包含人胎盤灌注液細胞、其亞群的組合物及其用圖

包含人胎盤灌注液細胞、其亞群的組合物及其用圖
【專利摘要】本文提供了包含來自人胎盤灌注液的單核細胞的組合物和使用該細胞的方法，包括使用該細胞和造血細胞以例如建立嵌合體，降低移植物抗宿主疾病的嚴重程度或持續時間，治療或減輕肌肉減少癥、代謝紊亂和血液學疾病例如惡性血液病的癥狀，和治療或減輕缺血性腦病(例如，缺氧缺血性腦病)及其它中樞神經系統損傷的癥狀。
【專利說明】包含人胎盤灌注液細胞、其亞群的組合物及其用途
[00011 本申請要求2013年11月15日提交的美國臨時專利申請號61/905,076和2013年11 月15日提交的美國臨時專利申請號61/905,077的權益，其公開內容在此全文引入作為參 考。 1 .技術領域
[0002] 本文提供了包含來自人胎盤灌注液的單核細胞的組合物和使用該細胞的方法，包 括將該細胞與造血細胞一起使用，例如用于建立嵌合體(chimerism);降低移植物抗宿主疾 病的嚴重程度或持續時間；治療或減輕肌肉減少癥的癥狀、代謝紊亂和血液學疾病例如惡 性血液病;和治療或減輕缺血性腦病的癥狀(例如，缺氧缺血性腦病)及其它中樞神經系統 損傷。 2.【背景技術】
[0003] 胎盤灌注液包含通過將灌注液穿過胎盤脈管系統獲得的胎盤細胞集合和來自脈 管系統、來自胎盤的母體表面、或來自兩者的灌注液集合。灌注哺乳動物胎盤的方法描述 于，例如，美國專利號7,045,146和美國專利號7,255,879。通過灌注獲得的胎盤細胞的群是 不均勻的，包括，尤其是，CD34+細胞，有核細胞例如粒細胞，單核細胞和巨噬細胞，和組織培 養基質-貼壁胎盤干細胞。
[0004] 3.發明概述
[0005] 本文提供了包含分離的人胎盤灌注液的組合物。在特別的實施方式中，人胎盤灌 注液包含至少6 X 105CD34+細胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量 的CD34+細胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+細胞。在 一些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含50倍更多數量的CD34+細胞。在一個更具體的實 施方式中，人胎盤灌注液包含基本上純的人胎盤灌注液CD34+細胞。
[0006] 在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少5 X 105⑶34+⑶451田胞。在一些 實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的CD34+CD451田胞。在一些實施方式中， 人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+CD451田胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注 液進一步包含50倍更多數量的CD34+CD45-細胞。在一個更具體的實施方式中，人胎盤灌注液 包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+⑶451田胞。
[0007] 在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少6 X105⑶34+⑶3Γ細胞。在一些 實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的CD34+CD31+細胞。在一些實施方式中， 人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+CD31+細胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注 液進一步包含50倍更多數量的CD34+CD31+細胞。在一個更具體的實施方式中，人胎盤灌注液 包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CD31+細胞。
[0008] 在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少5X 105CD34+KDR+細胞。在一些 實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的CD34+KDR+細胞。在一些實施方式中， 人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+KDR+細胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注 液進一步包含50倍更多數量的CD34+KDR+細胞。在一個更具體的實施方式中，人胎盤灌注液 包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+KDR+細胞。
[0009] 在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少5X 105CD34+CXCR4+細胞。在一 些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的CD34+CXCR4+細胞。在一些實施方式 中，人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+CXCR4+細胞。在一些實施方式中，人胎盤 灌注液進一步包含50倍更多數量的CD34+CXCR4+細胞。在一個更具體的實施方式中，人胎盤 灌注液包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CXCR4+細胞。
[0010] 在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少6 X105⑶34+⑶381田胞。在一些 實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的CD34+CD381田胞。在一些實施方式中， 人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+CD381田胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注 液進一步包含50倍更多數量的CD34+CD3K細胞。在一個更具體的實施方式中，人胎盤灌注液 包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CD381田胞。
[0011 ]在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少7 X 105CD34+CD1171田胞。在一 些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的CD34+CD1171田胞。在一些實施方式 中，人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+CD1171田胞。在一些實施方式中，人胎盤 灌注液進一步包含50倍更多數量的CD34+CD1171田胞。在一個更具體的實施方式中，人胎盤 灌注液包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+⑶1171田胞。
[0012]在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少6X 105CD34+CD140a+細胞。在一 些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的⑶34+⑶140a+細胞。在一些實施方 式中，人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的⑶34+CD140a+細胞。在一些實施方式中，人 胎盤灌注液進一步包含50倍更多數量的CD34+CD140a+細胞。在一個更具體的實施方式中，人 胎盤灌注液包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CD140a+細胞。
[0013] 在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少3 X 105CD34+巢蛋白+細胞。在一 些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的CD34+巢蛋白+細胞。在一些實施方 式中，人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的CD34+巢蛋白+細胞。在一些實施方式中，人 胎盤灌注液進一步包含50倍更多數量的CD34+巢蛋白+細胞。在一個更具體的實施方式中，人 胎盤灌注液包含基本上純的人胎盤灌注液CD34+巢蛋白+細胞。
[0014] 在其它特別的實施方式中，人胎盤灌注液包含至少3 X 104CD3 + CD4 + CD8 - ⑶25hiroi27lciw細胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含2倍更多數量的⑶3+⑶4+ ⑶8TD25hirai27lOT細胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含10倍更多數量的⑶3 +⑶4+⑶8TD25hiCDl271?細胞。在一些實施方式中，人胎盤灌注液進一步包含50倍更多數量 的⑶3+⑶4+⑶8TD25 hiroi27lciw細胞。在一個更具體的實施方式中，人胎盤灌注液包含基本上 純的人胎盤灌注液0)3+004+0^0)25^0)127 1^細胞。
[0015] 在一些實施方式中，人胎盤灌注液分離自對單一胎盤的灌注。
[0016] 本文還提供了治療對象中的中樞神經系統損傷、疾病或障礙的方法，包括對對象 施用含有本文提供的分離的人胎盤灌注液和來自另一來源的造血細胞的組合物。在一個具 體實施方式中，所述中樞神經系統損傷、疾病或障礙是缺血性腦病（例如，缺氧缺血性腦 病)。
[0017] 本文還提供了治療對象中肌肉減少癥的方法，包括對對象施用含有本文提供的分 離的人胎盤灌注液和來自另一來源的造血細胞的組合物。
[0018] 本文提供了在對象中誘導嵌合體的方法，包括對對象施用含有本文提供的分離的 人胎盤灌注液和來自另一來源的造血細胞的組合物。
[0019] 本文提供了用于對象中細胞移植的方法，包括對對象施用含有本文提供的分離的 人胎盤灌注液和來自另一來源的造血細胞的組合物。
[0020] 本文提供了用于降低對象中移植物抗宿主疾病(GVHD)的嚴重程度或持續時間的 方法，包括對對象施用含有本文提供的分離的人胎盤灌注液和來自另一來源的造血細胞的 組合物。
[0021] 本文提供了治療對象中代謝障礙的方法，包括對對象施用含有本文提供的分離的 人胎盤灌注液和來自另一來源的造血細胞的組合物。
[0022] 本文提供了治療對象中的血液學疾病或惡性血液病的方法，包括對對象施用含有 本文提供的分離的人胎盤灌注液和來自另一來源的造血細胞的組合物。
[0023] 本文提供了用于下述方法的包含分離的人胎盤灌注液或人胎盤灌注液細胞的組 合物：（a)用于治療對象中的中樞神經系統損傷、疾病或障礙，優選的所述中樞神經系統損 傷、疾病或障礙是缺氧缺血性腦病；（b)用于在對象中誘導嵌合體；（c)用于細胞移植；（d)用 于降低對象中移植物抗宿主疾病(GVHD)的嚴重程度或持續時間；（e)用于治療對象中的代 謝障礙；（f)用于治療對象中的血液學疾病或惡性血液病;或(g)用于治療對象中的肌肉減 少癥。
[0024] 本文還提供了用于下述方法的包含分離的人胎盤灌注液或人胎盤灌注液細胞的 組合物：（a)用于治療對象中的中樞神經系統損傷、疾病或障礙，優選的所述中樞神經系統 損傷、疾病或障礙是缺氧缺血性腦病；（b)用于在對象中誘導嵌合體；（c)用于細胞移植；（d) 用于降低對象中移植物抗宿主疾病(GVHD)的嚴重程度或持續時間；（e)用于治療對象中的 代謝障礙；（f)用于治療對象中的血液學疾病或惡性血液病;或(g)用于治療對象中的肌肉 減少癥，其中該組合物進一步包含來自另一來源的造血細胞。
[0025] 4.附圖簡述
[0026]圖1描述了 43個人胎盤灌注液和臍帶血單位配對的全有核細胞計數。
[0027]圖2A-2C描述了人胎盤灌注液細胞(A)閘門（gated)優先⑶45+細胞(B)和閘門優先 CD34+細胞(C)的FACS分析。
[0028]圖3A-3E描述了人胎盤灌注液(A)和臍帶血⑶閘門優先CD34+細胞的比較。然后人 胎盤灌注液細胞閘門⑶34+細胞(C)可以被分選以分離⑶34+⑶45_ (D)和⑶34+⑶45+ (E)細胞。 [0029]圖4描述了人胎盤灌注液(HPP)或臍帶血(HUCB)中表達特異性⑶34+表型的有核細 胞百分比。
[0030] 圖5描述了使用人胎盤灌注液內皮細胞(上圖）的脂蛋白攝入實驗和HUVECs和人胎 盤灌注液(HPP)細胞中觀察到的微管形成(下圖）。
[0031] 圖6描述了人胎盤灌注液(HPP)或臍帶血(HUCB)中表達⑶34和/或巢蛋白的有核細 胞百分比。
[0032]圖7描述了人胎盤灌注液(HPP)或臍帶血(HUCB)中表達特異性HLA抗原的有核細胞 百分比。
[0033]圖8描述了人胎盤灌注液或臍帶血(HUCB)中表達⑶3而有或沒有⑶4和有或沒有 ⑶8的有核細胞百分比。
[0034] 5.發明詳述
[0035]在多個方面，本文提供了生產來自人胎盤灌注液的單核細胞(HPC)的方法，例如人 胎盤灌注液，包含該細胞的組合物，和該細胞在治療患有中樞神經系統損傷、疾病、障礙或 病況的個體中的用途。在一個更具體的實施方式中，所述疾病、障礙或病況是缺血性腦病 (例如，缺氧缺血性腦病）。本文還提供了對對象(例如人對象)施用HPC(例如人胎盤灌注液） 以減輕移植物抗宿主疾病嚴重程度和治療或減輕代謝和血液學疾病的癥狀(例如惡性血液 病)的方法。本文還提供了對對象(例如人對象)施用HPC(例如人胎盤灌注液）以治療或減輕 肌肉減少癥的癥狀的方法。
[0036] 5.1包含胎盤灌注液細胞的組合物和使用其的方法
