治療腦內出血的組合物和方法

治療腦內出血的組合物和方法
【專利摘要】本公開提供了通過施用FXa變體治療或預防對象腦內出血(ICH)的組合物和方法。
【專利說明】治療腦內出血的組合物和方法
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2014年1月24日提交的美國臨時申請號61/931,071的權益，其內容通 過引用全文納入本文。
[0003] 參考序列表
[0004] 根據37CF巧1.821與本文同步提交的序列表通過引用納入本文，所述序列表采用 計算機可讀形式(CRF)，通過EFS-Web提交，文件名為PC072056A_沈化IST_ST25.txt。序列表 的電子拷貝在2015年1月6日創建，文件大小為7千字節。
【背景技術】
[0005] 需要有效療法W控制一系列臨床病癥中的出血過多，所述病癥中無法通過手術干 預或其它方式控制出血。設及不可控出血的最具破壞性的臨床綜合征之一是腦內出血 (ICH)。非創傷性ICH是出血進入腦實質，其可延伸到腦室中。全球至少10%的中風病例由 ICH引起。估計美國每年受影響的個體數目范圍為37,000-52,400到多至79,500(911'63^ 等，N Engl J Med 344(19):1450-1460(2001);Roger等，Circulation 125:e2-220 (2012))，且預期發生率隨著群體年齡而增加。ICH繼續與不良臨床結果相關。約40-50%的 患者在1個月內死亡（如reshi ;&rode;rick等，Stroke 38:2001-2023(2007))，且一大部分受 影響個體無法在6個月中再獲得功能性獨立(Broderick)。因此，ICH是永久部分或完全殘疾 的重要原因。
[0006] 腦內出血后的血腫體積顯示是ICH患者死亡率和發病率的獨立預測指標 (Broderick等，Stroke 24:987-993( 1993))。在約26%的腦內出血患者中于基線CT掃描1小 時內發生血腫體積增大(Brott等，S化oke 28:1-5( 1997))且血腫擴大是死亡率和不良患者 結果的另外的獨立預測指標(Davis等，Neurology 66 :1175-1181(2006) ;Delcou;rt等， Neurology 79:314-319(2012))〇
[0007] 目前沒有批準的療法用于治療ICH，日常管理在很大程度上是支持性的(Rincon和 Mayer，Critical Care 12:237-250(2008))。例如，施用重組凝血因子Vila可減少ICH患者 中的血腫擴大，但90天時未提高的神經功能(Mayer等，肥JM 358:2127-2137(2008))。因此， 為降低死亡率和改善神經功能性結果，本領域迫切需要有效療法W在敏感患者中預防ICH 和治療ICH患者。

【發明內容】

[000引申請者如下針對此未滿足的關鍵臨床需求，提供預防和/或治療ICH的組合物和方 法，包括用于預防和/或治療ICH的組合物。本發明的特定非限制性實施方式示于W下段落。
[0009]根據某些實施方式，本公開提供治療對象腦內出血(ICH)的方法，通過給對象施用 治療有效量的因子Xa(FXa)變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235或236對應的氨基酸位置處的 至少一個取代突變。還提供FXa變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235和/或236對應的氨基酸位 置處的至少一個取代突變，用于治療對象腦內出血(ICH)。在一些實施方式中，與235位對應 的位置處的取代可W用化r、Leu、化e、Asp或Gly。在其它實施方式中，與236位對應的位置處 的取代可W用Leu、Ala或Gly。
[0010] 根據某些實施方式，本公開提供方法降低具有ICH的對象由于ICH導致死亡的可能 性，通過給對象施用治療有效量的因子Xa(FXa)變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235或236對 應的氨基酸位置處的至少一個取代突變。在一些實施方式中，與235位對應的位置處的取代 可W用化'、1^611、？}16、439或617。在其它實施方式中，與236位對應的位置處的取代可^用 Leu、Ala或Gly。
[0011] 根據某些實施方式，本公開提供在對象患有ICH后提高對象的腦功能的方法，通過 給對象施用治療有效量的因子Xa(FXa)變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235或236對應的氨基 酸位置處的至少一個取代突變。在一些實施方式中，與235位對應的位置處的取代可W用 化'、1^611、？}16、439或617。在其它實施方式中，與236位對應的位置處的取代可^用1^611、八1曰 或Gly。根據一些實施方式，腦功能提高與降低對象中由ICH所導致煩內壓增高相關，降低到 或低于80mm Hg、70mm Hg、60mm Hg、50mm Hg、40mm Hg、30mm Hg、20mm Hg或 10mm Hg壓力。在 其它實施方式中，腦功能提高與維持腦灌注壓(CPP)相關，維持在或高于40mm Hg、50mm Hg、 60mm Hg、70mm Hg、80mm Hg、90mm Hg、100mm Hg、110、mm Hg或 120mm Hg壓力。在其它實施方 式中，腦功能提高與維持腦組織氧分壓(Pbt02)相關，維持在或高于6mm化、8mm Hg、10mm Hg、12mm Hg、14mm Hg、16mm Hg、18mm Hg、20、mm Hg、22mm Hg或24mm Hg壓力。在其它實施方 式中，腦功能提高與降低乳酸和丙酬酸濃度之比(LAR)相關，降低到或低于60、50、40、30或 20。在其它實施方式中，腦功能提高與降低腦血管壓力反應指數(PRx)相關，降低到或低于 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.0、-0.1、-0.2或-〇.3。
[0012] 根據某些實施方式，本公開提供在對象患有ICH后減少對象的神經功能缺損的方 法，通過給對象施用治療有效量的因子Xa(FXa)變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235或236對 應的氨基酸位置處的至少一個取代突變。在一些實施方式中，與235位對應的位置處的取代 可W用化'、1^611、？}16、439或617。在其它實施方式中，與236位對應的位置處的取代可^用 Leu、Ala或Gly。根據一些實施方式，減少的神經功能缺損用格拉斯哥昏迷評分評價，并且作 為治療結果，對象的得分提高，從3到4或更高，從4到5或更高，從5到6或更高，從6到7或更 高，從7至化或更高，從8到9或更高，從9到10或更高，從10到11或更高，從11到12或更高，從12 到13或更高，從13到14或更高，或從14到15。在其它實施方式中，神經功能缺損用格拉斯哥 預后評分擴展版評價，并且作為治療結果，所治療對象的平均得分提高到1或更佳，2或更 佳，3或更佳，4或更佳，5或更佳，6或更佳，7或更佳，或8。在其它實施方式中，神經功能缺損 用己氏量表評價，并且作為治療結果，所治療對象的平均得分提高到10或更佳，20或更佳， 30或更佳，40或更佳，50或更佳，60或更佳，70或更佳，或80或更佳，或90或更佳。在其它實施 方式中，神經功能缺損用NIH卒中量表評價，并且作為治療結果，所治療對象的平均得分降 低，從42到41或更少，從41到40或更少，從40到39或更少，從39到38或更少，從38到37或更 少，從37到36或更少，從36到35或更少，從35到34或更少，從34到33或更少，從33到32或更 少，從32到31或更少，從31到30或更少，從30到29或更少，從29到28或更少，從28到27或更 少，從27到26或更少，從26到25或更少，從25到24或更少，從24到23或更少，從23到22或更 少，從22到21或更少，從21到20或更少，從20到19或更少，從19到18或更少，從18到17或更 少，從17到16或更少，從16到15或更少，從15到14或更少，從14到13或更少，從13到12或更 少，從12到11或更少，從11到10或更少，從10到9或更少，從9到8或更少，從8到7或更少，從7 至化或更少，從巧化或更少，從?5到4或更少，從巧Ij3或更少，從：3到2或更少，從巧Ijl或更少，或 從1到0。在其它實施方式中，神經功能缺損用改良的蘭金量表評價，并且作為治療結果，所 治療對象的平均得分從約5-6降低到約4-5,從約4-5降低到約3-4,從約3-4降低到約2-3,從 約2-3降低到約1-2,或從約1-2降低到約0-1。在其它實施方式中，神經功能缺損用改良的蘭 金量表評價，并且作為治療結果，改良的蘭金量表評分為5或6的所治療對象比例相較于評 分為0、1、2、3或4的那些降低。在其它實施方式中，神經功能缺損用改良的蘭金量表評價，并 且作為治療結果，改良的蘭金量表評分為4、5或6的所治療對象比例相較于評分為0、1、2或3 的那些降低。
[0013] 根據某些實施方式，本公開提供在對象患有ICH后減少對象出血灶周圍水腫(P肥） 的方法，通過給對象施用治療有效量的因子Xa(FXa)變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235或 236對應的氨基酸位置處的至少一個取代突變。在一些實施方式中，與235位對應的位置處 的取代可W用化'、1^611、？}16、439或617。在其它實施方式中，與236位對應的位置處的取代可 W用Leu、Ala或Gly。根據某些實施方式，治療使具有ICH的對象的平均P皿體積相較于未治 療對照減少至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在其它實施方式中，治療使具有ICH的對象中P肥 所導致的煩內壓平均增加相較于未治療對照減少至少約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、 35%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%'80%'85%'90%或95%。
[0014] 根據某些實施方式，本公開提供在對象患有ICH后減少或防止對象血腫體積增大 的方法，通過給對象施用治療有效量的因子Xa(FXa)變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235或 236對應的氨基酸位置處的至少一個取代突變。在一些實施方式中，與235位對應的位置處 的取代可W用化'、1^611、？}16、439或617。在其它實施方式中，與236位對應的位置處的取代可 W用Leu、Ala或Gly。根據某些實施方式，治療使具有ICH的對象的平均血腫體積增大相較于 未治療對照減少至少約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在其它實施方式中，治療使對象的平均血 腫體積增大相較于未治療對照減少至少約1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、 5ml、5.5ml、6ml、6.5ml、7ml、7.5ml、8ml、8.5ml、9ml、9.5ml、10ml、10.5ml、11ml、11.5ml、 12ml、12.5ml、13ml、13.5ml、14ml、14.5ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、22ml、24ml、 26ml、28ml、30ml、35ml、40ml、45ml或50ml。在其它實施方式中，治療使血腫體積增大3ml或 更多、6ml或更多，或12.5ml或更多的對象比例相較于未治療對照減少至少約5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90 %或95 %。在其它實施方式中，治療使血腫體積增大15%、20%、25%、30%或33%或更多 的對象比例相較于未治療對照減少至少約5 %、10 %、15 %、20%、25%、30 %、35 %、40 %、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在其它實施方式中，治療 使治療后斑點征評分為4、3、2或1的對象比例相較于未治療對照減少至少約5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%或95%。在其它實施方式中，斑點征評分在首次施用FXa變體后30分鐘、45分鐘、60分 鐘、75分鐘、90分鐘、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9 小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、30小時、48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8 天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、18天、3周或4周測定。
