用于治療肺高壓的組合物和方法

用于治療肺高壓的組合物和方法
【專利摘要】在一些方面，本發明教導了包含TGF?β配體捕獲劑的藥物組合物，以及使用TGF?β配體捕獲劑來治療、預防肺高壓(PH)或降低肺高壓(PH)的進展速度的方法。本發明還提供了使用TGF?β配體捕獲劑來治療、預防多種病癥或降低多種病癥的進展速度的方法，所述病癥包括但不限于：肺血管重塑、肺纖維化、右心室肥厚、與過度的TGF?β信號傳導有關的疾病、與過度的GDF15信號傳導有關的疾病以及與過度的PAI?1信號傳導有關的疾病。本發明進一步提供了使用TGF?β配體捕獲劑來降低受試者中的右心室收縮壓的方法。
【專利說明】
用于治療肺高壓的組合物和方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 根據35U .S.C.119(e)，本申請要求2013年11月21日提交的美國臨時專利申請系列 號61/907，260的權益，W引用的方式將其各自的內容整體并入本文。
[0003] 關于聯邦贊助研究的聲明
[0004] 本發明是在NIH授予的5R01AR057374的政府支持下作出的。政府對本發明享有一 定的權利。
技術領域
[0005] 本發明大體上設及醫學領域W及屯、血管疾病和肺部疾病領域。
【背景技術】
[0006] 將本文中的所有出版物W引用的方式并入，其程度如同將每個單獨的出版物或專 利申請具體且單獨地指示為W引用的方式并入一樣。下面的描述包括對于理解本發明可能 有用的信息。運并不是承認本文提供的任何信息都是現有技術或者與目前所請求保護的發 明相關，或者任何明確或隱含地引用的出版物都是現有技術。
[0007] 通過配體結合至細胞表面受體W及過度/異常活躍的信號傳導出現了許多病理過 程和不期望的生物過程。因此，旨在降低或者有利地調制此類結合和信號傳導的組合物和 方法可W是有用的。
[000引TGF-β超家族包括許多具有生物學意義的配體。TGF-β和活化素在許多疾病（包括 不受控的纖維化和癌癥的進展，例如腎、肺和肝纖維化疾病）中發揮重要的致病作用。肌肉 生長抑制素(myostatinVGDW是與活化素有關的另一重要配體，該配體共享結合至相同的 II型受體(活化素 Rllb)。肌肉生長抑制素是骨骼肌生長的強力抑制劑，而且是用于肌肉萎 縮疾病(諸如肌營養不良癥）的經過驗證的治療祀點。TGF-β家族中的額外的配體包括牽設 在屯、血管疾病中的骨形態發生蛋白（BMP)。例如，高水平的BMP2和BMP4均已在巧化的動脈粥 樣硬化斑塊和病態的主動脈瓣中發現。
[0009] 已開發了方法用來通過捕獲配體并防止其與細胞表面受體的相互作用來減少配 體結合。W此種配體為祀標的主要試劑是對配體進行結合并隔離（sequester)的配體捕獲 劑/括抗劑。兩種實例是：（1)抗-配體抗體;W及(2)可溶性受體胞外結構域。
[0010] 已報導了使用直接捕獲并中和配體的抗-配體抗體來抑制一些配體。受體胞外結 構域的可溶形式通過結合至配體、并防止配體與細胞表面受體相互作用來直接括抗配體。 在TGF-β的情況中，在動物模型中，TGF-β受體II型(邱RII)胞外結構域化D)的表達部分恢復 了宿主免疫并促進了腫瘤清除，表明受體胞外結構域介導的TGF-β的中和抑制了腫瘤的進 展。不幸的是，已表明就括抗TGF-β而言，單價邱RII-抓的功效低于最佳功效。克服運一問題 的嘗試使得產生邱RII-抓的二價人工二聚化形式，經由融合至卷曲螺旋結構域或IgG的化 結構域發生二聚化。此種二聚化改善了括抗作用。已表明邱RII-抓的非共價二聚化(例如， 經由融合至異源二聚化的螺旋鏈(卷曲螺旋邱RII-ED))極大地增強了邱RII-抓的括抗效力 (De Crescenzo等，2004,J.Biol.Chem.279:26013)。卷曲螺旋融合二聚體的顯著缺點是二 聚化結構域的非共價性質限制了它的效力，即該二聚體在低濃度下解離，從而使螺旋融合 的受體胞外結構域的大部分將被用作單體而非二聚體。IgG的Fc結構域的使用提供了共價 相互作用，但W大的尺寸為代價。
[0011] 重要的是，迄今開發出的用于治療PH的TG邱RI抑制劑的臨床部署的障礙之一是毒 性，包括出血性瓣膜壞死。
[0012] 鑒于到目前為止嘗試的治療手段的缺點，在本領域中明確地需要能夠括抗配體活 性、并有潛力作為治療試劑或診斷(成像或非成像)試劑的基于受體的捕獲劑/中和劑，W用 于由本文所述的祀標配體的過度產生/活性引起的疾病/障礙。

【發明內容】

[0013] 結合系統、組合物和方法對如下實施方式及其方面進行描述和說明，其意在示例 和說明，而并不對范圍進行限制。
[0014] 本發明的多個實施方式描述了包含TGF-β配體捕獲劑的藥物組合物。在一些實施 方式中，TGF-β配體捕獲劑是可溶性重組TGF-的I型受體化-融合蛋白（TGFBRII-Fc)。在一些 實施方式中，TGFBRII-Fc融合蛋白包含與SEQ ID N0:1的氨基酸序列至少80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列;或者由與569 10^:1的氨基酸序 列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列組成。
[0015] 本發明的多個實施方式描述了用于治療、預防受試者中的肺高壓(PH)或降低受試 者中的肺高壓(PH)的進展速度(progression rate)的方法。在一些實施方式中，該方法包 括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的PH或降低受試 者中的PH的進展速度。
[0016] 本發明的多個實施方式描述了治療、預防受試者中的肺血管重塑或降低受試者中 的肺血管重塑的進展速度的方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效 量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的肺血管重塑或降低受試者中的肺血管重 塑的進展速度。
[0017] 本發明的多個實施方式描述了治療、預防受試者中的肺纖維化或降低受試者中的 肺纖維化的進展速度的方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的 TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的肺纖維化或降低受試者中的肺纖維化的進展 速度。
[0018] 本發明的多個實施方式描述了治療、預防受試者中的右屯、室肥厚或降低受試者中 的右屯、室肥厚的進展速度的方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效 量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的右屯、室肥厚或降低受試者中的右屯、室肥 厚的進展速度。
[0019] 本發明的多個實施方式描述了治療、預防受試者中的與過度的TGF-β信號傳導有 關的疾病或降低受試者中的與過度的TGF-β信號傳導有關的疾病的進展速度的方法。在一 些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防 受試者中的所述疾病或降低受試者中的所述疾病的進展速度。
[0020] 本發明的多個實施方式描述了治療、預防受試者中的與過度的GDF15信號傳導有 關的疾病或降低受試者中的與過度的GDF15信號傳導有關的疾病的進展速度的方法。在一 些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防 受試者中的所述疾病或降低受試者中的所述疾病的進展速度。
[0021] 本發明的多個實施方式描述了治療、預防受試者中的與過度的PAI-1信號傳導有 關的疾病或降低受試者中的與過度的PAI-1信號傳導有關的疾病的進展速度的方法。在一 些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防 受試者中的所述疾病或降低受試者中的所述疾病的進展速度。
[0022] 本發明的多個實施方式描述了降低受試者中的右屯、室收縮壓的方法。在一些實施 方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而降低受試者中的右 屯、室收縮壓。
[0023] 本發明的多個實施方式描述了對受試者中的TGF-β配體進行成像/檢測的方法，該 方法包括向受試者給予一定量的連接至成像分子的TGF-β配體捕獲劑。
【附圖說明】
[0024] 在參考的附圖中對示例性的實施方式進行說明。本文公開的實施方式和附圖意圖 被視為說明性的、而非限制性的。
[0025] 圖1A至圖化是表明根據本發明的實施方式大鼠中的野百合堿(MCT)誘發的肺高壓 與增高的PAI-1和降低的Idl轉錄活性有關的圖表。在用MCT(40mg/kg SC)處理Sprague Dawl巧大鼠之后，定期對在右屯、室收縮壓(RVSP，圖1A)和右屯、室肥厚(RVH，圖1B)方面的變 化進行測量。通過右屯、室導管插入術對RVSP進行測量，并通過右屯、室(RV)游離壁的重量對 左屯、室和間隔壁(LV+S)的總和的比例確定RVH(每個時間點η = 3)。經MCT處理的大鼠的肺的 定量RT-PCR顯示升高的ΡΑΙ-1轉錄(反映了增高的TGF-β信號傳導）（圖1C)，PAI-1轉錄的水 平與基于RVSP的PH程度直接相關（圖1D和圖化）。相反，觀察到Bmpr2W及其轉錄祀標Idl的 表達降低，兩者都具有與RVSP負相關的水平。（n = 5-6，*p<0.05和*卸<0.01相較于對照大 鼠）。
[0026] 圖2A至圖2F示出了免疫印跡和圖表。圖2A-圖2C表明根據本發明的實施方式 TGFBRII-Fc在人肺動脈平滑肌細胞(PASMC)中選擇性地抑制TGFf31、TG邱3和GDF15的信號傳 導。將經培養的PASMC去除血清，并與多個濃度的BMP4、TGFf31、TG邱2、TG邱3和GDF15配體一 起解育30分鐘。實施Western印跡和qPCR，W評估TGFBRII-Fc在體外對信號傳導活性進行調 制的能力。圖2D-圖2F表明根據本發明的實施方式TGFBRII-化選擇性地抑制血管平滑肌細 胞中的TG邱1與GDF15信號傳導。（圖2D)將人主動脈平滑肌細胞去除血清并過夜，然后與所 示濃度的81?4、了6即1、了6即2或60。15 -起解育30分鐘，并如所示出的，通過免疫印跡對 Smadl、Smad2、Smad3和Smad5的憐酸化進行分析。TGFPl、TG邱巧日GDF15 W劑量依賴的方式引 起Smad2和Smad3的活化、并引起Smadl和Smad5活化較小程度，而BMP4僅活化Smadl和Smad5。 (圖沈-圖2F)將HASMCs去除血清，并用TGFBRII-Fc(2000ng/ml)或輔料預處理，隨后與TG邱1 (lng/ml)、TGFe2(lng/ml)或 GDF15(30ng/ml) -起解育 2 小時。通過 qRT-PCR 的基因表達分析 顯示GDF15和TG邱1-誘發的PAI-1和IdlmRNA表達得到有效抑制，但TG邱2誘發的PAI-1和 IdlmRNA表達未得到有效抑制(各自η = 3-5個樣品，*p<0.05，**p<0.01相較于輔料）。