[0037] 胎盤灌注液包含如本文所述獲得自流經胎盤的灌注溶液的總單核細胞。通常，來 自單一胎盤灌注的胎盤灌注液包含約1〇〇百萬個至約500百萬個有核細胞。在某些實施方式 中，來自單一胎盤灌注的胎盤灌注液包含約1〇〇百萬個至約400百萬個有核細胞，約100百萬 個至約300百萬個有核細胞，或約100百萬個至約200百萬個有核細胞。
[0038]用于按照本公開的用途的來自人胎盤灌注液的單核細胞(HPC)，例如，人胎盤灌注 液，可以以任何醫學或藥學可接受方式進行收集，并可存在于組合物中，例如，藥物組合物。 在某些實施方式中，本文提供的組合物(例如，藥物組合物，即，適于對人施用的制藥等級的 溶液)包含人胎盤灌注液。
[0039]在某些實施方式中，胎盤灌注液或灌注液細胞包含CD34+細胞，例如，造血干細胞 或祖細胞或內皮祖細胞。在一個更具體的實施方式中，這種細胞可以包含CD34+CD45干細胞 或祖細胞，CD34+CD45+干細胞或祖細胞，骨髓祖細胞，淋巴祖細胞，和/或紅系祖細胞。
[0040] 在其它實施方式中，胎盤灌注液和胎盤灌注液細胞包含，例如，內皮祖細胞，骨祖 細胞，和/或自然殺傷細胞。
[0041] 在某些實施方式中，從胎盤中收集并去除紅細胞的胎盤灌注液，或從該灌注液中 分離的灌注液細胞，包含約60-90 %，例如，約60 %，65 %，70 %，80 %，85 %，或90 %，例如，約 60-90%，65-90%，70-90%或約75-90%的白細胞。在某些實施方式中，從胎盤中收集并去 除紅細胞的胎盤灌注液，或從該灌注液中分離的灌注液細胞，包含約2-11 %，例如，約2，3， 4,5,6,7,8,9，10或11%，例如，約5-8%，或約6-7%的自然殺傷細胞(〇)3-{056 +);和/或約 7-37%，例如，約7,8,9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20,21，22,23,24,25,26,27,28， 29，30,31，32,33,34,35,36,或37 %，例如，約20-25 %，約22-24%，或約22-23 % 的T細胞 (〇)3+);和/或約5-15%，例如，約5,6,7,8,9，10，11，12，13，14，或15%，例如，約8-12%，或 約 10-11%B細胞（CD19+);和/或約20-32%，例如，約20,21，22,23,24,25,26,27,28,29,30， 31，或32%，例如，約22-28%，25-28%，或約26-27%的單核細胞(CD14+);和/或約1-5%，例 如，約1，2，3，4，或5 %，例如約2-4%或約2-3%的內皮祖細胞(例如，CD34+，⑶3Γ);和/或約 0.5-5%，例如，約0.5,1，2,3,4,或5%，例如約2-4%或約2-3%的神經祖細胞(巢蛋白+ ); 和/或約1-7%，例如，約1，2,3,4,5,6，或7%，例如約2-4%或約3-4%的造血祖細胞(0034 + );和/或約1-5%，例如，約1，2,3,4,或5%，例如約2-4%，約2-3%，或約1-2%的貼壁胎盤 干細胞(例如，⑶34_，⑶117，⑶105+和⑶44+ )，如通過例如流式細胞術如FACS分析測定。 [0042]在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞包含CD34+細胞。在一個更具體的實施方 式中，所述CD34+細胞是CD34+CD45細胞。在另一實施方式中，所述CD34+細胞分離自胎盤。在 又一實施方式中，所述胎盤灌注液細胞群進一步包含不是分離自所述灌注液的額外的分離 的CD34+細胞(例如，分離自臍帶血，胎盤血，外周血，骨髓，等等）。在另一實施方式中，所述 額外的⑶34+細胞分離自臍帶血，胎盤血，外周血，或骨髓。
[0043] 在其它實施方式中，CD34+細胞另外是⑶117_。在某些實施方式中，CD34+細胞另外 是⑶3 Γ，CXCR4+，和/或KDR+。在某些實施方式中，⑶34+細胞另外是⑶140a+。在某些實施方式 中，CD34+細胞另外是巢蛋白+。在某些實施方式中，所述人胎盤灌注液細胞，例如所述CD34+ 細胞比相當量的臍帶血細胞包含更多的CD1171田胞。在某些實施方式中，所述CD34+細胞比 相當量的臍帶血細胞包含更多的⑶31+，CXCR4+，和/或KDR+細胞。在某些實施方式中，任意所 述CD34+細胞是CD34+CD45細胞。在某些實施方式中，所述人胎盤灌注液細胞，例如所述CD34 +細胞比相當量的臍帶血細胞包含更多的CD140a+細胞。在某些實施方式中，所述人胎盤灌注 液細胞，例如所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更多的巢蛋白+細胞。
[0044] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞以比相當量 的來自臍帶血的CD34+細胞更高的水平產生大量的一種或多種血管生成相關的標記。在具 體實施方式中，所述標記包括⑶31，KDR和/或CXCR4。在一個【具體實施方式】中，所述⑶34+細 胞是⑶45。在一個更具體的實施方式中，所述⑶34+細胞或⑶34+⑶45細胞比相當量的來自 臍帶血的⑶34+細胞表達更高水平的至少一種⑶31，CXCR4或KDR。在某些實施方式中，所述 胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+胎盤細胞比相當量的臍帶血細胞表達更高水平的巢蛋 白。
[0045] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液富集CD34+細胞。在某些實施方式中，所 述胎盤灌注液富集CD45^細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液富集CD34 +CD45^細胞。在 某些實施方式中，所述胎盤灌注液富集CD31 +，KDR+和/或CXCR4+細胞。在某些實施方式中，所 述胎盤灌注液富集CD34+CD3Γ，CD34+KDR+，和/或CD34+CXCR4+細胞。在某些實施方式中，所述 胎盤灌注液富集CD140a+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液富集CD34+CD140a+細胞。 在某些實施方式中，所述胎盤灌注液富集CD1171田胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液 富集CD34+CD1171田胞.在某些實施方式中，所述胎盤灌注液富集CD381田胞。在某些實施方 式中，所述胎盤灌注液富集CD34+CD381田胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液富集巢蛋 白+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液富集CD34+巢蛋白+細胞。在某些實施方式中， 所述胎盤灌注液富集0)3+004+0^0)25^0)127 1^細胞。
[0046] 關于富集，特定細胞群可以通過，例如，將該細胞類型引入細胞群、在細胞群中增 加額外數量的細胞類型和/或從細胞群中去除（去除一些或總的）一種或多種細胞類型，例 如，表現不同的特異性細胞表面標記表型的細胞，來富集一種或多種細胞類型，例如，表現 特異性細胞表面標記表型的細胞。
[0047] 在一些實施方式中，在所述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中富集特定細胞群或細 胞亞群通過一輪或多輪的細胞分選，例如，FACS細胞分選來完成。在一些實施方式中，在所 述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中富集特定細胞群或細胞亞群通過去除一個或多個細胞 群或細胞亞群來完成。在一些實施方式中，在所述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中富集特 定細胞群或細胞亞群通過添加已被分離自胎盤灌注液的細胞群或細胞亞群來完成。在一些 實施方式中，在所述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中富集特定細胞群或細胞亞群通過添加 已被分離自另一來源(例如臍帶血）的細胞群或細胞亞群來完成。在一些實施方式中，在所 述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中富集特定細胞群或細胞亞群通過添加已針對該細胞群 或細胞亞群進行了富集的胎盤灌注液來完成。在其它實施方式中，在所述胎盤灌注液或胎 盤灌注液細胞中富集特定細胞群或細胞亞群通過擴增該細胞群或細胞亞群來完成。在一些 實施方式中，在所述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中富集特定細胞群或細胞亞群通過增加 所述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中那些細胞的總數來完成。在一些實施方式中，在所述 胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中富集特定細胞群或細胞亞群通過增加所述胎盤灌注液或 胎盤灌注液細胞中那些細胞的比例來完成。在一些實施方式中，在所述胎盤灌注液或胎盤 灌注液細胞中富集特定細胞群或細胞亞群通過培養擴增特定細胞群或細胞亞群來完成。在 一些實施方式中，去除所述胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中的特定細胞群或細胞亞群通過 培養擴增另一特定細胞群或細胞亞群來完成。富集或分離特定細胞群或細胞亞群可以在擴 增特定細胞群或細胞亞群后進行，或對來自胎盤灌注液的總有核細胞進行。
[0048] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 父106,4\106,5\106,6\10 6,7\106,8\106，或9\1060)34 +細胞。在另一實施方式中，所述 胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含6 X 105至3 X 107CD34+細胞。在另一實施方式中，所 述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X l〇7CD34+細胞。在另一實施方式中， 所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇4至1 X l〇8CD34+細胞。在一個具體實 施方式中，用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選獲得所述CD34+細 胞。在一些實施方式中，所述CD34+細胞已從胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞中分離。在 一些實施方式中，胎盤灌注液的CD34+細胞已培養擴增。
[0049] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約10%CD34 +細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含8%至12%CD34+細 胞。
[0050] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 X 106,4 X 106,5 X 106,6 X 106,7 X 106,8 X 106,或9X 106CD34+CD45-細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含5X 105至1 X 107⑶34+CD451田胞。在另一實 施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X 1〇7⑶34+⑶45^細胞。在 另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+⑶45^ 細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇4至1 X l〇8CD34 +⑶45_細胞。在一個【具體實施方式】中，所述⑶34+⑶45_細胞已經用針對⑶34的抗體對胎盤灌 注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD45的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行 細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述CD34+CD451田胞已經用針對CD45的抗體對胎盤 灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進 行細胞分選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+CD45-細胞已從胎盤灌注液或所述胎盤灌注 液細胞中分離。
[0051] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X106,3 X 106,4 X 106,5 X 106,6 X 106,7 X 106,8 X 106,或9X 106CD34+CD31+細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含6 X 105至3 X 107⑶34+CD31+細胞。在另一實 施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X 1〇7⑶34+⑶31+細胞.在 另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+⑶31+ 細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇4至1 X l〇8CD34 +⑶31+細胞。在一個【具體實施方式】中，所述⑶34+⑶31+細胞已經用針對⑶34的抗體對胎盤灌 注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD31的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行 細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述CD34+CD31+細胞已經用針對CD31的抗體對胎盤 灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進 行細胞分選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+CD31+細胞已從胎盤灌注液或所述胎盤灌注 液細胞中分離。
