奧美拉唑用于制備自身免疫性疾病治療藥物的應用
【專利摘要】本發明提供了奧美拉唑用于制備自身免疫性疾病治療藥物的應用。本發明通過實驗發現，口服奧美拉唑對自身免疫性疾病、尤其是自身免疫性疾病導致的炎性損傷具有確切的緩解作用。進一步實驗表明，奧美拉唑下調了EAN脾臟中γ干擾素、腫瘤壞死因子α、白介素6和白介素17四種促炎性細胞因子的mRNA水平，同時上調了白介素4和白介素10兩種抗炎性細胞因子的mRNA水平。而且在脾單個核細胞培養上清液中，ELISA檢測的細胞因子表達譜也有相似的趨勢。正是基于以上藥理性質，奧美拉唑起到自身免疫性疾病治療作用，進而支撐其用于制備自身免疫性疾病治療藥物的用途。
【專利說明】
奧美拉唑用于制備自身免疫性疾病治療藥物的應用
技術領域
[0001]本發明涉及醫藥技術領域，進一步涉及物質的新的醫藥用途，具體涉及奧美拉唑用于制備自身免疫性疾病治療藥物的應用。
【背景技術】
[0002]自身免疫性疾病是指機體對自身抗原發生免疫反應而導致自身組織損害所引起的疾病。由于其成因在于自身免疫系統，因此此類病癥的治療主要著眼于免疫系統的調節，通常具有較長的療程。現有技術中依據自身免疫疾病病變位置的不同，治療方法的側重點也存在差異，普遍來看，自身免疫疾病的治療目前主要依賴于免疫抑制劑，最常用的是腎上腺皮質激素類制劑，如:強的松、氫化可的松、地塞米松等，大家往往將其簡稱“激素” ο如果療效不佳，還可能用環磷酰胺、氨甲喋呤等所謂細胞毒性藥物，這些藥物在緩解自身免疫疾病的同時，也影響著免疫系統正常的抵御能力。
[0003]奧美拉唑，5-甲氧基_2-[[ (4-甲氧基-3，5_二甲基-2-吡啶基)甲基]亞磺酰基]_IH-苯并咪唑，為質子栗抑制劑，是一種脂溶性弱堿性藥物。現有技術研究發現，奧美拉唑易濃集于酸性環境中，特異性地作用于胃黏膜壁細胞頂端膜構成的分泌性微管和胞質內的管狀泡上，即胃壁細胞質子栗(H+，K+_ATP酶)所在部位，并轉化為亞磺酰胺的活性形式，通過二硫鍵與質子栗的巰基發生不可逆行的結合，從而抑制H+，K+-ATP酶的活性，阻斷胃酸分泌的最后步驟，使壁細胞內的H+不能轉運到胃腔中，使胃液中的酸含量大為減少。對基礎胃酸和刺激引起的胃酸分泌都有很強的抑制作用。對組胺、五肽胃泌素及刺激迷走神經引起的胃酸分泌有明顯的抑制作用，對H2受體拮抗劑不能抑制的由二丁基環腺苷酸引起的胃酸分泌也有強而持久的抑制作用。
[0004]目前的醫療實踐中，奧美拉唑主要用于十二指腸潰瘍和卓-艾綜合征，也可用于胃潰瘍和反流性食管炎;靜脈注射可用于消化性潰瘍急性出血的治療。現有技術中未見奧美拉唑在自身免疫性疾病中的應用。
【發明內容】
[0005]本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供奧美拉唑用于制備自身免疫性疾病治療藥物的應用，以解決現有技術中奧美拉唑用途范圍較為局限的技術問題。
[0006]本發明要解決的另一技術問題是自身免疫性疾病的治療效果不佳。
[0007]奧美拉唑用于制備自身免疫性疾病治療藥物的應用。
[0008]作為優選，所述藥物下調體內γ干擾素含量。
[0009]作為優選，所述藥物下調體內腫瘤壞死因子α含量。
[0010]作為優選，所述藥物下調體內iNOS含量。
[0011]作為優選，所述藥物下調體內白介素6的信使RNA表達量。
[0012]作為優選，所述藥物下調體內白介素17的信使RNA表達量。
[0013]作為優選，所述藥物的劑型是口服劑。
[0014]作為優選，所述自身免疫性疾病是自身免疫性神經炎。
[0015]作為優選，所述自身免疫性疾病是由自身免疫性疾病引起的炎癥損傷。
[0016]本發明以經典的吉蘭-巴雷綜合征動物模型，即實驗性自身免疫性神經炎(EAN)作為實驗環境研究了奧美拉唑對自身免疫性疾病的治療作用。本發明發現奧美拉唑可下調促炎性細胞因子γ-干擾素、腫瘤壞死因子CU白介素6及白介素17的信使RNA水平，并上調抗炎性細胞因子白介素4和10的信使RNA的水平，從而改善EAN模型中的炎癥損傷；同時發現其在哺乳動物中的主要作用器官在于脾臟及坐骨神經。基于以上積極的發現，本發明進一步確定了利用奧美拉唑制備自身免疫性疾病治療藥物的應用。