磁性熒光多模態納米生物探針及其制備方法和應用

磁性熒光多模態納米生物探針及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種磁性熒光多模態納米生物探針及其制備方法和應用，特異性靶向肝癌細胞，包括二氧化硅將磁性納米粒子與熒光染料的共包埋功能化修飾氨基，核酸適體與磁性熒光探針共價偶聯同時特異性靶向肝癌細胞。所述的磁性納米粒子為尺寸為十納米順磁性氧化鐵，所述的熒光染料為異硫氰酸熒光素，所述的包埋劑二氧化硅為四乙基原硅酸鹽和3?氨丙基三乙氧基硅烷水解得到，所述的核酸適體為TLS11a。該探針合成方法簡便，材料易得，熒光性能穩定，為肝癌的早期診斷奠定了基礎。
【專利說明】
磁性黃光多模態納米生物探針及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明設及納米生物探針領域，具體設及一種磁性巧光探針用于制備生物傳感。
【背景技術】
[0002] 肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，盡管多數W手術切除為主，同時輔助 化療、熱療等綜合治療，部分改善了肝癌的治療效果，但是肝癌患者的長期存活率仍然比較 低，究其愿意，主要是由于大多數肝癌患者的病情隱匿，潛伏期長，腫瘤生長迅速導致早期 診斷困難。因此，早期精確祀向診斷、良好的生物兼容性、低毒副作用成為肝癌乃至癌癥診 斷的挑戰。但是，隨著近年來納米技術和生物醫學的結合，納米材料W其獨特的納米結構和 性能W及良好的穩定性，低成本等優勢引起了研究者的廣泛關注。針對目前臨床肝癌診斷 中出現的早期診斷困難、祀向效果差、有毒副作用等缺點，巧妙的利用光學成像、核磁共振 成像(MRI)和細胞成像構建多模態探針，避開單模式成像的局限性，從而達到肝癌早期祀向 診斷目的。
[0003] 二氧化娃納米顆粒由于具有大的比表面積、良好的生物相容性，結構可調，分散性 良好，細胞毒性小，并且可W進行功能化修飾等特點，已經越來越吸引人們的注意。通過二 氧化娃前驅體TE0S和APTES的水解將順磁性氧化鐵和共價結合的巧光染料同時包裹形成分 散性良好的磁性巧光核殼結構。其中順磁性氧化鐵(SPI0)既作為MRI造影劑又可作為分離 手段，巧光染料通過與氨基化娃源試劑共價結合共包裹于二氧化娃內，并能保持持久的良 好巧光性能。此外，磁性巧光多模態納米粒子表面偶聯生物活性分子增加其祀向性，祀向識 別肝癌細胞。結合特異性的祀向對比劑核磁共振成像，實現腫瘤早期診斷，同時對腫瘤治療 效果進行有效的原位監測，使評價疾病的指標更完善。磁性巧光多模態探針集磁性、巧光、 祀向于一身，祀向識別的同時可W用于核磁共振成像(MRI)，光學成像W及細胞成像利于更 直觀的觀察病灶，對于癌癥的臨床早期診斷尤其是肝癌，具有重要的意義。

【發明內容】

[0004] 技術問題:本發明的目的是提供一種磁性巧光多模態納米生物探針及其制備方法 和應用，采用兩種不同娃源試劑同時將順磁性氧化鐵(SPI0)和巧光染料異硫氯酸巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，門TC)包裹并進行表面修飾，其中順磁性氧化鐵既作為MRI 造影劑又可作為分離手段，解決了現有技術中巧光易澤滅或巧光不穩定和傳統造影劑滯留 時間短的問題。本發明還提供了巧妙的利用光學成像、核磁共振成像和細胞成像，避開單模 式成像的局限性，從而達到肝癌早期祀向診斷目的。
[0005] 技術方案：本發明的一種磁性巧光多模態探針，包括順磁性的四氧化Ξ鐵 (Ferroferric oxide，Fe3〇4)、異硫氯酉畫巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，FITC)、二氧 化娃（Si〇2)分別由四乙基原娃酸鹽（Tetraethylo;rthosilicate，TEOS)和3-氨丙基Ξ乙氧 基硅烷（3-aminop;ropyl) triethoxysi lane，APTES)的水解得到和核酸適體（TLS1 la Aptamer)，其特征在于，所述順磁性四氧化Ξ鐵(Ferroferric oxide，Fe3〇4)和巧光素異硫 氯酸巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，F]；TC)同時被二氧化娃(Si〇2)包裹形成尺寸均 一的磁性巧光探針，并能特異性識別肝癌細胞，進行光學成像、細胞成像與核磁共振成像。
