一種酶刺激響應型智能納米容器及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種酶刺激響應型智能納米容器，由MCM?41介孔二氧化硅和環糊精通過一條含有酯鍵的化學鏈相連接形成。所述的酶刺激響應型智能納米容器通過先將介孔二氧化硅微球進行表面修飾后與七?(6?脫氧?6?疊氮基)?β?環糊精通過反應組裝成納米容器，再通過自然吸附使藥物存儲在MCM?41介孔二氧化硅的內部制備而成。脂肪酶作用于智能納米容器中的酯鍵，實現藥物的釋放，從而促使納米容器吸附?釋放藥物分子。本發明的智能納米容器作為一種藥物載體系統，能夠對人體中的多種酶做出響應，并且對酶刺激響應靈敏度高，操作簡便，在生物化學醫學領域具有良好的應用前景，能夠實現靶向治療癌癥殺滅癌細胞，適用于癌癥的治療。
【專利說明】
-種酶刺激響應型智能納米容器及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于材料科學技術領域，具體設及一種酶刺激響應型智能納米容器及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 智能納米容器，能在外界的某種刺激信號刺激下發生水解、質子化、構象、親水性 和溶解度等性質變化，實現反饋調節，并且根據刺激信號的性質和強弱調整藥物釋放的時 間、空間和劑量。刺激信號主要包括內源性刺激，如pH值、氧化還原物質和酶濃度等，和外源 性刺激，如溫度、光、磁場、超聲和電壓等。具有緩釋、控釋和祀向釋放功能的智能納米容器 藥物傳遞系統可W提高藥物生物利用度并降低其毒副作用。具備自組裝能力的超分子實體 是構筑具有特殊性能的智能藥物載體的理想擱塊。
[0003] Wang等人（Mingdong W, et al. Qiemical Communications , 2014,50(39): 5068- 5071)將含有疊氮基的苯并咪挫和帶有烘基的β-環糊精通過點擊反應生成一個遇酸可分解 的可控開關，然后用硅烷偶聯劑3-氨基丙基和Ξ甲氧基硅烷在介孔二氧化娃表面修飾丙 氨，最終由于介孔二氧化娃-丙氨上有游離的氨基，可W和被修飾的β-環糊精上面的艦原子 發生取代反應，把遇酸可分解的開關連接到介孔二氧化娃納米微球的表面上，構建了 pH刺 激響應型智能藥物納米容器，該智能藥物納米容器能夠實現藥物在酸性條件時的抑響應吸 附和釋放。Lin等人（Min Lin,et al.Acs Applied Mate;rials&Inte;rfaces,2014,6(8): 5860-5868)制備了能夠在酶作用下發生響應的智能納米容器，通過硅烷偶聯劑Ξ乙氧基娃 燒把DNA修飾在介孔二氧化娃納米微球表面，如果納米微球的介孔中裝載有藥物分子，微球 表面卷曲形狀的DNA分子就會對納米微球進行封裝，當DNA酶(I酶)加到模擬液體中時，介孔 二氧化娃納米微球表面的DNA就會發生水解，成為大量細小的片段，介孔處的口打開，藥物 分子就可W釋放出來。
[0004] 目前報道的可控性釋放的智能納米容器雖然能夠對外部刺激作出響應，但是存在 響應時間長，響應過程繁瑣復雜，適用范圍狹窄，靈敏度低等問題。此外，有的智能納米容器 中的超分子閥口具有生物毒性，限制了其在生物醫學領域中的應用。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種響應過程快、靈敏度高、操作性好的酶刺激響應型智 能納米容器及其制備方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明的技術方案如下：
[0007] -種酶刺激響應型智能納米容器的制備方法，具體步驟如下：
[000引步驟1，制備介孔二氧化娃微球；
[0009] 步驟2,將介孔二氧化娃微球超聲分散在無水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基Ξ乙氧基 硅烷后加熱回流，氮氣保護，攬拌進行無水無氧縮醇反應，得到產物MS化-1;
[0010] 步驟3,將MS化-1分散在二甲基亞諷中，然后加入下二酸酢和Ξ乙胺，于35°C~45 °C下反應48~60小時，反應產物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得產物MS化-2;
[0011] 步驟4,將MS化-2與2-(2-丙烘氧基）乙醇、N，N-二異丙基碳二亞胺和4-二甲氨基化 晚在二甲基亞諷中混合，于35°C~45°C下反應24~36小時，反應產物先后用二甲基亞諷和 水清洗后烘干；
[0012] 步驟5,將步驟4得到的產物加入到吸附分子的飽和水溶液中，室溫下吸附72~84 小時；
[0013] 步驟6,將含有屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環糊精、無水硫酸銅和抗壞血酸鋼的N， Ν-二甲基甲酯胺溶液加入到步驟5中的吸附溶液中，反應72~84小時，產物用水洗后即得酶 刺激響應型智能納米容器。
[0014] 本發明步驟1中所述的介孔二氧化娃微球優選為MCM-41，可參考文獻【Werner Slobcr,Arthur Fink,Ernst Bohn.Controlled growth of monodisperse silica，spheres in the micron size range：Journal of Colloid and Interface Science，1968:P62- 69】制備。