[0027] 圖3A至圖3D是表明根據本發明的實施方式低劑量的TGFBRII-化處理引起降低右 屯、室收縮壓（RVSP)的趨勢、降低右屯、室肥厚的趨勢W及顯著降低肺血管重塑的趨勢的圖 表。在用或不用TGFBRII-化(5mg/kg，每周兩次）的條件下，經MCT處理3周后，通過在用戊己 比妥麻醉的條件下的導管插入術和氣管內插管，W盲法對大鼠進行分析，從而確定RVSP(圖 3A)、體循環動脈壓（未示出），并將大鼠進行安樂死。基于化1 ton ' S比例（RV/化V+S))的測 量，W盲法對RVH的程度進行評估（圖3B)。將值表示為平均值±SEM，n = 6-8，*p<0.05和**p< 0.01(相較于對照大鼠）。用α-平滑肌肌動蛋白和血管性血友病因子對肺組織切片進行染 色，W分別識別血管平滑肌血管和內皮。對遠端腺泡內血管(直徑10皿-50皿)的肌肉化進行 定量，并對無肌肉化血管、部分肌肉化血管和完全(周向）肌肉化血管的百分比進行計算（圖 3C)。對全部的完全肌肉化的腺泡內血管(直徑10μπι-50皿，圖3D)的內側壁厚度進行計算。將 壁厚指數計算為：指數=(外徑-內徑)/外徑XlOOeTGFBRII-Fc處理(5mg/kg，每周兩次）引 起降低完全肌肉化血管的百分比的趨勢W及顯著降低內側壁厚度指數的趨勢。將值表示為 平均值± SEM，η = 100-150個血管/處理組(各自來自6-8只大鼠），P值如圖所示。
[002引圖4Α至圖4D示出了表明根據本發明的實施方式高劑量的TGFBRII-化處理減弱了 右屯、室收縮壓（RVSP)、右屯、室肥厚、并防止肺血管重塑的圖表。在用或不用TGFBRII-Fc (15mg/kg，每周兩次）的條件下，經MCT處理3周后，W盲法對大鼠進行分析，W確定RVSP(圖 4A)。基于化Iton's比例的測量，W盲法對RVH的程度進行評估（圖4B)。將值表示為平均值± SEM，η = 6-8。對遠端腺泡內血管(直徑10μπι-50μπι)的肌肉化進行定量（圖4C)。對全部的完全 肌肉化的腺泡內血管（直徑10μπι-50μπι，圖4D)的內側壁厚度進行計算。TGFBRII-Fc處理 (15mg/kg，每周兩次）顯著降低了完全肌肉化血管的百分比、并降低了內側壁厚度指數。將 值表示為平均值±861，11 = 89-127個血管/處理組(各自來自6-8只大鼠），*p<0.05和***p< 0.001相較于對照大鼠。
[0029] 圖5A至圖加示出了表明根據本發明的實施方式TGFBRII-化減弱了超聲屯、動圖的 RV肥厚的圖表。在MCT(40mg/kg SC)處理后，在MCT后24小時開始用輔料或TGFBRII-Fc (15mg/kg，每周兩次)對大鼠進行處理。在MCT 2周后，在用1.5%異氣燒麻醉的條件下，通過 小動物超聲檢查對大鼠進行分析，W測量右屯、室厚度和舒張期內徑（圖5A和圖5B)、肺血流 加速時間（PAT，圖5C)W及肺射血時間（PET，圖加）。將值表示為平均值±SEM，n = 6-8，*p< 0.05和***p<0.001相較于對照大鼠。
[0030] 圖6A至圖6F是表明根據本發明的實施方式P胡市組織中的TGFBRII-Fc抑制的TGW- 介導的轉錄的圖表。MCT-誘發的PH與TG邱1的適度增高和TG邱2mRNA表達的顯著降低相關 (圖6A-圖6C) dMCT處理之后，Bmpr2和Idl表達的阻抑未受到TGFBRII-Fc的影響（15mg/kg每 周兩次，圖抓-圖6E)，而用TGFBRII-Fc處理使得TG邱1及其轉錄祀標PAI-1顯著降低（圖6F)。 將值表示為平均值± SEM，n = 3-5，*p<0.05和**p<0.01相較于對照。
[0031] 圖7A至圖7C是表明根據本發明的實施方式在PH確立之后用TGFBRII-化處理同根 據本發明的多個實施方式的死亡率和PH的部分復蘇有關的圖表。在用MCT(40mg/kg SC)處 理之后，W延遲的方式在PH確立后的第17天開始用TGFBRII-FC(15mg/kg每周Ξ次)對大鼠 進行處理。相較于用輔料處理的大鼠（每組n=12，p = 0.10)，Kaplan-Meie;r分析（圖7A)顯示 出在經TGFBRII-Fc處理的組中的改善的存活趨勢。在第35天的存活動物中，在用TGFBRII- 化處理的動物中存在顯著降低的RVSP(圖7B)。然而，在存活的動物中，在RVH方面不存在顯 著差異（圖7C)。示出的值為平均值± SEM，每組η = 8-11，**p<0.01相較于對照。
[0032] 圖8A和圖8B示出了人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4較鏈（圖8A)W及Fc(圖8B)結構域的 氨基酸序列。IgGl較鏈結構域(SEQ ID N0:65);IgG2較鏈結構域(SEQ ID N0:66);IgG3較鏈 結構域(SEQ ID N0:67);IgG4較鏈結構域(SEQ ID N0:68);圖8BW與圖8A相同的順序示出： IgGlFc結構域(SEQ ID N0:69)，即氨基酸序列的第一行；IgG2Fc結構域(SEQ ID N0:70)，即 氨基酸序列的第二行；IgG3Fc結構域(SEQ ID N0:71)，即氨基酸序列的第蘭行；IgG4Fc結構 域(SEQ ID N0:72)，即氨基酸序列的第四行。根據Kabat EU編號系統對圖8A和圖8B中示出 的氨基酸殘基進行編號。通過將各自較鏈區域的第一個和最后一個半脫氨酸殘基(其形成 重鏈間S--S鍵)置于相同的位置，將同種型序列與IgGl序列進行比對。就圖8B而言，CH2結構 域中的殘基由加號(+ )表示，而CH3結構域中的殘基由波浪線表示。可將任何Fc結構域用于 本發明的方法中，如在向多種Fc結構域提供指導的圖8中所述，可對全部的抗體序列進行比 對。
[0033] 圖9A至圖9B示出了表明響應于TGFBRII-Fc處理而無二尖瓣重塑、退行性病變或異 常的組織切片。圖9A為對照。圖9B為經TGFBRII-Fc-處理。
【具體實施方式】
[0034] 本文中引用的所有參考文獻都^引用的方式整體并入本文進行充分闡述。除非另 外定義，否則本文使用的科技術語具有與本發明所屬領域中的普通技術人員通常所理解的 相同白勺含義DSingleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第3 片反，J.Wiley&Sons(New York，NY 2001);March，Advanced Organic Chemistry 民eactions， Mechanisms and Structure,第5版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2001); 1^及53111131'〇〇1^和 民ussel，Molecular Cloning : A Laboratory Manual，第3片反，Cold Spring Harbor Laboratoiy Press(Cold Spring Harbor,NY 2001)，為本領域技術人員提供了本申請中使 用的許多術語的通用指導。
[0035] 關于如何制備抗體的參考文獻，參見例如D · Lane，Antibodies : A LaboratoiT Manual(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor NY，1988);Kohler和Milstein， (1976)Eur.J. Immunol .6:511 ;Queen等，美國專利號5,585,089; 1^及1^6(31111131111 等，Nature 332:323(1988)。除非另有說明，本發明的實踐將采用本領域的技術范圍之內的分子生物學 (包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學和免疫學的常規技術。在文獻 中對此類技術進行了充分地闡釋，例如，Current Protocols in ImmunologyQ.E.Coligan 等編著，1999,包括 2011 年的補充）；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等編著，1987,包括2011 年的補充）；Short Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等編著，第五版2002,包括2011年的補充；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第S版（Sambrook和Russel,2001);PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等編著，1994) ;The Immunoassay Handbook(D.Wild編著，Stockton Press NY, 1994) ；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson編著，Academic Press， 1996);Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.A化6別和N.A.Staines編 著，Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow and Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor，N.Y. ,1999; 1^及86311〇3容6等編著，Current Protocols in Nucleic Acid Qiemistry John Wiley&Sons公司，New York,2000)。
[0036] 本領域技術人員將認識到可用于本發明的實踐中、與本文描述的方法和材料類似 或等同的許多方法和材料。本發明的其它特征和優勢將根據結合附圖進行的如下詳細描述 而變得顯而易見，所述附圖通過示例的方式說明本發明的實施方式的多個特征。實際上，本 發明并不限于所描述的方法和材料。出于本發明的目的，下面對一些術語進行定義。
[0037] "有益結果"可包括但不W任何方式限于減輕或緩解疾病病癥的嚴重程度、防止疾 病病癥惡化、治療疾病病癥、防止疾病病癥發展、降低患者發展疾病病癥的機會W及延長患 者的壽命或預期壽命。在多個實施方式中，疾病病癥是肺高壓、肺血管重塑、肺纖維化、右屯、 室肥厚、與過度的TGF-β信號傳導有關的疾病、與過度的GDF15信號傳導有關的疾病W及與 過度的PAI-1信號傳導有關的疾病。
[0038] 如本文所使用的"治療/處理"指的是治療性的治療/處理和預防性或防范性措施， 其中，目標是減緩(減輕)祀向的病理病癥、預防病理病癥、追求或獲得有益結果、或即使治 療最終不成功也會降低個體發展病癥的機會。需要治療/處理的對象包括已患有病癥的對 象W及易于患有病癥的對象、或在其中待對病癥進行預防的對象。
[0039] 如本文所使用的"肺高壓"（PH)可包括肺動脈(肺動脈高壓）、肺靜脈或肺毛細血管 (一起被稱為肺脈管系統）中的血壓的增高，導致呼吸急促、頭暈、昏厥、下肢腫脹W及其它 癥狀。PH可W是伴隨有顯著降低的運動耐量W及屯、力衰竭的嚴重疾病。PH可W是至少五種 不同的可能類型中的一種，包括:動脈PH、靜脈PH、缺氧性PH、血栓栓塞性PH或混雜性PH。
[0040] 如本文所使用的"TGF-β配體捕獲劑"指的是能夠捕獲TGF-β配體（即使僅瞬時地）， 從而調制配體與一種或多種額外的分子相互作用的能力的蛋白質。
[0041 ] 在一些實施方式中，TGF-β配體可意味著選自TGF-m、TGF-e2、TGF-03和GDF 15中 的配體。
[0042] TGF-β配體捕獲劑的實例包括但不W任何方式限于可溶性重組TGF-β受體化-融合 蛋白，其包含TGF-β受體的TGF-β配體結合結構域和免疫球蛋白的Fc結構域。