[0052]在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 X 106,4X 106,5 X 106,6 X 106,7X 106,8X 106,或9X 106CD34+KDR+細胞。在另一實施方式中， 所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含5 X 105至2 X 107CD34+KDR+細胞。在另一實施方 式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X l〇7CD34+KDR+細胞。在另一 實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+KDR+細胞。 在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇4至1 X l〇8CD34+KDR+ 細胞。在一個【具體實施方式】中，所述CD34+KDR+細胞已經用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的 總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對KDR的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分 選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述CD34+KDR+細胞已經用針對KDR的抗體對胎盤灌注液的 總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分 選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+KDR+細胞已從胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞中 分咼。
[0053]在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 \106,4\106,5\106,6\106,7\10 6,8\106，或9\1060034+〇父0?4 +細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含6 X 105至3 X 107CD34+CXCR4+細胞。在另一 實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X 107CD34+CXCR4+細 胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+ CXCR4+細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 104至1 X 108⑶34+CXCR4+細胞。在一個【具體實施方式】中，所述⑶34+CXCR4+細胞已經用針對⑶34的抗體 對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CXCR4的抗體對胎盤灌注液的總有 核細胞進行細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述CD34+CXCR4+細胞已經用針對CXCR4 的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的 總有核細胞進行細胞分選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+CXCR4+細胞已從胎盤灌注液 或所述胎盤灌注液細胞中分離。
[0054]在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 X 106,4 X 106,5 X 106,6 X 106,7 X 106,8 X 106,或9X 106CD34+CD38-細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含6 X 105至3 X 107⑶34+CD381田胞。在另一實 施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X 1〇7⑶34+⑶3&細胞。在 另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+⑶3K 細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇4至1 X l〇8CD34 +⑶381田胞。在一個【具體實施方式】中，所述⑶34+⑶381田胞已經用針對⑶34的抗體對胎盤灌 注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD38的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行 細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述CD34+CD381田胞已經用針對CD38的抗體對胎盤 灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進 行細胞分選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+CD3K細胞已從胎盤灌注液或所述胎盤灌注 液細胞中分離。
[0055] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 \106,4\106,5\106,6\10 6,7\106,8\106，或9\1060034 +0)117-細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含7 X 105至2 X 107CD34+⑶1171田胞。在另一 實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X 1〇7⑶34⑶1171田胞。 在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+ CD1171田胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 104至1 X 108⑶34+⑶117-細胞。在一個【具體實施方式】中，所述⑶34+⑶117-細胞已經用針對⑶34的抗體 對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD117的抗體對胎盤灌注液的總有 核細胞進行細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述⑶34+⑶1171田胞已經用針對⑶117 的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌注液的 總有核細胞進行細胞分選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+CD1171田胞已從胎盤灌注液 或所述胎盤灌注液細胞中分離。
[0056] 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 X 106，4 X 106，5 X 106，6 X 106，7 X 106，8 X 106，或9 X 106CD34+CD140a+細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含6 X 105至2 X 107CD34+⑶140a+細胞。在另一 實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X l〇7CD34+⑶140a+細 胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+ CD140a+細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 104至1 X 108⑶34+⑶140a+細胞。在一個【具體實施方式】中，所述⑶34+⑶140a+細胞已經用針對⑶34的抗 體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD140a的抗體對胎盤灌注液的總 有核細胞進行細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述CD34+CD140a+細胞已經用針對 CD140a的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌 注液的總有核細胞進行細胞分選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+CD140a+細胞已從胎盤 灌注液或所述胎盤灌注液細胞中分離。
[0057]在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 父106,4\106,5\106,6\106,7\10 6,8\106，或9\1060)34+巢蛋白+細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含6 X 105至2 X 107CD34+巢蛋白+細胞。在另一 實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇6至1 X l〇7CD34+巢蛋白+細 胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD34+ 巢蛋白+細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇4至1 X 108CD34+巢蛋白+細胞。在一個【具體實施方式】中，所述CD34+巢蛋白+細胞已經用針對CD34的抗 體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對巢蛋白的抗體對胎盤灌注液的總 有核細胞進行細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】中，所述CD34+巢蛋白+細胞已經用針對巢 蛋白的抗體對胎盤灌注液的總有核細胞進行細胞分選、隨后用針對CD34的抗體對胎盤灌注 液的總有核細胞進行細胞分選獲得。在一些實施方式中，所述CD34+巢蛋白+細胞已從胎盤灌 注液或所述胎盤灌注液細胞中分離。
[0058]在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含約2X 106,3 \106,4\106,5\106,6\106,7\10 6,8\106，或9\106003+0)4+0)8-0)25 1^0)1271。'"細胞。在 另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含4 X104to 5 X106⑶3+⑶4+ ⑶8TD25hiCD127lOT細胞。在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 106至1 X 107⑶3+⑶4+⑶8TD25hirai27lciw細胞.在另一實施方式中，所述胎盤灌注液或所 述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇5至1 X l〇8CD3+CD4+CD8-CD25hiCD127lQW細胞。在另一實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞包含1 X 1〇4至1 X l〇8CD3 + CD4 + CD8 - CD25hiCD127lQW細胞。在一個【具體實施方式】中，所述CD3+CD4+CD8-CD25 hiCD127lQW細胞已被分 離。在一個更具體的實施方式中，所述CD3+CD4+CD8_CD25 hiCD127lQW細胞已使用人CD4+ CD25hiCD127lQW調節T細胞(Cat#15861，Stem Cell)完整試劑盒進行分離。
[0059]在某些實施方式中，富集的CD34+細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細 胞。在某些實施方式中，富集的CD34+細胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在 某些實施方式中，富集的CD34+細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50倍于未富集 的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或基本純的 ⑶34+細胞群。