[0015] 優選地，步驟2中，所述的介孔二氧化娃微球與3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷的摩爾比為 1:1 ~1.2:1。
[0016] 優選地，步驟3，4和6中加入反應物的量為化學反應計量比，可根據反應情況適當 增加與介孔二氧化娃反應的各物質的量W達到提高產率的目的。
[0017] 優選地，步驟5中，所述的吸附分子為羅丹明B或鹽酸多柔比星(D0X)。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有W下顯著優點：（1)本發明的酶刺激響應型智能納米 容器的制備方法簡單方便；（2)酶刺激響應型智能納米容器響應過程簡單且迅速，靈敏度 高，應用范圍廣；（3)智能納米容器中的超分子閥口具有良好的生物相容性，無毒可降解，且 不產生酸性分解物，在藥物可控釋放領域具有廣泛的應用價值。
【附圖說明】
[0019] 圖巧本發明的酶刺激響應型智能納米容器的裝配圖。
[0020] 圖2為本發明的酶刺激響應型智能納米容器的結構圖。
[0021] 圖3為酶刺激響應型智能納米容器對羅丹明B的釋放圖。
[0022] 圖4為酶刺激響應型智能納米容器對鹽酸柔比星(D0X)的釋放圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖及具體實施例，對本發明做進一步詳細說明。
[0024] 如圖1所示，為本發明的酶刺激響應型智能納米容器的制備流程圖，首先制備介孔 二氧化娃，隨后對其進行表面修飾，最后將環糊精與其進行封裝。如圖2為酶刺激響應型智 能納米容器的結構示意圖。
[0025] 本發明的一種酶刺激響應型智能納米容器，具體制備步驟如下：
[00%] 步驟1，制備介孔二氧化娃微球MCM-41，參考文獻（WernerSt郎巧Arthur Fink, Ernst Bohn.Controlled growth of monodisperse silica,spheres in the micron size range：Journal of Colloid and Interface Science，1968:P62-69)審ij備；
[0027]步驟2,將介孔二氧化娃微球超聲分散在無水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基蘭乙氧基 硅烷后加熱回流，氮氣保護，攬拌進行無水無氧縮醇反應，得到產物MSNs-1，其中介孔二氧 化娃微球與硅烷偶聯劑3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷的摩爾比為1:1~1.2:1;
[00%]步驟3,將MSNs-1分散在二甲基亞諷中，按化學計量比加入下二酸酢和Ξ乙胺，于 35°C~45°C反應48~60小時，反應產物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得產物MS化-2;
[00巧]步驟4,將MS化-2與2-(2-丙烘氧基）乙醇、N，N-二異丙基碳二亞胺和4-二甲氨基化 晚按化學計量比在二甲基亞諷中混合，于35°C~45°C下反應24~36小時，反應產物先后用 二甲基亞諷和水清洗后烘干；
[0030] 步驟5,將步驟4的產物加入到吸附分子的飽和水溶液中，室溫下吸附72~84小時， 所述吸附分子為羅丹明B或鹽酸多柔比星(D0X);
[0031] 步驟6,將屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環糊精，無水硫酸銅，抗壞血酸鋼按化學計量 比溶于Ν，Ν-二甲基甲酯胺后加入到步驟5中的吸附溶液中，繼續反應72~84小時，產物用水 洗清洗，得到上述一種酶刺激響應型智能納米容器。
[0032] 實施例1
[0033] -種酶刺激響應型智能納米容器的制備方法，具體步驟如下：
[0034] 1.制備介孔二氧化娃微球MCM-41
[0035] 將十六烷基Ξ甲基漠化錠（CTAB，0.5g)，NaOH溶液（2mo 1/L，1.75mL)與此0(240血） 混合，80°C下攬拌30min。逐滴加入正娃酸乙醋(TE0S，2.5mL)，充分攬拌lOmin后形成白色沉 淀。80°C下攬拌化，趁熱過濾，用水和甲醇充分清洗產物，90°C下真空干燥。
[0036] 稱取0.3g干燥固體，超聲分散于異丙醇(60mL)和濃鹽酸(3mL)的混合溶液，加熱回 流化，離屯、分離，用水和甲醇充分清洗，90°C下真空干燥得到介孔二氧化娃微球(MCM-41)。
[0037] 2.介孔二氧化娃的表面修飾
[003引將干燥后的MCM-41(200mg)超聲分散在無水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加熱回流，攬拌反應2地，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用無水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥過夜得白色粉末MS化-1。
[0039] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亞諷（lOmL)，加入下二酸酢（0.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在35°C條件下反應48小時，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥過夜得白色粉末MS化-2。