[0043] 因此，在一個實施方式中，提供了治療、預防受試者中的肺高壓(PH)或降低受試者 中的肺高壓(PH)的進展速度的方法。該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕 獲劑，從而治療、預防受試者中的PH或降低受試者中的PH的進展速度，其中TGF-β配體捕獲 劑包含：1 )TGF-i3受體的TGF-β配體結合結構域;2)免疫球蛋白的化結構域；W及3)任選的在 配體結合結構域和Fc結構域之間的接頭(免疫球蛋白接頭或其它接頭）。
[0044] 在一個實施方式中，TGF-β受體的TGF-β配體結合結構域包含SEQ ID N0:63、或其 部分、或其變體:?ΡΡΗ V0KSV NN DΜIVTDNN GAVKFPQLCK FCDV 艮 FSTCD NQKSCMSNCS ITSiCEKPQE VCVAVW 民 KND ENiTLETVCH DPKLPYHDFl LEDAASPKCi MKEKKKPGET FFMCSCSSDE CNDNilFSEE YNTSNPD (SEQ ID NO: 63)。
[0045] 在一個實施方式中，TGF-β受體的TGF-β配體結合結構域包含SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、或其部分、或其變體。
[0046] 在一個實施方式中，Fc結構域包含SEQ ID N0:64、或SEQ ID N0:64的部分/片段、 或其變體。沈Q ID N0:61:ECPPCPAP P-VAGPSVFLF PPKPKDTLMi S 民 TPEVTCVV VDVSHE；DPE￥ QFNWYVDGVE VHNAKTKP 民 E EQFNSTF 民 VV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPP S 民 EEM 下 KNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 64)。
[0047] 進一步而言，圖8B中描述了示例性的Fc結構域，例如SEQ ID N0:69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID N0:71和沈Q ID N0:72。在一些實施方式中，Fc結構域包含沈Q ID N0:69、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:71、或沈Q ID N0:72,或者包含沈Q ID N0:69的片段、SEQ ID N0:70 的片段、SEQ ID N0:71的片段、或沈Q ID N0:72的片段、或者沈Q ID N0:69的變體、SEQ ID NO:70的變體、SEQ ID NO:71的變體、或SEQ ID NO:72的變體。
[0048] 按照本文的公開內容，對合適的結合結構域進行選擇在本領域普通技術人員的能 力之內。在一些實例中，結合結構域可選自TGF-的型受體和TGF-βΠ 型受體的胞外結構域。 一個非限制性實例是可溶性重組TGF-的I型受體Fc-融合蛋白（TGFBRII-Fc)。
[0049] 在進一步的實例中，從其出發設計多膚結合結構域的天然受體可W是邱R-I-邸或 邱R-n-邸。
[0050] 在一個實施方式中，TG邱受體的TGF-β配體結合結構域包含TGF-βΙ型受體胞外結 構域的序列、或胞外結構域的部分;例如SEQ ID NO:73或其部分， GVQVETISPG DGRTFPKRGQ TCVVHYTGML EDGKKFDSS 民 DRNKPFKFML GKQEVIRGWE EGVAQMSVGQ RAKLT1SPDY AYGATGHPGI IPPHATLVFD VELLKLEC SE〇 ID NO: 73)；
[0化1 ] 或者例如沈Q ID NO: 74、或其部分/ j 'I.段，EDPSLDRPFl:沒EGTTLK：丘LI YDMTTSGSGS GLPLLVQ 民 Τ? A 民 TIVLQESl GKG 民 FGEVW 民 GKWRGEEVAV KIFSS 民 EERS WFREAEIYQT VMLRHENILG FiAADNKDNG TWTQLWLVSD YHEHGSLFDY LNRYTVTVEG MIKLALSTAS GLAHLHMEiV GTQGKPAIAH RDLKSKNILV KKNGTC 幻 AD LGLAVRHDSA TDTIDIAPNH RVGTKRYMAP EVLDDSINMK HFESFKRADI YAMGLVFWEI AR 民 CSIGGIH EDYQLPYYDL VPSDPSVEEM RKVVCEQKL 民 PNIPN 民 WQSC EAL民VMA腳M RECWYANGAA RLTAL民脹KT LSQLSQQBGi KM (SEQ 1D NO: 74)(鏈A，無化bp 12而結晶的未憐酸化的TGF-的型受體的細胞質結構域，GenBank 登錄 1IAS_A 01:15988007)。
[0052]在一個實施方式中，TG邱受體的TGF-β配體結合結構域包含邱R-III-邸的序列、或 沈Q ID N0:75的部分；MTSHYVIAIF ALMSSCLATA GPEPGALCEL SPVSASHPVQ ALMESFTVLS GCASRGTTGL PQEVHVLNLR TAGQGPGQLQ 民EVTLHLNPl SSVHiHHKSV VFLLNSPHPL VWHLKTE 民 LA TGVSRLFLVS EGSVVQFSSA NFSLTAETEE 民 NFPHGNEHL LNWARKEYGA VTSFTELKIA 民 NIYIKVGED QVFPPKCNIG KNFLSLNYLA EYLQPKAA 巨 G CVMSSQPQNE EVHIIELITP NSNPYSAFQV DITIDIRPSQ EDLEVVKNLI LILKCKKSVN VVVIKSFDVKG SLKllAPNSI GFGKESERSM TMTKSI 民 DDI PSTQGNLVKW ALDNGYSPIT SYTMAPVANR FHL 民 LENNEE MGDEEVHTIP PELRILLDPG ALPALQNPPi 艮 GGEGQNGGL PFPFPDISR 民 VWNEEGEDGL P 民 PKDPVIPS IQLFPGL 民 EP EEVQGSVDIA LSVKCDNEKM IVAVEKDSFQ ASGYSGMDVT LLDPTCKAKM NGTHFVLESP LNGCGT 民P 艮 W SALDGVVYYN SiVIQVPALG DSSGWPDGYF. DLESGDNGFP GDMDEGDASL FTRPEIVVFN CSLQQVRNPS SFQEQPHGNi TFNMELYNTD LFLVPSQGVF SVPENGHVYV EVSVTKAEQE LGFAIQTCFi SPYSNPDRMS HYTIIENICP KDESVKFYSP KRVHFPIPQA DMDKK 民 FSFV FKPVFNTSLL FLQCELTLCT KMEKHPQKLP KCVPPDEACT SLDASliWAM MQNKKTFTKP LAVIHHEAES KEKGPSMKEP NPISPPIFHG LDTLT 、'SEQ !D NO: ^)(化稱為可溶性TGF-β受體III，例如，在如下中對人重組可溶性TGF-fcR III進行了描述：Moren A等，Molecular cloning and characterization of the human and porcine transforming growth factor-beta type III receptors，1992， J.Biochem.Bic^hys.Res.Commun.189(1),356-362)〇
[0053] 在如下中對重組可溶性TGF-郵II型cDNA進行了描述：Melissa A.Rowland- Goldsmith等，Soluble Type II Transforming Growth Factor-0(TGF-0)Receptor Inhibits TGF-0Signaling in COL〇-357Pancreatic Cancer Cells in Vitro and Attenuates Tumor F'ormationlJOOUClin Cancer Res,7:2931。將人邱RII的完整cDNA用 作邱RII的細胞外結構域的編碼序列(包含信號序列的核巧酸1-477)的PCR擴增的模板。使 用正義引物（5'-AAGCTTGCCGCCGCCATGGGTCG(SEQ ID N0:76))和反義引物（5'- CTGGAATTCGTCAGGATTGCTGG(SEQ ID N0:77))實施PCR。沈Q ID N0:78是II型轉化生長因子- iKTGF-β)受體細胞外結構域的實例： Μ 婦 R(3LL 民 GLW PLHIVLWTRI A 沒 TIPPHVQK SVNNDMIVTD NNGAVKFPQL CKFCDVRFST CDNQKSCMSN CSITSICEKP QEVCVAVWRK NDENITLETV CHDPKLPYHD FILEDAASPK CiMKEKKKPG ETFFMCSCSS DECNDNMFS EEYNTSNPDL LLVIFQVTGI SLLPPLGVAI SVIllFYCYR VN 民 QQKLSST WETGKTRKLM EFSEHCAIiL EDDRSDISST CANNINHNTE LLPIELDTLV GKG 民 FAEVYK AKLKQNTSEQ FETVAVKIFP YEEYASWKTE KDIFSDINLK HENILQFLTA EE 民 KTELGKQ YWLITAFHAK GNLQEYLTRH VISWF,DLRKL GSSLARGiAH LHSDHTPCG 民 PKMPIVH 民 DL KSSNMLVKND LTCCLCDFGL SLRLDPTLSV DDLANSGQVG TARYMAPEVL ES 民 MNLENVE SFKQTDVYSM ALVLWEMTSR CNAVGEVKDY EPPFGSIC (SEQ ID NO 78)。
[0054] TG邱受體的完整細胞外部分通常包含位于其折疊的配體結合結構域兩側的非結 構化部分。運些非結構化的細胞外部分從如下顯而易見:可從PDB數據庫獲得的實驗確定的 3D結構(Berman等，2000，Nucl. Acid Res. 28:235)(例如，I型TGF-β受體胞外結構域(Groppe 等，2008，Mol .Cell 29: 157)或II型TGF-β受體胞外結構域的晶體結構（Hart等， 2002化t. Struct .Biol.9:203; Boesen 等，2002，Structure 10 : 913 ;G;roppe等，2008， Mol.Cell 29:157))、或11型了6。-0受體胞外結構域的醒3結構（〇6邱等，2〇〇3,81〇油611113付7 42:10126)。本領域技術人員精通于識別TGF-β受體的配體結合結構域。就TGF-β配體捕獲劑 而言，可使用本領域技術人員公知的標準配體結合分析法(例如放射配體結合分析法)對配 體的結合進行確認（參見例如Si ttampalam , G . S . ; Kahl ,S.D. iJanzen.W.P.High- throughput screening:Advances in assay technologies,1997,Current Opinion in Qiemical Biology 1(3) :384-391 及De Jong,L.A.A.等，Receptor-ligand binding assays:Technologies and Applications,2005,Journal of Chromatography B 829(1- 2):l-25)。