[0060]在某些實施方式中，富集的CD45^細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細 胞。在某些實施方式中，富集的CD451田胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在 某些實施方式中，富集的CD45_細胞2，3,4,5,6,7,8,9，10，15,或20倍于未富集的胎盤灌注 液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或基本純的CD451田胞 群。
[0061 ]在某些實施方式中，富集的CD34+CD45-細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注 液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD451田胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注 液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD45-細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40 或50倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是 純的或基本純的群⑶34+⑶45_細胞。
[0062]在某些實施方式中，富集的⑶31+，KDR+和/或CXCR4+細胞2倍于未富集的胎盤灌注 液或胎盤灌注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD31+，KDR+和/或CXCR4+細胞3倍于未富集 的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD31+，KDR+和/或CXCR4+細胞 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。 在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或基本純的CD31 +，KDR+和/或CXCR4+細胞群。 [0063] 在某些實施方式中，富集的CD34 +CD31 +，CD34+KDR+和/或CD34+CXCR4+細胞2倍于未 富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD31 +，CD34+KDR+ 和/或CD34+CXCR4+細胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在某些實施方式中， 富集的CD34+CD3 Γ，CD34+KDR+和/或CD34+CXCR4+細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40 或50倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是 純的或基本純的CD34 +CD31+，CD34+KDR+和/或CD34+CXCR4+細胞群。
[0064]在某些實施方式中，富集的CD1171田胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液 細胞。在某些實施方式中，富集的CD1171田胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細 胞。在某些實施方式中，富集的CD117-細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50倍于 未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或基 本純的⑶117-細胞群。
[0065]在某些實施方式中，富集的⑶34+CD1171田胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌 注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD1171田胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌 注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD117-細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 40或50倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞 是純的或基本純的⑶34+CD1171田胞群。
[0066]在某些實施方式中，富集的CD3K細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細 胞。在某些實施方式中，富集的CD381田胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在 某些實施方式中，富集的CD38-細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50倍于未富集 的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或基本純的 ⑶38-細胞群。
[0067]在某些實施方式中，富集的CD34+CD3K細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注 液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD381田胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注 液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD38-細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40 或50倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是 純的或基本純的⑶34+CD38lH胞群。
[0068]在某些實施方式中，富集的CD140a+細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液 細胞。在某些實施方式中，富集的CD140a+細胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細 胞。在某些實施方式中，富集的CD140a+細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50倍 于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或 基本純的⑶140a+細胞群。
[0069]在某些實施方式中，富集的⑶34+⑶140a+細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌 注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD140a+細胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤 灌注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+CD140a+細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、40或50倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細 胞是純的或基本純的⑶34+CD140a+細胞群。
[0070] 在某些實施方式中，富集的巢蛋白+細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液 細胞。在某些實施方式中，富集的巢蛋白+細胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細 胞。在某些實施方式中，富集的巢蛋白+細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50倍 于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或 基本純的巢蛋白+細胞群。
[0071] 在某些實施方式中，富集的CD34+巢蛋白+細胞2倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌 注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+巢蛋白+細胞3倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤 灌注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD34+巢蛋白+細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、40或50倍于未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細 胞是純的或基本純的CD34+巢蛋白+細胞群。
[0072] 在某些實施方式中，富集的⑶3+⑶4+⑶8TD25hirai27lciw細胞2倍于未富集的胎盤灌 注液或胎盤灌注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD3+CD4+CD8-CD25hiCD127lQW細胞3倍于 未富集的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞。在某些實施方式中，富集的CD3 + CD4 + CDK CD25hiCD127lQW 細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50倍于未富集的胎盤灌注液或 胎盤灌注液細胞。在另一實施方式中，胎盤灌注液細胞是純的或基本純的CD3+CD4+CDK CD25 hiCD127lm^H胞群。
[0073]在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞，比相當量的臍帶 血細胞表達更低水平的CD3。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細 胞，比相當量的臍帶血細胞表達更低水平的CD3和CD8。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液 細胞，例如，所述CD34+細胞，比相當量的臍帶血細胞表達更低水平的CD3和CD4。
[0074] 在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶 血細胞包含更少的CD3+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細 胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3+CD8+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細 胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3+CD4+細胞。在某些實施方式 中，所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞已被去除了CD3+細胞。在某些實施方式中，所述 胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞已被去除了 CD3+CD8+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤 灌注液或所述胎盤灌注液細胞已被去除了 CD3+CD4+細胞。
[0075] 在某些實施方式中，去除CD3+細胞導致比未去除的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞 中2倍更少的CD3+細胞。在某些實施方式中，去除CD3+細胞導致比未去除的胎盤灌注液或胎 盤灌注液細胞中3倍更少的CD3+細胞。在某些實施方式中，去除CD3+細胞導致比未去除的胎 盤灌注液或胎盤灌注液細胞中2，3,4,5,6,7,8,9,10，15，或20倍更少的CD3+細胞。
[0076]在某些實施方式中，去除CD3+CD8+細胞導致比未去除的胎盤灌注液或胎盤灌注液 細胞中2倍更少的CD3+CD8+細胞。在某些實施方式中，去除CD3+CD8+細胞導致比未去除的胎 盤灌注液或胎盤灌注液細胞中3倍更少的CD3+CD8+細胞。在某些實施方式中，去除CD3+CD8+ 細胞導致比未去除的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 40或50倍更少的CD3+CD8+細胞。
[0077] 在某些實施方式中，去除CD3+CD4+細胞導致比未去除的胎盤灌注液或胎盤灌注液 細胞中2倍更少的CD3+CD4+細胞。在某些實施方式中，去除CD3+CD4+細胞導致比未去除的胎 盤灌注液或胎盤灌注液細胞中3倍更少的CD3+CD4+細胞。在某些實施方式中，去除CD3+CD4+ 細胞導致比未去除的胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 40或50倍更少的⑶3+CD4+細胞。