臨床評分及組織病理學檢查結果顯示，奧美拉唑干預后實驗動物坐骨神經炎癥細胞浸潤和脫髓鞘損傷得到明顯緩解，其抗炎效果也改善了免疫器官環境并間接產生神經保護作用，其療效確切、顯著。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發明實施例中奧美拉唑對EAN癥狀、組織學病理學特征以及炎癥細胞浸潤的緩解作用實驗結果圖；其中A部分是臨床評分變化圖；B部分是發病高峰期臨床評分結果；C部分是首發癥狀出現時間；D部分是臨床評估運動缺損曲線的AUC結果圖；E部分是臨床評分高峰期實驗動物坐骨神經橫斷面HE染色圖；F部分是坐骨神經中炎癥細胞浸潤數目檢測結果圖；G部分是臨床評分高峰期實驗動物坐骨神經橫斷面快藍染色圖；H部分是坐骨神經組織評分結果圖。
[0018]圖2是本發明實施例中奧美拉唑對淋巴細胞增殖情況和細胞因子表達量的影響圖；圖中A部分是淋巴細胞數量的化學發光檢測結果圖；B部分是TNF-α、IL_6、IFN- γ、IL-1a、IL-4以及IL-1O六種細胞因子表達量檢測結果圖；C?F部分分別是TNF_a、IL_6、IFN- γ、IL-1a、IL-4以及IL-10六種細胞因子mRNA表達水平檢測結果圖。
[0019]在以上附圖中，CMC標記表示對照組實驗結果，DMF-P表示奧美拉唑預防組實驗結果，DMF-T表示奧美拉唑治療組實驗結果。
【具體實施方式】
[0020]以下將對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。
[0021]以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數值不限于該準確數值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數值在正負百分之十(10%)的范圍內變化，比如，“大約100”表示的可以是90至IjllO之間的任何數值。此外，在“大約第一數值到第二數值”的表述中，大約同時修正第一和第二數值兩個數值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關。
[0022]除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。
[0023]I材料與方法
[0024]1.1實驗動物和分組
[0025]本發明以18只6-8周齡的雄性Lewis大鼠(體重160_190g)作為實驗對象。所有大鼠均在溫度合適及12小時晝夜循環的環境下飼養7天以適應環境，期間大鼠均可自由獲取食物和水。本發明將大鼠隨機分為3組(預防組，治療組，對照組，每組n = 6)。實驗共重復3次，結果類似。
[0026]1.2EAN造模及臨床功能評估
[0027]本發明將含300微克的溶解后的PO 180-199肽段(10mg/ml; B1-Synthes isCorporat1n)的300微升乳化物注射于動物的雙足墊進行造模。首先將肽段溶解于磷酸鹽緩沖液中(2毫克每毫升)，然后用含有結核菌素(strain H37RA)的同等體積的完全弗氏佐劑(CFA; D i fco)進行乳化，肽段的終濃度為I毫克每毫升。免疫后，本發明對動物的臨床癥狀進行評分，量化如下:0分正常；I分尾部變軟；2分尾部無法抬起;3分體位不能自行糾正;4分共濟失調;5分后肢輕度麻痹;6分后肢中度麻痹;7分后肢重度麻痹;8分四肢輕癱;9分四肢重癱;10分死亡。
[0028]1.3奧美拉唑處理
[0029]奧美拉唑(97 %純度)溶于0.08 %的羧甲基纖維素/磷酸鹽緩沖液中。預防組于免疫后第一天開始給藥，直到免疫后第16天(疾病高峰期)，灌胃給藥，劑量為25毫克/公斤體重/天。治療組給藥的劑量與預防組相同，是在出現癥狀后開始給藥，也就是從免疫后第7天到第16天期間給藥。對照組灌胃給同樣劑量的載體溶液(0.08%的羧甲基纖維素/磷酸鹽緩沖液)。
[0030]1.4組織病理學評估
[0031]在發病高峰期(免疫后第16天)取坐骨神經。每組6只大鼠全身麻醉后行心臟灌注，首先用4攝氏度的磷酸鹽緩沖液灌注2分鐘，然后用4%的多聚甲醛灌注5分鐘。快速分離取出坐骨神經置于4 %多聚甲醛中4攝氏度過夜，然后石蠟包埋。