[0化日]本文所使用的叮GFBRII-Fc"指的是包含如下的融合蛋白：TGF-的I型受體的TGF-β 配體結合結構域或其變體或其生物活性部分W及免疫球蛋白的Fc結構域。在多個實施方式 中，在TGF-β配體結合結構域和化結構域之間可包含接頭。還根據本發明，融合蛋白可包含 TGF-WI型受體的整個細胞外部分或其變體W及免疫球蛋白的化結構域。在一些實施方式 中，融合蛋白可包含如下的一部分:TGF-WI型受體的細胞外部分或其變體W及免疫球蛋白 的Fc結構域。變體的實例可包括但不限于包括傳統的氨基酸突變、SNP變體W及剪接變體的 變體。一個非限制性實例是TGF-的I型受體的Hb剪接變體。在多個實施方式中，可對TGF-0 配體結合結構域和/或化結構域進行修飾例如用于促進純化，只要此類修飾不會將運些結 構域的功能降低至不可接受的水平。
[0化6]已在本領域中普遍描述了化-融合的基本技術，例如在Czajkowsky等，Fc-化sion proteins:new developments and future perspectives，EMB0 Mol Med.2012年10月，4 (10) :1015-28中，w引用的方式將其整體并入本文。TGF-β型II受體可來自哺乳動物。在一 些實例中，該受體來自人、猴、猿、狗、貓、牛、馬、山羊、綿羊、豬、兔、小鼠或大鼠。免疫球蛋白 可來自哺乳動物。僅舉例來說，免疫球蛋白可來自人、猴、猿、狗、貓、牛、馬、山羊、綿羊、豬、 兔、小鼠或大鼠。
[0057] 當提及抗體結構域時，根據Kabat的定義對各個結構域指定氨基酸（參見，Elvin A.Kabat,Tai Te Wu，Kay S.Gottesman，Carl Foeller的"Sequences of Proteins of Immunological Interest"，第5版，出版號913242,國立衛生研究院，Bethesda,Md.，1991， W及更早的版本）。來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變區域的氨基酸通過鏈中的氨 基酸的位置指明。Kabat描述了就抗體而言的許多氨基酸序列，識別了就各亞組而言的氨基 酸共有序列，W及對每個氨基酸指定了殘基編號。通過參照保存的（conserved)氨基酸將有 疑問的抗體與Kabat中的共有序列中的一個進行比對，可將Kabat的編號方案擴展到未包含 在他的概論內的抗體。用于指定殘基編號的運一方法已經在本領域中成為標準，并方便地 識別不同抗體中（包括嵌合變體或人源化變體)的等價位置處的氨基酸。例如，人抗體輕鏈 的位置50處的氨基酸占據了小鼠抗體輕鏈的位置50處的氨基酸的等價位置。
[0058] 如本文所使用的術語"Fc區域"、"Fc結構域"或類似的術語用于限定IgG重鏈的 CH2/CH3C-末端區域。圖8B中示出了包含人IgGl的氨基酸序列的實例。如根據Kabat系統的 編號，雖然界限可能略有變化，Fc結構域從氨基酸231延伸至氨基酸447(根據Kabat系統對 圖8B中的氨基酸殘基進行編號：參見Kabat等，"Sequences of Proteins of Immunological Interest",第5版，Public Health Se;rvice，NIH，MD(1991)，W引用的方式 將其整體并入本文）。圖8B還提供了 IgG同種型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的Fc區域的氨基酸序 列的實例。
[0059] IgG的Fc區域包含兩個恒定的結構域:CH2和C冊。根據Kabat的編號系統，人IgG Fc 區域的C肥結構域通常從氨基酸231延伸至氨基酸341(圖8B)。根據Kabat的編號系統，人IgG Fc區域的C冊結構域通常從氨基酸342延伸至氨基酸447(圖8B)。人IgG化區域的C肥結構域 (也稱為乂丫 2"結構域)是獨特的，因為它不與另一結構域緊密配對。而是，兩個N-連接的分 支糖鏈插在完整的天然IgG的兩個CH2結構域之間。
[0060] TGFBRII-Fc的實例包括但不限于具有在SEQ ID N0:1或其變體中列出的序列的蛋 白質。在一個實施方式中，SEQ ID N0:1的變體包含與SEQ ID N0:1具有至少80%、85%、 90 %、95 %、98 %或99 %序列一致性的序列。 TIPPHVQKSV NNDMIVTDNN GAVKFPQL成 FCDV民FSTCD
[0061 ] 在SEQ ID NO: 1中，氨基酸1-137是TGF-β配體結合結構域，氨基酸138-141是接頭， 且氨基酸142-364是化結構域。運一示例性了6。8311斗(3可通過包含56〇10^:2或其簡并變 體中列出的核巧酸序列的核酸來表示。如本文所使用的"簡并變體"指的是具有突變的核巧 酸序列、但由于遺傳密碼的冗余性仍然編碼相同多膚的變體。
[0062]
[0063]
[0064]
[0065] 使用Kabat編號，通常將重鏈IgG的"較鏈區域"或"較鏈結構域"定義為人IgGl的 G1U216延展至Pro230。圖8A中示出了人IgGl較鏈區域的氨基酸序列的實例(根據Kabat系統 對圖8A中的氨基酸殘基進行編號）。如圖8A中所示，通過將形成重鏈間S--S鍵的第一個和最 后一個半脫氨酸殘基置于相同的位置，可將其它IgG同種型的較鏈區域與IgGl序列進行比 對。在一些實施方式中，配體結合結構域和Fc結構域之間的接頭包含較鏈區域，例如SEQ ID N0:65至SEQ ID N0:68中的任一者(參見圖8A)。在一個實施方式中，接頭包含TGG G(SEQ ID NO :79)。在一些實施方式中，接頭包含沈Q ID NO :6至SEQ ID NO :48中的任一者（參見實施 例3)。
[0066] 本領域技術人員將容易理解的是，與在本文中具體描述的膚基本相同的膚是在考 慮之列的，并且可包含一種或多種傳統的氨基酸突變。本領域中已知的是，對參照膚進行一 種或多種傳統的氨基酸突變可產生在生理學、化學或功能性質方面與所述參照膚相比沒有 實質變化的突變膚;在此類情況中，參照膚和突變膚可被認為是"基本上相同"的多膚。
[0067] 傳統的氨基酸的突變可包括氨基酸的添加、缺失或取代。在本文中將傳統的氨基 酸取代定義為將一個氨基酸殘基用具有類似化學性質(例如大小、電荷或極性)的另一氨基 酸殘基取代。在非限制性實例中，傳統的突變可W是氨基酸取代。此類傳統的氨基酸取代可 將堿性氨基酸、中性氨基酸、疏水性氨基酸或酸性氨基酸用具有相同基團的另一氨基酸取 代。
[0068] 如本文所使用的"堿性氨基酸"包括具有大于7的側鏈地a值的親水性氨基酸，其在 生理抑下通常帶正電。堿性氨基酸包括組氨酸化is或H)、精氨酸(Arg或R)和賴氨酸化ys或 K)。如本文所使用的"中性氨基酸"（也稱為"極性氨基酸"）意味著具有在生理pH下不帶電的 側鏈的親水性氨基酸，但是在其中具有至少一個鍵，在所述鍵中兩個原子共用的成對電子 更靠近其中一個原子。極性氨基酸包括絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、半脫氨酸(切S或 C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酷胺(Asn或N)和谷氨酷胺(Gin或Q)。依據Eisenberg的標準化通 用疏水性標度(1984 )，術語"疏水性氨基酸"（也被稱為"非極性氨基酸"）意味著包括顯示出 大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、異亮氨酸(lie或I)、苯丙氨 酸(Phe或F)、鄉氨酸(化1或V)、亮氨酸化eu或L)、色氨酸(T巧或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨 酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。"酸性氨基酸"指的是具有小于7的側鏈地a值的親水性氨基 酸，其在生理pH下通常帶負電。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
[0069] 將序列一致性用于評價兩個序列的相似性；當對兩個序列的殘基位置之間的最大 對應性(correspondence)進行比對時，通過計算相同的殘基的百分比確定序列一致性。任 何已知的方法都可用于計算序列一致性;例如，可用計算機軟件來計算序列一致性。作為非 限制性實例，序列一致性可通過諸如BLAST-P、Blast-N或FASTA-N的軟件、或者本領域中已 知的任意其它合適的軟件來計算。本發明的基本上相同的序列可至少80%相同。在其它實 例中，基本上相同的序列可在氨基酸水平上與本文所述的序列至少80%、85%、90%、95% 或100%相同。
[0070] 如上所述，在多個實施方式中，在TGF-β配體結合結構域和化結構域之間，可存在 接頭。本文提供的是此類接頭的序列。在一個實施方式中，接頭是非結構化和柔性的多膚序 列。接頭區域提供了不同于結構化的配體結合結構域和Fc結構域的區段，并因此可將接頭 區域用于綴合至輔助分子(例如，用于提高諸如聚乙二醇化(PEGylation)部分的穩定性的 分子)或負荷分子(諸如用于成像的造影劑和毒素），而無需對配體結合結構域和化結構域 進行化學上的修飾。綴合的方法有所不同，但通常可使用能夠經由常見的反應性基團（諸如 伯胺、班巧酷亞胺(NHS)醋和琉基反應性基團）進行綴合的商業化試劑盒來實施。一些非限 制性實例是：Alexa Fluor 488蛋白質標記試劑盒（分子探針，Invitrogen detection technologies)和聚乙二醇化試劑盒(Pierce Biotechnology Inc.)。
[0071] 接頭可包括非結構化的氨基酸序列，該非結構化的氨基酸序列可與TGF-β超家族 中的另一受體或感興趣的配體的的細胞外部分中的天然非結構化區域的序列相同、或者衍 生自對該天然非結構化區域的序列的傳統修飾。在其它實例中，此類接頭在組成和來源上 可W是完全人工化的，但將會包含所選定的用于提供非結構化的柔性接頭的氨基酸，在當 使該接頭緊密接近感興趣的配體時，具有較低可能遇到靜電或空間位阻混亂。
[0072] 認為接頭的長度是如下兩者之間的氨基酸的數量：（a)位于接頭N-末端的結合結 構域的C-末端主鏈碳原子；W及(b)位于接頭C-末端的結合結構域的N-末端主鏈氮原子。當 接頭長度允許結合結構域將它們的天然結合位點結合在它們的天然配體上時，該接頭長度 被認為是可接受的。表2中給出了不同長度的天然接頭序列和人工接頭序列的實例。例如， 不希望W任何方式受到限制，接頭長度可為約18-80個氨基酸、25-60個氨基酸、35-45個氨 基酸、或可為任何其它合適的長度。
[0073] 在一些實例中，可能期望使本文公開的配體結合試劑的基于多膚的連接設計接受 特定應用所期望的特性的優化。例如，為了改善結合親和性、特異性、免疫原性和穩定性，可 基于原子水平模擬和基于知識的設計，在長度和組成上對接頭進行修飾。運適用于表現出 同聚、異聚、二聚和多聚的配體-受體結構特性的廣泛范圍的分子系統。可將額外的不同的 結合結構域并入，W產生具有甚至更高的結合效價的多價捕獲劑。
[0074] 可對接頭進行設計，W促進接頭和/或配體結合捕獲劑的純化。所選擇的精確純化 方案將確定需要何種修飾，例如而且不希望受到限制，加入純化"標簽"（諸如化S標簽)是在 考慮之列的;在其它實例中，接頭可包含有利于添加負荷分子或輔助分子的區域。當此類添 加影響了接頭的非結構化性質或引入了潛在的靜電或空間干擾時，將適當增加接頭長度w 確保結合結構域能夠使其位點結合在配體上。按照本文的方法和教導，此類確定可通過本 領域技術人員常規地做出。