[0078] 在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶 血細胞包含更少的⑶3+⑶4+⑶8TD25 hirai27lOT細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細 胞，例如，所述CD34 +細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3 + CD4 + CD『 ⑶25hiCD127lOT⑶45RA+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述⑶34+細 胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的⑶3+⑶4+⑶8TD25 hiCD127lOTCD45RA_細胞。在某些實施 方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3+ ⑶4+⑶8-OT25hi⑶12How⑶45RA-HLADR+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例 如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的⑶3+⑶4+⑶8TD25+/TD127+/_細胞。在 某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含 更少的⑶3+⑶4+⑶8TD25 +/TD127+/TD45RA+HLADR_細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注 液細胞，例如，所述⑶34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的⑶3+⑶4+⑶8TD25 VTD127 VTD45RATCR7+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述⑶34+細胞比相 當量的臍帶血細胞包含更少的CD3+CD4+CD8-CD25 +/-CD127+/-CD45RA-CCR7-細胞。在某些實施 方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3+ ⑶4+⑶8-ro25 vTD127vTD45RA+CCR7-細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例 如，所述⑶34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的⑶3+⑶4+⑶8-OT25 +/-CD127+/TD45RA 一 HLADR+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍 帶血細胞包含更少的⑶3+⑶4+⑶8-OT25 +/-CD127+/-OT45RA-OT69+細胞。在某些實施方式中，所 述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3+CD4TD8+ 細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細 胞包含更少的⑶3+⑶4TD8+⑶45RA+HLADRTCR7+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液 細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3 +CD4_CD8+CD45RA_CCR7+細 胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞 包含更少的⑶3+⑶4TD8+⑶45RA+CCR7-細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例 如，所述⑶34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的⑶3+⑶4TD8+⑶45RATCR7-細胞。在某 些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更 少的CD3 +CD4_CD8+CD45RA_HLADR+細胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述 CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的⑶3+⑶4+⑶8+細胞。在某些實施方式中，所述 胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞包含更少的CD3+CD4TD81田 胞。在某些實施方式中，所述胎盤灌注液細胞，例如，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血細胞 包含更少的⑶3+CD4-CT8-CT69+細胞。
[0079]在某些實施方式中，本文描述的任何CD34+細胞或CD34+細胞群被擴增。在某些實施 方式中，本文描述的任何CD34+細胞或CD34+細胞群被富集。在某些實施方式中，本文描述的 任何⑶3+細胞，例如⑶34+⑶3+細胞，被去除。
[0080] 在某些實施方式中，對所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞進行處理以抑制 CD3+細胞增殖。在某些實施方式中，對所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞進行處理以 抑制CD3+CD8+細胞增殖。在某些實施方式中，對所述胎盤灌注液或所述胎盤灌注液細胞進行 處理以抑制CD3+CD4+細胞增殖。在一個【具體實施方式】中，CD3+CD4+細胞增殖的抑制通過添加 分離的 CD3+CD4+CD8-CD25hiCD127lQW 細胞來完成。
[0081] 胎盤灌注液、胎盤灌注液細胞及其任何群和亞群可以進行組合。在一個實施方式 中，一種或多種所述胎盤灌注液細胞群或亞群與來自胎盤灌注液的總有核細胞組合。在另 一實施方式中，所述胎盤灌注液細胞的一種或多種群或亞群彼此組合。在一個具體實施方 式中，所述一種或多種群或亞群已富集一種或多種特定表型的細胞。在另一【具體實施方式】 中，所述一種或多種群或亞群已從自胎盤灌注液或胎盤灌注液細胞中分離。在另一具體實 施方式中，所述一種或多種群或亞群通過一輪或多輪細胞分選獲得。在另一【具體實施方式】 中，所述一種或多種群或亞群已被去除了一種或多種特定表型的細胞。
[0082]在又一實施方式中，胎盤灌注液或灌注液細胞群與多種⑶34+細胞組合。該⑶34+細 胞可包含在，例如，未處理的胎盤、臍帶血或外周血中；胎盤血、臍帶血或外周血的總有核細 胞中；分離的胎盤血、臍帶血或外周血CD34+細胞群中；未處理的骨髓中；骨髓總有核細胞 中；分離的骨髓CD34+細胞群中，等等。在一個【具體實施方式】中，造血干細胞是CD34+胎盤內皮 祖細胞。
[0083]在一個方面，本文提供了一種治療患有中樞神經系統損傷、疾病或障礙的方法，包 括以足以對一種或多種中樞神經系統損傷、疾病或障礙的癥狀產生可檢測的改善或減輕惡 化的量對該個體施用胎盤灌注液或本文呈現的任何細胞群或亞群，或其任意組合。在一個
【具體實施方式】中，中樞神經系統損傷、疾病或障礙是缺血性腦病(例如，缺氧缺血性腦病）。 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液細胞是來自胎盤灌注液的總有核細胞。在另一實 施方式中，所述胎盤灌注液細胞是包含本文描述的胎盤灌注液細胞的任何群、亞群或組合。 在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液細胞群包含分離自單一胎盤灌注的胎盤灌注液細 胞。在另一【具體實施方式】中，所述胎盤灌注液細胞群包含不是分離自所述灌注液的分離的 CD34+細胞。在一個更具體的實施方式中，所述CD34+細胞分離自胎盤。在另一更具體的實施 方式中，所述CD34+細胞分離自臍帶血，胎盤血，外周血，或骨髓。在另一更具體的實施方式 中，所述CD34+細胞比相當量的臍帶血CD34+細胞表達更高水平的巢蛋白。
[0084] 在另一方面，本文提供了對對象(例如人對象)施用HPC(例如人胎盤灌注液）以減 輕移植物抗宿主疾病嚴重程度和/或治療或減輕代謝和血液學疾病的癥狀(例如惡性血液 病)的方法。
[0085] 在另一方面，本文提供了對對象(例如人對象)施用HPC(例如人胎盤灌注液）以治 療或減輕肌肉減少癥的癥狀的方法。該方法的進一步實施方式在后文中詳細描述。
[0086] 5.2胎盤灌注液細胞的分離、分選和表征
[0087] 本文提供了從哺乳動物胎盤獲得胎盤灌注液和胎盤灌注液細胞的方法。在本文描 述的所有實施方式中，優選的灌注液是人胎盤灌注液，優選的灌注液細胞是人胎盤灌注液 細胞。本文還描述了用于分離細胞群和亞群和用于表征細胞群和亞群及其組合的方法。 [0088]用于按照本公開的用途的來自人胎盤灌注液的單核細胞(HPC)，例如，人胎盤灌注 液，可以以任何醫學或藥學可接受方式進行收集，并可存在于組合物中，例如，藥物組合物。 在某些實施方式中，本文提供的組合物(例如，藥物組合物，即，適于對人施用的制藥等級的 溶液)包含人胎盤灌注液。在某些實施方式中，組合物包含從部分抽血的胎盤獲得的人胎盤 灌注液。在某些實施方式中，組合物包含從抽血的胎盤獲得的人胎盤灌注液。在某些實施方 式中，組合物包含細胞，例如干細胞，分離自人胎盤灌注液。在某些實施方式中，組合物包含 有核細胞分離自人胎盤灌注液，例如，單核細胞或總有核細胞。
[0089] 在一個實施方式中，HPC例如人胎盤灌注液，是無菌的。
[0090] 在一個【具體實施方式】中，通過按照標準方法去除紅血細胞和/或粒細胞來加工HPC 或人胎盤灌注液以產生有核細胞群。該富集的細胞群可不冷凍使用，或冷凍以待后用。如果 細胞群要進行冷凍，那么可以在其冷凍前向富集的細胞群中添加標準冷凍保護劑（例如， DMS0,甘油，Epilife?細胞冷凍劑(Cascade Biologies))。
[0091] 在某些實施方式中，從胎盤灌注液獲得的細胞包含來自胎盤灌注液的單核細胞。 在某些實施方式中，從胎盤灌注液獲得的細胞包含來自胎盤灌注液的總有核細胞。在特別 的實施方式中，可以加工灌注液以通過向灌注液中添加羥乙基淀粉并隨后重力沉降去除或 基本去除紅細胞。
[0092] 在某些實施方式中，從胎盤灌注液獲得的細胞獲得自單一胎盤。在某些實施方式 中，從胎盤灌注液獲得的細胞獲得自多于一個胎盤。在某些實施方式中，從胎盤灌注液獲得 的細胞獲得自兩個胎盤。在細胞獲得自多于一個胎盤的實施方式中，來自不同胎盤的細胞 可不必彼此相關或匹配。
[0093] 如本文所述，胎盤灌注液可以獲得自在灌注獲得胎盤細胞前已排出臍帶血并灌注 去除殘余血的胎盤。胎盤灌注液可以獲得自已排出臍帶血但沒有灌注去除殘余血的胎盤。 胎盤灌注液可以獲得自胎盤，所述胎盤分離自差不多0.5-6.0英寸，例如，0.5-1.0，1. Ο-? · 5 ， 1 · 5-2 · 0 ， 2 · 0-2 · 5 ， 2 · 5-3 · 0 ， 3 · 0-3 · 5 ， 3 · 5-4 · 0 ， 或4 · 0-6 · 0英寸的臍帶， 其中臍帶可以 含有殘余臍帶血，其一部分可以在灌注過程中進入胎盤灌注液，并從而包含在胎盤灌注液 中。胎盤灌注液可以獲得自既沒有排出臍帶血也沒有灌注去除殘余血的胎盤。在后兩種實 施方式中，胎盤細胞，例如，來自胎盤灌注液的有核細胞，例如，HPC，包含來自胎盤血和/或 臍帶血的有核細胞。在一個【具體實施方式】中，按照本公開的胎盤灌注液不含臍帶血。在另一
【具體實施方式】中，按照本公開的胎盤灌注液基本不含臍帶血，例如，所述胎盤灌注液包含少 于10%，少于5%，少于1 %，少于0.5%，或少于0.1 %的臍帶血。通常，如果灌注液細胞中包 含臍帶血細胞，那么為了本文提供的方法的目的，該細胞被認為是HPC群的一部分，而不是 ΗΤ細胞例如UCB細胞的一部分。
[0094] 胎盤灌注液可從單一個體收集(即，作為單一單位)用于給藥，或與其它單位混合， 例如來自相同個體或來自一名或多名其他個體。在某些實施方式中，由此獲得的胎盤灌注 液或細胞在給藥前進行儲存。在某些實施方式中，一單位胎盤灌注液包含足夠數量的細胞， 從而對每公斤對象體重給藥至少約 1.0x105,0.5x106，1.0x106，1.5x10 6,2.0x106,2.5x106， 3.(^106,4.(^10 6,5.(^106，或1.(^107從胎盤灌注液獲得的細胞，例如，總有核細胞。在某些 實施方式中，給藥一單位由此獲得的胎盤灌注液或細胞。在某些實施方式中，給藥少于一個 單位。在某些實施方式中，給藥多于一個單位。
[0095] 用于獲得胎盤灌注液的胎盤可在成功的生產和胎盤排出后回收。在某些實施方式 中，胎盤來自足月生產。在某些實施方式中，胎盤來自早產。在一些實施方式中，胎盤是懷孕 約23至約25周出生的嬰兒的胎盤。在一些實施方式中，胎盤是懷孕約26至約29周出生的嬰 兒的胎盤。在一些實施方式中，胎盤是懷孕約30至約33周出生的嬰兒的胎盤。在一些實施方 式中，胎盤是懷孕約34至約37周出生的嬰兒的胎盤。在一些實施方式中，胎盤是懷孕約37至 約42周出生的嬰兒的胎盤。
[0096] 在特別的實施方式中，在灌注胎盤以去除任何殘余臍帶血前，或在灌注胎盤而不 去除殘余臍帶血前，可將胎盤儲存約1小時至約72小時或約4至約24小時。可將胎盤儲存于 約5 °C至約25 °C，例如室溫下的抗凝溶液中。合適的抗凝溶液是本領域熟知的。例如，可以使 用肝素或華法林鈉溶液。在一個實施方式中，抗凝溶液包含肝素溶液（1 1:1000溶液 中）。在某些實施方式中，在收集HPC例如人胎盤灌注液前胎盤儲存不超過36小時。
[0097] 由此獲得的用于按照本公開的用途的人胎盤灌注液或細胞通常與細胞的對象接 受對象無關。由此獲得的用于按照本公開的用途的人胎盤灌注液或細胞通常與細胞的對象 接受對象不匹配或部分不匹配。
