 化的高艦酸鹽為偏高艦酸鹽。在優選實施方案中，用于血清型10A、22F或33F多糖的氧化的 高艦酸鹽為偏高艦酸鋼。
[0102] 在優選實施方案中，將多糖與0.01至10摩爾當量、0.05至5摩爾當量、0.1至1摩爾 當量、0.5至1摩爾當量、0.7至0.8摩爾當量、0.01至0.2摩爾當量、0.05至0.5摩爾當量、0.05 至0.2摩爾當量、0.1至0.3摩爾當量的氧化劑反應。在優選實施方案中，將多糖與約0.05摩 爾當量、0.1摩爾當量、0.15摩爾當量、0.2摩爾當量、0.25摩爾當量、0.3摩爾當量、0.35摩爾 當量、0.4摩爾當量、0.45摩爾當量、0.5摩爾當量、0.55摩爾當量、0.6摩爾當量、0.65摩爾當 量、0.7摩爾當量、0.75摩爾當量、0.8摩爾當量的氧化劑反應。在優選實施方案中，將多糖與 約0.10摩爾當量的氧化劑反應。在優選實施方案中，將多糖與約0.15摩爾當量的氧化劑反 應。在優選實施方案中，將多糖與約0.25摩爾當量的氧化劑反應。在優選實施方案中，將多 糖與約0.5摩爾當量的氧化劑反應。在優選實施方案中，將多糖與約0.8摩爾當量的氧化劑 反應。
[0103] 在優選實施方案中，步驟(a)中的反應持續時間在1與50小時之間、1與40小時之 間、1與30小時之間、1與25小時之間、1與20小時之間、1與10小時之間、10至50小時、10至40 小時、10至30小時、10至20小時。在優選實施方案中，當多糖為血清型10A多糖時，步驟(a)中 的反應持續時間在1與10小時之間。在優選實施方案中，當多糖為血清型10A多糖時，步驟 (a)中的反應持續時間為約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、 10小時。在優選實施方案中，當多糖為血清型10A多糖時，步驟(a)中的反應持續時間為約4 小時。在優選實施方案中，當多糖為血清型22F多糖時，步驟(a)中的反應持續時間在10小時 與20小時之間。在優選實施方案中，當多糖為血清型22F多糖時，步驟(a)中的反應持續時間 為約10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20 小時。在優選實施方案中，當多糖為血清型33F多糖時，步驟(a)中的反應持續時間在15小時 與25小時之間。在優選實施方案中，當多糖為血清型33F多糖時，步驟(a)中的反應持續時間 為約15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、24小時或25 小時。在優選實施方案中，當多糖為血清型33F多糖時，步驟(a)中的反應持續時間為約20小 時。
[0104] 在優選實施方案中，將步驟(a)的反應溫度維持在rC與30°C之間、rC與10°C之 間、10°C與20°C之間、20°C與30°C之間、2°C與8°C之間。在優選實施方案中，將步驟(a)的反 應溫度維持在約5 °C。
[0105] 在優選實施方案中，在選自憐酸鋼、憐酸鐘、2-(N-嗎嘟代）乙橫酸(MES)或Bis- Tris的緩沖液中進行步驟(a)。在優選實施方案中，在憐酸鐘緩沖液中進行步驟(a)。在優選 實施方案中，在憐酸鋼緩沖液中進行步驟(a)。
[0106] 在優選實施方案中，所述緩沖液具有在ImM與500mM之間、ImM與300mM之間、50mM與 200mM之間的濃度。在優選實施方案中，所述緩沖液具有約1 OOmM的濃度。
[0107] 在優選實施方案中，步驟(a)中的pH在4與8之間、5與7之間、5.5與6.5之間。在優選 實施方案中，步驟(a)中的pH為約6。在優選實施方案中，步驟(a)中的pH為約5.8。
[0108] 在一個實施方案中，巧滅劑選自鄰二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷脫甘膚、亞硫酸 鹽、硫酸氨鹽、連二亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞憐酸鹽、次憐酸鹽或亞憐酸。
[0109] 在一個實施方案中，巧滅劑為下式的1,2-氨基醇
[0110]
[01川其中Ri選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
[0112] 在一個實施方案中，巧滅劑選自亞硫酸、硫酸氨、連二亞硫酸、焦亞硫酸、硫代硫 酸、亞憐酸、次憐酸或亞憐酸的鋼鹽和鐘鹽。
[0113] 在一個實施方案中，巧滅劑為氨基酸。在一個實施方案中，所述氨基酸選自絲氨 酸、蘇氨酸、半脫氨酸、脫氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、徑脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和組氨酸。
[0114] 在一個實施方案中，巧滅劑為亞硫酸鹽諸如硫酸氨鹽、連二亞硫酸鹽、焦亞硫酸 鹽、硫代硫酸鹽。
[0115] 在一個實施方案中，巧滅劑為包含兩個鄰位徑基（即共價連接于兩個相鄰碳原子 的兩個徑基)的化合物(鄰二醇）。
[0116] 優選地，巧滅劑為式(II)的化合物
[0117]
[011引其中R哺R2各自獨立地選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
[0119] 在優選實施方案中，巧滅劑是甘油、乙二醇、丙-1，2-二醇、下-1，2-二醇或下-2，3- 二醇、抗壞血酸。在優選實施方案中，巧滅劑為下-2，3-二醇。
[0120] 在優選實施方案中，通過添加0.1至10摩爾當量、0.5至5摩爾當量、0.5至3摩爾當 量、0.5至2摩爾當量的巧滅劑來中和氧化劑。在優選實施方案中，通過添加約0.5摩爾當量、 1摩爾當量、1.5摩爾當量、2摩爾當量、2.5摩爾當量、3摩爾當量的巧滅劑來中和氧化劑。在 優選實施方案中，通過添加約2摩爾當量的巧滅劑來中和氧化劑。
[0121] 在優選實施方案中，步驟(b)的持續時間在0.1小時與10小時之間、0.5小時與5小 時之間或0.5小時與2小時之間。在優選實施方案中，步驟(b)的持續時間為約0.5小時、1小 時、1.5小時、2.5小時或3小時。
[0122] 在優選實施方案中，將步驟(b)中的反應溫度維持在rC與30°C之間、rC與25°C之 間、rC與20°C之間、rC與10°C之間、10°C與20°C之間、2 °C與8 °C之間。在優選實施方案中， 將步驟(b)中的反應溫度維持在約rC、2 °C、3 °C、4 °C、5 °C、6 °C、7 °C或8 °C。
[0123] 在優選實施方案中，步驟(b)中的pH在4與8之間、5與7之間、5.5與6.5之間。在優選 實施方案中，步驟(a)中的抑為約6。
[0124] 在優選實施方案中，純化活化的血清型10AJ2F或33F多糖。可按照本領域技術人 員已知的方法諸如凝膠滲透層析法(GPC)、透析或超濾/滲濾純化活化的血清型10A、22F或 33F多糖。例如，通過使用超濾裝置進行濃縮和滲濾來純化活化的多糖。
[0125] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型10A多糖：
[0126] (a)將分離的血清型10A多糖與高艦酸鹽反應;和，
[0127] (b)通過添加下-2,3-二醇來巧滅氧化反應，從而導致活化的血清型10A多糖。
[0128] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型10A多糖：
[0129] (a)在2°C與8°C之間的溫度下將分離的血清型10A多糖與高艦酸鹽反應;和，
[0130] (b)通過在2°C與8°C之間的溫度下添加下-2,3-二醇來巧滅氧化反應，從而導致活 化的血清型10A多糖。
[0131] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型10A多糖：
[0132] (a)在2°C與8°C之間的溫度下將分離的血清型10A多糖與0.2至0.3摩爾當量的高 艦酸鹽反應;和，
[0133] (b)通過在2°C與8°C之間的溫度下添加0.5至2摩爾當量的下-2,3-二醇來巧滅氧 化反應，從而導致活化的血清型10A多糖。
[0134] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型22F多糖：
[0135] (a)將分離的血清型22F多糖與高艦酸鹽反應;和，
[0136] (b)通過添加下-2,3-二醇來巧滅氧化反應，從而導致活化的血清型22F多糖。
[0137] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型22F多糖：
[0138] (a)在2°C與8°C之間的溫度下將分離的血清型22F多糖與高艦酸鹽反應;和，
[0139] (b)通過在2°C與8°C之間的溫度下添加下-2,3-二醇來巧滅氧化反應，從而導致活 化的血清型22F多糖。
[0140] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型22F多糖：
[0141] (a)在2°C與8°C之間的溫度下將分離的血清型22F多糖與0.05至0.2摩爾當量的高 艦酸鹽反應;和，
[0142] (b)通過在2°C與8°C之間的溫度下添加2至3摩爾當量，優選2摩爾當量的下-2,3- 二醇來巧滅氧化反應，從而導致活化的血清型22F多糖。
[0143] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型33F多糖：
[0144] (a)將分離的血清型33F多糖與高艦酸鹽反應;和，
[0145] (b)通過添加下-2,3-二醇來巧滅氧化反應，從而導致活化的血清型33F多糖。
[0146] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型33F多糖：
[0147] (a)在2°C與8°C之間的溫度下將分離的血清型33F多糖與高艦酸鹽反應;和，
[0148] (b)通過在2°C與8°C之間的溫度下添加下-2,3-二醇來巧滅氧化反應，從而導致活 化的血清型33F多糖。
[0149] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法來活化分離的血清型33F多糖：
[0150] (a)在2°C與8°C之間的溫度下將分離的血清型33F多糖與0.05至0.2摩爾當量的高 艦酸鹽反應;和，
[0151] (b)通過在2°C與8°C之間的溫度下添加0.5至1.5摩爾當量的下-2,3-二醇來巧滅 氧化反應，從而導致活化的血清型33F多糖。
[0152] 在優選實施方案中，本發明設及通過或可通過上文中公開的方法獲得的活化的血 清型10A芙膜多糖。
[0153] 在優選實施方案中，本發明設及通過或可通過上文中公開的方法獲得的活化的血 清型22F芙膜多糖。
[0154] 在優選實施方案中，本發明設及通過或可通過上文中公開的方法獲得的活化的血 清型33F芙膜多糖。
[0155] 在優選實施方案中，獲自步驟(b)的活化的血清型10A多糖具有步驟(a)中使用的 分離的多糖的分子量的20%與100%之間、30%與95%之間、40%與95%之間、60%至95%、 85 %至95 %或約90 %的分子量。
[0156] 在優選實施方案中，獲自步驟(b)的活化的血清型10A多糖具有步驟(a)中使用的 分離的多糖的分子量的至少20%、25%、30%、35%、40%或45%的分子量。在優選實施方案 中，獲自步驟(b)的活化的血清型10A多糖具有步驟(a)中使用的分離的多糖的分子量的至 少50%'51%'52%'53%'54%'55%'56%'57%'58%'59%'60%'61%'62%'63%'64%、 65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 的分子量。
[0157] 在優選實施方案中，獲自步驟(b)的活化的血清型22F多糖具有步驟(a)中使用的 分離的多糖的分子量的50%與100%之間、60%至95%、85%至95%或約90%的分子量。
[0158] 在優選實施方案中，獲自步驟(b)的活化的血清型22F多糖具有步驟(a)中使用的 分離的多糖的分子量的至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的分子量。
[0159] 在優選實施方案中，獲自步驟(b)的活化的血清型33F多糖具有步驟(a)中使用的 分離的多糖的分子量的50%與100%之間、60%至95%、85%至95%或約90%的分子量。
[0160] 在優選實施方案中，獲自步驟(b)的活化的血清型33F多糖具有步驟(a)中使用的 分離的多糖的分子量的至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的分子量。
[0161] 在優選實施方案中，活化的血清型10A、22F或33F多糖的氧化程度在2與30之間、2 與25之間、2與20之間、2與15之間、2與10之間、2與5之間、5與30之間、5與25之間、5與20之 間、5與15之間、5與10之間、10與30之間、10與25之間、10與20之間、10與15之間、5與25之間、 10與30之間、15與30之間、15與25之間、15與20之間、20至30、20至25。在優選實施方案中，活 化的血清型10A、22F或33F多糖的氧化程度在2與10之間、4與8之間、4與6之間、6與8之間、6 與12之間、8與14之間、9與11之間、10與16之間、12與16之間、14與18之間、16與20之間、16與 18之間、18與22之間、18與20之間。
[0162] 在優選實施方案中，活化的血清型10A多糖具有在50kDa與4001d)a之間、50kDa與 350kDa之間、50kDa與300kDa之間、50kDa與250kDa之間、50kDa與200kDa之間、lOOkDa與 300W)a之間、lOOkDa與250kDa之間或lOOkDa與200W)a之間的分子量。在優選實施方案中，活 化的血清型10A多糖具有50kDa與300W)a之間的分子量。在優選實施方案中，活化的血清型 lOA多糖具有l〇〇ld)a與200W)a之間的分子量。在優選實施方案中，活化的血清型lOA多糖具 有100W)a與200W)a之間的分子量W及5與20之間、5與15之間、8與14之間、8與12之間或9與 11之間的氧化程度。在優選實施方案中，活化的血清型10A多糖具有lOOkDa與200W)a之間的 分子量W及9與11之間的氧化程度。
[0163] 在優選實施方案中，活化的血清型22F多糖具有25kDa與lOOOkDa之間、lOOkDa與 lOOOkDa 之間、300kDa 與 SOOkDa 之間、300kDa 與 700kDa 之間、300kDa 與 600kDa 之間、400kDa 與 lOOOkDa之間、400kDa與SOOkDa之間、400kDa與700之間或400kDa與600kDa之間的分子量。在 優選實施方案中，活化的血清型22F多糖具有300kDa與SOOkDa之間的分子量。在優選實施方 案中，活化的血清型22F多糖具有400W)a與8001d)a之間的分子量。在優選實施方案中，活化 的血清型22F多糖具有4001d)a與600kDa之間的分子量。在優選實施方案中，活化的血清型 22F多糖具有400kDa與800W)a之間的分子量W及10與25之間、10與20之間、12與20之間或14 與18之間的氧化程度。在優選實施方案中，活化的血清型22F多糖具有400kDa與SOOkDa之間 的分子量W及10與20之間的氧化程度。
[0164] 在優選實施方案中，活化的血清型22F多糖包含每mM血清型22F多糖至少O.lmM、 0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM或0.7mM或約0.8mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，活化的 血清型22F多糖包含每mM血清型22F多糖至少0.5、0.6或0.7mM的醋酸鹽。在優選實施方案 中，活化的血清型22F多糖包含每mM血清型22F多糖至少0.6mM的醋酸鹽。在優選實施方案 中，活化的血清型22F多糖包含每mM血清型22F多糖至少0.7mM的醋酸鹽。
[0165] 在優選實施方案中，活化的血清型22F多糖具有400W)a與800W)a之間的分子量并 且包含每mM血清型22F多糖至少0.6mM的醋酸鹽。
[0166] 在優選實施方案中，活化的血清型22F多糖具有在400kDa與800W)a之間的分子量、 12與20之間的氧化程度，并且包含每mM血清型22F多糖至少0.6mM的醋酸鹽。
[0167] 在優選實施方案中，活化的血清型33F多糖具有50kDa與1250kDa之間、200kDa與 1200kDa 之間、SOOkDa 與 1200kDa 之間、SOOkDa 與 lOOOkDa 之間、700kDa 與 1200kDa 之間、 SOOkDa與 1200kDa之間、SOOkDa與 11 OOkDa之間、900kDa與 1200kDa之間、SOOkDa與 lOOOkDa之 間的分子量。在優選實施方案中，活化的血清型33F多糖具有500W)a與lOOOkDa之間的分子 量。在另一個優選實施方案中，活化的血清型33F多糖具有50kDa與600kDa之間、50kDa與 SOOkDa之間或50kDa與400kDa之間的分子量。
[0168] 在優選實施方案中，活化的血清型33F多糖包含每mM血清型33F多糖至少O.lmM、 0.21111、0.3111]\1、0.4111]\1、0.51111、0.61111、0.71111或0.8或約0.9111]\1的醋酸鹽。在優選實施方案中，活 化的血清型33F包含每ml血清型33F多糖至少0.6mM、0.7mM或0.8mM的醋酸鹽。在優選實施方 案中，活化的血清型33F多糖包含每ml血清型33F多糖至少0.6mM的醋酸鹽。在優選實施方案 中，活化的血清型33F多糖包含每mM血清型33F多糖至少0.7mM的醋酸鹽。
[0169] 在優選實施方案中，活化的血清型33F多糖具有800W)a與1200kDa之間的分子量并 且包含每ml血清型33F多糖至少0.7mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，活化的血清型33F多糖 具有800W)a與1200kDa之間的分子量，包含每mM血清型33F多糖至少0.7mM的醋酸鹽并且具 有10與20之間的氧化程度。