[0075] 在本發明的實施方式中，其中配體結合結構域和接頭主要包含天然序列，在典型 的患者中通常不期望該天然序列是嚴重免疫原性或毒性的。
[0076] 本發明的多膚可用作對與疾病相關的共價穩定的二聚配體(諸如生長因子）的作 用進行中和的治療劑。它們還可具有用作診斷試劑的商業化潛力，W在成像和非成像診斷 應用中檢測與疾病相關的共價穩定的二聚配體(諸如生長因子)的存在。
[0077] 本發明還涵蓋了對本發明的多膚進行編碼的核巧酸序列。可對運些核巧酸序列進 行克隆并將其插入到任何合適的載體(包括表達載體)中，并因此運些核巧酸序列非常適合 于生產本發明的多膚。
[0078] 如本文所使用的術語"載體"指的是可向其中插入核酸序列的載體核酸分子，W用 于將核酸序列引入它可在其中復制的細胞中。核酸序列可W是"外源的"，運意味著核酸序 列對于載體被引入其中的細胞而言是外來的，或所述序列與細胞中的序列同源、但處在宿 主細胞核酸之內的通常未發現該序列的位置中。載體包括質粒、粘粒、病毒(隧菌體、動物病 毒和植物病毒)和人工染色體(例如YACs)。通過標準重組技術，本領域技術人員將很好地準 備構建載體(參見，例如，Maniatis等，1988W及Ausubel等，1994, W引用的方式將兩者并入 本文）。另外，就有效的載體構建而言，在參照的附圖中表明和本文所述的技術也是有啟發 性的。
[0079] 術語"表達載體"指的是任何類型的遺傳構建體，其包含對能被轉錄的RNA進行編 碼的核酸。在一些情況中，RNA分子隨后被翻譯成蛋白質、多膚或膚。在其它情況中，例如在 反義分子或核酶的生產中，運些序列不被翻譯。表達載體可包含多種的"控制序列"，該控制 序列指的是在特定宿主細胞中對于可操作地連接的編碼序列的可能的翻譯和轉錄而言所 必需的核酸序列。除了支配轉錄和翻譯的控制序列之外，載體和表達載體可包含還起到其 它功能、在下文描述的核酸序列。
[0080] 如本文所使用的術語"多膚"或"蛋白質"是指通過膚鍵W特定序列連接的氨基酸 的聚合物。如本文所使用的，除非另外具體地指定，術語"氨基酸"指的是氨基酸的D或L立體 異構體形式。
[0081] 如本文所使用的分子的"生物活性"部分指的是能夠執行與較大的分子類似功能 的較大的分子的部分。僅作為非限制性實例，蛋白質的生物活性部分是蛋白質的任何部分， 該部分保留了（即使僅略微地)執行全長蛋白質的一種或多種生物功能的能力(例如與另一 分子結合、憐酸化等）。作為非限制性實例，配體結合結構域是TGFi3受體的生物學部分。
[0082] 如本文所使用的術語"治療有效量"意味著減弱或抑制過度的TGF-β信號傳導并因 此使得治療、預防本文所述的疾病病癥或減緩本文所述的疾病病癥的進展速度的TGF-β配 體捕獲劑的量。根據患者和他或她的狀態W及本領域技術人員公知的其它因素，有效量將 取決于待治療的病癥或病理而變化。本領域技術人員容易確定有效量。在一些實施方式中， W范圍為0.05mg/kg體重-50mg/kg體重、W及任選1. Omg/kg體重-lOmg/kg體重、或0.3mg/kg 體重-3.Omg/kg體重的劑量，經由皮下途徑、銷內途徑、對流增強途徑、靜脈內途徑或動脈內 途徑，W每日至每月的間隔給予治療劑量。在多個實施方式中，每周1-7次、或每周一次、或 每兩周一次、每Ξ周一次、或每四周一次向受試者給予TGF-β配體捕獲劑。在多個實施方式 中，向受試者給予TGF-β配體捕獲劑1 -5天、1 -5周、1 -5個月、或1 -5年。
[0083] 盡管根據本發明提供了一些示例性的給予途徑，但可對TGF-β配體捕獲劑的任何 合適的給予途徑進行改進，因此本文所述的給予途徑并不意在進行限制。給予途徑可包括 但不限于靜脈內、口服、頰部、鼻內、吸入、局部施用至粘膜、或注射(包括皮內注射、銷內注 射、腦池內注射、病灶內注射或任何其它類型的注射）。給予可連續地或間歇地進行，并隨受 試者和待治療的病癥而變化。本領域技術人員將容易理解的是，本文所述的多種給予途徑 將使得能夠在肺部疾病位置或祀細胞上、在肺部疾病位置或祀細胞中、在接近肺部疾病位 置或祀細胞處遞送TGF-β配體捕獲劑或組合物。本領域技術人員還將容易理解的是，本文所 述的多種給予途徑將使得能夠將本文所述的TGF-β配體捕獲劑或組合物遞送至在待治療的 患病組織、器官或單個細胞的鄰近區域。"鄰近"可包括受試者中的任何組織或體液，所述組 織或體液足夠緊密地接近患病組織、器官或單個細胞，或者與患病組織、器官或單個細胞充 分連通，從而使得向受試者給予的TGF-β配體捕獲劑或組合物的至少部分到達其預期祀標 并發揮其治療效果。
[0084] 藥物組合物
[0085] 在多個實施方式中，本發明提供了包含本文所述的TGF-β配體捕獲劑的藥物組合 物。在多個實施方式中，藥物組合物被配制用于改進釋放、持續釋放、或控制釋放、或它們的 組合。在多個實施方式中，藥物組合物被配制用于口服、經由吸入、鼻部、舌下、頰部、皮下、 皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或腸胃外給予。
[0086] 在多個實施方式中，藥物組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的賦形劑。賦 形劑的實例包括但不限于淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、 潤濕劑、乳劑、著色劑、脫模劑(release agents)、包衣劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、防腐劑、 抗氧化劑、增塑劑、膠凝劑、增稠劑、硬化劑、凝固劑（setting agents)、懸浮劑、表面活性 劑、保濕劑、載體、穩定劑W及它們的組合。
[0087] 在多個實施方式中，藥物組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的載體。藥學 上可接受的載體在本領域中是公知的，并包括水性溶液，例如生理緩沖鹽水、或其它溶劑、 或輔料(諸如乙二醇、甘油、植物油(例如橄攬油)或可注射的有機醋）。藥學上可接受的載體 可用于向體外的細胞或向受試者體內給予本發明的組合物。藥學上可接受的載體可包含生 理學上可接受的化合物，例如，所述化合物具有對組合物進行穩定或增加試劑的吸收的作 用。生理學上可接受的化合物可包括例如碳水化合物(諸如葡萄糖、薦糖或右旋糖）、抗氧化 劑(諸如抗壞血酸或谷脫甘膚）、馨合劑、低分子量蛋白質或其它穩定劑或賦形劑。其它生理 學上可接受的化合物包括潤濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑，防腐劑特別是用于防止微生物 的活動或生長。多種防腐劑是公知的并包括例如苯酪和抗壞血酸。本領域的技術人員知曉 的是，藥學上可接受的載體(包含生理學上可接受的化合物）的選擇取決于例如多膚的給予 途徑。例如，生理學上可接受的化合物(諸如單硬脂酸侶或明膠)被特別用作延長向受試者 給予的藥物組合物的吸收速度的延遲劑。可在1日的111，1^1111叫如11'3?}1日^11.5^.，第15版， (Mack Publ. Co .，Easton，1975)中發現載體、穩定劑或輔助劑的進一步實例，將其W引用的 方式并入本文。載體的其它實例包括但不限于基于納米顆粒的載體(例如，聚合物N-(2-^ 丙基）甲基丙締酷胺化PMA)、谷氨酸、PEG、右旋糖)和納米載體(例如，納米殼、脂質體、納米 脂質體）。
[0088] 治療方法
[0089] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者中的肺高壓(PH)或降低受試 者中的肺高壓(PH)的進展速度的方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療 有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的PH或降低受試者中的PH的進展速 度。在一些實施方式中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲 劑之前，將藥學上可接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。肺動脈高壓是可特別適合于用 TGF-β配體捕獲劑治療的肺高壓的類型。因此，在一些實施方式中，該方法包括向受試者給 予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的肺動脈高壓(包括肺動脈高 壓的如下亞類中的任一者)或降低受試者中的肺動脈高壓(包括肺動脈高壓的如下亞類中 的任一者)的進展速度。肺動脈高壓可繼發于其它病癥、或作為原發性或特發性肺動脈高壓 產生。特別令人感興趣的是，家族性肺動脈高壓的一些類型與骨形態發生蛋白受體II型 (BMPRII)的降低的表達或功能有關，運被認為導致了 TGF-β的過度的信號傳導。
[0090] 肺高壓可具有五種主要類型，因此實施了一系列的測試，W將肺動脈高壓與如下 區分開:靜脈肺高壓、缺氧性肺高壓、血栓栓塞性肺高壓或混雜性肺高壓。運些測試一般包 括:肺功能測試;血液測試W排除HIV、自身免疫性疾病和肝部疾病;屯、電圖巧CG);動脈血氣 測量;胸部X射線（如果懷疑有間質性肺部疾病，隨后進行高分辨率CT掃描）；W及通氣灌注 或V/Q掃描，W排除慢性血栓栓塞性肺高壓。PAH的診斷需要肺高壓的存在。雖然可基于超聲 屯、動圖對肺動脈壓進行估計，但用穿過屯、臟右側的Swan-Ganz導管進行的壓力測量提供了 用于診斷的最確切的評估。
[0091] 本領域技術人員精通于監測肺高壓中的改善，例如通常通過"六分鐘步行測試" (即，患者在六分鐘內可步行的距離)對臨床改善進行測量。運一測量中的穩定性和改善與 更好的存活相關聯。血液BNP水平現還被用于跟蹤肺高壓患者的進展。還可通過分析動脈壓 對癥狀的改善進行監測。例如，生活在海平面的人在休息時的正常肺動脈壓具有8mmHg- 20111111叱（1066化-2666?日）的平均值。當休息時平均肺動脈壓超過25111111化(3300?日)時，存在 肺高壓。不應將平均肺動脈壓（mPAP)與通常在超聲屯、動圖報告中報告的肺動脈收縮壓 (sPAP)混淆。40mm Hg的收縮壓通常暗示著超過25mm化的平均壓力。粗略地，mPAP = 0.61 · sPAP+2。
[0092] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者中的肺血管重塑或降低受試 者中的肺血管重塑的進展速度的方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療 有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的肺血管重塑或降低受試者中的肺血 管重塑的進展速度。在一些實施方式中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量 的TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。