[00巧]根據本公開的其它實施方式，提供因子Xa(FXa)變體，其包括與SEQ ID NO: 1中235 和/或236對應的氨基酸位置處的至少一個取代突變，用于治療對象腦內出血（ICH)，提高具 有ICH的對象的腦功能，用于減少具有ICH的對象的神經功能缺損，用于減少具有ICH的對象 出血灶周圍水腫(PHE)，或用于減少或防止具有ICH的對象的血腫體積增大。在一些實施方 式中，與235位對應的位置處的取代可W用化'、1^611、口}16、43口或617。在其它實施方式中，與 236位對應的位置處的取代可W用Leu、Ala或Gly。
[0016] 并且根據其它實施方式，任何先前實施方式的特征在于，腦內出血在腦的大腦、額 葉、頂葉、枕葉、顛葉、小腦、腦干、中腦、腦橋、髓質、腦下垂體、下丘腦、丘腦、海馬體、杏仁 核、屏狀核或基底神經節中發生。
[0017] 附圖簡要說明
[0018] 圖1A顯示凝血酶生成試驗(TGA)結果，測試加入不同濃度活化的因子X變體FXaiisL 對正常人血漿樣品中開始凝血后產生的凝血酶量的影響。在60分鐘實驗時程中，相較于僅 用載劑處理的血漿，加入FXaiis叫I起凝血酶生成的劑量依賴性增加。
[0019] 圖1B顯示凝血酶生成試驗（TGA)結果，測試加入不同濃度血漿源性活化的因子X pdFXa對正常人血漿樣品中開始凝血后產生的凝血酶量的影響。在60分鐘實驗時程中，相較 于僅用載劑處理的血漿，加入pdFXa引起凝血酶生成的劑量依賴性增加。
[0020] 圖1C顯示從圖1A和圖1B所描述的實驗的數據計算的凝血起始期的滯后時間。相較 于僅用載劑處理的人血漿，pdFXa和FXaiisL都縮短滯后時間，盡管經FXaiisL處理的血漿的滯 后時間長于經pdFXa處理的血漿。
[0021] 圖2A顯示用漸增濃度的FXaiisL預處理對非血友病小鼠尾切斷后失血的影響。相較 于僅用載劑處理的小鼠，尾切斷前的FXaiisL處理引起總失血的劑量依賴性減少。
[0022] 圖2B顯示用漸增濃度的FXaiisL預處理對非血友病大鼠尾切斷后失血的影響。相較 于僅用載劑處理的大鼠，尾切斷前的FXaiisL處理引起總失血的劑量依賴性減少。
[0023] 圖3A顯示用漸增濃度的FXaiisL處理對實驗操作成產生腦內出血的小鼠血腫體積 的影響，所述小鼠作為ICH動物模型。相較于僅用載劑處理的小鼠，在實驗誘導出血進入腦 組織后的FXaiisL處理引起血腫體積的劑量依賴性減少。
[0024] 圖3B顯示相較于載劑的血腫體積減少百分比，與基于圖3A數據的劑量相關。
[0025] 圖4A顯示用漸增濃度的FXaiisL處理對實驗操作成產生腦內出血的大鼠血腫體積 的影響，所述大鼠作為ICH動物模型。相較于僅用載劑處理的大鼠，在實驗誘導出血進入腦 組織后的FXaiisL處理引起血腫體積的劑量依賴性減少。
[0026] 圖4B顯示相較于載劑的血腫體積減少百分比，與基于圖4A數據的劑量相關。
[0027] 圖5是野生型人因子X前蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)。信號膚對應于氨基酸 1-23。前膚對應于氨基酸24-40。活化的因子X(FXa)的成熟輕鏈對應于氨基酸41-179。活化 的FXa(移除激活膚后）的成熟重鏈對應于氨基酸235-488。激活膚(AP)對應于氨基酸183- 2：34。
[00%]圖6是編碼野生型人因子X前蛋白的cDNA的核巧酸序列（SEQ ID N0:2)。編碼序列 對應于核巧酸58-1524。
[0029] 發明詳述
[0030]先前證明有酶原性質的凝血因子Xa變體有效抑制血友病動物中的不受控出血。然 而，尚未知曉或預測此變體是否能在凝血系統完整的動物中有效停止不受控出血。申請者 已證明此變體在非血友病動物中是有效促凝血劑且還能減少腦內出血非血友病動物模型 中的血腫擴大。根據運些新研究，預期本公開的FXa變體和含運些變體的組合物可用于治療 和預防非血友病對象的ICH的方法中，所述對象包括人和非人動物。相較于未治療對照，用 FXa變體治療ICH對象能改善對象的生活質量和神經系統功能并降低ICH所導致癥狀和損傷 的嚴重性。用本公開的FXa變體和組合物治療和預防ICH的方法如下進一步詳細描述。
[00川因子Xa和其變體
[0032] 凝血因子X(FX)是酶原，其在由內在的因子IX/因子VIII或外源途徑(組織因子/因 子VI la)激活后變成FXa,運是凝血酶原酶的蛋白酶部分。蛋白酶切Arg-Ile剪切鍵 (scissile bond)后，釋放激活膚(AP)，一系列明確的酶原結構變化推動向成熟活性絲氨酸 蛋白酶的激活過程(參見Toso等，（2008) J. Biol. Chem. 283,18627-18635 ;Bunce等，（2011) Blood 117,290-298;和Ivanciu等，（2011)化t.Biotechnol.29,1028-1033,通過引用全文 納入本文）。成熟FXa具有輕鏈和含催化結構域的重鏈。成熟FXa在凝血酶原酶復合物形成后 變成活性絲氨酸蛋白酶，其包括結合活化輔因子即因子Va(FVa)。
[0033] 開發出FX變體形式，其在激活切割后產生酶原樣FXa變體。即一旦切割，所得FXa變 體有弱活性位點功能且更抗循環抑制劑（即抗凝血酶III和TFPI)引起的失活。因此，FXa變 體在血漿中的半衰期長于野生型FXa JXa變體結合FVa、脂膜和巧W形成有效激活凝血酶原 的完全活性凝血酶原酶復合物。
[0034] 酶原樣FXa變體在酶原樣構象中循環，似乎不致血栓（參見Toso等，（2008) J.Biol.Chem.283,18627-18635和Ivanciu等，（2011 )Nat.Biotechnol.29,1028-1033,通過 引用全文納入本文）。運類FXa變體示例描述于國際專利公開W02007/059513,所述專利通過 引用全文納入本文。
[0035] 凝血的酶是膜蛋白酶樣酶，屬于攜帶膜凝乳蛋白酶樣折疊的蛋白酶的S1膚酶家 族。凝血蛋白酶包含催化結構域，彼此之間且與消化的祖絲氨酸蛋白酶高度同源。結構同源 性/相同性很大(>70%)從而凝血酶(包括因子Xa)的催化結構域中的殘基根據膜凝乳蛋白 酶原的對應殘基編號。（化ymo trypsin numbering system;參見 Baja j和Birktoft,Methods Enzymol. 1993;222:96-128,Table 2,和Bode W,Mayr I,Bauman Y等，The refinedl..9.A crystal structure of human alpha-thrombin:interaction with D-Phe-Pro-Arg chloromethyIketone and significance of the Tyr-Pro-Trp insertion segment.EMBO J 1989:8(11) :3467-3475),兩者都通過引用全文納入本文）。因此，在本文中氨基酸可W指 的是本領域技術人員熟知的膜凝乳蛋白酶編號系統。
[0036] 根據本公開，FXa變體可W是含氨基酸取代的FXa蛋白，所述取代使變體相較于野 生型FXa蛋白在體內或體外更像酶原。本公開的FXa變體在凝血酶原酶形成后基本恢復野生 型FXa活性。用于本公開方法的FXa變體示例是含選自下組修飾的變體:a)16位的lie是化r、 1611、？]16、439或617和13)17位的化1是1^611、41曰或617，根據膜凝乳蛋白酶編號系統。膜凝乳蛋 白酶編號系統中的氨基酸16和17分別在SEQ ID NO: 1(人因子X前原蛋白）的氨基酸235和 236處出現。在某些實施方式中，FXa變體是FXaiis哺FXaiisT(本文用于FXa變體的命名法列舉 了膜凝乳蛋白酶編號系統所述編號位置處的初始氨基酸，然后是取代的氨基酸KFXa變體 可W是任何哺乳動物FXa的變體。然而，尤其對人FXa的FXa變體感興趣。
[0037]在某些實施方式中，活化成本公開變體FXa的FX變體可通過插入非天然胞內蛋白 酶切位點來進一步修飾。在一個非限制性示例中，為在哺乳動物細胞中表達"活化"酶原樣 FXa變體，非天然胞內蛋白酶切位點能插入變體FX酶原中SEQ ID NO: 1的234位(膜凝乳蛋白 酶編號系統的15位)處的Arg與SEQ ID NO: 1的235位(膜凝乳蛋白酶編號系統的16位)處的 氨基酸之間。在某些實施方式中，非天然胞內蛋白酶切位點是Arg-Lys-Arg A巧-Lys-Arg(SEQ ID NO: 3)。運些切割位點由細胞內的蛋白酶(PACE/弗林蛋白酶樣酶)有 效識別并移除。此切割可產生經加工的變體FXa,其中成熟的分子重鏈目前開始于位置對應 于SEQ ID NO: 1 235位(膜凝乳蛋白酶編號系統的16位）的氨基酸。在所述位置引入此切割 位點允許FX胞內轉變成FXa。
[003引在某些實施方式中，FX變體激活膚(AP)的完整氨基酸序列（即SEQ ID NO: 1的氨基 酸183-234)被非天然胞內蛋白酶切位點取代。根據某些實施方式，非天然胞內蛋白酶切位 點是Arg-Lys-Arg或Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(沈Q ID NO: 3)。如上所解釋，此修飾允許胞 內切割細胞表達的FX變體。胞內切割將FX變體轉變成活化的酶原樣FXa變體，其隨后由細胞 分泌用于后續純化。另外需要胞外切割W激活變體凝血因子，例如在分離蛋白后或臨凝血 前，此方法避免了對胞外切割的需求。
[0039] 在某些實施方式中，本公開的FXa變體衍生自FX變體前蛋白，包含天然野生型人信 號序列和/或前膚序列。在其它實施方式中，來自非人物種的FX信號序列和/或前膚能用于 取代對應的天然氨基酸序列。在其它實施方式中，來自其它人或非人分泌蛋白的信號序列 和/或前膚序列能用于取代對應的天然氨基酸序列。
[0040] 在一個示范性實施方式中，FXa變體包括SEQ ID NO: 1的氨基酸41-179和氨基酸 235-488,其中235位的氨基酸(野生型序列中的異亮氨酸）用選自下組的不同氨基酸取代： 蘇氨酸(了虹）、亮氨酸化eu)、苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)或甘氨酸(Gly)。運些取代能分 別用命名12351\1235^1235。、12350和12356書寫，其中首字母是異亮氨酸的單字母代碼且 最后的字母是取代成野生型序列的氨基酸的單字母代碼。由于SEQ ID N0:1的235位等同于 膜凝乳蛋白酶編號系統的16位，相同取代能用1161\116^116。、1160和1166書寫。在一個實 施方式中，FXa變體包括SEQ ID NO: 1的氨基酸41-179和氨基酸235-488,其中235位的氨基 酸用化r取代（即I235T或I16T)。在一個實施方式中，FXa變體包括SEQ ID N0:1的氨基酸41- 179和氨基酸235-488,其中235位的氨基酸用Leu取代（即123化或II化）。在一個實施方式 中，FXa變體包括SEQ ID NO: 1的氨基酸41-179和氨基酸235-488,其中235位的氨基酸用陸e 取代（即I235F或I16F)。在一個實施方式中，FXa變體包括SEQ ID NO: 1的氨基酸41-179和氨 基酸235-488,其中235位的氨基酸用Asp取代（即123加或II抓）。在一個實施方式中，FXa變 體包括SEQ ID NO: 1的氨基酸41-179和氨基酸235-488,其中235位的氨基酸用Gly取代（即 I235G或I16G)。