[0170] 在優選實施方案中，活化的血清型33F多糖具有50kDa與200W)a之間的分子量并且 包含每mM血清型33F多糖至少0.7mM的醋酸鹽。
[0171] 在優選實施方案中，活化的血清型33F多糖具有50kDa與200W)a之間的分子量，包 含每mM血清型33F多糖至少0.7mM的醋酸鹽，并且具有10與20之間的氧化程度。
[0172] 在實施方案中，任選地在冷凍保護劑/凍干保護劑存在的情況下冷凍干燥活化的 血清型10A、22F或33F多糖。在優選實施方案中，冷凍保護劑/凍干保護劑選自薦糖、海藻糖、 棉子糖、水蘇糖、松Ξ糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和帕拉金糖醇。在優選實施方案中，所述冷 凍保護劑/凍干保護劑為薦糖。隨后可將凍干的活化的多糖與包含載體蛋白的溶液混合。
[0173] 在另一個實施方案中，將活化的血清型10A、22F或33F多糖與載體蛋白混合，并且 任選地在冷凍保護劑/凍干保護劑存在的情況下將其冷凍干燥。在優選實施方案中，所述冷 凍保護劑/凍干保護劑選自薦糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松Ξ糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇 和帕拉金糖醇。在優選實施方案中，所述冷凍保護劑/凍干保護劑為薦糖。可隨后將共凍干 的多糖和載體蛋白重懸浮于溶液中并與還原劑反應。
[0174] 在實施方案中，本發明設及凍干的活化的血清型10A多糖。在實施方案中，本發明 設及凍干的活化的血清型22F多糖。在實施方案中，本發明設及凍干的活化的血清型33F多 糖。
[0175] 在實施方案中，本發明設及共凍干的活化的血清型10A多糖和蛋白載體。在優選實 施方案中，所述蛋白載體為CM197。在實施方案中，本發明設及共凍干的活化的血清型22F多 糖和蛋白載體。在優選實施方案中，所述蛋白載體為CRM197。在實施方案中，本發明設及共凍 干的活化的血清型33F多糖和蛋白載體。在優選實施方案中，所述蛋白載體為CRM197。
[017W 利用載體蛋白綴合活化的血清型l0A、22F或33F多糖
[0177]可通過包括W下步驟的方法將本文中公開的活化的血清型10AJ2F或33F多糖綴 合于載體蛋白：
[017引（a)將活化的血清型10A、22F或33F多糖與載體蛋白混合;和，
[0179] (b)將混合的活化的血清型10A、22F或33F多糖和載體蛋白與還原劑反應W形成血 清型10A、22F或33F多糖:載體蛋白綴合物。
[0180] 相較于在水相中的還原胺化(其中多糖的0-乙酷化水平被顯著降低），通過在二甲 基亞諷(DMS0)中進行還原胺化的活化的血清型22F或33F多糖與蛋白質載體的綴合適于保 留多糖的0-乙酷基含量。在優選實施方案中，在DMS0中進行步驟(a)和步驟化）。
[0181] 在優選實施方案中，步驟(a)包括將凍干的血清型10A、22F或33F多糖溶解在包含 載體蛋白的水溶液中或包含載體蛋白和DMS0的溶液中。在優選實施方案中，步驟(a)包括將 共凍干的血清型10A、22F或33F多糖和載體蛋白溶解在水溶液中或DMS0中。
[0182] 當在水溶液中進行步驟(a)和(b)時，所述溶液包含緩沖液，緩沖液優選選自PBS、 MES、肥陽 5、813-付13、404、？1陽5.]\?^50、肥5、]\?^5、01?50、]\1085、肥？？50、？0?50、了64、6口口5、 Bicine或肥PB，pH在6.0與8.5之間、7與8之間或7與7.5之間。在優選實施方案中，所述緩沖 液為PBS。在優選實施方案中，pH為約7.3。
[0183] 在優選實施方案中，步驟（a)中的活化的血清型10A、22F或33F多糖的濃度在 0.1 mg/mL與lOmg/mL之間、0.5mg/mL與5mg/mL之間、0.5mg/mL與2mg/mL之間。在優選實施方 案中，步驟（a)中的活化的血清型10A、22F或33F多糖的濃度為約0.1mg/mL、0.2mg/mL、 0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、lmg/mL、1.Img/ mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、 2mg/mL、2.Img/mL、2.2mg/mL、2.3mg/mL、2.4mg/mL、2.5mg/mL、2.6mg/mL、2.7mg/mL、2.8mg/ mL、2.9mg/mL或 3mg/mL。
[0184] 在優選實施方案中，活化的血清型10A、22F或33F多糖對載體蛋白的初始比率(重 量/重量)在5:1與0.1:1之間、2:1與0.1:1之間、2:1與1:1之間、1.5:1與1:1之間、0.1:1與1: 1之間、0.3:1與1:1之間、0.6:1與1:1.2之間。在優選實施方案中，活化的血清型10A、22F或 33F多糖對載體蛋白的初始比率為約0.6:1和1:1.2。在優選實施方案中，活化的血清型10A、 22F 或 33F 多糖對載體蛋白的初始比率為約 0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、 1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1。
[0185] 在優選實施方案中，在步驟(b)中，將活化的血清型10A、22F或33F多糖與0.1摩爾 當量與10摩爾當量之間、0.5摩爾當量與5摩爾當量之間、0.5摩爾當量與2.5摩爾當量之間 的還原劑反應。在優選實施方案中，在步驟(b)中，將活化的血清型10A、22F或33F與約0.5摩 爾當量、0.6摩爾當量、0.7摩爾當量、0.8摩爾當量、0.9摩爾當量、1摩爾當量、1.1摩爾當量、 1.2摩爾當量、1.3摩爾當量、1.4摩爾當量、1.5摩爾當量、1.6摩爾當量、1.7摩爾當量、1.8摩 爾當量、1.9摩爾當量、2摩爾當量、2.1摩爾當量、2.2摩爾當量、2.3摩爾當量、2.4或2.5摩爾 當量的還原劑反應。
[0186] 在實施方案中，所述還原劑為氯基棚氨化鋼、Ξ乙酷氧基棚氨化鋼、棚氨化鋼或鋒 (在布朗斯臺德酸或路易斯酸存在的情況下）、胺棚燒諸如化晚棚燒、2-甲基化晚棚燒、2,6- 二棚燒-甲醇、二甲胺-棚燒、t-BuMeiprN-B曲、節胺-B曲或5-乙基-2-甲基化晚棚燒（陽MB)。 在優選實施方案中，所述還原劑是氯基棚氨化鋼。
[0187] 在優選實施方案中，步驟(b)的持續時間在1小時與50小時、5小時與30小時、10小 時與3 0小時、15小時與3 0小時、20小時與3 0小時、5小時與2 5小時、10小時與2 5小時、15小時 與25小時之間。在優選實施方案中，步驟(b)的持續時間為約20小時、21小時、22小時、23小 時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時。
[018引在優選實施方案中，將步驟(b)中的反應溫度維持在10°C與40°C之間、15 °C與30°C 之間、20°C與26°C之間、2rC與25°C之間。在優選實施方案中，將步驟(b)中的反應溫度維持 在約 2 rC、22 °C、23 °C、24 °C 或 25 °C。
[0189] 在優選實施方案中，用于制備包含共價連接于載體蛋白的血清型10A、22F或33F多 糖的免疫原性綴合物的方法還包括通過添加化BH4來對未反應的醒加帽（巧滅）的步驟(步 驟C)。
[0190] 在優選實施方案中，在步驟(C)中，通過添加0.1摩爾當量至10摩爾當量、0.5摩爾 當量至5摩爾當量或1摩爾當量至3摩爾當量的NaBH4來對未反應的醒進行加帽。在優選實施 方案中，在步驟(C)中，通過添加約2摩爾當量的NaBH冰對未反應的醒進行加帽。
[0191] 在優選實施方案中，步驟(C)的持續時間在0.1小時與10小時之間、0.5小時與5小 時之間或2小時與4小時之間。在優選實施方案中，步驟(C)的持續時間為約3小時。
[0192] 在優選實施方案中，將步驟(C)中的反應溫度維持在10至40°C之間、15至30°C之間 或20至26°C之間。在優選實施方案中，將步驟(C)中的反應溫度維持在約23°C。
[0193] 在將血清型10A、22F或33F多糖綴合于載體蛋白之后，可通過本領域技術人員已知 的各種技術來純化(針對多糖-蛋白質綴合物進行富集)多糖-蛋白質綴合物。運些技術包括 透析、濃縮/滲濾操作、切向流過濾沉淀/洗脫、柱層析(DEAE或疏水相互作用層析)和深度過 濾。
[0194] 在優選實施方案中，所述載體蛋白是無毒的和非反應原性的，并且可WW足夠的 量和純度獲得。載體蛋白應當順從于標準綴合方法。
[0195] 在優選實施方案中，將活化的血清型10AJ2F或33F多糖綴合于載體蛋白，載體蛋 白選自DT(白喉毒素）、ΤΤ(破傷風類毒素)或TT的片段C、CRM197(白喉毒素的無毒性的但抗 原性上相同的變體）、其它〇1'點突變體，諸如〔1?1176、〔1?1228、〔1?145(1](3^(1曰等 1.81〇1.化6111.218;3838-3844，1973);0?19、0?1102、0^103和0?1107^及由化油〇113和 Youle在Genetically Engineered Toxins,Ed:Frankel ,Maecel Dekker Inc,1992中描述 的其它突變;Glu-148的缺失或Glu-148至Asp、Gln或Ser的突變和/或Ala 158的缺失或Ala 158至Gly的突變W及US 4709017或US 4950740中公開的其它突變；至少一個或多個殘基 Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突變W及US 5917017或US 6455673中公開的其 它突變；或US 5843711中公開的片段，肺炎球菌的肺炎球菌溶血素化UO等（1995)Infect Immun63;2706-13)，包括 W-定方式脫毒的 ply 例如 dPLY-GMBS(W004081515，PCT/EP2005/ 010258)或dPLY-甲醒、PhtX，包括化14、？^8、化10、？^6(化14，？^8，化10或化巧的序列公 開于W000/37105或W0 00/39299中）W及化t蛋白的融合物例如化tDE融合物、Pht邸融合物、 Pht A-E(W0 01/98334，W0 03/54007，W02009/000826)、0MPC(腦膜炎球菌外膜蛋白-通常從 腦膜炎奈瑟球菌血清群B提取的-EP0372501)、化巧(來自腦膜炎奈瑟球菌）、PD(流感嗜血桿 菌蛋白D-參見，例如，EP 0594610B)、或其免疫功能等同物、合成膚（EP0378881， EP0427347)、熱休克蛋白（W0 93/17712，W094/03208)、百日咳蛋白（W0 98/58668， EP0471177)、細胞因子、淋己因子、生長因子或激素(W01091/01146)、包含來自各種病原體 來源的抗原的多個人CD4巧細胞表位的人工蛋白（Falugi等（20〇nEur J Immunol 31; 3816-3824)諸如N19蛋白（Baraldoi等（2004)Infect Immun 72;4884-7)、肺炎球菌表面蛋 白PspA(W0 02/091998)、鐵攝取蛋白（W0 01/72337)、艱難梭菌(C.difficile)的毒素 A或B (W000/61761)。在實施方案中，將活化的血清型10A、22F或33F多糖綴合于DT(白喉類毒素）。 在另一個實施方案中，將活化的血清型10A、22F或33F多糖綴合于ΤΤ(破傷風類毒素）。在另 一個實施方案中，將活化的血清型l〇A、22F或33F多糖綴合于ΤΤ的片段C。在另一個實施方案 中，將活化的血清型l〇A、22F或33F多糖綴合于PD(流感嗜血桿菌蛋白D-參見，例如，EP 0594610B)。
[0196] 在優選實施方案中，將活化的血清型10A、22F或33F多糖綴合于CRM197蛋白。所述 CRM197蛋白為白喉毒素的無毒形式，但其在免疫上與白喉毒素無區別。CRM197由被通過產毒0 棒狀隧菌體的亞硝基脈誘變產生的非產毒隧菌體染的白喉桿菌產生(UcMda，T. 等1971,Nature New Biology 233:8-11)。通過超濾、硫酸錠沉淀和離子交換層析純化 CRMi97dCRMi97蛋白具有與白喉毒素相同的分子量但與其相異在于結構基因中的單堿基變化 (鳥嚷嶺至腺嚷嶺）。該單堿基變化在成熟蛋白質中引起氨基酸取代(谷氨酸對甘氨酸的取 代)并且消除白喉毒素的毒性性質。CRM197蛋白是糖類的安全有效的T細胞依賴性載體。關于 CMR197及其生產的其它詳細內容可見于例如US5614382中。
[0197] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法將本文中公開的活化的血清型10A、 22F或33F多糖綴合于CRM197:
[019引 （a)將活化的血清型10A、22F或33F多糖與CRM197混合；
[0199] (b)將混合的活化的血清型10A、22F或33F多糖和CRMi97與氯基棚氨化鋼反應，W形 成血清型10A、22F或33F多糖:CRM197綴合物。
[0200] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法將本文中公開的活化的血清型10A、 22F或33F多糖綴合于CRM197:
[0201] (a)將活化的血清型10A、22F或33F多糖與CRM197混合；
[0202] (b)將混合的活化的血清型10A、22F或33F多糖和CRM197與氯基棚氨化鋼反應，W形 成血清型10A、22F或33F多糖:CRM197綴合物；
[0203] 其中在DMS0中進行步驟(a)和(b)。
[0204] 在優選實施方案中，通過包括W下步驟的方法將本文中公開的活化的血清型10A、 22F或33F多糖綴合于CRM197:
[0205] (a)將活化的血清型10A、22F或33F多糖與CRM197混合；
[0206] (b)將混合的活化的血清型10A、22F或33F多糖和CRM197與0.5摩爾當量至2摩爾當 量的氯基棚氨化鋼反應，W形成血清型10A、22F或33F多糖:CRM197綴合物；
[0207] 其中在DMS0中進行步驟(a)和(b)。
[0208] 在實施方案中，本發明設及通過或可通過本文中公開的方法獲得的免疫原性綴合 物。在優選實施方案中，本發明設及通過或可通過將如本文中公開的血清型l〇A、22F或33F 活化的多糖綴合(通過還原胺化)于載體蛋白獲得的免疫原性綴合物。在優選實施方案中， 本發明設及通過或可通過將本文中公開的血清型l〇A、22F或33巧舌化的多糖綴合(通過在 DMS0中進行還原胺化)于載體蛋白獲得的免疫原性綴合物。在優選實施方案中，所述載體蛋 白為 CRM197。
[0209] 血清型10A免疫原性綴合物
[0210] 在優選實施方案中，血清型10A免疫原性綴合物具有500kDa與15000kDa之間、 500kDa與lOOOOkDa之間、2000kDa與lOOOOkDa之間或3000kDa與SOOOkDa之間的分子量。在優 選實施方案中，血清型10A免疫原性綴合物具有3000kDa與SOOOkDa之間的分子量。免疫原性 綴合物的分子量通過SEC-MALLS來測量。
[0211] 在優選實施方案中，血清型10A免疫原性綴合物包含相較于血清型10A多糖的總量 少于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20 %或15 %的游離血清型10A多糖。在優選實施 方案中，血清型10A免疫原性綴合物包含相較于血清型10A多糖的總量少于約25%的游離血 清型10A多糖。在優選實施方案中，血清型10A免疫原性綴合物包含相較于血清型10A多糖的 總量少于約20%的游離血清型10A多糖。在優選實施方案中，血清型10A免疫原性綴合物包 含相較于血清型10A多糖的總量少于約15%的游離血清型10A多糖。
[0212] 在優選實施方案中，綴合物中的血清型10A多糖對載體蛋白的比率(重量/重量)在 0.5與3之間。在優選實施方案中，綴合物中的血清型10A多糖對載體蛋白的比率在0.5與2之 間、0.5與1.5之間、0.5與1之間、1與1.5之間、1與2之間。在優選實施方案中，綴合物中的血 清型10A多糖對載體蛋白的比率在0.8與1.4之間。在優選實施方案中，綴合物中的血清型 10A芙膜多糖對載體蛋白的比率在0.8與1.2之間。
[0213] 大小排阻層析介質（α-4Β)可被用來測定綴合物的相對分子大小分布。將大小排 阻層析(SEC)用于重力進料柱中W分析綴合物的分子大小分布。從介質中的孔排斥的大分 子比小分子更快地洗脫。將級分收集器用于收集柱洗脫液。通過糖類測定來比色測試級分。 為了測定Kd，將柱校準w確定分子被完全排斥時級分(Vo),化d = 0)，和代表最大持留量的 級分(Vi)，化d=l)。達到指定的樣品屬性時的級分(Ve)按照表達式Kd=(Ve-V〇)/(Vi-V〇)與 Kd相關。
[0214] 在優選實施方案中，至少30%的血清型10A免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于 或等于0.3的Kd。在優選實施方案中，至少40%的血清型10A免疫原性綴合物具有在化-4B柱 中低于或等于0.3的Kd。在優選實施方案中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%或85%的血清型10A免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。在優選實 施方案中，至少60%的血清型10A免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。在 優選實施方案中，50 %與80 %之間的血清型10A免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等 于0.3的Kd。
[0215] 綴合程度是載體蛋白中綴合于目標多糖的賴氨酸殘基的數目。使用本領域技術人 員已知的常規方法，通過氨基酸分析獲得因與多糖的共價鍵聯而引起的載體蛋白的賴氨酸 修飾的證據。綴合導致相較于用于產生綴合物材料的CRM197蛋白起始材料，回收的賴氨酸殘 基的數目的減少。