[0093] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者的屯、臟中的血管重塑或降低 受試者的屯、臟中的血管重塑的進展速度的方法。在一些實施方式中，該方法可進一步包括 在向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可接受的載體與TGF-β配體 捕獲劑混合。在一些實施方式中，本發明的方法降低了二尖瓣退行性病變、或例如二尖瓣脫 垂。可通過超聲屯、動圖對有益效果進行監測。
[0094] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者中的肺纖維化或降低受試者 中的肺纖維化的進展速度的方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效 量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的肺纖維化或降低受試者中的肺纖維化的 進展速度。在多個實施方式中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量的TGF-β配 體捕獲劑之前，將藥學上可接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。
[0095] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者中的右屯、室肥厚或降低受試 者中的右屯、室肥厚的進展速度的方法。在多個實施方式中，該方法包括向受試者給予治療 有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的右屯、室肥厚或降低受試者中的右屯、 室肥厚的進展速度。在一些實施方式中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量 的TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。
[0096] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者中的與過度的TGF-β信號傳導 有關的肺部疾病或降低受試者中的與過度的TGF-β信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的 方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而 治療、預防受試者中的所述疾病或降低受試者中的所述疾病的進展速度。在一些實施方式 中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可 接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。
[0097] 在多個實施方式中，TGF-β可W是TGF-化、TGF-盼或它們的組合。
[0098] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者中的與過度的GDF15信號傳導 有關的肺部疾病或降低受試者中的與過度的GDF15信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的 方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而 治療、預防受試者中的所述疾病或降低受試者中的所述疾病的進展速度。在一些實施方式 中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可 接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。
[0099] 在多個實施方式中，本發明提供了治療、預防受試者中的與過度的PAI-1信號傳導 有關的肺部疾病或降低受試者中的與過度的PAI-1信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的 方法。在一些實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而 治療、預防受試者中的所述疾病或降低受試者中的所述疾病的進展速度。在一些實施方式 中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可 接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。
[0100] 在多個實施方式中，本發明提供了降低受試者中的右屯、室收縮壓的方法。在一些 實施方式中，該方法包括向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而降低受試者中 的右屯、室收縮壓。在一些實施方式中，該方法可進一步包括在向受試者給予治療有效量的 TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混合。
[0101] 在多個實施方式中，上述實例中的受試者是哺乳動物。在一些實施方式中，受試者 是人、猴、猿、狗、貓、牛、馬、山羊、綿羊、豬、兔、小鼠或大鼠。在多個實施方式中，TGF-β是 TGF-化、TGF-盼或它們的組合。
[0102] 在多個實施方式中，向受試者給予的TGF-β配體捕獲劑的量為0.05mg/kg體重- 50mg/kg體重、任選1. Omg/kg體重-1 Omg/kg體重、或0.3mg/kg體重-3. Omg/kg體重。在多個實 施方式中，每周1-7次、或每周一次、或每兩周一次、或每Ξ周一次、或每四周一次向受試者 給予TGF-β配體捕獲劑。在多個實施方式中，向受試者給予TGF-β配體捕獲劑1-5天、1-5周、 1-5個月或1-5年。TGF-β配體捕獲劑可通過用于蛋白質療法的任何途徑給予，包括但不限于 皮下給予、靜脈內給予或肌內給予。
[0103] 如上所述，在多個實施方式中，向受試者口服、經由吸入、鼻部、舌下、頰部、皮下、 皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或腸胃外給予TGF-β配體捕獲劑。在多個實施方式中，在受試者 發展如下疾病病癥之前、期間或之后給予TGF-β配體捕獲劑，所述疾病病癥包括但不限于： 肺高壓、肺血管重塑、肺纖維化、右屯、室肥厚、與過度的TGF-β信號傳導有關的肺部疾病、與 過度的GDF15信號傳導有關的肺部疾病W及與過度的PAI-1信號傳導有關的肺部疾病。
[0104] 在多個實施方式中，TGF-β配體捕獲劑是藥物組合物的部分。在多個實施方式中， 藥物組合物被配制用于改進釋放、持續釋放、或控制釋放、或它們的組合。在多個實施方式 中，藥物組合物被配制用于口服、經由吸入、鼻部、舌下、頰部、皮下、皮內、肌內、靜脈內、腹 膜內或腸胃外給予。
[0105] 在多個實施方式中，藥物組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的賦形劑。賦 形劑的實例包括但不限于淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、 潤濕劑、乳劑、著色劑、脫模劑、包衣劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、增塑劑、 膠凝劑、增稠劑、硬化劑、凝固劑、懸浮劑、表面活性劑、保濕劑、載體、穩定劑W及它們的組 厶 1=1 〇
[0106] 本發明的一些實施方式可由如下編號段落中的任一段定義：
[0107] 段落1. 一種治療、預防受試者中的肺高壓(PH)或降低受試者中的肺高壓(PH)的進 展速度的方法，所述方法包括：向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預 防受試者中的PH或降低受試者中的PH的進展速度。
[0108] 段落2.如段落1所述的方法，其中，所述PH通過過度的TGF-β信號傳導而介導。
[0109] 段落3.如段落1-2中任一段所述的方法，其中，所述受試者是人。
[0110] 段落4.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑包含：1)TGF 受體的TGF-β配體結合結構域;W及2)免疫球蛋白的Fc結構域。
[0111] 段落5.如段落4所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑進一步包含在TGF受體的 TGF-β配體結合結構域和Fc結構域之間的接頭。
[0112] 段落6.如段落1-5中任一段所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑是可溶性重 組TGF-的I型受體Fc-融合蛋白（TGFBRII-Fc)。
[0113] 段落7.如段落1-6中任一段所述的方法，其中，所述TGFBRII-Fc由SEQ ID NO: 1或 其變體中列出的序列組成。
[0114] 段落8.如段落1-6中任一段所述的方法，其中，所述TGFBRII-Fc包含SEQ ID NO: 1 或其變體中列出的序列。
[0115] 段落9.如段落1-6中任一段所述的方法，其中，所述TGFBRII-Fc包含SEQ ID NO: 1 中列出的序列的一個或多個生物活性部分。
[0116] 段落10.如段落1-6中任一段所述的方法，其中，通過如下核酸對所述TGFBRII-化 進行編碼，所述核酸包含SEQ ID NO:2或其簡并變體中列出的核巧酸序列。
[0117] 段落11.如段落1-10中任一段所述的方法，其中，向受試者給予的TGF-β配體捕獲 劑的量為0.1 mg/kg體重-lOmg/kg體重。
[0118] 段落12.如段落1-11中任一段所述的方法，其中，每月1-7次向受試者給予所述 TGF-β配體捕獲劑。
[0119] 段落13.如段落1-12中任一段所述的方法，其中，向受試者給予所述TGF-β配體捕 獲劑1-5天、1-5周、1-5個月或1-5年。
[0120] 段落14.如段落1-13中任一段所述的方法，其中，向受試者口服、經由吸入、鼻部、 舌下、頰部、皮下、皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或腸胃外給予TGF-β配體捕獲劑。
[0121] 段落15.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，在受試者發展PH之前、期間或之 后給予TGF-β配體捕獲劑。
[0122] 段落16.如段落1-15中任一段所述的方法，其中，所述方法進一步包括在向受試者 給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可接受的載體與TGF-β配體捕獲劑混 厶 1=1 〇
[0123] 段落17.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑是藥物組 合物的部分。
[0124] 段落18.如段落17所述的方法，其中，所述藥物組合物被配制用于改進釋放、持續 釋放、或控制釋放、或它們的組合。
[0125] 段落19.如段落17所述的方法，其中，所述藥物組合物被配制用于口服、經由吸入、 鼻部、舌下、頰部、皮下、皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或腸胃外給予。
[01%]段落20.如段落17所述的方法，其中，所述藥物組合物進一步包含至少一種藥學上 可接受的賦形劑。
[0127] 段落21.如段落17所述的方法，其中，所述藥物組合物進一步包含至少一種藥學上 可接受的載體。