[0041] 根據另一示范性實施方式，FXa變體包括SEQ ID NO: 1的氨基酸41-179和氨基酸 235-488,其中236位的氨基酸(野生型序列中的鄉氨酸）用選自下組的不同氨基酸取代：亮 氨酸化eu)、丙氨酸(Ala)或甘氨酸(Gly)。運些取代能分別用命名V236UV236A和V236G書 寫，其中首字母是鄉氨酸的單字母代碼且最后的字母是取代成野生型序列的氨基酸的單字 母代碼。由于SEQ ID N0:1的236位等同于膜凝乳蛋白酶編號系統的17位，相同取代能用 V17L、V17A和V17G書寫。在一個實施方式中，FXa變體包括SEQ ID N0:1的氨基酸41-179和氨 基酸235-488,其中236位的氨基酸用Leu取代（即V23化或VI化）。在一個實施方式中，FXa變 體包括SEQ ID NO: 1的氨基酸41-179和氨基酸235-488,其中236位的氨基酸用Ala取代（即 V236A或V17A)。在一個實施方式中，FXa變體包括SEQ ID N0:1的氨基酸41-179和氨基酸 235-488，其中236位的氨基酸用Gly取代（即V236G或V17G)。
[0042] 在其它實施方式中，包括前面段落所述特定變體在內的本公開FXa變體可包含蛋 白質輕鏈和/或成熟重鏈的各種同種型。FXa變體成熟重鏈的非限制性示范性同種型包括α 和β形式的成熟重鏈。Jesty等J Biol Chem.1975年6月25日；250(12):4497-504,通過引用 納入本文。本公開的組合物可包括FXa變體蛋白，其中表示α和β成熟重鏈同種型之一或另一 個或兩者。
[0043] 根據其它實施方式，包括前面段落所述特定變體在內的FXa變體蛋白同種型可包 括其中從蛋白輕鏈和/或成熟重鏈的簇基末端缺失或在所述簇基末端添加不同數量的氨基 酸(例如1、2、3、4、5、6或更多個氨基酸)的同種型。
[0044] 根據某些實施方式，相較于SEQ ID NO: 1野生型FXa的氨基酸序列，本公開的FXa變 體包括具有最低程度同源性或序列相同性的蛋白。因此，例如，FXa變體包括含輕鏈和成熟 重鏈的蛋白質，其與SEQ ID NO: 1中野生型FXa輕和成熟重鏈的序列有至少60%、70%、 80 %、85%、90 %、95%、98 %或99 %同源性或相同性，其中運種FXa變體還包括在對應于SEQ ID NO: 1的235位的氨基酸位置處用化r、Leu、化e、Asp或Gly的取代，或在對應于沈Q ID NO: 1 236位的氨基酸位置處用Leu、Ala或Gly的取代，并且其中運類FXa變體是酶原性的，直至 納入凝血酶原酶復合物。在SEQ ID NO: 1氨基酸序列中，野生型FXa輕鏈序列對應于氨基酸 41-179且野生型FXa成熟重鏈序列對應于氨基酸235-488。氨基酸序列同源性或相同性百分 比可W容易地用軟件如Protein BLAST測定，所述軟件可獲自國家生物技術信息中屯、網站 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
[0045] 根據其它非限制性實施方式，本公開的FXa變體還能包括含一個或多個翻譯后修 飾的FXa變體，包括但不限于一個或多個0-連接或N-連接碳水化合物基團或可變數量的丫- 簇基谷氨酸(Gla)殘基。本公開的FXa變體還能包括化學修飾的FXa變體蛋白。用于本公開方 法的其它FXa變體也可行。
[0046] 本文所用的術語FXaiisx指活化的因子X的變體，其中對應于SEQ ID N0:1的235位 (膜凝乳蛋白酶編號系統的16位)的氨基酸從野生型序列的氨基酸（異亮氨酸)變成表示為 V'的不同氨基酸。在一些非限制性示范性實施方式中，氨基酸V'可W是蘇氨酸(Thr或T)、 亮氨酸化eu或L)、苯丙氨酸(Phe或巧、天冬氨酸(Asp或D)或甘氨酸(Gly或G)。
[0047] 本文所用的術語FXaV"y指活化因子X的變體，其中對應于SEQ ID N0:1的236位(膜 凝乳蛋白酶編號系統的17位）的氨基酸從野生型序列的氨基酸(鄉氨酸)變成表示為"y"的 不同氨基酸。在一些非限制性示范性實施方式中，氨基酸V'可W是亮氨酸化eu或L)、丙氨 酸(Ala或A)或甘氨酸(Gly或G)。
[004引術語FXaiis嘴FXaV"y不受SEQ ID N0:1所列蛋白序列限制。相反，運些術語額外包 括本文所述多種同種型和同源蛋白，帶有膜凝乳蛋白酶編號系統中16或17位的指定取代突 變，其性能如同酶原，直至納入凝血酶原酶復合物。
[0049]本公開的FXa變體可通過任何表達蛋白質的技術來生成。
[0050] "分離的蛋白質"、"分離的多膚"或"分離的變體"是，由于其衍生的起源或來源， (1)不與天然狀態下伴隨其的天然相關組分相關，（2)沒有來自同一物種的任何蛋白，（3)由 來自不同物種的細胞表達，或(4)不天然出現的蛋白質、多膚或變體。因此，化學合成或在與 其天然來源的細胞不同的細胞系統中合成的多膚與其天然相關組分"分離"。蛋白質還可通 過使用本領域熟知的蛋白純化技術分離而基本沒有天然相關組分。
[0051] 當至少約60-75%的樣品顯示單一種類的多膚時，蛋白質或多膚是"基本純"、"基 本同源"或"基本純化"。所述多膚或蛋白可W單聚或多聚。基本純的多膚或蛋白質通常包括 約50 %、60 %、70 %、80 %或90 %W/W的蛋白質樣品，更通常地約95%，且可W超過99%純。蛋 白純度或均一性可通過本領域熟知的多種手段來指示，如蛋白質樣品的聚丙締酷胺凝膠電 泳，接著在用本領域熟知的染料染色凝膠后肉眼觀察單一多膚帶。對于某些目的，用HPLC或 本領域熟知的其它純化方式可提供更高的分辨率。
[0化2] 腦內出血
[0053] 腦內出血（ICH)是由腦中病變或受損血管破裂導致的中風形式，所述破裂引起出 血進入腦組織(實質）。腦損傷和隨之的神經功能缺損或死亡能通過不同機制引起。例如，認 為血液滲漏可減少由受影響血管供給的腦細胞氧合。還認為滯積血可導致水腫，最終形成 的血腫還能對周圍腦組織施加壓力。水腫和血腫能增加煩內壓。其它ICH導致腦損傷的機制 也可行。負責在ICH后或特定病例中導致腦損傷的特定一種或多種機制不意在W任何方式 限制本公開的實施方式。
[0054] ICH能在任何腦部分發生。可發生ICH或能受不同腦部分所發生ICH影響的示范性 腦區域包括但不限于大腦（包括額葉、頂葉、枕葉、顛葉）、小腦、腦干(包括中腦、腦橋、髓 質）、腦下垂體、下丘腦、丘腦、海馬體、杏仁核、屏狀核或基底神經節。
[0055] ICH能作為腦內動脈出血的結果發生。示范性腦動脈包括但不限于大腦前動脈 (ACA)、大腦中動脈(MCA)、大腦后動脈(PCA)、眼動脈、Willis環動脈、小腦后下動脈(PICA) 或豆紋動脈。
[0056] 盡管某些指示煩內壓增加的癥狀如頭痛、惡屯、、嘔吐和意識喪失，可表明存在ICH， 但最終診斷需要腦成像。腦成像(也稱為神經成像)技術為本領域普通技術人員熟知，包括 計算機斷層掃描(CT)、血管造影術、CT血管造影、磁共振成像(MRI)和MR血管造影。最終診斷 ICH的其它技術為本領域普通技術人員熟知。
[0057] 1C取受有缺血性卒中常見，后者由血栓引起的腦血管阻塞導致，但包括所有中風的 約12%。與缺血性卒中不同，ICH在出血開始后的前24小時尤其是當出血伴隨血腫擴大時， 更可能顯著惡化。如下進一步討論，血腫擴大與患者預后不良相關。
[0化引治療腦內出血（ICH)的方法
[0059] 本公開提供治療或預防ICH的方法，通過給需要ICH治療的對象施用治療有效量的 具酶原性質的FXa變體，例如FXa變體FXaiis^
[0060] 本文所用的術語"對象"指有腦和凝血系統的任何動物，所述腦能患有腦內出血， 所述凝血系統能用本公開的FXa變體激活。在一些實施方式中，所述動物是哺乳動物，例如 人和非人靈長類(如猿、猴、拂拂、黑猩猩），或其它哺乳動物如曬齒動物(如小鼠、大鼠）、牛、 馬、貓、狗、豬、兔、山羊、鹿、綿羊、雪貂、沙鼠、豚鼠、倉鼠和騙幅。根據本領域普通技術人員 的知識，其他動物也可行。
[0061] 在一些實施方式中，對象是非血友病哺乳動物，例如非血友病的人。在其它實施方 式中，對象有血友病，可包括血友病A、血友病B或其它血友病類型。
[0062] 本文所用的短語"治療有效量"指FXa變體(如FXaiisL)的量，其給具有ICH的對象施 用時使得所述對象由于ICH死亡的可能性降低，引起ICH所導致發病率下降，引起ICH所導致 神經功能缺損減少，或使對象在ICH后的功能、生活質量或病癥改善。治療有效量的FXa變體 能另外防止或降低ICH所導致血腫在出血開始或診斷ICH后的體積擴增程度，防止ICH所導 致出血灶周圍水腫體積增大或減少體積，或防止或降低可伴隨(attend) ICH的煩內壓增加。 治療有效量的FXa變體能另外延遲ICH所導致任何體征、癥狀、生理效應或神經功能缺損發 生，或緩解、減輕或減弱其嚴重性。治療有效量的FXa變體可根據諸如W下的因素而變化:待 用的特定FXa變體性質、疾病狀態、待治療對象的年齡、性別和體重W及FXa變體在對象中引 發所需反應的能力。治療有效量還是FXa變體的治療有益效果超過任何毒性或有害作用的 量。
[00創短語"預防有效量"指FXa變體的量，其給有一個或多個ICH風險因素的對象施用 時，降低對象患ICH的可能性或減少有類似風險譜的對象群體中ICH的發生率。
[0064] FXa變體的功效和有效量能根據對施用FXa變體的個體ICH對象的觀察來測定。FXa 變體的功效和有效量還能如下測定;根據本領域普通技術人員的知識，在確定ICH對象群體 中進行對照臨床研究。根據運類臨床研究結果，護理提供者能提前預測哪個可能是有效量 的FXa變體，然后施用新經歷且需要1C取臺療的對象。
[0065] 盡管是想要的，但對于功效存在，不要求完全預防或逆轉ICH的體征或癥狀(包括 例如血腫擴大）或者ICH所導致神經功能缺損。相反，如上所示，相較于沒有FXa變體治療時 可能出現的對象病癥，有效量的FXa變體僅需改善ICH對象病癥。
[0066] 減少ICH所導致死亡的方法
[0067] 據報道ICH所導致30天致死率范圍為40%-50%，約一半的死亡在發生后2天內出 現。ML Flaherty等，。腦內出血的流行病學（The epidemiology of intracerebral hemorrhage)"，收錄于《腦內出血Kinhacerebral Hemorrhage),JR (^irhuapoma等編（劍 橋:劍橋大學出版社(Cambridge化iversity Press) ,2010)，其通過引用全文納入本文。 [006引根據某些實施方式，給具有ICH的對象施用有效量FXa變體(如FXaiisL)能減少ICH 所導致死亡發生率(死亡率）。運能通過，例如，比較FXa變體在確定ICH對象群體中相較于未 治療對照群體降低死亡率的能力進行證明。在一些實施方式中，治療具有ICH的對象可使 ICH所導致死亡率從約40 %-50 %降低到約45 %、約40 %、約35 %、約30 %、約25 %、約20 %、 約15 %、約10%或更少。在一些其它實施方式中，相較于未用FXa變體治療的ICH對象的死亡 率，用FXa變體治療使ICH所導致死亡率降低約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多。死亡率可在1邸發 生后的任何時間測定。非限制性示范性的發生后時間包括1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、 10天、14天、15天、20天、21天、25天、28天、30天或更多。
[0069] ICH后提高腦功能的方法