[0098]由此獲得的用于按照本公開的用途的人胎盤灌注液或細胞可通過任何方法獲得。 可以按照例如美國專利號7,045，148，美國專利號7,255,879，和/或美國專利號8,057,788 中公開的內容獲得胎盤灌注液，其各自內容在此全文引入作為參考。該灌注可以是例如通 過盤(pan)法灌注，其中將灌注液加壓流過胎盤脈管，在一個容納胎盤的盤中收集從胎盤 (通常是產婦一側)滲出的灌注液。灌注也可以是例如封閉回路灌注，其中灌注液僅流經并 收集自胎盤的胎兒脈管。參見，例如，美國專利號8，057，788，其內容在此全文引入作為參 考。在一個【具體實施方式】中，該灌注可以是連續的，即，在分離從胎盤灌注液獲得的細胞(例 如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細胞)之前，流經胎盤的灌注液二次流過或多次流過。 [0099] 在某些實施方式中，使用約0.5-2升灌注液，例如，約0.5-1升，或約750mL灌注一個 胎盤。在【具體實施方式】中，胎盤的灌注在約15分鐘至2小時內完成，例如，約30分鐘至1.5小 時，約30分鐘至1小時，或約30分鐘。
[0100] 從哺乳動物胎盤收集的細胞數量和類型可以通過例如使用標準細胞檢測技術來 檢測形態學和細胞表面標記的改變進行監控，所述標準細胞檢測技術例如流式細胞術、細 胞分選、免疫細胞化學(例如，用組織特異性或細胞標記特異性抗體染色）、熒光激活細胞分 選(FACS)、磁激活細胞分選(MACS)、通過使用光學或共聚焦顯微鏡檢測細胞形態、和/或通 過使用本領域熟知技術例如PCR和基因表達譜檢測基因表達的改變。這些技術也可以用于 鑒定對一種或多種特定標記呈陽性的細胞。例如，使用CD34的抗體，人們可以使用上述技術 判斷細胞是否包含可檢測量的CD34;如果包含，則該細胞是CD34+。類似的，如果細胞產生可 被RT-PCR檢測到的足夠的特定標記RNA，或比成體細胞顯著多的特定標記RNA，那么該細胞 對于該標記是陽性的。細胞表面標記(例如，CD標記如CD34)的抗體和特異性基因的序列是 本領域熟知的。
[0101] 在另一實施方式中，胎盤細胞，例如，胎盤灌注液或灌注液細胞可通過集落形成單 位分析進行鑒定和表征。集落形成單位分析是本領域熟知的。
[0102] 可使用本領域已知的標準技術對胎盤灌注液或灌注液細胞額外評價活力、增殖潛 力和壽命，例如臺盼藍排除分析、熒光素二乙酸酯攝取分析、碘化丙啶攝取分析（以評價活 力)和胸苷攝取分析、MTT細胞增殖分析（以評價增殖）。可通過本領域熟知的技術確定壽命， 例如通過測定延長培養中的最大群體倍增數確定。
[0103] 細胞可以被例如分選，例如，使用熒光激活細胞分選儀(FACS)分選。熒光激活細胞 分選（FACS)是一種眾所周知的方法，用來基于顆粒的熒光性質分離顆粒，包括細胞 (Kamarch，1987，Methods Enzymol ,151:150-165)。激光激發個體顆粒中的熒光部分產生小 的電荷，允許陽性和陰性顆粒從混合物中電磁分離。在一個實施方式中，細胞表面標記-特 異性抗體或配體用不同熒光標簽標記。用細胞分選儀處理細胞，允許基于細胞結合所用抗 體的能力來分離細胞。FACS分選的顆粒可以直接置于96孔板或384孔板的單個孔中以便于 分離和克隆。
[0104] 在另一實施方式中，磁珠可用于分離或分選細胞，和/或去除細胞群。細胞可以例 如使用磁珠激活細胞分選(MACS)技術進行分選，后者是一種基于顆粒結合磁珠(0.5-100μπι 直徑)的能力來分離顆粒的方法。可以在磁珠上進行多種有用的修飾，包括共價加入特異性 識別特定細胞表面分子或半抗原的抗體。然后將磁珠與細胞混合以使之結合。然后將細胞 通過磁場以分離具有特異性細胞表面標記的細胞。在一個實施方式中，這些細胞可以隨后 進行分離并重新與偶聯有針對另外的細胞表面標記的抗體的磁珠混合。再將細胞通過磁 場，分離結合兩種抗體的細胞。然后可以將該細胞稀釋入分開的盤中，例如微量滴定盤用于 克隆分離。
[0105] 胎盤灌注液細胞可使用其它本領域已知的方法分離，例如，選擇性生長期望的細 胞(正向選擇），選擇性破壞不需要的細胞(負向選擇）；基于混合群中的差速細胞凝集性，例 如，使用大豆凝集素;凍融流程;過濾;常規和區帶離心；離心淘洗(逆流離心）；單位重力分 離;反流分布;電泳;等等。
[0106] 5.3使用造血細胞例如臍帶血細胞和人胎盤灌注液細胞的方法
[0107] 在一個方面，本文提供了對對象例如人對象移植造血細胞的方法，包括施用造血 細胞組合來自人胎盤灌注液的單核細胞(HPC)，例如，人胎盤灌注液。所述HPC可以是人胎盤 灌注液，來自胎盤灌注液的總有核細胞，或本文所述來自人胎盤灌注液的單核細胞的任何 群、亞群或組合，包括那些富集或去除特定群或亞群的。可用于本文描述的移植造血細胞的 方法的造血細胞的來源包括，例如，骨髓或其中的細胞，外周血或其中的細胞，和臍帶血或 其中的細胞。如本文使用的，這些來源的造血細胞一起被稱為"HT細胞"。
[0108] 在一個實施方式中，本文提供了一種對對象例如人對象移植HT細胞例如人臍帶血 細胞(UCB)細胞例如人臍帶血的方法，包括給藥HT細胞，例如，人臍帶血細胞(UCB)細胞，例 如，人臍帶血，并組合來自人胎盤灌注液的單核細胞(HPC)，例如，人胎盤灌注液。在一個實 施方式中，HT細胞，例如，人UCB細胞，例如，人UCB，與對象無關。在一個【具體實施方式】中，HT 細胞例如UCB細胞，例如，人UCB，與對象部分不匹配。在另一實施方式中，HPC例如人胎盤灌 注液，與對象無關。在一個【具體實施方式】中，HPC例如人胎盤灌注液，與對象部分不匹配。在 另一【具體實施方式】中，HPC例如人胎盤灌注液，與對象不匹配。在又一實施方式中，HT細胞， 例如，人UCB細胞，例如，人UCB，與對象無關且HPC例如人胎盤灌注液，與對象無關。在又一實 施方式中，HT細胞，例如，人UCB細胞，例如，人UCB，與對象無關和部分不匹配且HPC例如人胎 盤灌注液，與對象無關和部分不匹配或與對象不匹配。在一個實施方式中，HPC例如人胎盤 灌注液，與HT細胞例如人UCB細胞如UCB，無關和不匹配。在一個實施方式中，HPC，例如人胎 盤灌注液，與HT細胞例如人UCB細胞如UCB和受試對象無關和不匹配。
[0109] 除非另有說明，否則如本文使用的"相關"在UCB或HPC的背景下指自體或一級或二 級血親。例如，與對象相關的UCB指的是來自對象自體的UCB，或來自對象的一級或二級血親 的UCB。在另一實施例中，與HPC相關的UCB指的是來自同一供體的UCB和HPC，或是一級或二 級血親的供體。類似的，除非另有說明，否則"無關"在這些背景下指比二級血親更遠的親緣 關系。
[0110] 除非另有說明，否則如本文使用的"匹配"在來自人胎盤灌注液(例如，HPC)的UCB 或細胞的背景下指的是HLA匹配的。此外，如本文使用的"部分匹配"在來自人胎盤灌注液 (例如，HPC)的UCB或細胞的背景下指的是在3/6,4/6,或5/6HLA基因座匹配的情形。同樣，除 非另有說明，否則如本文使用的"不匹配"在來自人胎盤灌注液(例如，HPC)的UCB或細胞的 背景下指的是在0/6,1/6,或2/6HLA基因座匹配。"匹配"、"部分匹配"和"不匹配"可以例如 指HT細胞例如UCB細胞和HPC之間的關系;HT細胞例如UCB細胞，單位之間的關系;和/或HT細 胞例如UCB細胞，和/或HPC和作為細胞受體的對象之間的關系。
[0111] 在某些實施方式中，該方法包括給藥一個單位的UCB或其中的細胞。在另一實施方 式中，本文給出的方法包括給藥多個單位的UCB或其中的細胞。例如，本文給出的方法可以 包括給藥2、3或4單位的UCB或其中的細胞。在其中使用了大于一個單位的HT細胞例如UCB細 胞的情況下，在某些實施方式中，至少部分HT細胞例如UCB細胞，可以與對象、與HPC和/或與 其它部分的HT細胞例如UCB細胞(例如，其它UCB細胞單位)無關。在其中使用了大于一個單 位的HT細胞例如UCB細胞的情況下，在某些實施方式中，至少部分HT細胞例如UCB細胞，可以 與對象、與HPC和/或與其它部分的HT細胞例如UCB細胞(例如，其它UCB細胞單位)不匹配或 部分匹配。在另一實施方式中，本文給出的方法可以包括給藥少于一個單位的HT細胞或 UCB，或其中的細胞。例如，本文給出的方法可以包括給藥0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8， 或0.9單位的HT細胞或UCB，或其中的細胞。在特別的實施方式中，本文給出的方法可以包括 在多次給藥中給藥特定數量的單位(少于1，1，或大于1)。
[0112] 在另一方面，本文提供了用于在對象中誘導嵌合體的方法，包括對對象給藥組合 的HT細胞例如UCB細胞如UCB，和HPC例如人胎盤灌注液，其中至少部分HT細胞例如UCB細胞， 與對象部分不匹配，和/或HPC與對象不匹配或部分匹配，從而在對象中發生嵌合體。除非另 有說明，否則如本文使用的"嵌合體"指對象中非自體DNA的存在，例如，來自相對于受體對 象不匹配或部分匹配的細胞的DNA的存在。
[0113] 在該方法的一個實施方式中，多于一個單位的HT細胞例如UCB細胞，被給藥至對 象，例如，2，3，或4單位的HT細胞例如UCB細胞，被給藥至對象。在其中多于一個單位的HT細 胞例如UCB細胞被給藥至對象的特別的實施方式中，誘導嵌合體的方法可導致多嵌合體， 即，可產生涉及大于1個至多達全部的給藥的HT細胞例如UCB細胞單位或其后代的嵌合體。
[0114] 在該方法的另一實施方式中，可以產生涉及HPC或其后代的嵌合體。。在又一實施 方式中，可以產生涉及HT細胞例如UCB細胞(包括在其中給藥多于一個單位的HT細胞例如 UCB細胞的情況中的多嵌合體)或其后代，和HPC或其后代的嵌合體。
[0115] 在該方法的又一實施方式中，HT細胞例如UCB細胞，與對象無關。在其中給藥多于 一個單位的HT細胞例如UCB的情況下，一種或多種HT細胞例如UCB細胞單位可以與對象無 關。在該方法一個【具體實施方式】中，HPC與對象無關且另外可以與HT細胞例如UCB細胞無關。 在該方法的又一實施方式中，HT細胞例如UCB細胞和HPC都與對象無關。
[0116] 在該方法的某些實施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62天內，或對對象給藥 更多HT細胞例如UCB細胞組合HPC，首先在對象中檢測到嵌合體(包括HT細胞例如UCB細胞或 其后代，或HPC或其后代的一種或兩種）。
[0117] 可以使用本領域公知的方法檢測嵌合體。例如，可以使用血樣檢測嵌合體。在一個 實施方式中，使用基于聚合酶鏈反應(PCR)的方法檢測嵌合體，例如，通過短串聯重復試驗。 在一個實施方式中，造血干細胞移植后的嵌合體檢測涉及鑒定受體和供體的的基因譜并隨 后評價受體的血液、骨髓或其它組織中混合物的程度。通過DNA進行嵌合體測試(移植分析） 使用人身份鑒定中通常使用的方法，并通過稱為短串聯重復(STR)基因座的基因組多態性 分析來完成。在一個實施方式中，在第7、14、30、60、100和180天(+/-10天)評價外周血供體 嵌合體(UCB/s和灌注液細胞）（全血、NK和T細胞）的定量(例如，使用短串聯重復實驗），外周 血受體嵌合體的定量(例如，使用短串聯重復實驗)在基線與供體細胞(UCB和灌注液細胞） 嵌合體在基線一起評價。
[0118] 在又一方面，本文提供了用于對象中的細胞移植的方法，包括對對象給藥組合的 HT細胞例如人UCB細胞如UCB，和HPC例如人胎盤灌注液，其中至少部分HT細胞例如UCB細胞 部分匹配對象，和/或HPC與對象不匹配或部分匹配，從而對象中發生細胞移植。在某些實施 方式中，細胞移植包括HT細胞例如UCB細胞或其后代的移植。在某些其它實施方式中，細胞 移植包含HPC或其后代的移植。在其它實施方式中，移植包括HT細胞例如UCB細胞或其后代， 和HPC或其后代的移植。
[0119] 在該方法的一個實施方式中，HT細胞例如UCB細胞與對象無關。在一個具體實施方 式中，HT細胞例如UCB細胞與對象部分不匹配。在另一【具體實施方式】中，HPC與對象無關并可 以另外與HT細胞例如UCB細胞無關。在一個【具體實施方式】中，HPC與對象部分不匹配。在另一
【具體實施方式】中，HPC與對象不匹配。在又一實施方式中，UCB細胞與對象無關且HPC與對象 無關。在又一實施方式中，HT細胞例如UCB細胞與對象無關和部分不匹配且HPC與對象無關 和部分不匹配或與對象不匹配。在某些實施方式中，本文給出的方法表現出相對于單獨給 藥HT細胞例如UCB細胞而言增強的移植能力。
[0120] 可以使用本領域已知的方法檢測移植。例如，在一個實施方式中，可以自第0天至 達到最低點后3天嗜中性細胞絕對計數>500/mm 3和直至在3個不同的天數獨立于最少7天的 血小板輸注的連續3天中測量血小板計數達到多20，000/mm3每1-3天進行全血差速計數。如 本文使用的，"嗜中性細胞移植"指嗜中性細胞絕對計數高于500/mm 3的嗜中性細胞最低點 后第一個3天。如本文使用的，"血小板移植"至無輸注下血細胞彡20,000/mm3 7天后顯示血 小板計數彡20,000/mm3的第一個連續3天。
[0121] 在某些實施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、或62天、或2個月、2.5個月、3個 月，或對對象給藥更多HT細胞例如UCB細胞組合HPC，在對象中檢測到細胞移植。
[0122] 在某些實施方式中，本文給出的方法包括給藥一個單位的HT細胞例如UCB細胞如 UCB。在另一實施方式中，本文給出的方法包括給藥多個單位的HT細胞例如UCB細胞如UCB。 例如，本文給出的方法可以包括給藥2、3或4單位的HT細胞例如UCB細胞如UCB。
[0123] 在又一方面，本文提供了用于降低對象中GVHD持續時間或嚴重程度的方法，包括 對對象給藥組合的HT細胞例如人UCB細胞如UCB，和HPC例如人胎盤灌注液，其中至少部分HT 細胞例如UCB細胞部分匹配對象，和/或HPC與對象不匹配或部分匹配，從而發生對象中GVHD 持續時間或嚴重程度降低。
[0124] 在該方法的一個實施方式中，HT細胞例如UCB細胞與對象無關。在一個具體實施方 式中，HT細胞例如UCB細胞與對象部分不匹配。在另一【具體實施方式】中，HPC與對象無關并可 以另外與HT細胞例如UCB細胞無關。在一個【具體實施方式】中，HPC與對象部分不匹配。在另一
【具體實施方式】中，HPC與對象不匹配。在又一實施方式中，UCB細胞與對象無關且HPC與對象 無關。在又一實施方式中，HT細胞例如UCB細胞與對象無關和部分不匹配且HPC與對象無關 和部分不匹配或與對象不匹配。在某些實施方式中，本文給出的方法顯示了與單獨給藥HT 細胞例如UCB細胞相比降低的GVHD持續時間或嚴重程度。
[0125] 在某些實施方式中，本文給出的方法包括給藥一個單位的HT細胞例如UCB細胞如 UCB。在另一實施方式中，本文給出的方法包括給藥多個單位的HT細胞例如UCB細胞如UCB。 例如，本文給出的方法可以包括給藥2、3或4單位的HT細胞例如UCB細胞如UCB。