[0032]石錯包塊切片(6微米)行HE (So larb1 Science&Technology)和快藍染色以評估單核細胞浸潤及脫髓鞘情況。利用尼康數字顯微鏡的圖像分析技術對HE染色中浸潤的炎癥細胞數進行計數。隨機取5個視野計算每平方毫米范圍內的細胞數目(200倍的放大倍數)。所有計數都采用的盲法計數。平均結果表示為細胞數/平方毫米。本發明用組織學評分來評價脫髓鞘的嚴重程度。每個血管旁的區域都由兩名獨立的觀察者(對于實驗分組并不知情)依據如下半定量病理組織學標準進行評分:O分，血管周圍區域無炎性細胞浸潤和脫髓鞘;I分，血管周圍區域輕度的炎性細胞浸潤；2分，血管周圍區域存在炎性細胞浸潤和脫髓鞘;3分，整個切片視野均有炎性細胞浸潤和脫髓鞘存在。
[0033]1.5淋巴細胞增殖實驗
[0034]像之前描述的一樣，利用MTS進行抗原特異的淋巴細胞增殖實驗。簡單來說，無菌取脾后收集脾單個核細胞。將100微升的密度為2 X 10~6個細胞/毫升的脾單個核細胞的單細胞懸液接種于96孔板。所用培養基為1640完全培養基(含2.05毫摩爾每升的谷氨酰胺，HyClone)，I % (v/v)HEPES溶液(Gibco)，0.I % (ν/ν)β巰基乙醇(Gibco)，I % (ν/ν)丙酮酸鈉(Gibco) ,and I % (ν/ν)青霉素/鏈霉素(Gibco) ,and 10% (ν/ν)胎牛血清(FBS;Gibco)。剛接種時即加入PO 180-199肽段(10yg/ml;B1-Synthesis Corporat1n)刺激細胞或不加。肽段的濃度是按照以往的報道來決定的。在37°C，5%二氧化碳條件下孵育72小時后，在每孔加入20微升的MTS溶液(Promega)，繼續孵育4小時。然后用酶標儀(Titertek)讀取96孔板在490nm處的吸光光度值。因為已經體內給藥，所以本發明沒有計算抑制率。所有數據均表示為平均OD值土標準誤。每組有4只大鼠進行試驗，重復3次。
[0035]1.6ELISA檢測細胞因子表達譜
[0036]單個核細胞(2\106個/1111)伴或不伴?0180-199肽段刺激，在37°(:和5%0)2條件下培養72小時后收集上清液。按照說明書應用多因子ELI SA檢測試劑盒(QIAGEN)同時對6種細胞因子包括白介素1α、白介素4、白介素6、白介素10、γ干擾素和腫瘤壞死因子α經行半定量檢測。檢測是重復進行的，結果表示為平均0D值±SEM(n = 4)。
[0037]2實驗結果
[0038]2.1奧美拉唑處理組改善EAN的癥狀、組織學改變和炎癥細胞浸潤
[0039]奧美拉唑分為兩種方式干預EAN(圖1)。在預防組中，本發明在免疫后即胃管飼載體或奧美拉唑(25mg/kg/天)。治療組中則是在免疫后第7天出現首發癥狀時開始給藥。與對照組(CMC)相比，應用臨床癥狀評分的方式，預防組和治療組均減輕了EAN的癥狀。預防組的大鼠與對照組相比，在免疫后第6天到第16天均有較好的臨床評分(每個時間點，p<0.05)。另外，治療組臨床癥狀的改善較預防組晚，其在第8天開始臨床評分低于對照組，而在免疫后第10天開始評分差異才有統計學意義(每個時間點，p<0.05)。此外預防組、治療組和對照組三組發病高峰期的得分分別是5.20±0.30，5.67±0.25和7.42±0.15(圖1A和B)。預防組延遲了機體損傷后的首發癥狀(圖1A和C)。預防組首發癥狀出現在第7.83±0.17天，治療組是第6.33 ± 0.21天，對照組是6.00 ± 0.26天(圖1C)。奧美拉唑也減少了臨床評估運動缺損曲線的曲線下面積(圖1D)。總之，奧美拉唑預防組和治療組均改善了 ΕΑΝ。
[0040]在EAN評分最高期(即免疫后第16天)，本發明對大鼠的坐骨神經進行了組織病理學評估。應用HE染色評估炎癥細胞浸潤，應用快藍染色表示髓鞘脫失。奧美拉唑干預的兩組均減少了坐骨神經中炎癥細胞的浸潤數目(圖1E和F)。奧美拉唑干預的兩組中脫髓鞘和炎癥細胞浸潤的發生率均較對照組低(圖1G和H)。應用半定量評分評估染色組織后，對照組的平均組織學評分(2.33 ± 0.25)明顯高于預防組(1.25±0.17，ρ<0.05)和治療組(1.33 土
0.25，ρ<0.05)的評分。
[0041]2.6奧美拉唑改善了淋巴細胞增殖活性反應，改變了細胞因子表達譜