[0128] 段落22. -種治療、預防受試者中的肺血管重塑或降低受試者中的肺血管重塑的 進展速度的方法，所述方法包括：向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、 預防受試者中的肺血管重塑或降低受試者中的肺血管重塑的進展速度。
[0129] 段落23. -種治療、預防受試者中的肺纖維化或降低受試者中的肺纖維化的進展 速度的方法，所述方法包括:向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防 受試者中的肺纖維化或降低受試者中的肺纖維化的進展速度。
[0130] 段落24.如段落23所述的方法，所述方法使用段落4-10中任一段所述的TGF-β配體 捕獲劑。
[0131] 段落25.-種治療、預防受試者中的右屯、室肥厚或降低受試者中的右屯、室肥厚的 進展速度的方法，所述方法包括：向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、 預防受試者中的右屯、室肥厚或降低受試者中的右屯、室肥厚的進展速度。
[0132] 段落26.如段落25所述的方法，所述方法使用段落4-10中任一段所述的TGF-β配體 捕獲劑。
[0133] 段落27. -種治療、預防受試者中的與過度的TGF-β信號傳導有關的肺部疾病或降 低受試者中的與過度的TGF-β信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的方法，所述方法包括： 向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的所述疾病或降低 受試者中的所述疾病的進展速度。
[0134] 段落28.如段落27所述的方法，所述方法使用段落4-10中任一段所述的TGF-β配體 捕獲劑。
[0135] 段落29.如段落1-28中任一段所述的方法，其中，所述TGF-β是TGF-i31、TGF-盼或它 們的組合。
[0136] 段落30. -種治療、預防受試者中的與過度的GDF15信號傳導有關的肺部疾病或降 低受試者中的與過度的GDF15信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的方法，所述方法包括： 向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的所述疾病或降低 受試者中的所述疾病的進展速度。
[0137] 段落31.如段落30所述的方法，所述方法使用段落4-10中任一段所述的TGF-β配體 捕獲劑。
[0138] 段落32. -種治療、預防受試者中的與過度的PAI-1信號傳導有關的肺部疾病或降 低受試者中的與過度的PAI-1信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的方法，所述方法包括： 向受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防受試者中的所述疾病或降低 受試者中的所述疾病的進展速度。
[0139] 段落33.如段落32所述的方法，所述方法使用段落4-10中任一段所述的TGF-β配體 捕獲劑。
[0140] 段落34.-種降低受試者中的右屯、室收縮壓的方法，所述方法包括：向受試者給予 治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而降低受試者中的右屯、室收縮壓。
[0141] 段落35.如段落34所述的方法，所述方法使用段落4-10中任一段所述的TGF-β配體 捕獲劑。
[0142] 實施例
[0143] 提供如下實施例是為了更好地闡明所請求保護的發明，而不應解釋為限制本發明 的范圍。就所提到的具體的材料而言，只是為了說明的目的，而并不意在限制本發明。本領 域技術人員可開發出等效方式或反應物，而無需創造力且并不背離本發明的范圍。
[0144] 實施例1:額外的背景和結果的簡要概括
[0145] 如上所述，轉化生長因子-(TGF-β)配體對發展中的重要過程進行協調，并對疾病 中的纖維化和組織重塑進行調節。過度的TGF-β信號傳導已牽設在肺高壓(PH)的動脈重塑 中，部分基于TG邱I型受體(ALK5)激酶抑制劑的能力，W改進動物模型中的實驗性PH。然而， ALK5抑制劑的臨床部署已受到屯、血管毒性的限制。本文所公開的實驗和結果表明，可溶性 重組TGF的I型受體Fc-融合蛋白（TGFBRII-Fc)在野百合堿(MCT)-誘發PH的大鼠中抑制TG邱 信號傳導。當在MCT之后預防性地給予時，TGFBRII-Fc處理降低了右屯、室收縮壓、右屯、室肥 厚并減弱了肺血管重塑。與TG邱信號傳導的減弱一致，TGFBRII-Fc對MCT大鼠肺中的TG邱轉 錄祀標PAI-1的升高的mRNA水平進行了校正。當在MCT之后的2.5周給予時，TGFBRII-Fc在第 5周時部分地復蘇了已確立的PH并具有改善的存活趨勢。值得注意的是，未發現與W任何劑 量的TGFBRII-Fc處理相關的屯、臟結構異常或瓣膜異常。總體而言，本文所公開的數據支持 如下結論:TG邱配體捕獲劑可W是用于校正TG邱-介導的肺血管重塑和PH的有效和可接受 的安全策略。
[0146] 實施例2
[0147] 表1.非限制性的示例性的TG邱配體結合結構域
[014 引
[0149] 實施例3
[0150] 表2.非限制性的示例性的接頭
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] 還在考慮之列的是編碼各上述的接頭和結合結構域的核酸序列。
[0155] 實施例4
[0156] 材料和方法
[0157] PAH的大鼠模型
[015引雄性Sprague-Dawley大鼠（6-8周齡，體重150g-170g)購自化arles River實驗室。 所有的方案和外科手術均由當地的動物保護委員會批準。動物在24°C下于12小時光照-黑 暗周期中飼養。食物和水自由攝取。大鼠接受野百合堿(MCT，40mg/kg)的單次皮下注射，W 誘發PAH。表3中總結了包括在本研究中的大鼠總數和死亡數。
[0159]表3
[0160]
[0161] 藥物處理
[0162] 預防方案-在PAH誘發后24小時，將大鼠隨機分為TGFBRII-化組（5mg/kg或15mg/ kg，每周兩次)或輔料組。將大鼠處理21天。在第14天，通過超聲屯、動圖對屯、室功能和RV重塑 進行檢查。在第21天，使大鼠接受血流動力學和右屯、室肥厚測量。
[0163] 復蘇方案-在另一群組中，對TGFBRII-化逆轉PAH進展的能力進行了檢查。在第18 天，用MCT注射大鼠并隨機給予TGFBRII-Fc (15mg/kg，每周Ξ次)或輔料。在第35天檢查血流 動力學和右屯、室肥厚(RVH)。
[0164] LV和RV功能的超聲屯、動圖評估
[0165] 在PA出秀發后第14天，用1.5%異氣燒對大鼠進行麻醉，并將其保持在仰邸位置。使 用Visual Sonics小動物高頻超聲探針檢測肺血流加速、右屯、室功能和肥厚W及左屯、室功 能。使多普勒穿過二尖瓣和Ξ尖瓣，W確定TGFBRII-化處理是否誘發任何明顯的反流或損 傷。
[0166] 血流動力學和RVH測量
[0167] 在特定的時間點，將大鼠用戊己比妥進行麻醉，并穿過氣管進行插管。使用曬齒類 動物呼吸機對大鼠進行機械通氣，并如之前所述使用填充有流體的導管穿過右屯、室(RV)頂 點進行血流動力學評估(Megalou, A. J.，Glava ,C.，Vilaeti,A.D.，Oikonomidis , D 丄.， Baltogiannis'G.G.，Papalois,A.，Vlahos,A.P.和Kolettis'T.M.(2012)Pulm Circ 2， 461-469)。用PBS對肺進行灌注，將一個右肺葉切除并快速冷凍，W用于RNA和蛋白質提取。 用1%多聚甲醒(PFA)進一步灌注肺進入肺動脈中，隨后灌注氣管1分鐘。將左肺葉包埋在石 蠟中。為了獲取RVH的程度，移出屯、臟，將RV游離壁從左屯、室加上間隔壁化V+S)中解剖出來， 并分別稱重。從RV/ (LV+S)比例對RVH的程度進行確定。
[0168] 血管重塑的定量
[0169] 為了確定肺血管重塑的程度，用α-平滑肌肌動蛋白和血管性血友病因子對肺組織 切片進行染色。對遠端腺泡內血管（直徑1〇μπι-5化m)的肌肉化進行定量，并對無肌肉化血 管、部分肌肉化血管和完全肌肉化血管的百分比進行計算。
[0170] 對全部的完全肌肉化的腺泡內血管(直徑10皿-50皿)的內側壁厚度進行計算。將 壁厚指數計算為:指數=(外徑-內徑)/外徑X 100。
[0171] 表達研究
[0172] 將冷凍肺樣品進行勻漿，并如之前所述使用TRIZ化試劑進行總的RNA提取(Long, L.'Crosby,A.，Yang,X.，Southwood,Μ.，Upton,P.D.，Kim,D.K.和Morrell,N.W.(2009) Circulation 119,566-576)。如此前所述實施逆轉錄和定量PCR化ong,L.，C;rosby,A.， 化ng,X.，Southwood,M.，Upton,P.D.，Kim,D.K.和Morrell,N.W.(2009)Ci;rculation 119， 566-576)。計算特異性基因對β-肌動蛋白的比例，并將該比例表示為倍數變化。表4中總結 了大鼠-特異性的序列。
[017引 表4
[0174]
[0175] 試劑
[0176] 野百合堿購自Oakwood ProductS公司。重組人ΒΜΡ4、TGFm、TG邱巧日GDF15從R&D Systems獲得。對憐酸化-Smad 3而言特異性的一抗購自Abeam，而對憐酸化-Smad 2、憐酸 化-Smad 1/5W及總的Smad 3而言特異性的其它一抗從Cell Signaling獲得。
[0177] 統計分析
[0178]血流動力學和RVH測量W及肺血管重塑定量的所有分析W盲法實施。將數據表示 為平均值±561，并采用t檢驗在各組之間進行比較。p<0.05被認為統計學上顯著。
[01巧]二尖瓣的血管重塑
[0180] 圖9A至圖9B示出了表明響應于TGFBRII-Fc處理而無二尖瓣重塑、退行性病變或異 常的屯、臟組織切片。圖9A為對照。圖9B為經TGFBRII-Fc-處理。
[0181] 上述多種方法和技術提供了實施該申請的多種方式。當然，應當理解的是，根據本 文所述的任何特定實施方式，所述的所有目標和優點未必都能實現。因此，例如，本領域技 術人員將認識到，可通過實現或優化如本文教導的一個優點或一組優點而不必實現如本文 教導或暗示的其它目標或優點的方式來實施本方法。本文提及了多種替代方式。應當理解 的是，一些優選的實施方式具體包括一種、另一種或多種特征，而其它的實施方式則具體地 排除一種、另一種或多種特征，然而還有其它實施方式通過包括一種、另一種或多種有利特 征而緩和特定的特征。
[0182] 此外，技術人員將認識到來自不同實施方式的多種特征的適用性。相似地，本領域 的普通技術人員能夠W多種組合采用上述公開的多種要素、特征和步驟W及各此類要素、 特征或步驟的其它已知等同物，W根據本文所述的原理實施方法。在多種要素、特征和步驟 之中，一些將被具體地包括在不同的實施方式之中，而其它的則被具體地排除在不同的實 施方式之外。
[0183] 雖然本申請已在一些實施方式和實施例的上下文中進行了公開，但是本領域的技 術人員將會理解的是，本申請的實施方式延伸到具體公開的實施方式之外，并延伸至其它 替代性實施方式和/或用途W及其修改物和等同物。