[0126] 在另一方面，本文提供了用于治療患有肌肉減少癥的個體的的方法，包括以足以 產生針對一種或多種肌肉減少癥的癥狀的可檢測的改進或減輕其惡化程度的量對個體給 藥胎盤灌注液或任何本文給出的細胞群或亞群，或其任意組合，包括對對象給藥組合的HT 細胞例如人UCB細胞如UCB，和HPC例如人胎盤灌注液。
[0127] 在又一方面，本文提供了用于治療患有中樞神經系統損傷、疾病或障礙的個體的 的方法，包括以足以產生針對一種或多種中樞神經系統損傷、疾病或障礙的癥狀的可檢測 的改進或減輕其惡化程度的量對個體給藥胎盤灌注液或任何本文給出的細胞群或亞群，或 其任意組合，包括對對象給藥組合的HT細胞例如人UCB細胞如UCB，和HPC例如人胎盤灌注 液。在一個【具體實施方式】中，中樞神經系統損傷、疾病或障礙是缺血性腦病(例如，缺氧缺血 性腦病）。
[0128] 在某些實施方式中，本文給出的方法包括同時給藥HT細胞例如UCB細胞如UCB與 HPC例如人胎盤灌注液。在一個【具體實施方式】中，細胞同時給藥至對象。在另一實施方式中， 在0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、16、18、或24小時內或更久，或在1、2、3、4、5、6、或7天內或 更久，對對象給藥HT細胞例如UCB細胞和HPC。在一個【具體實施方式】中，HT細胞例如UCB細胞 如UCB，被給藥至對象，然后給藥HPC例如人胎盤灌注液，例如，在給藥UCB的1小時內，或在確 認對象未表現出對UCB給藥的不良反應所需的最短時間內給藥。
[0129] 本文提供的方法可以表現出下列優點，包括，例如，相對于單獨給藥HT細胞例如 UCB細胞如UCB而言，減少細胞移植的時間，限制對象中性粒細胞減少的時間，限制對象血小 板減少的時間，建立嵌合體，以及減少GVHD的嚴重程度或持續時間，或防止GVHD。
[0130] HT細胞例如UCB細胞和HPC的給藥比例可以變化。HT細胞例如UCB細胞和HPC的給藥 比例可根據本領域技術人員的判斷確定。在某些實施方式中，HT細胞例如UCB細胞和HPC的 比例為約100,〇〇〇,〇〇〇: 1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5，000,000 :1、2， 000，000:1、1，000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000: 1、5,000:1、2,000:1、1，000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1;1:2;1: 5；1:10；1:100；1:200；1:500；1:1,000；1:2,000；1:5,000；1:10,000；1:20,000；1:50,000； 1:100,000；1:500,000；1:1,000,000；1:2,000,000；1:5,000,000；1:10,000,000；1:20, 000,000; 1:50,000,000或約1:100,000,000。在某些實施方式中，HT細胞例如UCB細胞和HPC 的比例為約20:1至約1:20，或約1:10，約1:5，約1:1，約5:1或約10:1。
[0131] HT細胞例如UCB細胞和HPC的給藥可以使用本領域已知的任何細胞給藥技術進行。 在一個實施方式中，給藥是靜脈方式，例如，靜脈內，例如，通過IV，PICC管，中線，等等。例 如，HT細胞例如UCB細胞和HPC可在分離的組合物中或在單一組合物中以任何藥學或醫學可 接受的方式對對象給藥，包括注射或輸液。在某些實施方式中，組合物可制劑為可注射組合 物(例如，TO 96/39101，在此全文引入作為參考）。
[0132] 在某些實施方式中，HT細胞例如UCB細胞或HPC對對象進行腸道外給藥。如本文使 用的術語"腸道外"包括皮下注射、靜脈內注射、肌肉注射、動脈內注射或輸液技術。在某些 實施方式中，HT細胞例如UCB細胞或HPC靜脈內對對象給藥。在某些其它實施方式中，HT細胞 例如UCB細胞或HPC心室內對對象給藥。
[0133] HT細胞例如UCB細胞和HPC可單獨或合并包裝在任何藥學可接受的載體內。HT細胞 例如UCB細胞或HPC可以在任何藥學或醫學可接受容器內進行裝載、儲存或運輸，例如血袋、 轉移袋、塑料管、注射器、小瓶等等。
[0134] HT細胞例如UCB細胞和/或HPC對對象的給藥可進行一次或多次。在某些實施方式 中，給藥進行一次。在某些實施方式中，給藥進行多次，例如，2、3、4或更多次。在某些實施方 式中，HT細胞例如UCB細胞給藥多次。在某些實施方式中，HPC給藥多次。
[0135] 在某些實施方式中，按照本文描述的方法對對象給藥的臍帶血或從中獲得的細胞 (例如，臍帶血總有核細胞)的量可根據臍帶血中存在的細胞的量來確定。對對象給藥的UCB 或從中獲得的細胞(例如，臍帶血總有核細胞)和/或人胎盤灌注液或HPC或總有核從中獲得 的細胞的量或數目取決于臍帶血或從中獲得的細胞(例如，臍帶血總有核細胞)和/或人胎 盤灌注液或HPC或從中獲得的總有核細胞的來源、障礙或病況的嚴重程度或性質、以及對象 的年齡、體重和身體狀況，等等。在某些實施方式中，每公斤對象體重給藥約0.01至約0.1、 約0.1至約1、約1至約10、約10至約10 2、約102至約103、約103至約104、約10 4至約105、約105至 約106、約10 6至約107、約107至約108、或約108至約10 9臍帶血細胞（例如，臍帶血總有核細 胞），人胎盤灌注液或從中獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細胞），或總臍 帶血細胞和從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，HPC或總有核細胞）。在各實施方式中，每公斤 對象體重給藥至少約0.1、1、10、10 2、103、104、105、106、10 7、108、或109臍帶血細胞(例如，臍帶 血總有核細胞），從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細胞），或 臍帶血細胞和從胎盤灌注液獲得的細胞。
[0136] 在【具體實施方式】中，每公斤對象體重給藥至少約0.5x106、1.0x10 6、1.5x106、 2.0x106、2.5x106、3.0x10 6、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x10 6、5.5x106、6.0x106、6.5x106、 7·0χ10 6、7·5χ106、8·0χ106、8·5χ106、9·0χ10 6、9·5χ106、1·0χ107、1·5χ107、2·0χ10 7、2·5χ107、 3·0χ107、3·5χ107、4·0χ10 7、4·5χ107、5·0χ107、5·5χ107、或 6·0χ107 臍帶血細胞（例如，臍帶血 總有核細胞），從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細胞），或臍 帶血細胞和從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細胞）。在一個 更具體的實施方式中，每公斤對象體重給藥至少約〇 . 5χ106、1. OxlO6、1.5xl06、2 . OxlO6、 2.5叉106、3.(^106、3.5110 6、4.(^106、4.51106、或5.(^106從胎盤灌注液獲得的細胞(例如， HPC或來自胎盤灌注液的總有核細胞）。在一個更具體的實施方式中，每公斤對象體重給藥 至少約 1·5χ107,2·0χ107,2·5χ107,3·0χ10 7,3·5χ107,4·0χ107,4·5χ107,5·0χ10 7,5·5χ107,或 6.OxlO7臍帶血細胞(例如，臍帶血總有核細胞）。在各實施方式中，每公斤對象體重給藥至 多約10 4、105、106、107、108、或10 9臍帶血細胞，從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，冊(：或來自胎 盤灌注液的總有核細胞），或臍帶血細胞和從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤 灌注液的總有核細胞）。在【具體實施方式】中，每公斤對象體重給藥至多約0.5χ10 6、1.0χ106、 1.5χ106、2.0χ106、2.5χ10 6、3.0χ106、3.5χ106、4.0χ106、4.5χ10 6、5.0χ106、5.5χ106、6.0χ106、 6·5χ10 6、7·0χ106、7·5χ106、8·0χ106、8·5χ10 6、9·0χ106、9·5χ106、1·0χ107、1·5χ10 7、2·0χ107、 2.5叉107、3.(^107、3.5叉10 7、4.(^107、4.5叉107、5.(^107、5.5叉10 7、或6.(^107臍帶血細胞（例 如，臍帶血總有核細胞），從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核 細胞），或臍帶血細胞和從胎盤灌注液獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細 胞）。在一個更具體的實施方式中，每公斤對象體重給藥至多約0.5χ10 6、1.0χ106、1.5xl06、 2.(^106、2.51106、3.(^106、3.5110 6、4.(^106、4.51106、或5.(^106從胎盤灌注液獲得的細胞 (例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細胞）。在一個更具體的實施方式中，每公斤對象體 重給藥至多約1 ·5χ107、2·0χ107、2·5χ107、3·0χ107、3·5χ10 7、4·0χ107、4·5χ107、5·0χ107、 5.5χ10 7、或6.0χ107臍帶血細胞(例如，臍帶血總有核細胞）。
[0137] 在上述實施方式的【具體實施方式】中，臍帶血細胞(例如，臍帶血總有核細胞)或從 胎盤灌注液獲得的細胞(例如，總HPC或來自胎盤灌注液的有核細胞)是CD34+細胞。在某些 實施方式中，每公斤體重給藥至少約1〇 4至約l〇7CD34+細胞。該⑶34+細胞可單獨來自臍帶 血，或可以來自臍帶血和胎盤灌注液。
[0138] HT細胞例如UCB細胞如UCB和HPC例如胎盤灌注液可以以適合對象大小的體積遞 送。典型的成人血體積是約85-100mL/kg體重。從而，成人血體積范圍為約40mL至約300mL。 在各實施方式中，因此，HT細胞例如UCB細胞如UCB，和HPC例如胎盤灌注液以總體積約 0·5mL、1·0mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、1lmL、12mL、13mL、14mL、15mL、 16mL、17mL、18mL、191111^、2〇1111^、211111^、221111^、231111^、241111^、251111^、261111^、271111^、281111^、291111^、或約 30mL、或更多的量給藥。該體積的給藥可以是單一給藥或多次給藥。該體積的臍帶血或臍帶 血細胞數量，或人胎盤灌注液或從中獲得的細胞(例如，HPC或來自胎盤灌注液的總有核細 胞)的給藥時間可以是例如，〇. 5小時、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小 時、或更多。
[0139] 在某些實施方式中，20mL以下的小的輸液使用注射器進行。大體積的輸液可通過 輸液器給藥，例如，在1 -4小時內。
[0140] 本文提供的的方法可以對任何有需要的對象進行。在一個方面，對象需要造血重 建、部分重建或增加。在某些實施方式中，對象是人對象。在某些實施方式中，對象是成人對 象。在某些實施方式中，對象25歲或更小。在某些實施方式中，對象是嬰兒。
[0141] 在某些實施方式中，在本文給出的方法例如移植、誘導嵌合體的方法和/或移植的 方法之前，對象已經使用例如TBI、氯法拉濱和/或Ara-Cl進行脊髓抑制調節;使用例如白消 安、氟達拉濱和/或阿倫單抗進行減毒調節;或進行放療或其它治療例如免疫抑制治療或降 低血細胞計數的治療。
[0142] 在一個具體的方面，本文提供的方法可被用作治療代謝障礙的方法，如有需要的 先天代謝缺陷、腎上腺腦白質營養不良、粘多糖病、尼曼-皮克病、異染性腦白質營養不良、 沃爾曼病、克拉伯病、高雪氏癥、巖藻糖苷貯積癥、或Batten病的對象。
[0143] 在另一具體方面，本文提供的方法可被用作治療血液學病癥或惡性腫瘤的方法， 例如有需要的淋巴造血惡性腫瘤、骨髓增生異常綜合征、低巨核細胞性血小板減少癥、白血 病、如急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性粒細胞白血病(AML)、粒細胞減少癥、鐮狀細胞病如 鐮狀細胞性貧血、地中海貧血(例如乙型重癥地中海貧血）、重癥聯合免疫缺陷病、骨髓衰 竭、或貧血如重型再生障礙性貧血或Diamond-Blackfan貧血的對象。
[0144] 如本文使用的術語"治療"指的是疾病或病癥或該疾病或病癥的任何參數或癥狀 的進展、嚴重性和/或持續時間的減輕或改善。如果對象存活，或如果要被治療的病癥或狀 況作為治療的結果以任何方式有可測量改進，則治療可被認為是有效的。這種改進可通過 例如一個或多個可測量的指標顯示，包括，例如，生理條件或與特定疾病、障礙或病況相關 的一組生理狀況的可檢測的變化。如果與不存在治療的情況下一個或多個指標的期望值相 比，所述指標對于例如相似年齡的個體通過改變至正常值內或接近正常值的變化顯示應答 所述治療，那么治療也被認為是有效的。
[0145] 在本文提供的方法的某些實施方式中，在障礙或病況的治療中本文提供的方法可 被用作第一療法組合一種或多種第二療法。所述第二療法包括但不限于手術、激素療法、免 疫療法、光療或用某些藥物治療。可與本文提供的方法組合的示例療法包括環境溫度的控 制;供氧;呼吸器或通風機;外周血輸血;補鐵;靜脈營養;光療;手術;代謝紊亂或血液病(包 括血液腫瘤）的治療劑;抗生素或抗病毒藥物;抗炎劑(例如，留體抗炎化合物，非留體抗炎 (NSAID)化合物）；一氧化氮;抗組胺藥;免疫抑制劑;和免疫調節化合物（例如，TNF-α抑制 劑)。