[0070] 在本公開方法的實施方式中，施用有效量的FXa變體(如FXaiisL)可提高1邸對象的 腦功能。
[0071] 在一個實施方式中，提高的腦功能與減少ICH所導致的增高的煩內壓(ICP巧Ij低于 特定最高水平相關。例如，ICP能降低到等于或低于80mm Hg、70mm Hg、60mm Hg、50mm Hg、 40mm Hg、30mm Hg、20mm Hg、10mm Hg或更少的水平。通過使ICP減少到低于特定水平，ICH對 象死亡的可能性下降。監測ICP的方法為本領域普通技術人員熟知。S. -B.Κο等，Stroke 42: 3087-3092(2011)，通過引用納入。
[0072] 在另一個實施方式中，提高的腦功能與維持特定最小水平的腦灌注壓(CPP)相關。 例如，CPP能維持于等于或超過40mm Hg、50mm Hg、60mm Hg、70mm Hg、80mm Hg、90mm Hg、 100mm Hg、110、mm化、120mm化或更高的水平。通過維持足夠水平的CPP,ICH對象經歷腦代 謝危象或腦組織缺氧的可能性減少。足夠高的CPP還與ICH對象死亡率下降相關。監測CPP的 方法為本領域普通技術人員熟知。S. -B. Κο等，Stroke 42:3087-3092 (2011)。
[0073] 在另一個實施方式中，提高的腦功能與維持特定最小水平的腦組織氧分壓(Pbt〇2) 相關。例如，Pbt〇2能維持于等于或超過6mm Hg、8mm Hg、10mm Hg、12mm Hg、14mm Hg、16mm Hg、18mm Hg、20、mm Hg、22mm Hg、24mm Hg或更高的水平。通過維持足夠水平的Pbt〇2，ICH對 象經歷腦代謝危象或腦組織缺氧的可能性減少。足夠高的Pbt〇2還與ICH對象死亡率下降相 關。監測Pbt〇2的方法為本領域普通技術人員熟知。S . -B . Κο等，Stroke 42 : 3087-3092 (2011)。
[0074] 在另一個實施方式中，提高的腦功能與減少乳酸和丙酬酸濃度之比（LAR)到低于 特定水平相關。更高的比例指示厭氧代謝。例如，LAR能減少至等于或低于60、50、40、30、20 或更小的水平。通過使LAR減少到低于特定水平，ICH對象死亡的可能性下降。監測腦乳酸和 丙酬酸濃度的方法為本領域普通技術人員熟知。S. -B.Κο等，Stroke 42:3087-3092(2011)。
[0075] 在另一個實施方式中，提高的腦功能與降低腦血管壓力反應指數(PRx)相關，其計 算為平均煩內壓（ICP)與平均動脈血壓（MAP)之間的移動相關系數。C.Zweif el等， 化urosurg.Focus ,25(10) :E2(2008)，通過引用納入。例如，PRx能減少至等于或低于0.5、 0.4、0.3、0.2、0.1、0.0、-0.1、-0.2、-0.3或更小的水平。通過使?3^減少到低于特定水平， I邸對象死亡的可能性下降。監測ICH和MAP并能計算PRx的方法為本領域普通技術人員熟 知。S. -B. Κο等，Stroke 42:3087-3092 (2011)。
[0076] ICH后減少神經功能缺損的方法
[0077] 除了死亡，ICH對對象最顯著的影響是神經功能缺損，運通常嚴重，能破壞對象生 活質量和對象的家庭W及造成巨大的社會成本。其中，神經功能缺損能干擾或妨礙ICH對象 在無協助的情況下工作或進行普通的日常活動。通過用本公開的FXa變體治療或預防對象 的ICH，ICH所導致的神經功能缺損程度相較于沒有治療時同一對象或類似未治療對照對象 中會出現的缺損程度可降低。因此，根據本公開方法治療的1邸對象獨立工作或活動的能力 提局。
[0078] 神經功能缺損能用神經功能評估工具量化。運種評估工具包括格拉斯哥昏迷評分 (GCS)、格拉斯哥預后評分擴展版(G0S-E)、己氏量表(BI)、NIH卒中量表(NIHSS)和改良的蘭 金量表(mRS)。其它評估工具也能根據本領域普通技術人員的知識使用，包括EuroQol量表、 修訂的漢密爾頓抑郁量表等。
[0079] 格拉斯哥昏迷評分意在描述ICH或其它腦損傷后對象的意識水平。GCS得分為3- 15，3最差而15最佳。其由巧巾參數構成，包括最佳眼反應、最佳語言反應和最佳運動反應。對 于最佳眼反應，無睜眼=1;疼痛刺激睜眼=2;語言命令睜眼=3和自發睜眼=4。對于最佳 語言反應，無語言反應=1;無意義的聲音=2;不恰當的語言=3;混亂的=4和定向的=5。 對于最佳運動反應，無運動反應=1;疼痛刺激伸展=2;疼痛刺激屈曲=3;逃避疼痛=4;疼 痛定位=5和遵從指令= 6dGCS為13或更高與輕度腦損傷相關，9-12是中度損傷，8或更小是 重度腦損傷。
[0080]格拉斯哥預后評分(G0S)和其擴展版(G0S-E)意在描述ICH或其它腦損傷后對象恢 復如何。G0S有5個水平和相關評分，包括死亡=1;植物人狀態(對象活著但無響應）=2;重 度殘疾(對象有意識但由于殘疾而需要其他人的日常協助）=3;中度殘疾(對象獨立但殘 疾）=4和良好恢復(對象恢復大部分正常活動但可能有較小遺留問題）=5。
[0081 ]在擴展G0S或G0S-E中，評分系統擴展到8個水平，其中死亡=1;植物人狀態=2;低 級重度殘疾=3;高級重度殘疾=4;低級中度殘疾=5;高級中度殘疾=6;低級良好恢復=7 和局級良好恢復=8。
[0082]己氏量表(BI)是測量ICH或其它腦損傷后對象活動限制的等級量表。Mahoney F. 和Barthel DFunctional evaluation:the Barthel Index.,Md Med J.14:61-65 (1965)，通過引用納入。該量表由10個功能類別組成，包括攝食能力、洗澡能力、打扮能力、 穿衣能力、腸控制、膀脫控制、如廁、在床和椅子之間來回移動的能力、移動能力和使用樓梯 的能力。對象就完成各類別指定活動所需的協助量進行評分。隨后類別得分疊加 W產生總 活動分數。在不同版本的BI量表中，類別恒定，但分配給依賴程度的數值可變，從而最小和 最大總評分隨著所用版本而變化。例如，一些版本中，評分范圍是0-20,而其它版本中，評分 范圍是0-100,但在所有版本中，評分越高，對象獨立活動的能力越大。
[0083] NIH卒中量表(NIHSS)是15項的神經檢查卒中量表，用于評估ICH、中風或其它腦損 傷對意識、語言、疏忽、視野缺損、眼外運動、運動強度、共濟失調、構音障礙和感覺缺失水平 的影響。訓練有素的觀察者就對象回答問題和實施活動的能力分級。各項目分級用3-5級評 分，0作為正常。0分指示無中風癥狀，1-4分指示輕度中風，5-15分指示中度中風，16-20分指 示中度到重度中風，21-42分指示重度中風。
[0084] 改良的蘭金量表(mRS)測量ICH、中風或其它腦損傷后對象殘疾或日常活動依賴性 的程度。得分范圍是0-6,其中0指示無神經功能缺損癥狀；1指示盡管存在一些癥狀但無明 顯殘疾;2指示輕度殘疾(如能獨立活動，但不能完成所有先前的活動）；3指示中度殘疾(如 需要一些幫助，但能獨立行走）；4指示中重度殘疾(如不能處理身體需求或獨立行走）；5指 示重度殘疾(如需要不斷護理、邸床不起、失禁)和6指示死亡。
[0085] 在一些實施方式中，用有效劑量的本公開FXa變體(如FXaiisL)治療ICH對象可有效 減少ICH所導致神經功能缺損，如用神經功能缺損評估工具所測。根據一些實施方式，神經 功能評估工具包括格拉斯哥昏迷評分(GCS)、格拉斯哥預后評分擴展版(G0S-E)、己氏量表 (BI)、NIH卒中量表(NIHSS)或改良蘭金量表(mRS)。使用其它工具也可行。如果使用GCS、 G0S、G0S-E、BI，則神經功能缺損減少通過評分增加來反映。
[0086] 在一些實施方式中，用有效劑量的本公開FXa變體(如FXaiisL)治療ICH對象使對象 的格拉斯哥昏迷評分有效增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。在其它實施方式中，用有 效劑量的本公開FXa變體(如FXaiisL)治療I邸對象使對象的格拉斯哥預后評分，包括其擴展 版，有效增加1、2、3、4、5、6或7。在其它實施方式中，用有效劑量的本公開FXa變體（如 FXaiisL)治療ICH對象使對象的己氏量表評分有效增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19或20，或如果使用更廣的評分范圍，增加至少5、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更多。
[0087] 如果使用NIHSS或mRS，則神經功能缺損減少通過評分降低來反映。在一些實施方 式中，用有效劑量的本公開FXa變體(如FXaiisL)治療ICH對象使對象的NIH卒中量表評分有 效降低至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42。
[0088] 改良的蘭金量表常用于評價ICH所導致對象殘疾或依賴性的程度。在一些實施方 式中，用有效劑量的本公開FXa變體(如FXaiisL)治療ICH對象使平均mRS得分從約5-6降低到 約4-5,從約4-5降低到約3-4,從約3-4降低到約2-3,從約2-3降低到約1-2,或從約1-2降低 到約0-1。在其它實施方式中，相較于無治療，用有效劑量的FXa變體治療ICH對象可增加經 歷平均mRS得分降低的對象比例，所述得分從約5-6降低到約3-4,或從約3-4降低到約1-2。
[0089] 在其它實施方式中，相較于無治療，用有效劑量的FXa變體治療ICH對象可降低改 良的蘭金量表評分為5或6的對象與評分為0、1、2、3或4的那些相比的比例，或降低評分為4、 5或6的對象(鑒定為不良）與評分為0、1、2或3的那些(鑒定為良好)相比的比例。在其它實施 方式中，相較于無治療，用有效劑量的FXa變體治療ICH對象可降低評分為2、3、4、5或6的對 象與評分為0或1的那些相比的比例。在其它實施方式中，相較于無治療，用有效劑量的FXa 變體治療ICH對象可降低從mRS評分2、3、4或5發展到mRS評分6的對象比例。
[0090] 根據一些實施方式，相較于未治療的對照ICH對象，用有效劑量的本公開FXa變體 (如FXaiis^治療ICH對象使神經功能缺損由于治療而減少的ICH對象比例有效增加至少約 5%、10%、15%'20%'25%'30%'35%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%、 80%、85%、90% 或更多。
[0091] 評價神經功能缺損能用評估工具在ICH治療后的不同時間進行。例如，神經功能缺 損在能用FXa變體治療ICH后7天、10天、14天、20天、21天、28天、30天、40天、50天、60天、70 天、80天或90天或更久進行測量。根據普通技術人員的知識，在治療后其它時間測量也可 行。
[0092] ICH后防止或減少水腫的方法
[0093] 繼發于ICH的出血灶周圍水腫(P肥)也可能對患者發病率有作用。不希望受任何具 體操作理論約束，認為初始損傷后的凝血和血腫分解產物開啟對出血灶周圍腦組織的二次 級聯損傷，導致P皿發展。水腫平均是潛在血腫體積的約2倍，可引起煩內壓增加和占位效 應，如痛形成。D. S化ykov等，Stroke 42:2625-2629(2011 )，通過引用納入。水腫體積增加與 死亡和殘疾正相關。H.Arima等，Neurology 73:1963-1968(2009)，通過引用納入。水腫體積 能用神經成像技術測量，如本文他處所述的MRI或CT掃描。
[0094] 本公開還提供預防或減弱ICH相關出血灶周圍水腫(P肥）的方法，運是通過將治療 有效量的有酶原性質的FXa變體施用經歷ICH的對象，包括人患者。在一些實施方式中，所述 FXa變體是FXaiisL。相較于未用FXa變體治療的ICH患者的水腫體積，用治療有效劑量的FXa 變體治療后的水腫體積可減少約5 %、10 %、15%、20%、25%、30%、35%、40 %、45 %、50 %、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多。在一些實施方式中，在FXa給ICH對象 施用前，水腫體積用神經成像或本領域普通技術人員熟知的其它技術測量。然后，水腫體積 能在FXa變體治療后至少測量一次，開始監測水腫體積變化(如果有）。在某些實施方式中， 水腫體積能在FXa變體治療后1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時、18 小時、24小時、48小時、72小時、96小時、5天、6天、7天、14天、21天或更久測量，開始監測水腫 體積變化。