[0006] 為解決上述問題，本發明采用W下技術方案:該探針W順磁性四氧化Ξ鐵核屯、，二 氧化娃為外殼，形成二氧化娃同時包裹順磁性四氧化Ξ鐵和異硫氯酸巧光素 FITC的殼核結 構，其中巧光素 FITC和3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷APTES共價偶聯形成FITC-APTES同時被包埋 于二氧化娃中，進而得到尺寸均一的磁性巧光探針，再偶聯上肝癌祀向識別核酸適體 化S11 a得到磁性巧光多模態探針。
[0007] 所述的生物探針核為順磁性四氧化Ξ鐵，粒徑為8-12nm，殼為二氧化娃，殼層厚度 40-90nm，殼層厚度調控根據TE0S和APTES的用量。
[0008] 本發明的磁性巧光多模態納米生物探針的制備方法是：W順磁性四氧化Ξ鐵為核 屯、，Si〇2為外殼同時將順磁性四氧化Ξ鐵和異硫氯酸巧光素包裹，偶聯上肝癌祀向識別核 酸適體化Slla得到尺寸均一磁性巧光多模態探針，該探針同時具有異硫氯酸巧光素的巧光 性質和順磁性四氧化Ξ鐵的順磁性性質；
[0009] 具體步驟為：
[0010] 步驟一，巧光素與氨基化娃源偶聯得到巧光素異硫氯酸巧光素-3-氨丙基Ξ乙氧 基硅烷FITC-APTES:向FITC乙醇溶液中加入APTES，室溫避光反應充分得到FITC-APTES;
[001。 步驟二，制備化304@Si02:在超聲環境下，向堿性Fe304乙醇溶液中逐滴加入TE0S乙 醇溶液，超聲反應充分得到化地4@Si02 ;
[0012] 步驟Ξ，制備Fe3〇4@Si〇2(FITC):化3〇4@Si〇2在超聲環境下，逐滴加入FITC-APTES， 再加入TE0S，振蕩均勻，繼續超聲反應充分得到化3^@Si〇2(門TC);
[OOU] 步驟四，禪聯核酸適體TLSlla制備磁性巧光多模態探針：向含有Fe3〇4@Si〇2(FITC) 的PBS(地os地ate buffer saline,憐酸緩沖鹽溶液)緩沖液中分別加入邸C和NHS(l-(3-二 甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽（l-(3-Dimethylaminop;ropyl)-3- ethylcarbodiimide hy化ochloride，抓C)和N-徑基班巧酷亞胺（N-Hy化oxysuccinimide， NHS))進行活化，活化后再加入核酸適體化S1 la，室溫反應充分后，離屯、，PBS洗涂后得到磁 性巧光多模態探針。
[0014] 所述的超聲反應溫度小于等于40°C，整個反應在避光條件下進行。
[0015] 本發明的磁性巧光多模態納米生物探針應用在祀向識別肝癌細胞，并應用于肝癌 細胞的光學成像、細胞成像和核磁共振成像。
[0016] 該磁性巧光探針用于細胞成像的最優濃度為60yg/2X105細胞。
[0017] 本發明的原理:磁性巧光多模態探針中的順磁性氧化鐵既分離手段，又作為核磁 共振成像造影劑，可W有效地改變病變組織中質子的自旋-自旋弛豫時間，從而達到增強對 比度的效果。吞隧細胞吞隧超順磁性氧化鐵顆粒后使相應區域信號減低，而腫瘤組織因不 含正常的吞隧細胞而保持信號不變。集磁性、巧光、祀向于一身，祀向識別的同時進行光學 成像，細胞成像和核磁共振成像，避開單模式成像的局限性，從而達到肝癌細胞早期祀向識 別目的。
[001引有益效果：
[0019] 1.本發明使用磁性巧光多模態探針，一方面該探針合成方法簡便，材料易得，尺寸 均一，分散性好，巧光性能穩定，與傳統造影劑相比，毒副作用小，滯留時間延長更利于多模 態成像。
[0020] 2.使用本發明磁性巧光多模態探針實現多模態，同時對早期肝癌進行可視化診 斷，避開單一模式成像的局限性，減少了檢測次數，同時對樣品的需求量較少，毒副作用小， 因此其臨床化研究具有廣泛的應用前景和重要的意義。
[0021] 3.本發明設計了尺寸均一、巧光穩定性好的W順磁性四氧化Ξ鐵為核屯、，Si〇2為 外殼的核殼結構，W核酸適配體為祀向生物活性分子，特異性表達肝癌細胞，與傳統抗體相 比，其與受體的親和力更高，且結構簡單，易于修飾，免疫原性低。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發明磁性巧光多模態探針的實施過程示意圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖和實施例對本發明做更進一步的解釋。