[0040] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亞諷(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二異丙基碳二亞胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在35°C條件下反應24小時，反應 結束后固體粉末通過離屯、收集并用二甲基亞諷和水各洗兩遍，干燥過夜得白色粉末MSNs- 3。
[0041] 3.介孔二氧化娃中藥物分子的吸附
[0042] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入50mg羅丹明B，在常溫下攬拌72小時。
[0043] 4.組裝智能納米容器
[0044] 取屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入羅丹明B(30mg)，無水硫酸銅（130mg)，抗壞血酸鋼(201.5mg)，將上述溶液加到上步吸附 的溶液中，常溫下攬拌72小時，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用水洗到基本無色，得 到上述一種酶刺激響應型智能納米容器MSNPs 1。
[0045] 5.智能納米容器的可控性釋放
[0046] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸鹽緩沖溶液3.8mL，稱取2.0mg MSNPs 1置于 折成錐形的已活化的半透膜中，將半透膜尖端朝下放入比色皿中，確保所有MSNPs 1都浸于 緩沖溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度計測其動力學變化化M = 572nm EX = 553nm)，如附圖3所示，釋放量達到40.3ymol/g。
[0047] 實施例2
[004引本發明一種酶刺激響應型智能納米容器的制備方法，步驟如下：
[0049] 1.制備介孔二氧化娃微球MCM-41
[(K)加]同實施例1步驟1方法制備。
[0051] 2.介孔二氧化娃的表面修飾
[0052] 將干燥后的MCM-41(240mg)超聲分散在無水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加熱回流，攬拌反應2地，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用無水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥過夜得白色粉末MS化-1。
[005；3] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亞諷（lOmL)，加入下二酸酢（0.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在40°C條件下反應48小時，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥過夜得白色粉末MS化-2。
[0054] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亞諷(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二異丙基碳二亞胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在40°C條件下反應24小時，反應 結束后固體粉末通過離屯、收集并用二甲基亞諷和水各洗兩遍，干燥過夜得白色粉末MSNs- 3。
[0055] 3.介孔二氧化娃中藥物分子的吸附
[0056] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入50mg羅丹明B，在常溫下攬拌72小時。
[0057] 4.組裝智能納米容器
[005引取屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入羅丹明B(30mg)，無水硫酸銅（130mg)，抗壞血酸鋼(201.5mg)，將上述溶液加到上步吸附 的溶液中，常溫下攬拌72小時，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用水洗到基本無色，得 到上述一種酶刺激響應型智能納米容器MSNPs 1。
[0059] 5.智能納米容器的可控性釋放
[0060] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸鹽緩沖溶液3.8mL，稱取2.0mg MSNPs 1置于 折成錐形的已活化的半透膜中，將半透膜尖端朝下放入比色皿中，確保所有MSNPs 1都浸于 緩沖溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度計測其動力學變化化M = 572nm EX = 553nm)，釋放量達到40.5ymol/g。
[0061] 實施例3
[0062] 本發明一種酶刺激響應型智能納米容器的制備方法，步驟如下：
[0063] 1.制備介孔二氧化娃微球MCM-41