[00M]根據其它實施方式，P皿后遺癥的發生率或嚴重性如腦組織壓縮所導致煩內壓增 高或痛形成，能通過給ICH患者施用治療有效量的有酶原性質的FXa變體來降低。在一些實 施方式中，所述FXa變體是FXaiisL。相較于未用FXa變體治療的ICH患者，用治療有效劑量的 FXa變體治療的ICH患者中P肥后遺癥的發生率或嚴重性(包括但不限于水腫或痛形成)可減 少約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %'40%'45%、50 %、55 %'60%'65%、70 %、 75%、80%、85%、90% 或更多。
[0096] 減少或防止血腫擴大的方法
[0097] IC Η所導致初始出血后，約3 0 %的IC Η患者繼續出血，導致明顯的血腫擴大。 Brouwers和Greenberg ,Cereb;rovase .Dis. 35:195-201 (2013)。不幸地，血腫擴大與較差預 后結果相關。Davis(2006);Dowlatshahi等，Neurology 76:1238-1244(2011)。為治療此ICH 患者亞群，含本公開FXa變體的組合物能W有效減少或甚至防止血腫擴大的劑量施用。
[009引測量血腫體積的多種技術為普通技術人員熟知，血腫體積在ICH后開始和之后隨 著時間變化。非限制性示例包括腦成像技術，如CT、CTA、MRI或MRA。特定方法包括ABC/2，有 調整的C值的ABC/2、測量面積和3D容積重建。使用計算機軟件根據腦掃描期間收集的數據 計算體積是常見的。
[0099] 血腫體積能根據首次腦掃描收集的數據計算，所述掃描用于明確診斷ICH從而建 立基線體積。血腫體積還能在之后的一個或多個預定時間檢測，W監測血腫體積是穩定還 是擴大，且如果擴大，則監測速度如何。
[0100] 在一些實施方式中，血腫擴大能定量為基線腦掃描后一次或多次預定時間的體積 增加百分比。一些時間段相較于基線的非限制性示范性相對血腫體積增加包括約5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、100%、150%或更多。在其它實施方式中，血腫擴大能定量為基線腦掃描 后一次或多次預定時間的體積絕對增加。一些時間段相較于基線的非限制性示范性血腫體 積絕對增加包括約 1 毫升(ml)、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、5.5ml、6ml、 6.5ml、7ml、7.5ml、8ml、8.5ml、9ml、9.5ml、10ml、10.5ml、11ml、11.5ml、12ml、12.5ml、13ml、 13.5ml、14ml、14.5ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、22ml、24ml、26ml、28ml、30ml、 35ml、40ml、45ml、50ml 或更多。
[0101] 在非限制性示例中，血腫體積能在基線測量血腫體積后約1小時、2小時、3小時、4 小時、5小時、6小時、9小時、12小時、15小時、18小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小 時或更久測量，用于確定體積是否增加，且如果有，確定量。可多次掃描同一對象從而W更 高分辨率隨著時間追蹤血腫擴大。
[0102] 根據某些非限制性實施方式，當計算的血腫體積增加(若存在)超過一定闊值，采 用絕對體積基礎或相對體積增加百分比，則血腫擴大可定義為發生。因此，例如，當預定時 間段后體積相較于基線增加3毫升(ml)或更多、6ml或更多、或12.5ml或更多，或者另一些絕 對體積增加，則血腫擴大可認為發生。或者，當預定時間段后體積相較于基線增加15%或更 多、20 %或更多、25 %或更多、30 %或更多、33 %或更多，或另一些體積百分比增加，則血腫 擴大可認為發生。
[0103] 根據一些實施方式，用有效劑量的本公開FXa變體(如FXaiisL)治療具有ICH的對象 可有效減少或防止另外會發生例如在未治療對照中的血腫擴大。在一些實施方式中，I邸對 象在呈現ICH前已經或正接受抗凝治療。在一些其它實施方式中，相較于未治療對照，用本 公開的FXa變體治療具有ICH的對象有效使另外情況下會在一定時間段發生的血腫體積平 均擴大降低至少1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、5.5ml、6ml、6.5ml、 7ml、7.5ml、8ml、8.5ml、9ml、9.5ml、10ml、10.5ml、11ml、11.5ml、12ml、12.5ml、13ml、 13.5ml、14ml、14.5ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、22ml、24ml、26ml、28ml、30ml、 35ml、40ml、45ml、50ml或更多。在其它實施方式中，相較于未治療對照，用本公開的FXa變體 治療具有ICH的對象有效使另外情況下會在一定時間段發生的血腫體積平均擴大降低至少 5%、10%、15%'20%'25%'30%'35%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%、 80%、85%、90%或95%。在其它實施方式中，相較于未治療對照，用本公開的FXa變體治療 具有ICH的對象有效使另外情況下會在一定時間段發生的血腫體積平均擴大降低至少約 5%-15%、約10%-20%、約15%-25%、約20%-30%、約25%-35%、約30%-40%、約35%- 45%、約40%-50%、約45%-55%、約50%-60%、約55%-65%、約60%-70%、約65%-75%、 約70%-80%、約75%-85%、約80%-90%、約85%-95%或約90%-100%。
[0104] 根據一些實施方式，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象可有效降低經歷血腫 擴大的對象比例。在一些實施方式中，所述比例從約30%或更多下降到約25%或更少，20% 或更少，15%或更少，10%或更少，或5%或更少。在其它實施方式中，相較于未治療對照，用 本公開的FXa變體治療有效使在一定時間段中經歷血腫擴大的ICH對象比例降低約5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95% 或更多。
[0105] 在其它實施方式中，相較于未治療對照，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象 有效使在一定時間段中血腫體積增加的對象比例降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，所述體 積增加3ml或更多、6ml或更多、或12.5ml或更多（或另一些量或更多）。在其它實施方式中， 相較于未治療對照，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象有效使在一定時間段中血腫體 積增加的對象比例降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，所述體積增加15%或更多、20%或更 多、25%或更多、30%或更多、33%或更多(或另一些百分比或更多）。
[0106] 所謂的"斑點征"的存在與血腫擴大和較差預后結果相關并預測其，所述斑點征用 CT血管造影或其它方法鑒定。斑點征對血腫擴大的預測價值，甚至對癥狀發生后超過6小時 去醫院的患者也存在。Brouwers等，Neurocrit &re 17:421-428(2012)。
[0107] 斑點征是急性原發性實質血腫內的一個或多個小對比增強病灶。不希望受任何具 體操作理論約束，認為斑點征的存在歸因于活性外滲。Wada等，Stroke 38: 1257-1262 (2007);化ouwers等，Shoke 43: 3427-:3432(2012) ;Demchuk等，Lancet Neurol. 11:307- 314(2012)。
[0108] 提出基于斑點征特性的評分系統，運是根據斑點征數目、最大軸向尺寸和最大衰 減量。Delgado等，Sta)ke 40:2994-3000(2009)。斑點征存在時，得分范圍從巧Ij多至4,1對 應于存在1或2個斑點征，各自尺寸小于5mm并顯示衰減小于180冊，4對應于存在3個或更多 斑點征，其中軸向尺寸最大的是5mm或更高并顯示最大衰減為180冊或更多。零分指示沒有 斑點征存在。得分與血腫擴大風險高度相關。
[0109] 根據一些實施方式，有特定斑點征得分的具有ICH的對象能用本公開的FXa變體治 療。因此，例如，斑點征得分為4、3、2或1的具有ICH的對象能用本公開的FXa變體治療。在其 它實施方式中，用FXa變體治療具有ICH的對象在特定對象中降低斑點征得分。因此，例如， 初始呈現斑點征得分為4的ICH對象可由于FXa變體治療而降低其得分到3、2、1或0。初始呈 現斑點征得分為3的ICH對象可由于FXa變體治療而降低其得分到2、1或0。初始呈現斑點征 得分為2的ICH對象可由于FXa變體治療而降低其得分到1或0。初始呈現斑點征得分為1的 ICH對象可由于FXa變體治療而降低其得分到0。
[0110] 在某些實施方式中，相較于未治療對照，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象 有效使呈現斑點征得分為4的對象比例降低約5%、10%、15%、20%、25%、30 %、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更多。在其它實施 方式中，相較于未治療對照，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象有效使呈現斑點征得 分為 3的對象比例降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。根據其它實施方式，相較于未治療對 照，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象有效使呈現斑點征得分為2的對象比例降低約 5%、10%、15%'20%'25%'30%'35%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%、 80%、85%、90%、95%或更多。在其它實施方式中，相較于未治療對照，用本公開的FXa變體 治療具有ICH的對象使呈現斑點征得分為1的對象比例降低約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更多。 在其它實施方式中，相較于未治療對照，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象有效使呈 現斑點征得分為0的對象比例增加約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、 100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%或更多。根據其它實施方式，用本公開的 FXa變體治療具有ICH的對象有效使任何斑點征發生率降低約5%-15 %、約10 %-20%、約 15%-25%、約20%-30%、約25%-35%、約30%-40%、約35%-45%、約40%-50%、約45%- 55%、約50%-60%、約55%-65%、約60%-70%、約65%-75%、約70%-80%、約75%-85%、 約80%-90%、約85%-95%或約90%-100%。