[0216] 在優選實施方案中，免疫原性綴合物的綴合程度在2與15之間、2與13之間、2與10 之間、2與8之間、2與6之間、2與5之間、2與4之間、3與15之間、3與13之間、3與10之間、3與8之 間、3與6之間、3與5之間、3與4之間、5與15之間、5與10之間、8與15之間、8與12之間、10與15 之間或10與12之間。在優選實施方案中，免疫原性綴合物的綴合程度在6與8之間。
[0217] 血清型22F免疫原性綴合物
[021引在優選實施方案中，免疫原性綴合物包含每mM血清型22F多糖至少0.1mM、0.2mM、 0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM或0.7mM或約0.8mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，免疫原性綴合 物包含每mM血清型22F多糖至少0.5mM、0.6mM或0.7mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，免疫原 性綴合物包含每mM血清型22F多糖至少0.6mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，免疫原性綴合 物包含每mM血清型22F多糖至少0.7mM的醋酸鹽。
[0219] 在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數對分 離的多糖中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、 0.85、0.9或0.95。在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每11^血清型22。多糖的醋酸鹽的11^ 數對分離的多糖中每ml血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.7。在優選實施方案 中，免疫原性綴合物中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的ml數對分離的多糖中每ml血清型22F 多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.9。
[0220] 在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數對活 化的多糖中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、 0.85、0.9或0.95。在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每11^血清型22。多糖的醋酸鹽的11^ 數對活化的多糖中每ml血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.7。在優選實施方案 中，免疫原性綴合物中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的ml數對活化的多糖中每ml血清型22F 多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.9。
[0221] 在優選實施方案中，血清型22F免疫原性綴合物具有在4001d)a與150001d)a之間、 500kDa 與 lOOOOkDa 之間、2000kDa 與 lOOOOkDa 之間、3000kDa 與 SOOOkDa 之間或 3000kDa 與 50001d)a之間的分子量。在優選實施方案中，血清型22F免疫原性綴合物具有在3000kDa與 5000kDa之間的分子量。通過SEC-MALLS測量所述免疫原性綴合物的分子量。
[0222] 在優選實施方案中，血清型22F免疫原性綴合物包含相較于血清型22F多糖的總量 少于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20 %或15 %的游離血清型22F多糖。在優選實施 方案中，血清型22F免疫原性綴合物包含相較于血清型22F多糖的總量少于約40%的游離血 清型22F多糖。在優選實施方案中，血清型22F免疫原性綴合物包含相較于血清型22F多糖的 總量少于約25 %的游離血清型22F多糖。在優選實施方案中，血清型22F免疫原性綴合物包 含相較于血清型22F多糖的總量少于約20%的游離血清型22F多糖。在優選實施方案中，血 清型22F免疫原性綴合物包含相較于血清型22F多糖的總量少于約15%的游離血清型22F多 糖。
[0223] 在優選實施方案中，綴合物中的血清型22F多糖對載體蛋白的比率(重量/重量)在 0.5與3之間。在優選實施方案中，綴合物中的血清型22F多糖對載體蛋白的比率在0.5與2之 間、0.5與1.5之間、0.8與1.2之間、0.5與1之間、1與1.5之間或1與2之間。在優選實施方案 中，綴合物中的血清型22F多糖對載體蛋白的比率在0.8與1.2之間。在優選實施方案中，綴 合物中的血清型22F芙膜多糖對載體蛋白的比率在0.9與1.1之間。
[0224] 在優選實施方案中，至少30%的血清型22F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于 或等于0.3的Kd。在優選實施方案中，至少40%的免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或 等于0.3的1((1。在優選實施方案中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%，或 85%的血清型22F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。在優選實施方案 中，至少60%的血清型22F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。在優選實 施方案中，50%與80%之間的血清型22F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3 的Kd。在優選實施方案中，65 %與80 %之間的血清型22F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中 低于或等于0.3的Kd。
[0225] 在優選實施方案中，免疫原性綴合物的綴合程度在2與15之間、2與13之間、2與10 之間、2與8之間、2與6之間、2與5之間、2與4之間、3與15之間、3與13之間、3與10之間、3與8之 間、3與6之間、3與5之間、3與4之間、4與7之間、5與15之間、5與10之間、8與15之間、8與12之 間、10與15之間或10與12之間。在優選實施方案中，免疫原性綴合物的綴合程度在4與7之 間。
[0。6] 血清型33F免疫原性綴合物
[0227]在優選實施方案中，免疫原性綴合物包含每mM血清型33F多糖至少0.1mM、0.2mM、 0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM或0.7mM或約0.8mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，免疫原性綴合 物包含每mM血清型33F多糖至少0.5mM、0.6mM或0.7mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，免疫原 性綴合物包含每mM血清型33F多糖至少0.6mM的醋酸鹽。在優選實施方案中，免疫原性綴合 物包含每mM血清型33F多糖至少0.7mM的醋酸鹽。
[02%]在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數對分 離的多糖中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、 0.85、0.9或0.95。在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每11^血清型33。多糖的醋酸鹽的11^ 數對分離的多糖中每ml血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.7。在優選實施方案 中，免疫原性綴合物中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的ml數對分離的多糖中每ml血清型33F 多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.9。
[0229] 在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數對活 化的多糖中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、 0.85、0.9或0.95。在優選實施方案中，免疫原性綴合物中每11^血清型33。多糖的醋酸鹽的11^ 數對活化的多糖中每ml血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.7。在優選實施方案 中，免疫原性綴合物中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的ml數對活化的多糖中每ml血清型33F 多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.9。
[0230] 在優選實施方案中，血清型33F免疫原性綴合物具有在5001d)a與300001d)a之間、 500kDa與 25000kDa之間、500kDa 與 20000kDa 之間、500kDa 與 15000kDa之間、500kDa 與 lOOOOkDa 之間、lOOOkDa 與 lOOOOkDa 之間、lOOOkDa 與 SOOOkDa 之間、lOOOkDa 與 5000kDa 之間、 2000kDa與lOOOOkDa之間、2000kDa與SOOOkDa之間或2000kDa與5000kDa之間的分子量。在優 選實施方案中，血清型33F免疫原性綴合物具有在lOOOkDa與SOOOkDa之間的分子量。通過 SEC-MLLS測量所述免疫原性綴合物的分子量。
[0231] 在優選實施方案中，血清型33F免疫原性綴合物包含相較于血清型33F多糖的總量 少于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20 %或15 %的游離血清型33F多糖。在優選實施 方案中，血清型33F免疫原性綴合物包含相較于血清型33F多糖的總量少于約25%的游離血 清型33F多糖。在優選實施方案中，血清型33F免疫原性綴合物包含相較于血清型33F多糖的 總量少于約20 %的游離血清型33F多糖。在優選實施方案中，血清型33F免疫原性綴合物包 含相較于血清型33F多糖的總量少于約15%的游離血清型33F多糖。
[0232] 在優選實施方案中，綴合物中血清型33F多糖對載體蛋白的比率（重量/重量)在 0.4與3之間。在優選實施方案中，綴合物中的血清型33F多糖對載體蛋白的比率在0.5與2之 間、0.5與1.5之間、0.5與1之間、1與1.5之間、1與2之間。在優選實施方案中，綴合物中的血 清型33F多糖對載體蛋白的比率在0.5與1.5之間。在優選實施方案中，綴合物中的血清型 33F芙膜多糖對載體蛋白的比率在0.5與1.2之間。
[0233] 在優選實施方案中，至少30%的血清型33F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于 或等于0.3的Kd。在優選實施方案中，至少40%的免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或 等于0.3的Kd。在優選實施方案中，至少45%、50%、55%、60%、65%的血清型33F免疫原性 綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。在優選實施方案中，至少60%的血清型33F免 疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。在優選實施方案中，40 %與80 %之間 的血清型33F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。在優選實施方案中， 45%與65%之間的血清型33F免疫原性綴合物具有在化-4B柱中低于或等于0.3的Kd。
[0234] 在優選實施方案中，免疫原性綴合物的綴合程度在1與15之間、2與13之間、2與10 之間、2與8之間、2與6之間、2與5之間、2與4之間、3與15之間、3與13之間、3與10之間、3與8之 間、3與6之間、3與5之間、3與4之間、5與15之間、5與10之間、8與15之間、8與12之間、10與15 之間或10與12之間。在優選實施方案中，免疫原性綴合物的綴合程度在3與6之間。
[0端]免疫原性組合物
[0236] 術語"免疫原性組合物"設及含有抗原例如微生物或其組分的任何藥物組合物，所 述組合物可用于引發受試者的免疫應答。
[0237] 如本文中所用，"免疫原性"意指抗原(或抗原的表位）（諸如細菌芙膜多糖)或包含 抗原的糖綴合物或免疫原性組合物引發宿主諸如哺乳動物的免疫應答(體液或細胞介導的 或兩者)的能力。
[0238] 在優選實施方案中，免疫原性組合物包含通過本文中公開的方法獲得的血清型 10A、22F或33F綴合物。在優選實施方案中，免疫原性組合物包含可通過本文中公開的方法 獲得的血清型10A、2 2F或3 3F綴合物。
[0239] 在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免疫原性組合物誘導能夠結合 血清型10A肺炎鏈球菌的抗體的形成。在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免 疫原性組合物誘導如通過標準化ISA測定測量的能夠結合血清型10A肺炎鏈球菌的抗體的 形成。
[0240] 在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免疫原性組合物誘導在如本文 公開的調理吞隧測定中能夠殺死血清型10A肺炎鏈球菌的抗體的形成。
[0241] 在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免疫原性組合物誘導能夠結合 血清型22F肺炎鏈球菌的抗體的形成。在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免 疫原性組合物誘導如通過標準化ISA測定測量的能夠結合血清型22F肺炎鏈球菌的抗體的 形成。
[0242] 在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免疫原性組合物誘導在如本文 公開的調理吞隧測定中能夠殺死血清型22F肺炎鏈球菌的抗體的形成。
[0243] 在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免疫原性組合物誘導能夠結合 血清型33F肺炎鏈球菌的抗體的形成。在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免 疫原性組合物誘導如通過標準化ISA測定測量的能夠結合血清型33F肺炎鏈球菌的抗體的 形成。
[0244] 在實施方案中，當向受試者施用時，本文中公開的免疫原性組合物誘導在如本文 中公開的調理吞隧測定中能夠殺死血清型33F肺炎鏈球菌的抗體的形成。
[0245] 可使用本領域公認的方法實現本發明的免疫原性組合物的配制。例如，可用生理 上可接受的媒介物配制血清型10A、22F或33F綴合物，W制備組合物。運樣的媒介物的實例 包括，但不限于，水、緩沖鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)和葡萄糖溶液。
[0246] 在優選實施方案中，免疫原性組合物可包含至少一種另外的抗原。在優選實施方 案中，免疫原性組合物可包含至少一種另外的肺炎鏈球菌芙膜多糖。
[0247] 在優選實施方案中，免疫原性組合物可包含至少一種另外的綴合于載體蛋白的肺 炎鏈球菌芙膜多糖。在優選實施方案中，所述載體蛋白為CRM197。
[0248] 在某些實施方案中，免疫原性組合物包含一種或多種佐劑。如本文中所定義的， "佐劑"為用于增強本發明的免疫原性組合物的免疫原性的物質。因此，佐劑通常被給予來 加強免疫應答，并且對于本領域技術人員來說是公知的。增強組合物的功效的合適的佐劑 包括，但不限于：
[0249] (1)侶鹽（明抓），諸如氨氧化侶、憐酸侶、硫酸侶等；
[0250] (2)水包油乳液制劑(具有或不具有其它特定的免疫刺激劑諸如胞壁酷膚(下文中 定義的)或細菌細胞壁組分），諸如，例如，
[0 巧 1] (a)MF59(PCT 公開號 W0 90/14837)，其含有 5% 角整締，0.5%5Tween 80 和 0.5% Span 85(任選地含有不同量的MTP-PE(參見下文，盡管不是必需的）），通過使用微流化器諸 如Model 110Y微流化器(Microfluidics,Newton,MA)配制成亞微米顆粒，
[0252] (b)SAF，其含有 10% 角整締，0.4%Tween 80,5%pluronic-嵌段聚合物 L121 和 thr-MDP(參見下文），其被微流化成亞微米乳劑或經滿旋W產生較大粒徑的乳劑，和 [0 巧 3] (c)Ribi? 佐劑系統(RAS)，（Corixa, Hamilton, MT)，其含有 2%角整締，0.2%Tween 80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述細菌細胞壁組分來自由美國專利No . 4，912，094 (Corixa)中描述的3-0-脫酷基單憐酷脂質A(MPL?)、海藻糖二霉菌酸醋(TDM)和細胞壁骨架 (CWS)，優選為MPL+CWS(Detox?).