[0184] 在一些實施方式中，在描述本申請特定實施方式的上下文中（尤其是在如下一些 權利要求的上下文中）使用的術語"一"、"一個"、"所述/該"和類似的提法可被解釋為涵蓋 單數和復數。本文列舉的值的范圍僅意在用作單獨提及的落在該范圍內的各單獨值的速記 方法。除非本文另外指明，否則每個單獨的值均被并入本說明書，就像在本文中單獨列舉一 樣。除非本文另外指明或上下文明顯沖突，否則本文所述的所有方法可W按任何合適的順 序實施。關于本文的一些實施方式提供的任何和所有實例或示例性語言（例如，"諸如"）的 使用僅意在更好地闡明本申請，并不對本申請的范圍造成限制，除非它們被請求保護。本說 明書中的語言不應解釋為是表示實踐本申請所必需的任何未請求保護的要素。
[0185] 本文對運一申請的優選實施方式進行了描述，包括本發明人已知的用于實施本申 請的最佳模式。在本領域的普通技術人員閱讀上述說明時，運些優選實施方式的變型將變 得顯而易見。在考慮之列的是，技術人員可在適當時采用此類變型，并且本申請可按本文具 體描述之外的方式加 W實踐。因此，如可適用的法律所允許的，運一申請的許多實施方式包 括所附權利要求書中列出的主題的所有修改物和等同物。此外，除非在本文中另外指明，或 除非與上下文明顯沖突，本申請涵蓋上述要素在其所有可能的變型中的任何組合。
[0186] 除了如下，將本文中參考的所有專利、專利申請、專利申請的公開文本W及其它材 料(諸如文章、書籍、說明書、出版物、文件、事物和/或類似物）由此都W此種引用方式整體 并入本文，用于所有目的：與相同材料相關的任何審查文件歷史、與本文件不一致或沖突的 任何相同材料、或可能對當前或隨后與本文件相關的權利要求書的最廣范圍具有限制作用 的任何相同材料。舉例來說，如果與任何并入的材料相關的術語的描述、定義和/或用途同 與本文件相關的術語的描述、定義和/或用途之間存在任何不一致或沖突，應w本文件中的 術語的描述、定義和/或用途為準。
[0187] 應當理解的是，本文所公開的申請的實施方式是對本申請實施方式的原理的說 明。可采用的其它修改形式可在本申請的范圍內。因此，舉例來說，而非加 W限制，本申請的 實施方式的替代構造可根據本文的教導而使用。因此，本申請的實施方式不限于如精確地 示出和描述的內容。
[0188] 在上面的詳細說明中描述了本發明的多個實施方式。雖然運些描述直接描述上面 的實施方式，但是應該理解，本領域技術人員可對本文示出和描述的特定的實施方式構想 出修改和/或變化。落入本發明說明書范圍內的任何此類修改或變化也意圖包括在其中。除 非特別指出，否則，本發明人的意圖是說明書和權利要求書中的詞匯和短語都被賦予適用 領域的普通技術人員所知曉的普通含義和慣用含義。
[0189] 已經給出了本
【申請人】在提交申請時所知道的本發明的多個實施方式的前述描述， 并意在用于說明和描述的目的。本描述并不意在詳盡無遺，也并不意在將本發明限于所公 開的精確形式，并且根據上述教導，許多修改和變化都是可能的。所描述的實施方式是用來 解釋本發明的原理及其實際應用，并用來使本領域其他技術人員能夠按多種實施方式及適 合于所預期的特定用途的多種修改來利用本發明。因此，并不意在將本發明限制至所公開 的用于實施本發明的特定實施方式。
[0190] 雖然已經示出和描述本發明的特定實施方式，但是對于本領域技術人員來說顯而 易見的是，根據本文中的教導，在不背離本發明及其較寬泛的方面的情況下可W作出改變 和修改，并且因此，所附權利要求書將在它們的范圍內涵蓋所有此類落在本發明的真正精 神和范圍內的改變和修改。本領域技術人員將理解，一般而言，本文使用的術語一般意圖作 為"開放的"術語(例如，術語"包掠'應解釋為"包括但不限于"，術語"具貧'應解釋為"具有 至少'，術語"包含"應解釋為"包含但不限于'等）。
【主權項】
1. 一種治療、預防受試者中的肺高壓(PH)或降低受試者中的肺高壓(PH)的進展速度的 方法，所述方法包括：向所述受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防所 述受試者中的PH或降低所述受試者中的PH的進展速度。2. 如權利要求1所述的方法，其中，所述PH通過過度的TGF-iH言號傳導而介導。3. 如權利要求1-2中任一項所述的方法，其中，所述受試者是人。4. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑包含：I)TGF受體 的TGF-β配體結合結構域；以及2)免疫球蛋白的Fc結構域。5. 如權利要求4所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑進一步包含在TGF受體的所述 TGF-β配體結合結構域和所述Fc結構域之間的接頭。6. 如權利要求1 -5中任一項所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑是可溶性重組 TGF-βΙΙ型受體Fc-融合蛋白（TGFBRII-Fc)。7. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中，所述TGFBRII-Fc由SEQ ID NO: 1或其變 體中列出的序列組成。8. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中，所述TGFBRII-Fc包含SEQ ID NO: 1或其 變體中列出的序列。9. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中，所述TGFBRII-Fc包含SEQ ID NO: 1中列 出的序列的一個或多個生物活性部分。10. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中，通過如下核酸對所述TGFBRII-Fc進行 編碼，所述核酸包含SEQ ID N0:2或其簡并變體中列出的核苷酸序列。11. 如權利要求1 -1 〇中任一項所述的方法，其中，向所述受試者給予的TGF-β配體捕獲 劑的量為〇. lmg/kg體重-10mg/kg體重。12. 如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中，每月1-7次向所述受試者給予所述 TGF-β配體捕獲劑。13. 如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中，向所述受試者給予所述TGF-β配體捕 獲劑1-5天、1-5周、1-5個月或1-5年。14. 如權利要求1-13中任一項所述的方法，其中，向所述受試者口服、經由吸入、鼻部、 舌下、頰部、皮下、皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或腸胃外給予所述TGF-β配體捕獲劑。15. 如權利要求1-14中任一項所述的方法，其中，在所述受試者發展PH之前、期間或之 后給予所述TGF-β配體捕獲劑。16. 如權利要求1-15中任一項所述的方法，其中，所述方法進一步包括在向所述受試者 給予治療有效量的所述TGF-β配體捕獲劑之前，將藥學上可接受的載體與所述TGF-β配體捕 獲劑混合。17. 如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中，所述TGF-β配體捕獲劑是藥物組合物 的一部分。18. 如權利要求17所述的方法，其中，所述藥物組合物被配制用于改進釋放、持續釋放、 或控制釋放、或它們的組合。19. 如權利要求17所述的方法，其中，所述藥物組合物被配制用于口服、經由吸入、鼻 部、舌下、頰部、皮下、皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或腸胃外給予。20. 如權利要求17所述的方法，其中，所述藥物組合物進一步包含至少一種藥學上可接 受的賦形劑。21. 如權利要求17所述的方法，其中，所述藥物組合物進一步包含至少一種藥學上可接 受的載體。22. -種治療、預防受試者中的肺血管重塑或降低受試者中的肺血管重塑的進展速度 的方法，所述方法包括：向所述受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防 所述受試者中的肺血管重塑或降低所述受試者中的肺血管重塑的進展速度。23. -種治療、預防受試者中的肺纖維化或降低受試者中的肺纖維化的進展速度的方 法，所述方法包括:向所述受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防所述 受試者中的肺纖維化或降低所述受試者中的肺纖維化的進展速度。24. 如權利要求23所述的方法，所述方法使用權利要求4-10中任一項所述的TGF-β配體 捕獲劑。25. -種治療、預防受試者中的右心室肥厚或降低受試者中的右心室肥厚的進展速度 的方法，所述方法包括：向所述受試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防 所述受試者中的右心室肥厚或降低所述受試者中的右心室肥厚的進展速度。26. 如權利要求25所述的方法，所述方法使用權利要求4-10中任一項所述的TGF-β配體 捕獲劑。27. -種治療、預防受試者中的與過度的TGF-β信號傳導有關的肺部疾病或降低受試者 中的與過度的TGF-iH言號傳導有關的肺部疾病的進展速度的方法，所述方法包括：向所述受 試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防所述受試者中的所述疾病或降低 所述受試者中的所述疾病的進展速度。28. 如權利要求27所述的方法，所述方法使用權利要求4-10中任一項所述的TGF-β配體 捕獲劑。29. 如權利要求1-28中任一項所述的方法，其中，所述TGF-β是TGF-βΙ、TGF-f33或它們的 組合。30. -種治療、預防受試者中的與過度的GDF15信號傳導有關的肺部疾病或降低受試者 中的與過度的GDF15信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的方法，所述方法包括：向所述受 試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防所述受試者中的所述疾病或降低 所述受試者中的所述疾病的進展速度。31. 如權利要求30所述的方法，所述方法使用權利要求4-10中任一項所述的TGF-β配體 捕獲劑。32. -種治療、預防受試者中的與過度的PAI-I信號傳導有關的肺部疾病或降低受試者 中的與過度的PAI-I信號傳導有關的肺部疾病的進展速度的方法，所述方法包括：向所述受 試者給予治療有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而治療、預防所述受試者中的所述疾病或降低 所述受試者中的所述疾病的進展速度。33. 如權利要求32所述的方法，所述方法使用權利要求4-10中任一項所述的TGF-β配體 捕獲劑。34. -種降低受試者中的右心室收縮壓的方法，所述方法包括：向所述受試者給予治療 有效量的TGF-β配體捕獲劑，從而降低所述受試者中的右心室收縮壓。35. 如權利要求34所述的方法，所述方法使用權利要求4-10中任一項所述的TGF-β配體 捕獲劑。
【文檔編號】A61K39/00GK105934249SQ201480073820
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2014年11月21日
【發明人】保羅·于, 阿斯亞·格林博格, 戴安娜·S·薩科, 羅斯琳·卡斯頓圭, 麗塔·斯帝夫斯, 拉溫德拉·庫馬爾
【申請人】布里格姆及婦女醫院股份有限公司, 阿塞勒隆制藥公司