[0111] 根據某些實施方式，在施用本公開的FXa變體前后的預定時間神經成像后，可測定 斑點征得分。在一些實施方式中，例如，在首次或后續施用FXa變體后30分鐘、45分鐘、60分 鐘、75分鐘、90分鐘、2小時小時、2.5小時小時、3小時小時、3.5小時小時、4小時小時、5小時 小時、6小時小時、7小時小時、8小時小時、9小時小時、10小時小時、11小時小時、12小時小 時、18小時小時、24小時小時、30小時小時、48小時小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10 天、11天、12天、13天、14天、15天、18天、3周、4周或另一些時間段，現憶斑點征得分。
[0112] 治療有ICH風險因素的患者的方法
[0113] 已鑒定多種有助于ICH風險增加的人類患者風險因素 。ML Flaherty等，"腦內出血 的流行病學"，收錄于《腦內出血》，JR Carhuapoma等編（劍橋：劍橋大學出版社，2010); 化ouwers等，Neurocrit 化'6 17:421-428(2012) ;A卵e化oom等，J.Shoke Cereb Dis., 22 :713-717(2013),各通過引用全文納入。根據某些實施方式，本公開的FXa變體例如 FXaiis^能W治療有效量給有一個或多個ICH風險因素的人ICH患者施用，從而治療或預防 運些患者的ICH。
[0114] 年齡是最顯著的風險因素，IHC率在60歲W上個體中大幅上升。因此，在本公開的 一些方法中，給60歲或W上患者施用FXa變體例如FXaiisL W治療或預防ICH。
[0115] 相反，高血壓是ICH的最重要可改變風險因素，在超過70%的ICH患者中存在。未治 療的高血壓相比受治療控制的高血壓是更高的風險因素，中斷用藥的治療中高血壓患者的 風險高于維持藥物的那些患者。高血壓是深半球和腦干區中出血W及葉ICH的風險因素。高 血壓作為ICH風險因素在年輕人中的相對影響高于老年患者。因此，在本公開的一些方法 中，給高血壓患者施用FXa變體例如FXaiisL W治療或預防ICH。
[0116] 使用非法擬交感神經藥例如可卡因和安非他命，與ICH相關。因此，在本公開的一 些方法中，給使用非法擬交感神經藥的ICH患者施用FXa變體例如FXaiis^
[0117] 腦淀粉樣血管病(CAA)也是老年人中葉ICH的重要風險因素。CAA表征為淀粉樣蛋 白沉積于柔腦膜動脈、小動脈、毛細血管和有時靜脈的中膜和外膜。因此，在本公開的一些 方法中，給腦淀粉樣血管病患者施用FXa變體例如FXaiisLW治療或預防ICH。
[0118] 載脂蛋白Ε(ΑΡ0Ε)ε2和ε4等位基因是腦葉區中ICH的獨立風險因素，可能作為運些 基因參與CAA的結果。Brouwers等，Stroke 43:2120-2125(2012),通過引用納入。因此，在本 公開的一些方法中，給有AP0E等位基因 ε2和ε4的患者施用FXa變體例如FXaiisLW治療或預 防 ICH。
[0119] 血管崎形包括動靜脈崎形(AVM)、海綿狀靜脈崎形、硬腦膜動靜脈擾、靜脈崎形和 毛細血管擴張癥，都與ICH相關。煩內小動脈瘤也能導致ICH，如果其出血流入腦實質而不流 入蛛網膜下腔，運更典型。因此，在本公開的一些方法中，給血管崎形患者施用FXa變體例如 FXaiisLW治療或預防ICH。
[0120] 使用抗凝劑如華法林預防缺血性中風，與ICH發生率增加相關。抗凝患者中ICH的 相對風險比一般群體高約7-10倍。關聯使用血栓溶解劑和抗凝劑來實現屯、肌梗塞或缺血性 中風的血栓溶解，與小但增加的ICH風險相關。在屯、肌梗塞的血栓溶解中，大部分出血位于 腦葉區。使用抗血小板藥如阿司匹林或氯化格雷，也是ICH的次要風險因素。因此，在本公開 的一些方法中，給服用抗凝劑(如華法林)或抗血小板(如氯化格雷)藥的患者施用FXa變體 例如FXaiisLW治療或預防ICH。
[0121] 腦實質中的微出血用梯度回波MRI檢測，其在ICH患者中常見并被視作小血管病變 和ICH傾向狀態的標志物。另外，先前的腦梗死與5倍-22倍增加的ICH風險相關。因此，在本 公開的一些方法中，給腦微出血或先前有腦梗死的患者施用FXa變體例如FXaiisLW治療或 預防ICH。
[0122] 低膽固醇血癥（與缺血性中風風險因素高膽固醇血癥相反)是ICH的風險因素。因 此，在本公開的一些方法中，給低膽固醇血癥患者施用F)(a變體例如FXaiisLW治療或預防 ICH。
[0123] 其它ICH風險因素包括醒酒和煙草使用，醒酒與血腫擴大相關。也認為糖尿病是 ICH的次要風險因素。因此，在本公開的一些方法中，給醒酒或使用煙草的患者或者糖尿病 患者施用FXa變體例如FXaiisLW治療或預防ICH。也能給其中創傷、感染或腫瘤是1C即隹一或 附帶原因的患者施用FXaiisL或另一 FXa變體W治療或預防ICH。
[0124] 設及ICH治療的其它方法
[0125] 在其它實施方式中，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象可有效減少對象中 ICH所導致的殘疾。殘疾的非限制性示例包括無 W下能力或能力降低或受損：駕車、獨立照 顧自己、工作、閱讀、說話、移動、走路、與其他人互動或其它殘疾類型。
[0126] 根據其它實施方式，用本公開的FXa變體治療具有ICH的對象可有效改善運類對象 的臨床狀態。臨床狀態改善的非限制性示例包括減少進入康復設施前的住院天數(例如住 院天數減少1、2、3、4、5、6、7、8或更多天）；使患者狀態的嚴重性降級(例如從臨界到嚴重或 更佳，嚴重到一般或更佳，一般到良好）；減少ICH患者許可進入神經重癥監護病房的天數 (例如減少1、2、3、4、5、6、7、8或更多天）；或減少ICH患者在重獲獨立呼吸能力前需要由機械 呼吸機協助的天數(例如減少1、2、3、4、5、6、7、8或更多天）。
[0127] 施用FXa變體W治療或預防ICH
[012引在ICH癥狀發生后或ICH診斷確認后，應盡快給患者施用FXa變體如FXaiisL。如本文 所示，可在某些癥狀呈現后懷疑ICH并通過神經成像確認，如通過MRI或CT掃描。根據本公開 的某些實施方式，在ICH癥狀發生后12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小時或更少時間內給患 者施用FXa變體。在其它實施方式中，在通過神經成像或本領域普通技術人員熟知的其它技 術確認ICH診斷后8、7、6、5、4、3、2、1小時或更少時間內給患者施用FXa變體。
[0129] 實現足W治療或預防ICH的FXa變體目標血漿濃度在本領域普通技術人員的知識 范圍內。在一個非限制性示例中，能根據對象性別、身高和體重或其它因素來估計相關藥代 動力學參數如對象血漿體積或其它參數，并用于計算需要施用多少FXa變體W達到目標濃 度。施用FXa變體后，血漿濃度能根據本領域普通技術人員的知識監控且此信息用于維持任 何所需范圍的濃度。
[0130] 可調整劑量方案W提供最優所需反應(如治療或預防反應）。例如，能施用單次大 劑量(bolus),可隨著時間施用數個分開劑量或劑量能成比例縮小或增加，如治療情況的緊 急狀態所示。
[0131] 劑量值可根據諸如W下因素而變化:所用特定FXa變體和其單獨使用還是與另一 治療劑聯用，待治療群體、亞群或個體對象的獨特性質，預期的特定治療或預防效果。本領 域普通技術人員會理解可影響劑量值的其它因素。此外，對于任何具體對象，根據個體需求 和施用或監督FXa變體組合物施用的護理提供者的專業判斷，特定劑量方案可能需要隨著 時間調整。因此，本文所列劑量方案僅是示范性的，不意在限制要求權利的FXa組合物和其 應用方法的范圍或實踐。
[0132] 在某些實施方式中，本公開FXa變體的治療或預防有效量是約0.0001-50mg/kg、約 0.001-50mg/kg、約0.001-5mg/kg、約 0.001-0.5mg/kg、約0.001-0.05mg/kg、約0.01-5mg/kg 或約0.01-0.5mg/kg。在其它實施方式中，治療或預防有效量的本公開FXa變體血液或血漿 濃度是約0.0003-300nM、約0.003-300nM、約0.03-300nM、約0.003-30nM、約0.03-30nM 或約 0.3-化M。其它劑量或血液或血漿濃度也可行。FXa變體濃度例如血液或血漿濃度可通過本 領域已知的任何方法測量。
[0133] 可給對象一次或多次施用FXa變體，例如采用含運種變體的組合物，直至實現合適 的治療或預防效果。采用多次施用時，其可每小時、每日或W任何其它合適間隔給藥，包括 例如多次日劑量。多劑量可根據方案施用，如每10分鐘、每15分鐘、每20分鐘、每30分鐘、每 小時、每2小時、每3小時、每4小時、每5小時、每6小時、每日3次、每日2次、每日1次、每隔2天、 每隔3天、每周1次，或另一些方案。FXa變體還可連續施用，例如通過微型累。可通過例如胃 腸外途徑(如靜脈內、皮下、腹腔內或肌肉內）施用FXa變體。FXa變體一般作為本文所述藥物 組合物的一部分給藥。
[0134] FXa變體給藥能與對象監測聯合W定制劑量方案，其最優治療對象ICH和產生作 用，如水腫或血腫擴大。因此，根據一些實施方式，給ICH對象施用FXa變體劑量，所述對象之 后經歷神經成像W確定腦內出血、水腫或血腫擴大是否停止或至少減小。掃描結果指示出 血、水腫或血腫擴大未停止或至少足夠改善時，能施用另一劑FXa變體。重復給藥和監測對 象的過程能持續直至對象病癥足夠改善，所述過程用于評價FXa變體對腦內出血、水腫或血 腫擴大的影響。給藥與監測之間的合適間隔能根據本領域普通技術人員的知識確定。非限 制性示例包括15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4 小時、5小時、6小時或更多。
[0135] 在另一個實施方式中，本公開的FXa變體可與至少第二活性治療劑共同施用（聯合 療法）。在一些實施方式中，所述第二藥劑可W是本公開的不同FXa變體。在其它實施方式 中，所述第二藥劑可W是另一凝血因子或其變體，包括例如因子IX、因子XIa、因子Xlla、因 子VIII、因子Vila,促凝血組合物如FEIBA或凝血酶原復合物濃縮物(PCC)，或抗纖溶劑如ε- 氨基已酸、凝血酸或抑膚酶。
[0136] 本公開的FXa變體與至少第二治療劑共同施用時，可在同一組合物中同時一起施 用或在分開的組合物中同時或依序施用。或者，FXa變體與至少第二治療劑能在分開的組合 物于不同時間施用。含FXa變體的組合物能在含至少第二治療劑的組合物前后施用。依序施 用之間的間隔可隨著FXa變體與第二治療劑施用而變化，其在某些實施方式中于同一天發 生。例如，FXa變體可每隔一天施用一次，而第二治療劑每天一次給藥，與FXa變體相同或在 施用巧巾藥劑的日子的不同時間。
[0137] 聯合療法可每小時、每日或每周多次給藥。可根據方案施用，如每10分鐘、每15分 鐘、每20分鐘、每30分鐘、每小時、每2小時、每3小時、每4小時、每5小時、每6小時、每日3次、 每日2次、每日1次、每2天1次、每3天1次、每周1次，或另一些方案。FXa變體還可連續給藥，例 如通過微型累。可施用聯合療法，例如通過胃腸外途徑(如靜脈內、皮下、腹腔內或肌肉內）。
[0138] 在其它實施方式中，本公開的FXa變體能與另一療法協作施用W有效治療ICH。在 非限制性示例中，能在施用藥物W降低有ICH的對象血壓或煩內壓或接受手術W如移除ICH 所導致血腫之前、同時或之后施用FXa變體。在其它示例中，能在藥物前、同時或之后施用 FXa變體W預防或治療癒痛或發燒，其各自伴隨lOLR.Sahni和J.Weinbe巧er，化SC Health Risk Manag 3:701-709(2007)，通過引用納入。