[0254] (3)皂巧佐劑，諸如可使用如il A或STIMUL0N? QS-21(Antigenics，Framin曲am, ΜΑ)(美國專利No. 5，057，540)或從其產生的顆粒諸如ISCOM(免疫刺激復合物）；
[0255] (4)細菌脂多糖、合成的脂質A類似物諸如氨基烷基氨基葡糖胺憐酸鹽化合物 (AGP)，或其衍生物或類似物，其可獲自Corixa，并且其描述于美國專利No.6,113,918中；一 種運樣的AGP為2-[(R)-3-十四酷氧基十四酷氨基]乙基2-脫氧-4-0麟酷基-3-0-[(R)-3-十 四酷氧基十四酷]-2-[(R)-3-十四酷氧基十四酷氨基]-b-D-化喃葡萄糖巧，其也被稱為529 (先前稱為RC529)，其被配制為含水形式或穩定的乳劑，合成的多核巧酸諸如含CpG基序的 寡核巧酸(美國專利No. 6,207,646);
[0256] (5)細胞因子，諸如白細胞介素（例如，比-1、化-2、化-4、化-5、比-6、化-7、化-12、 比-15、化-18等）、干擾素（例如，丫干擾素）、粒細胞巨隧細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨隧 細胞集落刺激因子(M-CS巧、腫瘤壞死因子(TNF)、共刺激分子87-1和87-2等；
[0257] (6)野生型或突變體形式的細菌ADP-核糖基化毒素諸如霍亂毒素(CT)的脫毒突變 體，例如，其中氨基酸位置29上的谷氨酸被另一種氨基酸優選組氨酸替代(根據公開的國際 專利申請號W0 00/18434(也參見W0 02/098368和W0 02/098369))，百日咳毒素(PT)或大腸 桿菌巧.coli)不耐熱毒素化 T)，尤其是 1；1'-1(63、1；1'-1?72、(：1'-5109、？1'-1(9/6129(參見，例如， W0 93/13302和W0 92/19265);和
[025引（7)用作增強組合物的功效的免疫刺激劑的其它物質。
[0259] 胞壁酷膚包括，但不限于，N-乙酷基-胞壁酷蘇氨酷-D-異谷酷胺(thr-MDP)、N- 乙酷基-正胞壁酷-k丙氨酸-2-0--2'-二棟桐酷-sn-甘油-3-?基憐酷氧基)-乙胺(MTP- 陽)等。
[0260] 在本發明的實施方案中，如本文公開的免疫原性組合物包含CpG寡核巧酸作為佐 劑。如本文所用的CpG寡核巧酸是指免疫刺激性CpG寡脫氧核巧酸(CpG 0DN)，因此，除非另 有所指，否則運些術語可互換使用。免疫刺激性CpG寡脫氧核巧酸含有(任選地在某些優選 的堿基背景中）一個或多個為未甲基化的胞喀晚-鳥嚷嶺二核巧酸的免疫刺激性CpG基序。 所述CpG免疫刺激性基序的甲基化狀態通常是指二核巧酸中的胞喀晚殘基。含有至少一個 未甲基化的CpG二核巧酸的免疫刺激性寡核巧酸為含有通過憐酸鍵連接于3 '鳥嚷嶺的5 '未 甲基化的胞喀晚，并且通過結合于Toll-樣受體9(TLR-9)激活免疫系統的寡核巧酸。在另一 個實施方案中，免疫刺激性寡核巧酸可含有一個或多個甲基化的CpG二核巧酸，其將通過 化R9激活免疫系統，但不如CpG基序未被甲基化那樣強。CpG免疫刺激性寡核巧酸可包含一 個或多個回文序列，所述回文序列繼而可包含CpG二核巧酸。已在許多頒布的專利、公開的 專利申請W及其它出版物，包括美國專利N〇.6，194,388;6,207,646;6,214,806;6,218, 371; 6，239，116 和6，339，068 中描述了CpG 寡核巧酸。
[0261] 在本發明的實施方案中，如本文公開的免疫原性組合物包含在W02010/125480的 第3頁第22行至第12頁第36行描述的CpG寡核巧酸的任一個。
[0262] 已鑒定了不同種類的CpG免疫刺激性寡核巧酸。運些種類被稱為A、B、C和P類，并且 更詳細地描述于W02010/125480的第3頁第22行至第12頁第36行。本發明的方法包括運些不 同種類的CpG免疫刺激性寡核巧酸的使用。
[0263] 在本發明的實施方案中，如本文公開的免疫原性組合物包含A類CpG寡核巧酸。優 選地，本發明的"A類"CpG寡核巧酸具有W下核酸序列：5 ' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3 '（沈Q ID NO: 1) dA-類寡核巧酸的一些非限制性實例包括:5 'G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_ G*G*G*G*G*G 3 (SEQ ID NO: 2);其中*是指硫代憐酸醋鍵，_是指憐酸^醋鍵。
[0264] 在本發明的實施方案中，如本文公開的免疫原性組合物包含B類CpG寡核巧酸。在 一個實施方案中，用于本發明的CpG寡核巧酸為由至少下式代表的B類CpG寡核巧酸：
[0265] 5'XiX2CGX3X4 3'，其中Xi、X2、X3和X4為核巧酸。在一個實施方案中，X2為腺嚷嶺、鳥 嚷嶺或胸腺喀晚。在另一個實施方案中，&為胞喀晚、腺嚷嶺或胸腺喀晚。
[0266] 本發明的B類CpG寡核巧酸序列是上文中廣泛描述的美國專利No. 6,194,388、6， 207,646、6,214,806、6,218,371、6,239，116和6,339,068中的那些。示例性序列包括但不限 于后面運些的申請和專利中公開的那些序列。
[0267] 在實施方案中，本發明的"B類"CpG寡核巧酸具有W下核酸序列：
[0% 引 5'1^61^61'1'1'1'1^66了6(：1'1'1'了3'（沈9 10備：3)，或
[0269] 5'1^61^61'1'1'1'1^661^61'1'17 3'（沈9 10備：4)，或
[0270] 5'1^61^61'1'1761^61'1'1761^617 3'（沈9 10備：5)，或
[0271] 5'1^61^61'1'1^61^61'1'1761^617 3'（沈9 10備：6)，或
[0272] 5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3'（沈Q ID N0:7)。
[0273] 在任何運些序列中，所有鍵聯可W均為硫代憐酸醋鍵。在另一個實施方案中，在任 何運些序列中，一個或多個鍵聯可W是憐酸二醋鍵，優選在產生半軟CpG寡核巧酸的CpG基 序的''護與'屯"之間。在任何運些序列中，乙基-尿巧或面素可取代5'τ;面素取代的實例包括 但不限于:漠-尿巧或艦-尿巧取代。
[0274] Β-類寡核巧酸的一些非限制性實例包括：
[02巧]5'料ΟΚ>?=料ΟΚ>?=料料料料料〔地地鐘地地3'（沈Q ID Ν0:8)，或
[0276] 5'料〇1〇1<料〇1〇1<料料料料料〇1〇1〇1<料〇1〇1<料料料了3'（沈9 10備：9)，或
[0277] 5'
[0278] 料〇1<>1<1'*〇1<>1<1'*1'*1'*1'*6*1'*〇1<>1<1'*1'*1'*1'*6*1'*〇1<>1<1'*了3'（沈9 10備：10)，或
[0279] 5'
[0280] 料〇1〇1<料〇1〇1<料料料〇1〇1<料〇1〇1<料料料1'地>1<料〇1〇1<料了3'（沈9 10備：11)，或
[0281] 5'
[0282] 料樹 料料 T>K>KT>K(>G>KT>KT>KT>KT>KT>KT>KT>K(>G>KA3'（WQIDN0:12)，
[0283] 其中*是指硫代憐酸醋鍵。
[0284] 在本發明的實施方案中，如本文公開的免疫原性組合物包含C類CpG寡核巧酸。在 實施方案中，本發明的乂類"CpG寡核巧酸具有W下核酸序列：
[0285] 5'1^6〔61^61'1^66〔6〔6〔6〇1；3'（沈9 10^):13)，或
[0286] 5'1^61^64〔61'1^66〔6〔6〔6〇1；3'（沈9 10^):14)，或
[0287] 5'1^664〔61'1^66〔6〔6〔6〇1；3'（沈9 10^):15)，或
[028引 5'1^664〔61'1^66〔6〔601；3'（沈9 10備：16)，或
[0289] 5'1^6〔61^61'1^66〔6〔6〇1；3'（沈9 10^):17)，或
[0 巧 0] 5'1^64〔61'1^66〔6〔6〔6〇1；3'（沈9 10備：18)，或
[0291] 5'1^64〔61'1^66〔6〔6〇1；3'（沈9 10^):19)，或
[0 巧 2] 5'1^6〔61^61'1^66〔6〇1；3'（沈9 10備：20)，或
[0 巧 3] 5'1^6〔64〔61'1^66〔6〔6〔6〇1；3'（沈9 10^):21)，或
[0 巧 4] 5'1^61^61'1'1'1^66〔6〔6〔6〇1；3'（沈9 10備：22)，或
[0 巧 5] 5'1^61^61'1'1'1^66〔66〇1；〇1；3'（沈9 10備：23)，或
[0296] 5'1^61^61'1'7^〔66〔6〇1^'6〇1；3'（沈9 10^):24)，或
[0297] 5'TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3'（沈Q ID N0:25)。
[0298] 在任何運些序列中，所有鍵聯可W均為硫代憐酸醋鍵。在另一個實施方案中，在任 何運些序列中，一個或多個鍵聯可W是憐酸二醋鍵，優選在產生半軟CpG寡核巧酸的CpG基 序的''護與'哲'之間。
[0299] C-類寡核巧酸的一些非限定性實例包括：
[0300] 5'1'*(：_6*(：_6*1'*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(：_6*(>6*(>(>63'（沈9 10備：26)，或
[0301] 5'
[0302] 1'*(：_6*1'*(：_6*4*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(：_6*(>6*(>(>0 3'（569 10備：27)，或
[0303] 5'1'*(：_6*6*4*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(：_6*(>6*(>(>0 3'（569 10備：28)，或
[0304] 5'1'*(：_6*6*4*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(>6*(>(>0 3'（569 10備：29)，或
[0305] 5'1'*(：_6*(：_6*1'*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(>6*(>(>0 3'（569 10備：30)，或
[0306] 5'1'*(：_6*4*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(：_6*(>6*(>(>0 3'（569 10備：31)，或
[0307] 5'1'*(：_6*4*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(>6*(>(>0 3'（沈9 10備：32)，或
[0308] 5'1'*(：_6*(：_6*1'*(：_6*1'*1'*(：_6*6*(>6*(>(>0 3'（沈9 10備：33)，或
[0309] 5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'（沈Q ID NO:34)，或
[0310] 5'料OGW地地地地地地地地地地地地地地3'（沈Q ID NO:35)，或
[0311] 5'料樹G>KT>K(>G>KT>K料料料OG地地地地地地地地地地]'（沈Q ID N0:36)，或
[0312] 5'
[0313] 1'*〇6*1'*(：_6*1'*1'*1'*1'*4*(：_6*6*(>6*(>(：_6*1'*6*(>(>0 3'（569 10備：37)，或
[0314] 5'
[0315] 料C_GW地地地地地地地地地地地地地地W 3'（沈Q ID NO:38)，
[0316] 其中*是指硫代憐酸醋鍵，_是指憐酸二醋鍵。
[0317] 在任何運些序列中，乙基-尿巧或面素可取代5'Τ;面素取代的實例包括但不限于 漠-尿巧或艦-尿巧取代。
[0318] 在本發明的實施方案中，如本文公開的免疫原性組合物包含Ρ類CpG寡核巧酸。在 實施方案中，用于本發明的CpG寡核巧酸為P類CpG寡核巧酸，其含有5 '化R活化結構域和至 少2個回文區，一個回文區為長度為至少6個核巧酸的5'回文區，其直接或通過間隔子連接 至長度為至少8個核巧酸的3'回文區，其中所述寡核巧酸包括至少一個化R二核巧酸。在實 施方案中，所述寡核巧酸不是T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
[0319] (SEQ ID NO :27)。在一個實施方案中，P類CpG寡核巧酸包括至少一個未甲基化的 CpG二核巧酸。在另一個實施方案中，所述化R活化結構域為TCG、TTCG、TTTCG、TTpR、TTTpR、 TTTTpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在另一個實施方案中，所述化R活化結構域在5 '回文 區內。在另一個實施方案中，所述TLR活化結構域緊接所述5'回文區的5'。
[0320] 在實施方案中，本發明的"P類"CpG寡核巧酸具有W下核酸序列：5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3'（沈Q ID N0:39)。
[0321] 在所述序列中，所有鍵聯可W均為硫代憐酸醋鍵。在另一個實施方案中，一個或多 個鍵聯可W是憐酸二醋鍵，優選在產生半軟CpG寡核巧酸的CpG基序的"C"與"G"之間。在任 何運些序列中，乙基-尿巧或面素可取代5'Τ;面素取代的實例包括但不限于漠-尿巧或艦- 尿巧取代。
[0322] Ρ-類寡核巧酸的非限制性實例包括：
[0323] 5'
[0324] 料C_GW^_G^A地_G^AW^_G地地地地_6地地地地地 3'（沈Q ID Ν0:40)
[0325] ，其中*是指硫代憐酸醋鍵，_是指憐酸二醋鍵。
[0326] 在一個實施方案中，寡核巧酸包括至少一個硫代憐酸醋鍵聯。在另一個實施方案 中，寡核巧酸的所有核巧酸間鍵聯為硫代憐酸醋鍵聯。在另一個實施方案中，寡核巧酸包括 至少一個憐酸二醋樣鍵聯。在另一個實施方案中，所述憐酸二醋樣鍵聯為憐酸二醋鍵聯。在 另一個實施方案中，將親脂性基團綴合于所述寡核巧酸。在一個實施方案中，所述親脂性基 團為膽固醇。
[0327] 在實施方案中，本文公開的CpG寡核巧酸的所有核巧酸間鍵聯為憐酸二醋鍵Γ軟" 寡核巧酸，如PCT申請W02007/026190中描述的）。在另一個實施方案中，使本發明的CpG寡核 巧酸被賦予對降解的抗性(例如，被穩定化）。"穩定化的寡核巧酸"是指對體內降解(例如經 由外切或內切核酸酶)相對耐受的寡核巧酸。可通過主鏈修飾實現核酸穩定化。具有硫代憐 酸醋鍵聯的寡核巧酸提供了最大活性并且保護寡核巧酸免受細胞內外切和內切核酸酶的 降解。
[0328] 免疫刺激性寡核巧酸可具有嵌合主鏈，其具有憐酸二醋鍵聯與硫代憐酸醋鍵聯的 組合。為本發明的目的，嵌合主鏈是指部分穩定化的主鏈，其中至少一個核巧酸間鍵聯是憐 酸二醋或憐酸二醋樣鍵聯，其中至少一個其它的核巧酸間鍵聯是穩定化的核巧酸間鍵聯， 其中所述至少一個憐酸二醋鍵聯或憐酸二醋樣鍵聯和所述至少一個穩定化的鍵聯是不同 的。當所述憐酸二醋鍵聯優選位于CpG基序內時，運樣的分子被稱為"半軟的"，如PCT申請 W02007/026190 中描述的。