[0064] 同實施例1步驟1方法制備。
[00化]2.介孔二氧化娃的表面修飾
[0066] 將干燥后的MCM-41(200mg)超聲分散在無水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加熱回流，攬拌反應36h，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用無水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥過夜得白色粉末MS化-1。
[0067] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亞諷（lOmL)，加入下二酸酢（0.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在45°C條件下反應60小時，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥過夜得白色粉末MS化-2。
[0068] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亞諷(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二異丙基碳二亞胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在45°C條件下反應36小時，反應 結束后固體粉末通過離屯、收集并用二甲基亞諷和水各洗兩遍，干燥過夜得白色粉末MSNs- 3。
[0069] 3.介孔二氧化娃中藥物分子的吸附
[0070] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入鹽酸多柔比星(D0X)(50mg)，在常溫下攬 拌84小時。
[0071] 4.組裝智能納米容器
[0072] 取屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入多鹽酸柔比星(D0X)(30mg)，無水硫酸銅（130mg)，抗壞血酸鋼(201.5mg)，將上述溶液加 到上步吸附的溶液中，常溫下攬拌84小時，反應結束后固體粉末通過離屯、收集并用水洗到 基本無色，得到上述一種酶刺激響應型智能納米容器MSNPs 2。
[0073] 5.智能納米容器的可控性釋放
[0074] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸鹽緩沖溶液3.8mL，稱取2.Omg MSNPs 2置于 折成錐形的已活化的半透膜中，將半透膜尖端朝下放入比色皿中，確保所有MSNPs 2都浸于 緩沖溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度計測其動力學變化化M = 480nm EX = 420nm)，如附圖4所示，釋放量達到37.祉mol/g。
【主權項】
1. 一種酶刺激響應型智能納米容器的制備方法，其特征在于，具體步驟如下： 步驟1，制備介孔二氧化娃微球； 步驟2,將介孔二氧化硅微球超聲分散在無水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷 后加熱回流，氮氣保護，攪拌進行無水無氧縮醇反應，得到產物MSNs-I; 步驟3,將MSNs-I分散在二甲基亞砜中，然后加入丁二酸酐和三乙胺，于35°C~45°C下 反應48~60小時，反應產物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得產物MSNs-2; 步驟4，將MSNs-2與2-( 2-丙炔氧基）乙醇、N，N-二異丙基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶在 二甲基亞砜中混合，于35°C~45°C下反應24~36小時，反應產物先后用二甲基亞砜和水清 洗后烘干； 步驟5,將步驟4得到的產物加入到吸附分子的飽和水溶液中，室溫下吸附72~84小時； 步驟6,將含有七-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環糊精、無水硫酸銅和抗壞血酸鈉的N，N-二 甲基甲酰胺溶液加入到步驟5中的吸附溶液中，反應72~84小時，產物用水洗后即得酶刺激 響應型智能納米容器。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述的介孔二氧化硅微球優 選為 MCM-41。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述的介孔二氧化硅微球與 3_氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為1:1~1.2:1。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5中，所述的吸附分子為羅丹明B 或鹽酸多柔比星。5. 根據權利要求1至4任一所述的制備方法制得的酶刺激響應型智能納米容器。
【文檔編號】A61K31/704GK105920613SQ201610465176
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】傅佳駿, 姜昊, 王婷
【申請人】南京理工大學