[0024] -種磁性巧光多模態納米生物探針及其制備與應用，特異性祀向肝癌細胞，包括 二氧化娃將磁性納米粒子與巧光染料的共包埋功能化修飾氨基，核酸適體與磁性巧光探針 共價偶聯同時特異性祀向肝癌細胞。所述的磁性納米粒子為尺寸為十納米順磁性氧化鐵， 所述的巧光染料為異硫氯酸巧光素，所述的包埋劑二氧化娃為四乙基原娃酸鹽和3-氨丙基 Ξ乙氧基硅烷水解得到。該探針合成方法簡便，材料易得，巧光性能穩定，為肝癌的早期診 斷奠定了基礎。
[0025] 具體制備步驟為：
[00%]步驟一、巧光素與氨基化娃源偶聯(門TC-APTES)
[0027] A:稱取20mg門TC，加入lOmL無水乙醇，立即加入50化1 APTES于上述溶液中。在室 溫條件下避光反應24小時，反應結束后4°C避光保存；
[0028] 步驟二、二氧化娃保護層的制備(Fe3〇4@Si化）
[00巧]B1:取lOmL無水乙醇，加入10化1 TE0S，振蕩1分鐘混合均勻。
[0030] B2:取lOmL無水乙醇，加入ImL水，再加入ImL氨水，振蕩1分鐘混合均勻。然后加入 60化L 2mg/mL化3化溶液，振蕩充分混合均勻。
[0031 ] 將B2在超聲環境下，逐滴加入B1，（標注為C)，振蕩均勻，繼續超聲反應1小時。
[0032] 步驟 Ξ、磁性巧光探針(Fe3〇4@Si〇2(FITC))
[0033] 取50化LA，振蕩1分鐘混合均勻。C在超聲環境下，逐滴加入A，再加入30化L TE0S， 振蕩均勻，繼續超聲反應2小時。注意超聲溫度不高于40°C，整個反應需在避光條件下進行。
[0034] 所述的磁性巧光探針，所述二氧化娃包埋的磁性采用W下步驟制備得到：
[00巧]步驟一、取20mg FITC溶于lOmL無水乙醇，加入50化1 APTES，混勻，置室溫避光反 應2地；
[0036] 步驟二、取lOmL無水乙醇，加入10化1 TE0S，振蕩，混勻；
[0037] 步驟Ξ、取1 OmL無水乙醇，加入ImL水，再加入ImL氨水，振蕩1分鐘混合均勻。然后 加入60化L 2mg/mL化3化溶液，振蕩充分混合均勻；
[0038] 步驟四、向步驟Ξ得到的溶液中逐滴加入步驟二溶液，混勻，超聲反應化；
[0039] 步驟五、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入5(Κ)化步驟一溶液，混勻，置室溫避光反 應化；
[0040] 步驟六、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入30化1 TEOS，置室溫避光反應化；
[0041] 步驟屯、分別用乙醇，水，pH 7.4的PBS離屯、，洗涂分離，去除未反應試劑并于pH 7.4的PBS中4°C條件下保存；
[0042] 步驟八、向步驟屯中分別加入2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-(3-Dimethylaminop;ropyl)-3-ethylca;rbodiimide hy化ochloride，邸C)和N-徑基班巧 酷亞胺（N-Hyh(Mysuccinimide，畑S)，活化15min，加入100μΙ ΙμΜ的核酸適體TLSlla，室溫 反應化后，離屯、，pH 7.4的PBS洗涂Ξ次并于抑7.4的PBS 4°C保存，備用。
[0043] 其中，步驟一至八的反應溫度均不超過40°C。
[0044] 實施例1
[0045] 本發明磁性巧光多模態探針實施過程如圖1所示。
[0046] 本實施例設及的PBS為抑7.4,無水乙醇均為優級純;使用的順磁性氧化鐵購自南 京東納生物科技有限公司；四乙基原娃酸鹽(Tetraethylo;rthosilicate，TEOS)和3-氨丙基 ^乙氧基硅烷（3-日111；[]1〇口1'〇口71)化161:11〇巧3；[1日]16,4?了65)購自美國5;[卵日-41化;[。11公司； 化Slla Aptamer序列購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0047] 所述的磁性巧光探針，所述二氧化娃包埋的磁性采用St6ba·法制備得到：
[004引步驟一、取20mg FITC溶于lOmL無水乙醇，加入50化1 APTES，混勻，置室溫避光反 應2地；
[0049] 步驟二、取lOmL無水乙醇，加入10化1 TE0S，振蕩，混勻；
[0050] 步驟Ξ、取lOmL無水乙醇，加入ImL水，再加入ImL氨水，振蕩1分鐘混合均勻。然后 加入60化L 2mg/mL化3化溶液，振蕩充分混合均勻；
[0051] 步驟四、向步驟Ξ得到的溶液中逐滴加入步驟二溶液，混勻，超聲反應化；