[0329] CpG寡核巧酸的大小（即，沿著寡核巧酸的長度的核巧酸殘基的數目）也可貢獻寡 核巧酸的刺激活性。為了有利于至細胞內的攝取，本發明的CpG寡核巧酸優選具有6個核巧 酸殘基的最小長度。如果存在足夠的免疫刺激性基序，則具有大于6個核巧酸的任何大小 (甚至許多化長）的寡核巧酸能夠誘導免疫應答，因為較大的寡核巧酸在細胞內被降解。在 某些實施方案中，所述CpG寡核巧酸為6至100個核巧酸長，優選8至30個核巧酸長。在重要的 實施方案中，本發明的核酸和寡核巧酸不是質粒或表達載體。
[0330] 在實施方案中，本文公開的CpG寡核巧酸包含諸如在堿基和/或糖中的取代或修 飾，如在W02007/026190的段落134至147中描述的。
[0331] 在實施方案中，本發明的CpG寡核巧酸被化學修飾。化學修飾的實例對于本領域技 術人員來說是已知的，并且描述于例如加 Imann E.等（1990) ,Chem.Rev.90:543, S.Agrawal,Ed. 'Humana Press,Totowa,USA 1993;C;rooke,S.T.等（ 1996) Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107-129;和Hunziker J.等，（1995), Mod. Synth.Methods?: 331-417中。根據本發明的寡核巧酸可具有一個或多個修飾，其中相 較于由天然DNA或RNA組成的相同序列的寡核巧酸，每一個修飾位于特定的憐酸二醋核巧間 橋上和/或特定的0-D-核糖單元上和/或在特定的天然核巧堿基位置上。
[0332] 在本發明的一些實施方案中，可按照本領域技術人員已知的方法將含CpG的核酸 與免疫原性載體簡單地混合(參見，例如，W003/024480)。
[0333] 在本發明的具體實施方案中，本文公開的任何免疫原性組合物包含化g至lOOmg的 CpG寡核巧酸，優選0.1 mg至50mg CpG寡核巧酸，優選0.2mg至lOmg CpG寡核巧酸，優選0.3mg 至5mg CpG寡核巧酸，優選0.5至2mg CpG寡核巧酸，優選0.75至1.5mg CpG寡核巧酸。在優選 實施方案中，本文公開的免疫原性組合物包含約Img CpG寡核巧酸。
[0334] 在優選實施方案中，佐劑為選自憐酸侶、硫酸侶和氨氧化侶的基于侶的佐劑。在一 個實施方案中，本文所述的免疫原性組合物包含佐劑憐酸侶。
[0335] 在優選實施方案中，本發明的免疫原性組合物還包含緩沖劑、冷凍保護劑、鹽、二 價陽離子、非離子去垢劑、自由基氧化的抑制劑、稀釋劑或載體的至少一種。
[0336] 免疫原性組合物任選地可包含藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體包括用 于動物(包括人W及非人動物）的由聯邦監管機構、州政府或其它管理機構批準的，或美國 藥典或其它通常公認的藥典中所列的載體。術語載體可用于指與藥物組合物一起施用的稀 釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。可將水、鹽水溶液W及含水葡萄糖和甘油溶液用作液體載體， 特別是用于可注射溶液。在E.W.Ma;rtin的"Remington'S Pharmaceutical Sciences"中描 述了合適的藥物載體的實例。所述制劑應當適應于施用模式。
[0337] 免疫原性組合物任選地可包含選自但不限于化is(S甲胺）、憐酸鹽、醋酸鹽、棚酸 鹽、巧樣酸鹽、甘氨酸、組氨酸和班巧酸鹽的一種或多種生理上可接受的緩沖劑。在某些實 施方案中，將制劑緩沖至約5.0至約7.0，優選約5.5至約6.5的pH范圍內。
[0338] 免疫原性組合物任選地可包含一種或多種非離子性表面活性劑，包括但不限于聚 氧乙締山梨聚糖脂肪酸醋、聚山梨醇醋-80(Tween80)、聚山梨醇醋-60(Tween 60)、聚山梨 醇醋-40(Tween 40)和聚山梨醇醋-20(Tween 20)、聚氧乙締烷基酸，包括但不限于化ij 58、Brij 35W及其它物質諸如Triton X-100;Triton X-114、NP40、Span 85和非離子性表 面活性劑的Pluronic系列（例如，Pluronic 121)，其中優選的組分聚山梨醇醋-80的濃度為 約0.001 %至約2% (高至約0.25%是優選的）或聚山梨醇醋-40的濃度為約0.001 %至1 % (高至約0.5 %是優選的）。
[0339] 本發明還設及包含本發明的免疫原性組合物的疫苗。
[0340] 用于誘導免疫應答和保護免受感染的方法
[0341] 本公開內容還包括用于本文所述的免疫原性組合物的使用方法。例如，本公開內 容的一個實施方案提供了誘導針對肺炎鏈球菌的免疫應答的方法，其包括向受試者施用免 疫原性量的本文所述的任何免疫原性組合物。
[0342] 本公開內容的一個實施方案提供了保護受試者免受肺炎鏈球菌感染的方法，或預 防肺炎鏈球菌感染的方法，或減輕與由肺炎鏈球菌引起的感染相關的至少一個癥狀的嚴重 度或延遲其發作的方法，所述方法包括向受試者施用免疫原性量的本文所述的任何免疫原 性組合物。
[0343] 本公開內容的一個實施方案提供了保護受試者免受血清型10A肺炎鏈球菌感染的 方法，或預防血清型10 A肺炎鏈球菌感染的方法，或減輕與由血清型10 A肺炎鏈球菌引起的 感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲其發作的方法，所述方法包括向受試者施用產生 免疫原性的量的本文所述的任何免疫原性組合物。
[0344] 本公開內容的一個實施方案提供了治療或預防受試者的與血清型10A肺炎鏈球菌 相關的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，所述方法包括向受試者施用治療或預防有效 量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。另一個實施方案提供了治療或預防受試者的與血 清型10A肺炎鏈球菌相關的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，所述方法包括從本文所述 的免疫原性組合物產生多克隆或單克隆抗體制劑，和使用所述抗體制劑W給受試者賦予被 動免疫。
[0345] 在一個實施方案中，本公開內容設及本文公開的免疫原性綴合物或免疫原性組合 物用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于保護受試者免受肺炎鏈球菌感染，和/或預防肺炎鏈 球菌感染，和/或減輕與由肺炎鏈球菌引起的感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲其 發作，和/或保護受試者免受血清型10A肺炎鏈球菌感染和/或預防血清型10A肺炎鏈球菌感 染，和/或減輕與由血清型10A肺炎鏈球菌引起的感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲 其發作。
[0346] 本公開內容的一個實施方案提供了保護受試者免受血清型22F肺炎鏈球菌感染的 方法，或預防血清型22F肺炎鏈球菌感染的方法，或減輕與由血清型22F肺炎鏈球菌引起的 感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲其發作的方法，所述方法包括向受試者施用免疫 原性量的本文所述的任何免疫原性組合物。
[0347] 本公開內容的一個實施方案提供了治療或預防受試者的與血清型22F肺炎鏈球菌 相關的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，所述方法包括向受試者施用治療或預防有效 量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。另一個實施方案提供了治療或預防受試者的與血 清型22F肺炎鏈球菌相關的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，所述方法包括從本文所述 的免疫原性組合物產生多克隆或單克隆抗體制劑，W及使用所述抗體制劑W給受試者賦予 被動免疫。
[0348] 在一個實施方案中，本公開內容設及本文公開的免疫原性綴合物或免疫原性組合 物用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于保護受試者免受肺炎鏈球菌感染，和/或預防肺炎鏈 球菌感染，和/或減輕與由肺炎鏈球菌引起的感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲其 發作，和/或保護受試者免受血清型22F肺炎鏈球菌感染和/或預防血清型22F肺炎鏈球菌感 染，和/或減輕與由血清型22F肺炎鏈球菌引起的感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲 其發作。
[0349] 本公開內容的一個實施方案提供了保護受試者免受血清型33F肺炎鏈球菌感染的 方法，或預防血清型33F肺炎鏈球菌感染的方法，或減輕與由血清型33F肺炎鏈球菌引起的 感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲其發作的方法，所述方法包括向受試者施用免疫 原性量的本文所述的任何免疫原性組合物。
[0350] 本公開內容的一個實施方案提供了治療或預防受試者的與血清型33F肺炎鏈球菌 相關的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，所述方法包括向受試者施用治療或預防有效 量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。另一個實施方案提供了治療或預防受試者的與血 清型33F肺炎鏈球菌相關的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，所述方法包括從本文所述 的免疫原性組合物產生多克隆或單克隆抗體制劑，W及使用所述抗體制劑W給受試者賦予 被動免疫。
[0351] 在一個實施方案中，本公開內容設及本文公開的免疫原性綴合物或免疫原性組合 物用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于保護受試者免受肺炎鏈球菌感染，和/或預防肺炎鏈 球菌感染，和/或減輕與由肺炎鏈球菌引起的感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲其 發作，和/或保護受試者免受血清型33F肺炎鏈球菌感染和/或預防血清型33F肺炎鏈球菌感 染，和/或減輕與由血清型33F肺炎鏈球菌引起的感染相關的至少一個癥狀的嚴重度或延遲 其發作。
[0352] 針對免疫原性組合物的"免疫應答"是受試者中針對存在于目標免疫原性組合物 或疫苗組合物中的分子的體液和/或細胞介導的免疫應答的發生。為了本公開內容的目的， "體液免疫應答"是抗體介導的免疫應答，并且牽設誘導和產生識別本公開內容的免疫原性 組合物或疫苗中的抗原并W-定的親和力與其結合的抗體，而"細胞介導的免疫應答"是由 T細胞和/或其它白血細胞介導的免疫應答。"細胞介導的免疫應答"通過與主要組織相容性 復合物(MHC)的I類或II類分子、CD1或其它非經典的Μ肥-樣分子締合的抗原性表位的呈遞 引發。運活化抗原特異性CD4巧輔助細胞或CD8+細胞毒性Τ淋己細胞rCTL" ) dCTL具有針對 與由經典或非經典MHC編碼并在細胞表面上表達的蛋白質締合呈遞的膚抗原的特異性。CTL 幫助誘導和促進細胞內微生物的細胞內破壞，或被運樣的微生物感染的細胞的裂解。細胞 免疫的另一個方面牽設通過輔助T細胞的抗原特異性應答。輔助T-細胞用于幫助刺激針對 在其表面上展示與經典或非經典MHC分子締合的膚或其它抗原的細胞的非特異性效應細胞 的功能和聚焦其活性。"細胞介導的免疫應答"還指細胞因子、趨化因子W及由活化的T細胞 和/或其它白細胞(包括來源于CD4+和CD8巧細胞的那些白細胞)產生的其它運樣的分子的 產生。特定抗原或組合物刺激細胞介導的免疫應答的能力可通過許多測定，諸如通過淋己 細胞增殖(淋己細胞活化)測定、CTL細胞毒性細胞測定，通過測定致敏受試者中特異于抗原 的T淋己細胞，或通過測量由T細胞響應于利用抗原的再刺激產生的細胞因子來測定。運樣 的測定在本領域中公知的。參見，例如，Erickson等（1993) J. Immuno 1.151:4189-4199和Doe 等（1994化ur.J. Immunol.24:2369-2376。
[0353] 如本文中所用，"治療"（包括其變型，例如，"醫治"或"治療的"）意指W下的任一個 或多個：（i)感染或再感染的預防，如在常規疫苗中，（ii)癥狀的嚴重度的減輕或癥狀消除， 和（iii)所設及的病原體或病癥的基本或完全消除。因此，可預防性(在感染前）或治療性 (在感染后)實現治療。在本公開內容中，預防性治療是優選模式。根據本公開內容的具體實 施方案，提供了治療(包括預防性和/或治療性免疫)宿主動物對抗血清型10A肺炎鏈球菌感 染的組合物和方法。根據本發明的具體實施方案，提供了治療(包括預防性和/或治療性免 疫)宿主動物對抗血清型22F肺炎鏈球菌感染的組合物和方法。根據本公開內容的具體實施 方案，提供了治療(包括預防性和/或治療性免疫)宿主動物對抗血清型33F肺炎鏈球菌感染 的組合物和方法。本公開內容的方法用于賦予受試者預防性和/或治療性免疫。還可對受試 者實施本公開內容的方法w進行生物醫學研究應用。
[0354] "免疫原性量"和"免疫上有效的量"運兩者在本文中可互換使用，是指足W引發免 疫應答(細胞(T-細胞)或體液(B-細胞或抗體)應答，或兩者）的抗原或免疫原性組合物的 量，如通過本領域技術人員已知的標準測定測量的。
[0355] 在優選實施方案中，所述受試者為人。在最優選實施方案中，所述受試者是新生兒 (即小于3個月）、嬰兒(從3個月至1歲）或幼兒（即從1歲至4歲）。
[0356] 在實施方案中，本文公開的免疫原性組合物用作疫苗。
[0357] 在運樣的實施方案中，待接種的受試者可小于1歲。例如，待接種的受試者可為約1 個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月大。 在實施方案中，待接種的受試者為約2、4或6個月大。在另一個實施方案中，待接種的受試者 小于2歲。例如，待接種的受試者可為約12-15個月大。在一些情況下，需要少至一個劑量的 根據本發明的免疫原性組合物，但在一些情況下，可給予第二、第Ξ或第四劑量(參見方案 部分）。
[0358] 在本發明的實施方案中，待接種的受試者為50歲或更老的成年人，更優選55歲或 更老的成年人。在實施方案中，待接種的受試者為65歲或更老、70歲或更老、75歲或更老或 80歲或更老的成年人。
[0359] 在實施方案中，待接種的受試者為免疫力低下個體，特別是人。免疫力低下個體通 常被定義為表現出減弱的或降低的引發針對感染原攻擊的正常體液或細胞防御的能力的 人。
[0360] 在本發明的實施方案中，待接種的免疫力低下受試者患有削弱免疫系統并導致不 足W保護免受肺炎球菌疾病或治療肺炎球菌疾病的抗體應答的疾病或病況。