[0139] 另一方面，本公開提供含FXa變體的組合物W用于治療或預防對象ICH。組合物能 包括藥學上可接受載體、載劑或生理上相容的其它成分。運類載體、載劑和其它成分的非限 制性示例包括溶劑(如水、乙醇、鹽水、憐酸鹽緩沖鹽水）、去垢劑、表面活性劑、分散介質、涂 層劑、抗細菌劑或抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑、糖(如薦糖、右旋糖、乳糖）、多元醇(如甘 油、甘露醇、山梨醇）、鹽(如氯化鋼、氯化鐘）、濕潤劑、乳化劑、防腐劑、緩沖劑W及能提高 FXa變體穩定性或效力的藥劑。
[0140] 根據本發明使用的組合物可采用任何合適形式W給對象施用，如液體溶液(如可 注射和不烙性溶液）。組合物可w預備好給對象施用的預混合形式提供，例如小瓶或預填充 注射器。運種形式不需要在施用前用稀釋劑復水。或者，組合物能W凍干形式提供，需要在 施用前用稀釋劑(如無菌水或鹽水)復水。若是后者，稀釋劑能與凍干物一起在分開容器中 提供。根據本領域普通技術人員的知識，組合物能配制用于冷藏或室溫存儲。組合物形式至 少部分取決于預期的施用模式。在某些實施方式中，施用模式是胃腸外，包括例如靜脈內、 皮下、腹腔內或肌肉內施用。
[0141] 為了便于施用和劑量均勻度，胃腸外組合物W及其它類型可W劑量單位形式配 審IJ。劑量單位形式指物理離散單元，適合作為單一劑量用于待治療對象，各單元含有計算的 產生所需治療效果的預定量的活性化合物W及所需藥物載體。
[0142] 治療組合物通常在制造和儲存條件下必須無菌和穩定。所述組合物能配制為溶 液、微乳劑、分散液、脂質體中、或適合高藥物濃度的其它有序結構。無菌可注射溶液可如下 制備：將所需量的FXa變體納入合適溶劑，根據需要用上面所列成分之一或組合，然后過濾 滅菌。一般，分散液如下制備:將活性化合物納入含堿性分散介質和所需其它成分的無菌載 劑，所述成分來自上面所列的那些。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末情況中，優選的 制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產生活性成分加任何另外所需成分的粉末，來自其先 前無菌過濾的溶液。能維持溶液的適當流動性，例如通過用涂層劑如卵憐脂，在分散液的情 況中通過維持所需粒度W及通過使用表面活性劑。通過將延遲吸附的試劑如單硬脂酸鹽和 明膠納入組合物，能引起可注射組合物延長吸附。
[0143] 本公開還提供試劑盒，包含FXa變體或含運種FXa變體的組合物。試劑盒可W進一 步包括診斷劑或一種或多種另外的治療劑。試劑盒還可包括用于治療方法的說明書W及包 裝材料。試劑盒可額外包括容器中的一或多個單位劑量形式，所述容器設計用于方便護理 提供者施用。非限制性示例包括小瓶或預填充注射器。還能包括用于凍干組合物的稀釋劑。
[0144] 應理解本文所述實施例和實施方式僅用于闡明目的，根據其的多種修改或變化對 本領域技術人員顯而易見并納入本發明真實范圍，能進行修改或變化而不偏離本發明真實 范圍。 實施例
[0145] 實施例1 :FXaiisL促進正常血漿中的血塊形成
[0146] FXaiisL和血漿源性FXa(pdFXa)的活性如下評估:測量巧樣酸鹽混合血漿中的活化 部分凝血活酶時間（aPTT)，所述血漿分離自健康人類對象。通過向巧樣酸鹽血漿加入表面 活性劑和稀釋的憐脂，進行aPTT試驗。在溫育W激活接觸因子（因子XII、因子XI、前激膚釋 放酶和高分子量激膚原）的后，加入巧并測量凝血時間。測定期間產生低水平的FVa和 FVIIIa。
[0147] 加入濃度增大的pdFXa或FXaiisL引起劑量依賴性縮短凝血時間。就FXaiisL和pdFXa 計算的預估EC日日分別是45ng/mL和化g/血。
[0148] 在分離自正常小鼠、大鼠和食蟹猴的巧樣酸鹽血漿中進一步檢測FXaiisL活性。凝 血時間用aPTT測定檢測。與人血漿內觀察到的類似，加入FXaiis咱所有3個種類中引起劑量 依賴性縮短凝血時間。在食蟹猴、小鼠和大鼠中就FXaiisL計算的預估ECso分別是49、89和 91ng/mL〇
[0149] 凝血酶生成試驗（TGA)測量凝血酶生成的起始期、激活期和滅活期。在凝血開始 后，TGA隨著時間測量血漿中的凝血酶生成并如前所述進行(Bunce等,Blood 117: 290-298 (2011)，通過引用全文納入本文）。在用于運些研究的條件下，IpM組織因子(TF)用于起始凝 血。在分離自健康對象的去血小板巧樣酸鹽人血漿中測量凝血酶生成(TG)。在實驗的60分 鐘時程中，加入FXaiisL或pdFXa引起凝血酶生成的劑量依賴性增加（圖1A，圖1B)。相較于載 劑處理的人血漿，就pdFXa和FXaiisL都觀察到滯后時間（起始期）縮短。然而，在絕對數中， FXaiisL滯后時間長于pdFXa(圖1C)。對于所述對TGA滯后時間的效果，就FXaiisL計算的預估 ECso是化g/mLDFXaiisL和pdFXa的峰值凝血酶生成類似，峰值凝血酶濃度范圍分別是233- 352nM 和 198-：M9nM。
[0150] 上面概括的數據證明FXaiisL在來自非血友病動物的血漿中有效加速血塊形成，所 述動物包括人。
[0151 ] 實施例2:FXaiisL在非血友病曬齒動物出血模型中引起止血
[0152] FXaiisL在非血友病動物中引起止血的能力如下測試:在非血友病小鼠和大鼠中， 測量對斷尾損傷后失血的影響。剪尾導致嚴重出血，挑戰凝血系統。
[0153] 給正常C57B1/6小鼠靜脈施用不同劑量（0、1、10、25、50、100和2004邑/4邑）的 FXaiisL"2分鐘后，尾己從末端橫切3mm，W微升(μ1)測量直至止血的總失血。對照小鼠用載 劑注射。結果示于圖2Α，其中數據表示為均值±SEM，V'指示在Ρ值<0.05的統計學顯著性， "***"指示在P值<0.001的統計學顯著性。對于載劑，測試5只動物。對于施用不同FXaiisL劑 量的動物，6只myg/kg測試，8只W l〇yg/kg測試，8只W 25yg/kg測試，6只W 50yg/kg測試，8 只 W1 〇〇yg/kg 測試，5 只 W 200yg/kg 測試。
[0154] 相較于載劑處理的小鼠，尾橫切前的FXaiisL處理引起總失血劑量依賴性減少12% (化邑/1^)、16.6%(1化邑/1^)、26.7%(2扣邑/1^)、45.3%(5化邑/1^)、62.9%(1004邑/1^)和 69.6 % (200yg/kg)。預估邸日日是 46yg/kg。
[0巧5] 第二研究中，在正常雄性CD-1小鼠用25yg/kg FXaiisL或載劑處理后2分鐘，測量血 漿凝固活性，采用活化部分凝血活酶時間(aPTT)測定和凝血酶生成試驗(TGA)。在來自經處 理動物的血漿中，aPTT顯示凝血時間縮短67%且TGA滯后時間縮短85%。還用TEG測量全血 中的凝血活性，所述全血來自用l〇yg/kg或25yg/kg FXaiisL或載劑處理的CD-1小鼠。給藥后 2分鐘，相較于僅接受載劑的小鼠，用巧中FXaiis^U量處理的動物中血的TEG R值減少70%。
[0156] FXaiisL的止血活性也在正常雄性Sprague-Dawley大鼠的剪尾重傷模型中測試。相 較于載劑處理的大鼠，用FXaiisL預處理的大鼠顯示出血劑量依賴性減少5.7 % (1化g/kg)、 11.3 % (30yg/kg)、49.0 % (50yg/kg)、63.2 % (100yg/kg)和59.45 % (200yg/kg)。結果示于 圖2B，其中V'指示在P值<0.05的統計學顯著性。各劑量采用總共5-7只大鼠。方法與用小鼠 的實驗類似。預估EDsq是38yg/kg。全血中的離體活性用TEG測量。用1、5、10或30yg/kg FXaiis^i理大鼠后2分鐘，相較于僅接受載劑的大鼠，在劑量10yg/kg和30yg/kg觀察到的 TEG-R值分別減少38.2%和43.6%。
[0157] 實施例3:FXaiisL在ICH曬齒動物模型中減少血腫體積
[0158] 在ICH小鼠模型中研究FXaiisL。此模型中，將細菌膠原酶定向注入腦紋狀體。 F. Schlunk等，Stroke 43:246-249(2012);C.R)erch等，Stroke 39:3397-3404(2008)，其通 過引用全文納入。圍繞注射位點附近毛細血管的胞外基質的蛋白水解消化引起出血，其模 擬連續出血導致的ICH患者血腫擴大。
[0159] 在用FXa變體的實驗中，通過將細菌膠原酶定向注入小鼠右側紋狀體來誘導ICH。 膠原酶注射后45分鐘，FXaiis噴載劑W不同劑量靜脈施用。由膠原酶破壞毛細血管引起的 滲入腦實質的血液體積在損傷后24小時測量。此時，血液從脈管系統排出，移出腦并均質 化，均質化腦組織的血紅蛋白含量通過與標準曲線比較來定量。
[0160] 相較于僅用載劑處理的小鼠，FXaiisL處理W劑量響應方式減少小鼠的血腫體積。 結果示于圖3A，其中指示在P值<0.05的統計學顯著性。預估抓5〇 = 3.05yg/kg。每組測試 的動物范圍是7-15。圖3B顯示相較于載劑，與劑量相關的血腫體積減少百分比。
[0161] 使用與小鼠所用類似的方法，在雄性Sprague Dawl巧大鼠中誘導ICH。膠原酶注射 后15分鐘，向大鼠靜脈施用不同劑量的FXaiisLaoou/kg的促凝血組合物因子8抑制劑旁路 活性(FEIBA)或僅載劑。基于腦血紅蛋白含量的血腫體積在損傷后2小時測定。
[0162] 相較于僅用載劑處理的大鼠，FXaiisL處理可減少大鼠的血腫體積。結果示于圖4A， 其中指示在P值<0.05的統計學顯著性。圖4B顯示相較于載劑，與劑量相關的血腫體積減 少百分比。盡管不如小鼠顯著，但劑量響應的趨勢明顯。
[0163] 除非本文另有定義，與本發明相關使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術 人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數項包括復數且復數項應包括單數。 一般，與本文所述細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白及核酸化 學和雜交相關使用的命名法W及其技術為本領域熟知并常用。
[0164] 本發明的方法和技術一般根據本領域熟知的常規方法進行，如多個一般和更特定 參考文獻所述，所述參考文獻在本說明書中引用和討論，除非另有說明。參見例如Sambrook J.&Russell D.《分子克隆：實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第3 版，紐約州冷泉港的冷泉港實驗室出版社（Cold Spring化rbor LaboratoiT Press), (2000) ;Ausubel等，《精編分子生物學實驗指南：最新分子生物學實驗指南方法匯編》 (Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology),約翰威利父子出版公司（Wiley, John&Sons,Inc.) (2002) ; Harlow 和Lane《使用抗體：實驗室手冊》（Using Antibodies: A Laboratory Manual)，紐約州冷泉港的冷泉港實驗室出版社（1998);和Coligan等，《精編蛋白科學實驗 指南》（化ort Protocols in Protein Science),約翰威利父子出版公司（2003)，其通過引 用納入本文。酶反應和純化技術根據廠商說明書進行，如本領域通常所完成或如本文所述。 與本文所述分析化學、合成有機化學、醫療和藥物化學相關使用的命名法W及其實驗室過 程和技術為本領域熟知并常用。
[0165] 本文引用的所有出版物、專利、專利申請或其它文獻通過引用全文納入本文W用 于所有目的，相同程度就好像各單獨出版物、專利、專利申請或其它文獻獨立表示成通過引 用納入W用于所有目的。
[0166] 本說明書和權利要求中，單詞"包含（comprise)"或變化形式如"comprises"或 "comprising"應理解成指納入規定整數或整數組，但不排除任何其它整數或整數組。
【主權項】