[0042]在免疫16天后取EAN大鼠脾臟的單個核細胞體外培養72小時，伴或不伴Ρ0180-199肽段(10yg/ml)刺激，以評估奧美拉唑對淋巴細胞增殖活性反應的效果(圖2A)。應用MTS試驗發現，在有PO肽段刺激時，和對照組(0.91 ±0.08)相比，預防組(0.58 ± 0.02)和對照組(0.54 ± 0.05)的淋巴細胞增殖活性都較低。沒有PO肽段刺激時，有同樣的淋巴細胞增殖活性模式，但奧美拉唑干預組與對照組的差異并沒有統計學意義。
[0043]研究表明，細胞因子的表達譜影響EAN的轉歸。因此本發明應用多因子ELISA對伴或不伴PO刺激的體外培養的EAN大鼠脾臟單個核細胞的細胞因子進行了半定量分析。如圖2B所示，奧美拉唑預防組和治療組較對照組減少了單個核細胞的促炎細胞因子(白介素6、γ干擾素、白介素Ia和腫瘤壞死因子α)的產生。其中白介素6、γ干擾素和腫瘤壞死因子α的變化具有統計學差異(圖2Β，ρ<0.05)，白介素Ia的水平在三組間的變化并無意義。相反，抗炎性細胞因子白介素4和10的水平升高。但只有白介素4的水平的變化具有統計學意義(圖2Β，ρ<0.05);而白介素1在各組內的水平差異性較大，并沒有統計學差異。
[0044]本發明進一步通過脾臟的RT-PCR證實了奧美拉唑處理組單個核細胞中產生細胞因子的差異。像圖2C-H所示，奧美拉唑干預組的γ干擾素、腫瘤壞死因子α、白介素6和白介素17的mRN水平較對照組明顯下降(圖2C-F，p <0.05)，而白介素4和白介素10的水平則明顯升高(圖 2G 和H，p<0.05)。
[0045]3實驗結論
[0046]本發明研究發現，奧美拉唑下調了EAN脾臟中γ干擾素、腫瘤壞死因子α、白介素6和白介素17四種促炎性細胞因子的mRNA水平，同時上調了白介素4和白介素10兩種抗炎性細胞因子的mRNA水平。而且在脾單個核細胞培養上清液中，ELISA檢測的細胞因子表達譜也有相似的趨勢。該性質足以支撐奧美拉唑對EAN炎癥損傷的治療作用。
[0047]通過臨床評分來評估神經癥狀，本發明發現奧美拉唑可以明顯改善EAN癥狀，表現為減輕癱瘓嚴重程度，延遲首發癥狀的出現，減低高峰期臨床評分和減少臨床評分的曲線下面積。肌電圖研究表明奧美拉唑可以通過改善運動傳導速度和復合肌動作電位波幅、減少末端運動潛伏期來保護EAN導致的外周神經損傷。組織病理方面，EAN的特點是炎癥細胞浸潤和神經脫髓鞘。本項研究中，奧美拉唑的預防組和治療組較對照組均明顯減少了浸潤的炎癥細胞的積聚和退髓鞘的程度。由此可見，奧美拉唑對EAN動物具有確切的治療作用。
[0048]以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.奧美拉唑用于制備自身免疫性疾病治療藥物的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物下調體內γ干擾素含量。3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物下調體內腫瘤壞死因子α含量。4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物下調體內iNOS含量。5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物下調體內白介素6的信使RNA表達量。6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物下調體內白介素17的信使RNA表達量。7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物的劑型是口服劑。8.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述自身免疫性疾病是自身免疫性神經炎。9.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述自身免疫性疾病是由自身免疫性疾病引起的炎癥損傷。
【文檔編號】A61P25/00GK105920002SQ201610298608
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月9日
【發明人】徐祗棟
【申請人】徐祗棟