[0361] 在實施方案中，所述疾病為原發性免疫缺陷病癥。優選地，所述原發性免疫缺陷病 癥選自：組合的T和B細胞免疫缺陷、抗體缺乏、明確定義的綜合征、免疫失調疾病、吞隧細胞 素亂、固有免疫缺陷、自身炎癥性病癥W及補體缺陷。在實施方案中，所述原發性免疫缺陷 病癥選自PCT申請W02010/125480的第24頁第11行至第25頁第19行中公開的原發性免疫缺 陷癥。
[0362] 在本發明的具體實施方案中，待接種的免疫力低下受試者患有選自下列的疾病： HIV感染、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、癌癥、慢性屯、臟或肺病癥、充血性屯、臟衰竭、糖尿 病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液滲漏、屯、肌病、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性 肺疾病(C0PD)、脾功能障礙(諸如鑲狀細胞病）、脾功能缺乏(無脾）、血液惡性腫瘤、白血病、 多發性骨髓瘤、霍奇金病、淋己瘤、腎功能衰竭、腎病綜合征和哮喘。
[0363] 在本發明的實施方案中，待接種的免疫力低下受試者患有營養不良。
[0364] 在本發明的具體實施方案中，待接種的免疫力低下受試者正在服用降低身體對感 染的抗性的藥物或進行降低身體對感染的抗性的治療。在實施方案中，所述藥物選自PCT申 請W02010/125480的第26頁第33行至第26頁第40行中公開的藥物。
[0365] 在本發明的具體實施方案中，待接種的免疫力低下受試者是吸煙者。
[0366] 在本發明的具體實施方案中，待接種的免疫力低下受試者具有低于5x 109個細 胞/升，或低于4x 109個細胞/升，或低于3x 109個細胞/升，或低于2x 109個細胞/升，或低于 lx 109個細胞/升，或低于0.5X109個細胞/升，或低于0.3X 109個細胞/升，或低于O.lx 109 個細胞/升的白血細胞計數（白細胞計數）。
[0367] 白血細胞計數（白細胞計數）：血液中的白血細胞(WBC)的數目。WBC通常被測量為 CBC(全血計數)的部分。白血細胞是血液中的抗感染細胞，并且與被稱為紅細胞的紅(載氧） 血細胞不同。存在不同類型的白血細胞，包括嗜中性粒細胞(多形核白細胞;PMN)、桿狀核細 胞(輕度未成熟嗜中性粒細胞）、Τ型淋己細胞(T細胞）、B型淋己細胞(B細胞）、單核細胞、嗜 酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。所有類型的白血細胞反映于白血細胞計數中。白血細胞計數 的正常范圍通常在每立方毫米血液4300個細胞與10800個細胞之間。運也可被稱為白細胞 計數，并且可W W國際單位表示為4.3-10.8x 109個細胞/升。
[0368] 在本發明的具體實施方案中，待接種的免疫力低下受試者患有嗜中性粒細胞減少 癥。在本發明的具體實施方案中，待接種的免疫力低下受試者具有低于2x 109個細胞/升， 或低于lx 109個細胞/升，或低于0.5X 109個細胞/升，或低于O.lx 109個細胞/升，或低于 0.05x 109個細胞/升的嗜中性粒細胞計數。
[0369] 低白血細胞計數或"嗜中性粒細胞減少癥"是特征在于循環血液中異常低水平的 嗜中性粒細胞的病況。嗜中性粒細胞是幫助預防和抵抗感染的特殊類型的白血細胞。癌癥 患者經歷嗜中性粒細胞減少癥的最常見原因是作為化療的副作用。化療誘導的嗜中性粒細 胞減少癥增加了患者的感染風險并使癌癥治療中斷。
[0370] 在本發明的具體實施方案中，待接種的免疫力低下受試者具有低于500/mm3的CD4 +細胞計數，或低于300/mm3的CD4+細胞計數，或低于200/mm3CD4+細胞計數，低于100/mm 3的 CD4+細胞計數，低于75/mm3的CD4+細胞計數，或低于50/mm3的CD4+細胞計數。
[0371] CD4細胞測試通常被報告為1mm3中的細胞的數目。正常CD4計數在500個與1600個 之間，CD8計數在375個與1100個之間。CD4計數在患有HI V的患者中急劇下降。
[0372] 在本發明的實施方案中，本文公開的任何免疫力低下受試者為男人或女人。
[0373] 組合物中綴合物的量通常基于針對該綴合物是綴合的和非綴合的總多糖來計算。 例如，具有20%游離多糖的綴合物將在lOOmcg多糖劑量中具有約80mcg綴合的多糖和約 20mcg非綴合的多糖。當計算綴合物的劑量時，通常不考慮蛋白質對綴合物的貢獻。通常地， 每一個劑量將包含0.1至lOOmcg，具體地0.1至lOmcg，更具體地1至lOmcgW及更具體地1至5 yg的多糖。優選地，每一個劑量將包含約1.1、2、2.2、3、3.3、4、4.化旨多糖。
[0374] 可通過牽設觀察受試者中適當的免疫應答的標準研究來確定特定免疫原性組合 物或疫苗的組分的最佳量。在初始接種后，受試者可接受一次或數次適當間隔的加強免疫。
[0375] 可通過增殖測定，通過測量T細胞裂解其特定祀細胞的能力的細胞溶解測定諸如 銘釋放測定，或通過測量B細胞活性的水平(通過測量血清中特異于抗原的循環抗體的水 平)來測量抗原作為免疫原的功效。還可通過測量在施用抗原后誘導的抗原特異性抗體的 血清水平，和更具體地，通過測量所誘導的抗體增強特定白血細胞的調理吞隧能力的能力 來檢測免疫應答，如本文中所描述的。免疫應答的保護水平可通過用已被施用的抗原攻擊 經免疫的宿主來測量。例如，如果針對其的免疫應答是期望的抗原為細菌，則由免疫原性量 的抗原誘導的保護水平通過在用所述細菌細胞攻擊動物后檢測百分比存活率或百分比死 亡率來測量。在一個實施方案中，可通過測量至少一個與細菌感染相關的癥狀，例如與感染 相關的發熱來測量保護量。多抗原或多組分疫苗或免疫原性組合物中的每一種抗原的量可 相對每一種其它組分而變化，并且可通過本領域技術人員已知的方法來測定。運樣的方法 可包括用于測量免疫原性和/或體內功效的方法。
[0376]本公開內容還提供了特異性和選擇性結合本公開內容的芙膜多糖或糖綴合物的 抗體和抗體組合物。在一些實施方案中，在對受試者施用本公開內容的芙膜多糖或糖綴合 物后產生抗體。在一些實施方案中，本公開內容提供了針對本公開內容的一種或多種芙膜 多糖或糖綴合物的純化的或分離的抗體。在一些實施方案中，本公開內容的抗體具有功能， 如通過在動物功效模型中殺死細菌或經由調理吞隧殺死測定測量的。在一些實施方案中， 本公開內容的抗體給受試者賦予被動免疫。通過使用本領域技術人員公知的技術，本公開 內容還提供編碼本公開內容的抗體或抗體片段的多核巧酸分子，W及產生本公開內容的抗 體或抗體組合物的細胞、細胞系(諸如用于抗體的重組產生的雜交瘤細胞或其它工程細胞 系)或轉基因動物。 實施例
[0巧7] 實施例1:血清型22F多糖-CRM197綴合物的制備
[0378] 1.1.分離的肺炎鏈球菌血清型22F多糖的制備
[0379] 可使用本領域普通技術人員已知的分離方法直接從細菌獲得血清型22F芙膜多 糖。（參見例如美國專利申請公開號20060228380，20060228381 ,20070184071， 20070184072,20070231340 和 20080102498或 W02008118752 中公開的方法）。將血清型 22F 肺 炎鏈球菌生長在接種瓶中，隨后轉移至接種發酵罐。一旦達到祀向光學密度，就將細胞轉移 至生產發酵罐中。發酵肉湯通過添加 N-月桂酷基肌氨酸滅活和通過超濾和滲濾純化。
[0380] 使用PANDA 2K均抑1器⑩(GEA Niro Soavi)，通過高壓均化裁剪純化的肺炎鏈球 菌血清型22F多糖，W產生分離的肺炎鏈球菌血清型22F多糖。
[0381] 1.2.分離的肺炎鏈球菌血清型22F芙膜多糖的氧化
[0382] 在通過連續添加計算的量的500mM憐酸鐘緩沖液(pH 5.8)和WFI(W提供2.Og/L的 多糖終濃度)獲得的lOOmM憐酸鐘緩沖液(pH5.8 ±0.2)中進行多糖的氧化。必要時，將反應 pH調整至大致5.8。在pH調整后，將反應溫度降至5 ± 3°C。通過添加0.10 ±0.02摩爾當量 (MEq)的高艦酸鋼來起始氧化。祀氧化反應時間為在5 ± 3 °C下16 ± 1小時。
[038引通過在5 ±3°C連續攬拌1-2小時，用2MEq的2,3-下二醇巧滅氧化反應。
[0384] 使用100K MWC0超濾盒進行活化的多糖的濃縮和滲濾。針對35倍滲濾體積的WFI進 行滲濾。將純化的活化的多糖于5±3°C下膽存。純化的活化的糖通過除其它W外（i)通過 SEC-MALLS測量的分子量，（ii )0-乙酷基的存在和(iii)氧化程度來表征。
[0385] SEC-MALLS用于測定多糖和多糖-蛋白質綴合物的分子量。SEC用于通過流體力學 體積分離多糖。折射率(RI)和多角度激光光散射(MA化S)檢測器用于測定分子量。當光與物 質相互作用時，其散射，并且散射光的量與濃度、dn/dc(特定的折射率增量）的平方和物質 的摩爾質量相關。基于來自MALLS檢測器的散射光信號和來自RI檢測器的濃度信號的讀數 計算分子量測量值。
[0386] 如下測定活化的多糖的氧化程度(D0 =糖重復單元的摩爾數/醒的摩爾數）：
[0387] 通過各種比色法，諸如例如通過使用蔥酬法測定糖重復單元的摩爾數。首先通過 硫酸和熱的作用將多糖分解成單糖。蔥酬測糖試劑與己糖反應W形成黃綠色復合物，其吸 光度在625nm處通過分光光度計讀取。在測定的范圍內，吸光度直接與存在的己糖的量成比 例。
[038引還同時使用MBTH比色法測定醒的摩爾數。MBTH測定牽設通過將醒基團（來自給定 的樣品）與3-甲基-2-苯并嚷挫酬腺(MBTH測定試劑）反應來形成叮嗦化合物。過量的3-甲 基-2-苯并嚷挫酬腺氧化W形成反應性陽離子。所述反應性陽離子與叮嗦反應W形成藍色 生色團。隨后在650nm處通過分光光度計讀取所形成的發色團。
[0389] 1.3.活化的肺炎鏈球菌血清型22F多糖與CRM197的綴合
[0390] 綴合方法由W下步驟組成：
[0391 ] a.與薦糖賦形劑混合，并冷凍干燥。
[0392] b.重建凍干的多糖和CRM197。
[0393] C.將活化的多糖綴合于CRM197并加帽
[0394] d.純化綴合物。
[03M] a.與薦糖混合和冷凍干燥
[0396] 將活化的多糖與薦糖（50%w/v，于WFI中）混合至每克活化的多糖25克薦糖的比 率。隨后凍干瓶裝的混合的混合物。在凍干后，將裝有凍干的活化的多糖的瓶子在-20±5°C 下膽存。分別地殼式冷凍和凍干計算的量的CRM197蛋白（祀S/P輸入比率=1)。將凍干的 CRM197 于-20 ± 5 °C 下膽存。
[0397] b.凍干的活化的多糖和CRM197蛋白的重建
[0398] 在無水二甲基亞諷(DMS0)中重建凍干的活化的多糖。在多糖完全溶解后，將等量 的無水DMS0添加至凍干的CRMwW進行重建。
[0399] C.將活化的多糖綴合于CRM197并加帽
[0400] 將重建的CRMi97(于DMS0中）與重建的活化的多糖在綴合反應容器中組合。反應溶 液中的多糖終濃度為Ig/L。通過向反應混合物中添加1.5±0.謹的氯基棚氨化鋼來起始綴 合，將反應在23 ± 2 °C下溫育20 ± 2小時。通過添加2MEq棚氨化鋼來終止綴合反應。將加帽反 應于23±2°C溫育3±1小時。
[0401 ] d.純化綴合物
[0402] 在制劑中用冰冷的5mM班巧酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)^1:5稀釋綴合物溶液，W用 于使用100K MWC0膜通過切向流過濾來純化，使用5mM班巧酸鹽-0.9 %鹽水(pH6.0)作為介 質進行20X滲濾。在完成滲濾后，進一步稀釋綴合物滲余物，將其通過0.22μπι濾器過濾，并于 2-8 °C下膽存。
[0403] 表1包含通過本發明的方法獲得的血清型22F多糖-CRM197綴合物的表征數據。具體 地，如實施例1中所公開的獲得表中的綴合物5和6。
[0404] 相較于通過RAC-含水法產生的綴合物，通過RAC-DMS0法產生的血清型22F多糖- CRM197綴合物提供了更好的產率，并且在MW上表現出更好的批間一致性，W及顯著更低的游 離糖百分比水平和較高的載體蛋白（賴氨酸)修飾，如表1中顯示的。
[0405]
[0407]如下計算綴合物產率百分比：（綴合物中的多糖的量xlOO)/活化的多糖的量。
[040引實施例2:血清型10A多糖-CRM197綴合物的制備
[0409] 2.1.分離的肺炎鏈球菌血清型10A多糖的制備
[0410] 除不裁剪純化的多糖外，如實施例1.1中所公開的獲得分離的血清型10A多糖。
[0411] 2.2.分離的肺炎鏈球菌血清型10A芙膜多糖的氧化
[0412] 將計算的體積的0.1M憐酸鐘緩沖液(pH 6.0)和注射用水(WFI)添加至多糖溶液W 獲得2.5g/L的多糖終濃度和25mM終濃度的憐酸鐘緩沖液，必要時，將pH調整至大致6.0。隨 后將稀釋的多糖冷卻至5 ± 3°C。通過添加0.25 ±0.02摩爾當量(MEq)的高艦酸鋼溶液起始 氧化。氧化反應時間為在5 ± 3 °C約4小時。通過在5 ± 3 °C連續攬拌1-2小時，用IMEq的2，3-下 二醇巧滅氧化反應。
[041引在達到祀反應時間后，使用30K MWC0 Millipore超濾盒濃縮活化的多糖。隨后針 對20倍滲濾體積的WFI進行滲濾。將純化的活化的多糖于5 ± 3 °C下膽存。純化的活化的多糖 通過除其它W外（i)通過SEC-MALLS測量的分子量，和(i i)氧化程度來表征。
[0414] 2.3活化的肺炎鏈球菌血清型1(^多糖與0^197的綴合
[0415] 綴合反應由W下步驟組成：
[0416] a.與薦糖賦形劑混合，并冷凍干燥。
[0417] b.重建凍干的多糖和CRM197。
[041引C.將活化的多糖綴合于CRM197并加帽
[0419] d.純化綴合物。
[0420] a.與薦糖混合
[0421] 將活化的多糖與薦糖混合至每克活化的多糖25±2.5克薦糖的比率。隨后凍干瓶 裝的混合的混合物。在凍干后，將裝有凍干的活化的多糖的瓶子在-20±5°C下膽存。
[0422] b.凍干的活化的多糖和CRM197蛋白的重建
[0423] 在無水二甲基亞諷(DMS0)中重建凍干的活化的多糖。在多糖完全溶解后，將等量 的無水DMS0添加至計算的CRMi97 W進行重建。
[0424] C.將活化的多糖綴合于CRM197并加帽
[0425] 將重建的CRMi97(于DMS0中）于綴合反應容器中添加至重建的活化的多糖。多糖終 濃度為Ig/L。通過向反應混合物中添加1.2±0.1MEq的氯基棚氨化鋼來進行綴合。將反應在 23±2°C下溫育24±2小時。通過添力日2MEq棚氨化鋼來終止綴合反應。將加帽反應于23±2°C 溫育3 ±1小時。
[0426] 通過添加的棚氨化鋼來終止綴合反應。將此加帽反應在23 ±2°C進行3 ±1小 時。
[0427] d.綴合物的純化
[042引隨后將綴合物溶液稀釋至5x(按體積)冰冷的5mM班巧酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)中 并且使用5mM班巧酸鹽-0.9 %鹽水(P冊.0)進行20X滲濾。在完成初始滲濾后，將綴合物滲余 物轉移通過0.22μπι過濾器。用5mM班巧酸鹽/0.9%鹽水(pH 6)進一步稀釋綴合物，并在最終 的0.22μπι過濾步驟后，將其于2-8 °C下膽存。
[0429] 表2包含通過本發明的方法獲得的血清型10A多糖-CRM197綴合物的表征數據。具體 地，如實施例2中所公開的獲得表2中的綴合物4至6。