1. 一種治療對象腦內出血(ICH)的方法，所述方法包括給需要ICH治療的對象施用治療 有效量的因子Xa(FXa)變體，其包括選自下組的至少一個取代突變： (a) 與SEQ ID N0:1中235對應的位置處的氨基酸用1^、1^11、？1^^8?或617取代;和 (b) 與SEQ ID NO: 1中236對應的位置處的氨基酸用Leu、Ala或Gly取代。2. 如權利要求1所述的方法，其中所述與SEQ ID NO: 1中235對應的位置處的氨基酸用 Leu取代。3. -種降低具有ICH的對象死亡可能性的方法，所述方法包括給處于ICH所導致死亡危 險的對象施用治療有效量的FXa變體，其包括選自下組的至少一個取代突變： (a) 與SEQ ID N0:1中235對應的位置處的氨基酸用1^、1^11、？1^^8?或617取代;和 (b) 與SEQ ID NO: 1中236對應的位置處的氨基酸用Leu、Ala或Gly取代。4. 如權利要求3所述的方法，其中所述與SEQ ID NO: 1中235對應的位置處的氨基酸用 Leu取代。5. -種提高具有ICH的對象的腦功能的方法，所述方法包括給患有ICH后需要提高腦功 能的對象施用治療有效量的FXa變體，其包括選自下組的至少一個取代突變： (a) 與SEQ ID N0:1中235對應的位置處的氨基酸用1^、1^11、？1^^8?或617取代;和 (b) 與SEQ ID NO: 1中236對應的位置處的氨基酸用Leu、Ala或Gly取代。6. 如權利要求5所述的方法，其中所述與SEQ ID NO: 1中235對應的位置處的氨基酸用 Leu取代。7. 如權利要求5所述的方法，其中所述腦功能提高與降低ICH所導致的增高的顱內壓 (ICP)相關，所述ICP降低到等于或低于選自80mm Hg、70mm Hg、60mm Hg、50mm Hg、40mm Hg、 30mm Hg、20mm Hg和IOmmHg的壓力值。8. 如權利要求5所述的方法，其中所述腦功能提高與維持腦灌注壓(CPP)相關，所述CPP 維持在等于或高于選自 40mm Hg、50mm Hg、60mmHg、70mm Hg、80mm Hg、90mm Hg、100mm Hg、 110、mm Hg和 120mmHg的壓力值。9. 如權利要求5所述的方法，其中所述腦功能提高與維持腦組織氧分壓(Pbt02)相關， 所述Pbt02維持在等于或高于選自 6mm Hg、8mm Hg、10mm Hg、12mm Hg、1 4mm Hg、16mm Hg、 18mm Hg、2〇、mm Hg、22mm Hg和24mm Hg的壓力值。10. 如權利要求5所述的方法，其中所述腦功能提高與降低乳酸和丙酮酸濃度之比 (LAR)相關，所述LAR降低到等于或低于選自60、50、40、30和20的值。11. 如權利要求5所述的方法，其中所述腦功能提高與降低腦血管壓力反應指數(PRx) 的比例相關，所述腦血管PRx的比例降低到等于或低于選自0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.0、-0.1、-0.2 和-0.3 的值。12. -種減少具有ICH的對象神經功能缺損的方法，所述方法包括給需要減少ICH所導 致神經功能缺損的對象施用治療有效量的FXa變體，其包括選自下組的至少一個取代突變： (a) 與SEQ ID N0:1中235對應的位置處的氨基酸用1^、1^11、？1^^8?或617取代;和 (b) 與SEQ ID NO: 1中236對應的位置處的氨基酸用Leu、Ala或Gly取代。13. 如權利要求12所述的方法，其中所述與SEQ ID NO: 1中235對應的位置處的氨基酸 用Leu取代。14. 如權利要求12所述的方法，其中所述神經功能缺損用格拉斯哥昏迷評分評價，且其 中作為治療結果，對象的得分從3提高到4或更高，從4提高到5或更高，從5提高到6或更高， 從6提尚到7或更尚，從7提尚到8或更尚，從8提尚到9或更尚，從9提尚到10或更尚，從10提尚 到11或更高，從11提高到12或更高，從12提高到13或更高，從13提高到14或更高，或從14提 尚到15。15. 如權利要求12所述的方法，其中所述神經功能缺損用格拉斯哥預后評分擴展版評 價，且其中作為治療結果，所治療對象的平均得分提高到1或更佳，2或更佳，3或更佳，4或更 佳，5或更佳，6或更佳，7或更佳，或8。16. 如權利要求12所述的方法，其中所述神經功能缺損用巴氏量表評價，且其中作為治 療結果，所治療對象的平均得分提高到10或更佳，20或更佳，30或更佳，40或更佳，50或更 佳，60或更佳，70或更佳，或80或更佳，或90或更佳。17. 如權利要求12所述的方法，其中所述神經功能缺損用NIH卒中量表評價，且其中作 為治療結果，所治療對象的平均得分從42降低到41或更少，從41降低到40或更少，從40降低 到39或更少，從39降低到38或更少，從38降低到37或更少，從37降低到36或更少，從36降低 到35或更少，從35降低到34或更少，從34降低到33或更少，從33降低到32或更少，從32降低 到31或更少，從31降低到30或更少，從30降低到29或更少，從29降低到28或更少，從28降低 到27或更少，從27降低到26或更少，從26降低到25或更少，從25降低到24或更少，從24降低 到23或更少，從23降低到22或更少，從22降低到21或更少，從21降低到20或更少，從20降低 到19或更少，從19降低到18或更少，從18降低到17或更少，從17降低到16或更少，從16降低 到15或更少，從15降低到14或更少，從14降低到13或更少，從13降低到12或更少，從12降低 到11或更少，從11降低到10或更少，從10降低到9或更少，從9降低到8或更少，從8降低到7或 更少，從7降低到6或更少，從6降低到5或更少，從5降低到4或更少，從4降低到3或更少，從3 降低到2或更少，從2降低到1或更少，或從1降低到0。18. 如權利要求12所述的方法，其中所述神經功能缺損用改良的蘭金量表評價，且其中 作為治療結果，所治療對象的平均得分從約5-6降低到約4-5,從約4-5降低到約3-4,從約3-4降低到約2-3,從約2-3降低到約1-2,或從約1-2降低到約0-1。19. 如權利要求12所述的方法，其中所述神經功能缺損用改良的蘭金量表評價，且其中 作為治療結果，改良的蘭金量表評分為5或6的所治療對象比例相較于評分為0、1、2、3或4的 那些降低。20. 如權利要求12所述的方法，其中所述神經功能缺損用改良的蘭金量表評價，且其中 作為治療結果，改良的蘭金量表評分為4、5或6的所治療對象比例相較于評分為0、1、2或3的 那些降低。21. -種減少具有ICH的對象出血灶周圍水腫(PHE)的方法，所述方法包括給需要減少 ICH所導致PHE的對象施用治療有效量的FXa變體，其包括選自下組的至少一個取代突變： (a) 與SEQ ID ΝΟ:1中235對應的位置處的氨基酸用1^、1^11、？1^^8?或617取代;和 (b) 與SEQ ID NO: 1中236對應的位置處的氨基酸用Leu、Ala或Gly取代。22. 如權利要求21所述的方法，其中所述與SEQ ID NO: 1中235對應的位置處的氨基酸 用Leu取代。23. 如權利要求21所述的方法，其中作為治療結果，具有ICH的對象的平均PHE體積相較 于未治療對照減少至少約5 %、10%、15%、20%、25%、30 %、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。24. 如權利要求21所述的方法，其中作為治療結果，具有ICH的對象中PHE所導致的顱內 壓平均升高相較于未治療對照減少至少約5 %、10 %、15 %、20%、25%、30 %、35 %、40 %、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。25. -種減少或防止具有ICH的對象血腫體積增大的方法，所述方法包括給需要減少或 防止血腫體積增大的對象施用治療有效量的FXa變體，其包括選自下組的至少一個取代突 變： (a) 與SEQ ID ΝΟ:1中235對應的位置處的氨基酸用1^、1^11、？1^^8?或617取代;和 (b) 與SEQ ID NO: 1中236對應的位置處的氨基酸用Leu、Ala或Gly取代。26. 如權利要求25所述的方法，其中所述與SEQ ID NO: 1中235對應的位置處的氨基酸 用Leu取代。27. 如權利要求25所述的方法，其中作為治療結果，具有ICH的對象的平均血腫體積增 大相較于未治療對照減少至少約5 %、10 %、15%、20%、25%、30%、35%、40 %、45 %、50 %、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。28. 如權利要求25所述的方法，其中作為治療結果，具有ICH的對象的平均血腫體積增 大相較于未治療對照減少至少約Iml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、 5·5ml、6ml、6·5ml、7ml、7·5ml、8ml、8·5ml、9ml、9·5ml、IOml、10·5ml、IIml、II·5ml、12ml、 12·5ml、13ml、13·5ml、14ml、14·5ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、22ml、24ml、26ml、 28ml、30ml、35ml、40ml、45ml或50mlD29. 如權利要求25所述的方法，其中血腫體積增大3ml或更多、6ml或更多、或12.5ml或 更多的具有ICH的對象的比例相較于未治療對照減少至少約5%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。30. 如權利要求25所述的方法，其中血腫體積增大15 %或更多、20 %或更多、25 %或更 多、30%或更多、33%或更多的具有ICH的對象的比例相較于未治療對照減少至少約5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90% 或 95%。31. 如權利要求25所述的方法，其中治療后斑點征評分為4的ICH對象的比例相較于未 治療對照減少至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。32. 如權利要求25所述的方法，其中治療后斑點征評分為3的ICH對象的比例相較于未 治療對照減少至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。33. 如權利要求25所述的方法，其中治療后斑點征評分為2的ICH對象的比例相較于未 治療對照減少至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。34. 如權利要求25所述的方法，其中治療后斑點征評分為1的ICH對象的比例相較于未 治療對照減少至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。35. 如權利要求31-34中任一項所述的方法，其中所述斑點征評分在首次施用FXa變體 后的一段時間測定，所述時間選自30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘、2小時、2.5小 時、3小時、3.5小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18 小時、24小時、30小時、48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14 天、15天、18天、3周和4周。36.如權利要求1、3、5、12、21或25所述的方法，其中所述腦內出血在選自下組的腦區域 發生:大腦、額葉、頂葉、枕葉、顳葉、小腦、腦干、中腦、腦橋、髓質、腦下垂體、下丘腦、丘腦、 海馬體、杏仁核、屏狀核和基底神經節。
【文檔編號】A61K38/48GK105934250SQ201580005696
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年1月15日
【發明人】S·阿金, J·弗魯比斯, M·E·卡爾, S·赫特, R·賈舒亞, D·D·彼德曼
【申請人】輝瑞公司