[0052] 步驟五、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入5(Κ)化步驟一溶液，混勻，置室溫避光反 應化；
[0053] 步驟六、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入30化1 TE0S，反應化；
[0054] 步驟屯、分別用乙醇，水，pH 7.4的PBS離屯、，洗涂分離，去除未反應試劑并于pH 7.4的PBS中4°C條件下保存；
[0055] 步驟八、向步驟屯中分別加入2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-(3-Dimethylaminop;ropyl)-3-ethylca;rbodiimide hy化ochloride，邸C)和N-徑基班巧 酷亞胺（N-Hyd;roxysuccinimide，NHS)，活化15min，加入100μLlμM的核酸適體（TLSlla Aptamer)，室溫反應化后，離屯、，pH 7.4的PBS洗涂Ξ次并于抑7.4的PBS 4°C保存，備用。 [0化6] 其中，步驟一至八的反應溫度均不超過4(TC。
[0化7] 步驟九、將0.5ml 12化g/ml磁性巧光探針與2 X 105個化pG2肝癌細胞共解育Ξ小 時，祀向識別肝癌細胞同時用于細胞成像和核磁共振成像。
[0058] W上所述僅為本發明的較佳實施方式，本發明的保護范圍并不W上述實施方式為 限，但凡本領域普通技術人員根據本發明所掲示內容所作的等效修飾或變化，皆應納入權 利要求書中記載的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種磁性熒光多模態納米生物探針，其特征在于，該探針以順磁性四氧化三鐵核心， 二氧化硅為外殼，形成二氧化硅同時包裹順磁性四氧化三鐵和異硫氰酸熒光素 FITC的殼核 結構，其中熒光素 FITC和3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES共價偶聯形成FITC-APTES同時被包 埋于二氧化硅中，進而得到尺寸均一的磁性熒光探針，再偶聯上肝癌靶向識別核酸適體 TLS11 a得到磁性熒光多模態探針。2. 根據權利要求1所述的磁性熒光多模態納米生物探針，其特征在于，所述的生物探針 核為順磁性四氧化三鐵，粒徑為8-12nm，殼為二氧化硅，殼層厚度40-90nm，殼層厚度調控根 據二氧化硅前驅體TEOS和APTES的用量。3. -種如權利要求1所述的磁性熒光多模態納米生物探針的制備方法，其特征在于，以 順磁性四氧化三鐵為核心，SiO 2為外殼同時將順磁性四氧化三鐵和異硫氰酸熒光素包裹， 偶聯上肝癌靶向識別核酸適體TLSlla得到尺寸均一磁性熒光多模態探針，該探針同時具有 異硫氰酸熒光素的熒光性質和順磁性四氧化三鐵的順磁性性質； 具體步驟為： 步驟一，熒光素與氨基化硅源偶聯得到熒光素異硫氰酸熒光素-3-氨丙基三乙氧基硅 烷FITC-APTES:向FITC乙醇溶液中加入APTES，室溫避光反應充分得到FITC-APTES; 步驟二，制備Fe3O4OSiO2:在超聲環境下，向堿性Fe3O 4乙醇溶液中逐滴加入TEOS乙醇溶 液，超聲反應充分得到Fe3O4OSiO2; 步驟三，制備Fe3〇4@Si02(FITC):Fe3〇4@Si0 2在超聲環境下，逐滴加入FITC-APTES，再加 入TE0S，振蕩均勻，繼續超聲反應充分得到Fe3〇4@Si02(FITC); 步驟四，耦聯核酸適體1'1^11&制備磁性熒光多模態探針：向含有?63〇4略10 2$11'〇的磷 酸緩沖鹽溶液PBS中分別加入EDC和NHS進行活化，活化后再加入核酸適體TLSl Ia，室溫反應 充分后，離心，PBS洗滌后得到磁性熒光多模態探針。4. 根據權利要求3所述的磁性熒光多模態納米生物探針的制備方法，其特征在于，所述 的超聲反應溫度小于等于40°C，整個反應在避光條件下進行。5. -種如權利要求1所述的磁性熒光多模態納米生物探針的應用，其特征在于該探針 應用在靶向識別肝癌細胞，并應用于肝癌細胞的光學成像、細胞成像和核磁共振成像。6. 根據權利要求5所述的磁性熒光多模態納米生物探針的應用，其特征在于該磁性熒 光探針用于細胞成像的最優濃度為60yg/2 X IO5細胞。
【文檔編號】A61K49/08GK105920620SQ201610451236
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】劉松琴, 魏珍珍
【申請人】東南大學