[0430] 相較于通過RAC-含水法產生的綴合物，通過RAC-DMS0法產生的血清型10A多糖- CRM197綴合物提供了更好的產率，并且在MW上表現出更好的批間一致性，W及顯著更低的游 離糖百分比水平和較高的載體蛋白（賴氨酸)修飾，如表2中顯示的。
[0431]
[0側實施例3:血清型33F多糖-CRMi97綴合物的制備
[0433] 3.1.分離的肺炎鏈球菌血清型33F多糖的制備
[0434] 如實施例1.1中公開的，獲得分離的血清型33F多糖。
[0435] 3.2.分離的肺炎鏈球菌血清型33F芙膜多糖的氧化
[0436] 將計算的體積的0.1M憐酸鐘緩沖液(pH 6.0)和注射用水(WFI)添加至多糖溶液W 獲得2g/L的多糖終濃度。必要時，將抑調整至大致6.0。隨后將稀釋的多糖冷卻至5±3°C。通 過添加0.1摩爾當量(MEq)的高艦酸鋼溶液起始氧化。氧化反應時間為在5 ± 3 °C約20小時。 通過在5 ±3 °C連續攬拌約1小時，用謹的的2,3-下二醇巧滅氧化反應。在達到祀反應時間 后，使用100K MWC0 Mi 11 ipore超濾盒濃縮活化的多糖。隨后針對40倍滲濾體積的WFI進行 滲濾。將純化的活化的多糖于5±3°C膽存。純化的活化的糖通過除其它W外（i)通過SEC- M化S測量的分子量和（i i)氧化程度來表征。
[0437] 3.3活化的肺炎鏈球菌血清型33。多糖與0^197的綴合
[0438] 使用實施例3.2中獲得的活化的33F多糖，通過與實施例1.3的方法類似的方法獲 得血清型33F多糖-CRM197綴合物。
[0439] 相較于通過RAC-含水法產生的綴合物，通過RAC-DMS0法產生的血清型33F多糖- CRM197綴合物提供更好的產率并且在0-乙酷基水平的保持上表現出更好的批間一致性W及 總體更低的游離糖百分比水平和較高的載體蛋白（賴氨酸)修飾，如表3中顯示的。
[0440]
[0441] L0Q =定量限
[04創實施例4:巧滅對活化的血清型22F和33F多糖的分子量的影響
[0443] 在4°C或22°C進行22F和33F多糖的活化。兩個溫度均給出相似的DO值。然而，由于 升高的溫度導致活化的多糖較快分解，從而降低活化的多糖的MW(如當例如比較圖4(22°C) 與圖5(4°C)時顯示的），4°C對于活化反應通常是優選的。另外，活化數據顯示在氧化后未反 應的NaI〇4的巧滅對于活化，尤其是對于使用較高量的NaI〇4的活化是必需步驟。圖6中顯示 的圖表明當將遞增濃度的高艦酸鹽用于活化時(具有巧滅)活化的33F多糖的MW是相對穩定 的，而當不使用巧滅步驟時，運樣的MW是高度可變的。在設置來獲得祀向的氧化程度的特定 條件下，當使用巧滅步驟時，活化的多糖的分子量是較少可變的。氧化后巧滅劑的添加幫助 保持活化的多糖的結構完整性，直至例如通過超濾和滲濾完成純化。
[0444] 實施例5:調理吞隧活性測定(0PA)
[0445] 可使用下述調整吞隧測定(0PA)評估通過本文公開的方法獲得的綴合物的免疫原 性。
[0446] 在第0周通過皮下途徑利用0.0(nyg、0.01yg或0.化g的測試綴合物免疫30只6-7周 齡雌性Swiss Webster小鼠的組。在第3周利用相同劑量的綴合物加強免疫小鼠，隨后在第4 周取血。對第4周血清樣品進行血清型特異性0PA。
[0447] 將經驗證的調整吞隧活性(0PA)測定用于測量鼠血清中的特異于肺炎鏈球菌血清 型10AJ2F或33F的功能性抗體。在測量芙膜多糖特異性免疫球蛋白調理細菌、觸發補體沉 積，從而促進吞隧作用和吞隧細胞對細菌的殺死的能力的測定反應中建立測試血清。OPA滴 度被定義為導致相對于無測試血清的對照孔細菌計數的50%減少的稀釋度倒數。從包含該 50 %殺死截斷值的兩個稀釋度內插0PA滴度。
[044引 0PA法基于Hu等，Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12(February(2)):287-95中描 述的方法并進行了 W下修飾。將測試血清進行2.5倍系列稀釋，并添加至微量滴定測定板。 將活的血清型10A、22F和33F祀細菌菌株添加至孔中，并在25°C(血清型22F)或37°C(血清型 10A和33F)下搖動板，進行30分鐘。將分化的化-60細胞(吞隧細胞)和幼兔血清(3至4周齡， ?61-1^>€€2@,12.5%的終濃度)添加至孔中，將板在37°(：搖動45分鐘(血清型22。和33尸)或 60分鐘(血清型10A)。為了終止反應，將80化的0.9%化C1添加至所有孔，混合，并將10化等 分部分轉移至含有20化L水的Multiscreen HTS HV過濾器板（Millipore⑩)的孔。將液體 在真空下過濾通過板，將15化L HySoy介質添加至每一個孔并過濾通過。隨后將過濾板在37 °C，5%C02溫育過夜，隨后用脫色溶液(Bio-Rad)進行固定。隨后用考馬斯藍對板進行染色， 并將其脫色一次。在Cellular Technology Limited(CTL)ImmunoSpot分泰f每t瘋上對集落 進行成像和計數。將原始集落計數用于繪制殺死曲線和計算OPA滴度。
[0449]在上述公開的0PA測定中測試如實施例1至3中所公開的獲得的血清型104多糖- CRM197綴合物、血清型22F多糖-CRM197綴合物和血清型33F多糖-CRM197綴合物，并發現其是免 疫原性的。
【主權項】
1. 一種用于制備活化的肺炎鏈球菌血清型l〇A、22F或33F莢膜多糖的方法，所述方法包 括以下步驟： (a) 將分離的血清型10A、22F或33F莢膜多糖與氧化劑反應;和 (b) 通過添加猝滅劑來猝滅氧化反應，從而導致活化的肺炎鏈球菌血清型10A、22F或 33F多糖。2. 權利要求1的方法，其中步驟(a)中的血清型IOA、22F或33F多糖的濃度在0.5mg/mL與 5mg/mL之間。3. 權利要求1或2的方法，其中在步驟(a)中將所述多糖與0.01至10摩爾當量、0.05至5 摩爾當量、0.1至1摩爾當量、0.5至1摩爾當量、0.7至0.8摩爾當量、0.01至0.2摩爾當量、 0.05至0.5摩爾當量、0.05至0.2摩爾當量、0.1至0.3摩爾當量的氧化劑反應。4. 權利要求1至3的任一項的方法，其中在步驟(a)中將所述多糖與0.05至0.3摩爾當量 的氧化劑反應。5. 權利要求1至4的任一項的方法，其中所述氧化劑為高碘酸鹽。6. 權利要求1至4的任一項的方法，其中所述氧化劑為偏高碘酸鈉。7. 權利要求1至6的任一項的方法，其中將步驟(a)中的反應溫度維持在TC與10 °C之 間。8. 權利要求1至7的任一項的方法，其中步驟(a)中的反應溫度為約°C或約5°C。9. 權利要求1至8的任一項的方法，其中步驟(a)的持續時間在約1小時與25小時之間。10. 權利要求1至9的任一項的方法，其中所述猝滅劑選自鄰二醇、1，2_氨基醇、氨基酸、 谷胱甘肽、亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、連二亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸 鹽或亞磷酸。11. 權利要求1至9的任一項的方法，其中所述猝滅劑為式(II)的化合物其中R1和R2各自獨立地選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。12. 權利要求1至9的任一項的方法，其中所述猝滅劑選自甘油、乙二醇、丙-1，2-二醇、 丁 _1，2-二醇或丁-2，3-二醇。13. 權利要求1至9的任一項的方法，其中所述猝滅劑為丁-2,3-二醇。14. 權利要求1至13的任一項的方法，其中通過添加0.1至10、0.5至5、0.5至3或0.5至2 摩爾當量的猝滅劑來猝滅氧化反應。15. 權利要求1至13的任一項的方法，其中通過添加0.5至2摩爾當量的猝滅劑來猝滅氧 化反應。16. 權利要求1至15的任一項的方法，其中將步驟(b)中的反應溫度維持在1°C與10 °C之 間。17. 權利要求1至16的任一項的方法，其中步驟(b)中的反應溫度為約4°C。18. 權利要求1至17的任一項的方法，其中步驟(b)的持續時間在0.5與2小時之間。19. 權利要求1至18的任一項的方法，其中在步驟(b)后純化所述活化的多糖。20. 權利要求1至19的任一項的方法，其中所述分離的多糖為分離的肺炎鏈球菌血清型 IOA多糖。21. 權利要求20的方法，其中通過包含以下步驟的方法獲得所述分離的肺炎鏈球菌血 清型IOA多糖： (a) 制備血清型IOA肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物； (b) 裂解所述發酵培養物中的細菌細胞;和 (c) 從所述發酵培養物純化血清型IOA多糖。22. -種活化的肺炎鏈球菌血清型IOA莢膜多糖，其通過權利要求1至21的任一項的方 法獲得。23. -種活化的肺炎鏈球菌血清型IOA莢膜多糖，其可通過權利要求1至21的任一項的 方法獲得。24. 權利要求22或23的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型IOA莢膜多糖，其中所述多糖 具有 50kDa 與 400kDa之間、50kDa 與 350kDa之間、50kDa 與 300kDa之間、50kDa 與 250kDa之間、 50kDa 與 200kDa 之間、IOOkDa 與 300kDa 之間、IOOkDa 與 250kDa 之間、或 IOOkDa 與 200kDa 之間 的分子量。25. 權利要求22或23的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型IOA莢膜多糖，其中所述多糖 具有50kDa與300kDa之間的分子量。26. 權利要求22或23的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型IOA莢膜多糖，其中所述多糖 具有I OOkDa與200kDa之間的分子量。27. 權利要求22至26的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型IOA莢膜多糖，其中所述多糖 具有5與20之間、5與15之間、8與14之間、8與12之間或9與11之間的氧化程度。28. 權利要求22至26的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型IOA莢膜多糖，其中所述多糖 具有9與11之間的氧化程度。29. 權利要求1至19的任一項的方法，其中所述分離的多糖為分離的肺炎鏈球菌血清型 22F多糖。30. 權利要求29的方法，其中通過包含以下步驟的方法獲得所述分離的肺炎鏈球菌血 清型22F多糖： (a) 制備血清型22F肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物； (b) 裂解所述發酵培養物中的細菌細胞； (c) 從所述發酵培養物純化血清型22F多糖;和 (d) 通過機械裁剪，優選通過高壓均化來裁剪所述血清型22F多糖。31. -種活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其通過權利要求1至19或29或30的任 一項的方法獲得。32. -種活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其可通過權利要求1至19或29或30的 任一項的方法獲得。33. 權利要求31或32的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其中所述多糖 具有 25kDa與 1000 kDa之間、IOOkDa與 1000 kDa之間、300kDa與 800kDa之間、300kDa 與 700kDa 之間、300kDa 與 600kDa 之間、400kDa 與 1000 kDa 之間、400kDa 與 800kDa 之間、400kDa 與 700kDa 之間或400kDa與600kDa之間的分子量。34. 權利要求31或32的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其中所述多糖 具有300kDa與800kDa之間的分子量。35. 權利要求31或32的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其中所述多糖 具有400kDa與600kDa之間的分子量。36. 權利要求31至35的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其中所述多糖 具有10與25之間、10與20之間、12與20之間或14與18之間的氧化程度。37. 權利要求31至35的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其中所述多糖 具有10與20之間的氧化程度。38. 權利要求31至37的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多糖，其中所述多糖 包含每mM血清型22F多糖至少0.6mM的醋酸鹽。39. 權利要求1至19的任一項的方法，其中所述分離的多糖是分離的肺炎鏈球菌血清型 33F多糖。40. 權利要求39的方法，其中所述分離的肺炎鏈球菌血清型33F多糖通過包含以下步驟 的方法獲得： (a) 制備血清型33F肺炎鏈球菌細菌細胞的發酵培養物； (b) 裂解所述發酵培養物中的細菌細胞； (c) 從發酵培養物純化血清型33F多糖;和 (d) 通過機械裁剪，優選通過高壓均化來裁剪所述血清型33F多糖。41. 一種活化的肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多糖，其通過權利要求1至19或39或40的任 一項的方法獲得。42. -種活化的肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多糖，其可通過權利要求1至19或39或40的 任一項的方法獲得。43. 權利要求39或40的活化的肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多糖，其中所述多糖具有 50kDa 與 1250kDa 之間、200kDa 與 1200kDa 之間、500kDa 與 1200kDa 之間、500kDa 與 1000 kDa 之 間、700kDa 與 1200kDa之間、800kDa 與 1200kDa之間、800kDa 與 IlOOkDa之間、900kDa 與 1200kDa之間或800kDa與I OOOkDa之間的分子量。44. 權利要求39或40的活化的肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多糖，其中所述多糖具有 500kDa與I OOOkDa之間的分子量。45. 權利要求39或40的活化的肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多糖，其中所述多糖具有 50kDa與400kDa之間的分子量。46. 權利要求41至45的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多糖，其中所述多糖 具有10與20之間的氧化程度。47. 權利要求41至34的任一項的活化的肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多糖，其中所述多糖 包含每mM血清型33F多糖至少0.7mM的醋酸鹽。48. 權利要求1至47的任一項的方法，其中在步驟(b)后冷凍干燥所述活化的多糖。49. 一種用于制備包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型10A、22F或33F多糖的 免疫原性綴合物的方法，所述方法包括步驟： (a)將通過或可通過權利要求1至19的任一項的方法獲得的活化的血清型10A、22F或 33F多糖與載體蛋白混合;和， (b) 將混合的活化的血清型10A、22F或33F多糖和載體蛋白與還原劑反應，以形成血清 型10A、22F或33F多糖:載體蛋白綴合物。50. 權利要求49的方法，所述方法還包括步驟： (c) 將所述血清型10A、22F或33F多糖:載體蛋白綴合物中的未反應的醛加帽。51. 權利要求49或50的方法，其中在DMSO中進行步驟(a)和(b)。52. 權利要求49或50的方法，其中在水溶液中進行步驟(a)和(b)。53. 權利要求49至52的任一項的方法，其中在步驟(a)后共同冷凍干燥所述活化的多糖 和蛋白質載體。54. 權利要求53的方法，其中在DMSO中進行步驟(b)。55. 權利要求53的方法，其中在水溶液中進行步驟(b)。56. 權利要求49至55的任一項的方法，其中步驟(b)中的活化的多糖的濃度在0. lmg/mL 與 I Omg/mL之間、0 · 5mg/mL 與 5mg/mL之間或0 · 5mg/mL 與 2mg/mL之間。57. 權利要求49至55的任一項的方法，其中步驟(b)中的活化的多糖的濃度在0.5mg/mL 與2mg/mL之間。58. 權利要求49至57的任一項的方法，其中活化的血清型10A、22F或33F多糖對載體蛋 白的初始比率在5:1與0.1:1之間、2:1與0.1:1之間、2:1與1:1之間、1.5:1與1:1之間、0.1:1 與1:1之間、0.3:1與1:1之間或0.6:1與1.2:1之間。59. 權利要求49至57的任一項的方法，其中活化的血清型10A、22F或33F多糖對載體蛋 白的初始比率在0.6:1與1.2:1之間。60. 權利要求49至59的任一項的方法，其中在步驟(b)中，將所述活化的多糖與0.5與 2.5摩爾當量之間的還原劑反應。61. 權利要求49至60的任一項的方法，其中所述還原劑為氰基硼氫化鈉。62. 權利要求49至61的任一項的方法，其中步驟(d)的持續時間在20小時與30小時之 間。63. 權利要求49至62的任一項的方法，其中將步驟d中的反應溫度維持在20 °C與26 °C之 間。64. 權利要求53的方法，其中通過添加約2摩爾當量的NaBH4來使未反應的醛加帽。65. 權利要求49至64的任一項的方法，其還包括純化所述多糖：載體蛋白綴合物的步 驟。66. 權利要求49至65的任一項的方法，其還包括通過切向流過濾和滲濾純化所述多糖： 載體蛋白綴合物的步驟。67. -種包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型IOA多糖的免疫原性綴合物，其 通過權利要求49至66的任一項的方法獲得。68. -種包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型IOA多糖的免疫原性綴合物，其 可通過權利要求49至66的任一項的方法獲得。69. 權利要求67或68的免疫原性綴合物，其中所述綴合物具有500kDa與15000kDa之間、 500kDa 與 1000 OkDa 之間、2000kDa 與 1000 OkDa 之間或 3000kDa 與 8000kDa 之間的分子量。70. 權利要求67或68的免疫原性綴合物，其中所述綴合物具有3000kDa與8000kDa之間 的分子量。71. 權利要求67至70的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物包含相較于血清型 IOA多糖的總量少于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%的游離血清型IOA多 糖。72. 權利要求67至70的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物包含相較于血清型 IOA多糖的總量少于約20%的游離血清型IOA多糖。73. 權利要求67至72的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物中的血清型IOA多糖 對載體蛋白的比率在0.5與3之間。74. 權利要求67至72的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物中的血清型IOA多糖 對載體蛋白的比率在0.8與1.4之間。75. 權利要求67至74的任一項的免疫原性綴合物，其中至少40%的所述免疫原性綴合 物具有在CL-4B柱中低于或等于0.3的Kd。76. 權利要求67至74的任一項的免疫原性綴合物，其中50 %與80 %之間的所述血清型 IOA免疫原性綴合物具有在CL-4B柱中低于或等于0.3的KcL77. 權利要求67至76的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物的綴合程 度在2與15之間、2與13之間、2與10之間、2與8之間、2與6之間、2與5之間、2與4之間、3與15之 間、3與13之間、3與10之間、3與8之間、3與6之間、3與5之間、3與4之間、5與15之間、5與10之 間、8與15之間、8與12之間、10與15之間或10與12之間。78. 權利要求67至76的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物的綴合程 度在6與8之間。79. -種包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型22F多糖的免疫原性綴合物，其 通過權利要求49至66的任一項的方法獲得。80. -種包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型22F多糖的免疫原性綴合物，其 可通過權利要求49至66的任一項的方法獲得。81. 權利要求79或80的免疫原性綴合物，其中所述綴合物包含每mM血清型22F多糖至少 0.5、0.6或0.711^的醋酸鹽。82. 權利要求79或80的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物中每mM血清型22F多 糖的醋酸鹽的mM數對分離的多糖中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.7。83. 權利要求79至82的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物中每mM血 清型22F多糖的醋酸鹽的mM數對活化的多糖中每mM血清型22F多糖的醋酸鹽的mM數的比率 為至少0.7。84. 權利要求79至83的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物具有400kDa與 15000kDa 之間、500kDa 與 1000 OkDa 之間、2000kDa 與 1000 OkDa 之間、3000kDa 與 8000kDa 之間 或3000kDa與5000kDa之間的分子量。85. 權利要求79至83的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物具有3000kDa與 5000kDa之間的分子量。86. 權利要求79至85的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物包含相較于血清型 22F多糖的總量少于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%的游離血清型22F多 糖。87. 權利要求79至83的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物包含相較于血清型 22F多糖的總量少于約20 %的游離血清型22F多糖。88. 權利要求79至87的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物中血清型22F多糖對 載體蛋白的比率在0.5與2之間。89. 權利要求79至87的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物中血清型22F多糖對 載體蛋白的比率在0.8與1.2之間。90. 權利要求79至89的任一項的免疫原性綴合物，其中至少40%的所述免疫原性綴合 物具有在CL-4B柱中低于或等于0.3的Kd。91. 權利要求79至89的任一項的免疫原性綴合物，其中50 %與80 %之間的所述血清型 22F免疫原性綴合物具有在CL-4B柱中低于或等于0.3的KcL92. 權利要求79至91的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物的綴合程 度在2與15之間、2與13之間、2與10之間、2與8之間、2與6之間、2與5之間、2與4之間、3與15之 間、3與13之間、3與10之間、3與8之間、3與6之間、3與5之間、3與4之間、4與7之間、5與15之 間、5與10之間、8與15之間、8與12之間、10與15之間或10與12之間。93. 權利要求79至91的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物的綴合程 度在4與7之間。94. 一種包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型33F多糖的免疫原性綴合物，其 通過權利要求49至66的任一項的方法獲得。95. -種包含共價連接于載體蛋白的肺炎鏈球菌血清型33F多糖的免疫原性綴合物，其 可通過權利要求49至66的任一項的方法獲得。96. 權利要求94或95的免疫原性綴合物，其中所述綴合物包含每mM血清型33F多糖至少 0.5mM、0.6mM或 0.7mM 的醋酸鹽。97. 權利要求94或95的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物中每mM血清型33F多 糖的醋酸鹽的mM數對分離的多糖中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數的比率為至少0.7。98. 權利要求94至97的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物中每mM血 清型33F多糖的醋酸鹽的mM數對活化的多糖中每mM血清型33F多糖的醋酸鹽的mM數的比率 為至少0.7。99. 權利要求94至98的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物具有500kDa與 30000kDa 之間、500kDa 與 25000kDa 之間、500kDa 與 20000kDa 之間、500kDa 與 15000kDa 之間、 500kDa與 1000 OkDa之間、1000 kDa與 1000 OkDa之間、1000 kDa與8000kDa之間、1000 kDa與 5000kDa 之間、2000kDa 與 1000 OkDa 之間、2000kDa 與 8000kDa 之間或 2000kDa 與 5000kDa 之間 的分子量。100. 權利要求94至98的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物具有1000 kDa與 5000kDa之間的分子量。101. 權利要求94至100的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物含有相較于血清 型33F多糖的總量少于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%的游離血清型33F 多糖。102. 權利要求94至100的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物包含相較于血清 型22F多糖的總量少于約20 %的游離血清型22F多糖。103. 權利要求94至102的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物中血清型33F多糖 對載體蛋白的比率在0.5與2之間。104. 權利要求94至102的任一項的免疫原性綴合物，其中所述綴合物中血清型22F多糖 對載體蛋白的比率在0.5與1.5之間。105. 權利要求94至104的任一項的免疫原性綴合物，其中至少40%的所述免疫原性綴 合物具有在CL-4B柱中低于或等于0.3的Kd。106. 權利要求94至104的任一項的免疫原性綴合物，其中40 %與80 %之間的所述血清 型33F免疫原性綴合物具有在CL-4B柱中低于或等于0.3的KcL107. 權利要求94至106的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物的綴合 程度在2與15之間、2與13之間、2與10之間、2與8之間、2與6之間、2與5之間、2與4之間、3與15 之間、3與13之間、3與10之間、3與8之間、3與6之間、3與5之間、3與4之間、5與15之間、5與10 之間、8與15之間、8與12之間、10與15之間或10與12之間。108. 權利要求94至106的任一項的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物的綴合 程度在4與6之間。109. 權利要求67至108的任一項的免疫原性綴合物，其中所述載體蛋白為CRM197。110. 權利要求49至66的任一項的方法，其中所述載體蛋白為CRM197。111. 權利要求49至66的任一項的方法，其中所述活化的多糖為血清型10A。112. 權利要求49至66的任一項的方法，其中所述活化的多糖為血清型22F。113. 權利要求49至66的任一項的方法，其中所述活化的多糖為血清型33F。114. 權利要求49至66和110至113的任一項的方法，其中所述方法還包括在多價疫苗中 配制所述綴合物的步驟。115. -種免疫原性組合物，其包含權利要求67至109的任一項的免疫原性綴合物和生 理上可接受的媒介物。116. 權利要求115的免疫原性組合物，其還包含至少一種另外的抗原。117. 權利要求115或116的免疫原性組合物，其還包含佐劑。118. 權利要求117的免疫原性組合物，其中所述佐劑為磷酸鋁。119. 一種疫苗，其包含權利要求115至118的任一項的免疫原性組合物。120. -種治療或預防受試者的與血清型10A、22F或33F肺炎鏈球菌相關的肺炎鏈球菌 感染、疾病或病況的方法，所述方法包括施用治療或預防有效量的權利要求115至118的任 一項的免疫原性組合物或權利要求119的疫苗的步驟。
【文檔編號】A61P31/04GK105934251SQ201580005247
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年1月15日
【發明人】顧建新, R·K·凱因坦, 金進煥, A·K·普拉薩德, Y-Y·楊
【申請人】輝瑞大藥廠