[0146] 5.4臍帶血細胞
[0147] 用于按照本公開使用的臍帶血(本文也稱為UCB或"臍血"）可以任何醫學或藥學可 接受的方式收集，并可存在于組合物中，例如，藥物組合物中。已有多種用于收集臍帶血的 方法的描述。參見，例如，美國專利號6,102,871;美國專利號6,179,819和美國專利號7， 147，626,其各自內容全文引入作為參考。收集臍帶血的常規技術基于針或插管的使用，其 在重力輔助下使用。臍帶血可收集至例如血袋、轉移袋或無菌塑料管。
[0148] 在一些實施方式中，臍帶血從商業臍帶血庫獲得(例如，LifeBankUSA，等）。在另一 實施方式中，臍帶血從產后哺乳動物臍帶收集并立即使用(例如，收集后1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、或12小時）。在其它實施方式中，用于治療對象的臍帶血是冷凍保存的臍帶血。臍 帶血可收集自單一臍帶或多個臍帶。
[0149] 在某些實施方式中，HT細胞例如UCB細胞與對象和/或HPC無關。在另一實施方式 中，HT細胞例如UCB細胞與對象和/或HPC部分不匹配。在又一實施方式中，HT細胞例如UCB細 胞與HPC不匹配。在又一實施方式中，HT細胞例如UCB細胞與HPC無關和不匹配。在特別的實 施方式中UCB在3/6，4/6，或5/6HLA基因座與對象匹配。在特別的實施方式中，HT細胞，例如， 來自成體來源的，在6/8，7/8，或8/8HLA基因座與對象匹配。
[0150] 在一些實施方式中，臍帶血制備自早產臍帶。在其它實施方式中，臍帶血制備自足 月臍帶。在某些實施方式中，臍帶血獲得自足月產的產后哺乳動物臍帶。在其它實施方式 中，臍帶血獲得自早產的產后哺乳動物臍帶。在一些實施方式中，臍帶是懷孕約23至約25周 出生的嬰兒的臍帶。在一些實施方式中，臍帶是懷孕約26至約29周出生的嬰兒的臍帶。在一 些實施方式中，臍帶是懷孕約30至約33周出生的嬰兒的臍帶。在一些實施方式中，臍帶是懷 孕約34至約37周出生的嬰兒的臍帶。在一些實施方式中，臍帶是懷孕約37至約42周出生的 嬰兒的臍帶。
[0151] 臍帶血或從中獲得的細胞(例如，其中來源的總有核細胞或干細胞)可收集自單一 個體（g卩，作為單一單位）用于給藥，或可以與其它單位混合。在某些實施方式中，臍帶血或 從中獲得的細胞(例如，其中來源的總有核細胞或干細胞)在使用前儲存。當臍帶血混合自 多個臍帶時，混合的臍帶血可以包含僅來自足月產的臍帶血、來自組合的足月產的臍帶血 或僅來自早產的臍帶血。例如，來自早產嬰兒的臍帶血可以與例如來自其它早產嬰兒的臍 帶血、僅來自足月產的臍帶血或來自早產和足月產胎盤的臍帶血混合物進行混合。臍帶血， 包括自體或異體臍帶血，也可以與外周血混合。在某些實施方式中，使用來自早產兒的臍帶 血，因為這種臍帶血與來自足月產的臍帶血相比包含相對高的每單位體積CD34+干細胞數 量。在某些實施方式中，一個單位的臍帶血包含足夠數量的細胞從而每公斤對象體重給藥 至少約 1·0χ106、1·5χ106、2·0χ106、1·5χ10 6、2·0χ106、2·5χ106、3·0χ106、3·5χ10 6、4·0χ106、 4·5χ106、6·0χ106、6·5χ10 6、7·0χ106、7·5χ106、8·0χ106、8·5χ10 6、9·0χ106、9·5χ106、1·0χ107、 1.5x10 7、2.0x107、2.5x107、3.0x107、3.5x10 7、4.0x107、4.5x107、5.0x107、5.5x10 7、S 6. OxlO7獲得自所述臍帶血的細胞，例如，臍帶血總有核細胞。在某些實施方式中，給藥一個 單位的臍帶血或從中獲得的細胞。在某些實施方式中，給藥少于一個單位。在某些實施方式 中，給藥多于一個單位，例如，給藥2個或多個(例如，2、3、4、5、6或多個)單位。 6.實施例
[0152] 6.1實施例1:人胎盤灌注液細胞組合物
[0153] 本實施例顯示了通過細胞類型和關聯表型確定人胎盤灌注液組合物。
[0154] 人胎盤灌注液(HPP)如上5.2節的描述獲得。供體匹配的冊?和人臍帶血(!11^8)袋 在37°C分別解凍，然后用等體積的解凍液（IMDM(Cat#30-2005，ATCC)+2%FBS(Cat# SH30070.03，Hyclone)+P/S(Cat#15140-122，Gibco))稀釋。稀釋的細胞混合物在400g 旋轉 8min(使用15ml圓錐管），如果使用50ml圓錐管則旋轉lOmin。用FACS緩沖液（PBS(Cat# 10010-023，Gibco)+2%FBS+P/S)重懸細胞團至lxl0 7/ml。以氯化銨比細胞9:1的比例在冰 上添加氯化銨溶液(Cat#07850，Stem Cell)10min裂解RBC(紅血細胞KRBC裂解后，將樣品 在400g下旋轉5min，然后用FACS緩沖液洗滌兩次。然后用Cytof ix/cytoperm溶液（Cat# 554722，BD Biosciences)在4°C重懸細胞團20分鐘至lml每lxlO7細胞。樣品用FACS緩沖液 洗滌兩次，然后在RT(室溫)下暗處用熒光染料綴合抗體染色20min。表型板(panel)列于表1 和表2。抗體信息列于表3。染色的樣品用FACS緩沖液洗滌兩次并重懸于200μ1 FACS緩沖液 用于數據收集：9色板來自FACS Aria(BD Biosciences)，6色板來自FACS Canto II(BD Biosciences)，按照生產商提供的說明進行。數據分析由Flowjo(Tree Star)進行。使用配 對學生t檢驗進行統計分析。



[0162] 分析來自HPP的單核細胞來確定各種單核細胞類型的組成。表4詳細顯示了鑒定的 細胞類型：
[0163] 表4:人胎盤灌注液組分
[0164]
[0165]
[0166] 6.2實施例2:人胎盤灌注液中的總有核細胞計數
[0167] 本實施例顯示了人胎盤灌注液和臍帶血單位的全有核細胞計數測定。
[0168] 對43對供體匹配的HPP和HUCB單位進行處理測定總有核細胞計數。單一單位的HPP 的平均總有核細胞計數為~135百萬個細胞。單一單位的HUCB的平均總有核細胞計數為~ 666百萬個細胞(圖1)。
[0169] 6.3實施例3:人胎盤灌注液中的祖細胞群
[0170] 本實施例顯示了人胎盤灌注液和臍帶血中⑶34+CD45lPro34+CD45+細胞群的測 定。
[0171] 使用熒光激活細胞分選(FACS)測定人胎盤灌注液細胞的亞群（圖2A)<XD34+細胞 的一個亞群是CD45'因此被從使用ISHAGE方案計數中排除（Barnett等，1999， Clin · Lab .Haem. 21: 301-308)，后者是一種序貫閘門策略（sequential gating strategy) (圖2B)，其閘門優先針對CD45+細胞。建立了使用另一種序貫閘門策略的方案，其中閘門優 先針對⑶34+細胞，以分析人胎盤灌注液中的⑶34+⑶45_和⑶34+⑶45+細胞兩者（圖2C)。使用 該方案，清楚的CD34+CD451田胞群在人胎盤灌注液中非常明顯。
[0172] FACS細胞分選如下進行：供體匹配的HPP和HUCB袋分別在37°C解凍，然后氯化銨 RBC裂解。然后用FITC抗人CD34(Cat#555821，BD Biosciences)和PE抗人CD45(Cat#555483， BD Biosciences)室溫暗處染色15min。用FACS緩沖液洗滌兩次后，將樣品重懸至lxlO7每ml 并通過FACS Aria(BD Biosciences)使用制造商提供的方案進行分選。
[0173] 使用FACS分選方案測得人胎盤灌注液含有比供體匹配的配對中的臍帶血更大比 例的CD34+細胞（圖3A-3B)。使用人胎盤灌注液細胞的集落形成實驗顯示了分選后CD34+CD45 +細胞和⑶34+⑶45_細胞的生長。
[0174] 6.4實施例4:人胎盤灌注液中的⑶34+亞群
[0175] 本實施例顯示了人胎盤灌注液和臍帶血中CD34+CD3 Γ、CD34+KDR+和CD34+CXCR-4+ 細胞群的確定。
[0176] 使用如6.1節描述的表型表征方案，我們確定HPP CD34+細胞包含比HUCB⑶34+細 胞更高百分比的⑶31 +、KDR+和CXCR-4+細胞(圖4)。這些表型與含成血管細胞群的HPP-致。 [0177] 6.5實施例5:人胎盤灌注液細胞的功能評價
[0178] 本實施例顯示了與臍帶血細胞相比人胎盤灌注液細胞血管生成性質的確定。如圖 5所示，在本文描述的試驗中人胎盤灌注液較之臍帶血顯示了更高的血管生成(血管形成） 活性。
[0179] 按照上述5.5節獲得冊?細胞。將冊?細胞（圖5，上左）與1(^8/111〇^14(：〇^(0&邙 L3484，Life technology)在37°C -起孵育4h，用Axiovert 200M(Zeiss)拍攝來自HPP的內 皮細胞的脂蛋白攝入熒光照片（圖5,上右）。進行體外功能試驗來評價人胎盤灌注液細胞的 血管生成性質。將按照上述5.5節獲得的HPP細胞在ECMATRIX?上培養18-24小時至96孔板中 約1〇 6細胞每孔，使用體外血管生成試驗試劑盒(Chemicon cat#ECM625)，其中細胞在TGF- i3、FGF、纖溶酶原、tPA和基質金屬蛋白酶存在下培養。在人胎盤灌注液細胞培養中觀察到微 血管形成（圖5,下右hHUVECs(人臍靜脈內皮細胞)被用作陽性對照（圖5,下左）。臍帶血培 養中未觀察到顯著的管形成。
[0180] 6.6實施例6:人胎盤灌注液中的原始祖細胞群
[0181] 本實施例顯示了人胎盤灌注液和臍帶血中各種CD34+原祖細胞群的確定。
[0182] 使用如6.1節描述的表型表征方案，我們確定人胎盤灌注液含有比臍帶血實質上 更大比例的巢蛋白+/CD34+細胞（圖6)。巢蛋白+CD34+細胞被建議是更原始的神經元祖細胞 (Mii等，J.Cell Biol.，2013)。
[0183] 人胎盤灌注液含有比臍帶血顯著更大數量的不成熟造血干細胞群（即，CD34 + ⑶45_，⑶34+⑶38_)，如表5所示。與表2所示類似，發現推定的成血管細胞群（即，⑶34+C3Γ， ⑶34+KDR+，和⑶34+CXCR4+)在人胎盤灌注液中比臍帶血中數量更多。
[0184]表5:人胎盤灌注液和臍帶血中的原始祖細胞.
[0185]
[0187] 6.7實施例7:人胎盤灌注液中的T-細胞含量
[0188] 本實施例顯示了人胎盤灌注液和臍帶血中多種T細胞群的確定。
[0189] 使用9色T細胞FACS板對人胎盤灌注液和臍帶血進行了 I和II類總HLA評價和大量 免疫表型表征，以描述 T 細胞亞群、CD45RA、CD8、CD25、CD 127、CD69、CD3、CCR7、HLADR 和 CD4， 如上6.1節所示。
[0190] 如表6所示，結果顯示人胎盤灌注液含有比臍帶血顯著更低的T細胞含量。類似的， 人胎盤灌注液細胞具有更低表達的I類和II類HLA(圖7)。還對人胎盤灌注液和臍帶血確定 了表達CD3、CD4和/或CD8的特異性T-細胞群的相對比例（圖8)。人胎盤灌注液的T細胞含量 表明，例如，人胎盤灌注液細胞適于同種異體錯配移植。
[0191] 表6:人胎盤灌注液和臍帶血中的T細胞群。"Hi"和"low"表示特定表型標記的表達 強度。
[0192]
[0194] 6.8實施例8: T細胞分離、功能評價和擴增
[0195] 本實施例顯示了可用于在人胎盤灌注液和臍帶血中成功分離、評價和擴增1^8細 胞群的方法。類似方法可用于分離、評價和擴增人胎盤灌注液細胞的其它群或亞群。
[0196] 可以使用針對人CD4+CD127lQWCD25 +調節T細胞(Cat#15861，Stem Cell)的完全試劑 盒從供體匹配的HPP或HUCB中分別分離Treg細胞。從供體匹配的HPP或HUCB、供體匹配的HPP 或HUCB、或不含Treg細胞的供體匹配的HPP或HUCB中分別分離的Treg細胞可通過體外磁珠 T細 胞反應(BTR)試驗進行評價。簡言之，用抗CD3/CD28磁珠激活的來自外周血(PB)的T細胞可 以與上文列出的樣品共培養5天。可以通過FACS檢測對⑶4和⑶8Τ細胞增殖的抑制。
[0197] 可以使用Treg 擴增試劑盒（Cat# :130-095-345，Miltenyi)和：DYNABEADS_? 調 節CD4+CD25+T細胞試劑盒(Cat#11363D，Life Technology)評價兩種分別來自供體匹配的 HPP和HUCB的基于磁珠的擴增試劑盒的1^細胞擴增。可以使用用于增強的壞死因子受體家 族成員:0X40、4-1BB來完成臨床應用的擴增Treg細胞的能力改進(Hippen等，2008)
[0198] 等價：
[0199] 本發明的范圍將不受本文描述的【具體實施方式】的限制。事實上，除了那些本文描 述的之外，根據之前的描述，本發明的多種修飾對于本領域技術人員而言將是顯而易見的， 這種修飾旨在落入附加權利要求的范圍內。
[0200] 本文引用的所有參考文獻在此全文引入作為參考并用于所有目的，其程度如同每 種單獨的出版物、專利或專利申請特別并單獨地表明用于所有目的而被全文引入作為參考 那樣。
[0201] 任何出版物的引用是為了其在提交日前的公開內容，且不應該被解釋為承認本發 明由于在先發明而無權享有先于這些出版物的資格。
【主權項】
1. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少6 X IO5⑶34+細胞。2. 權利要求1的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的CD34+細胞。3. 權利要求1的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的CD34+細胞。4. 權利要求1的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的CD34+細胞。5. 權利要求1的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液CD34+細胞。6. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少5 X 105CD34+⑶45^ 細胞。7. 權利要求6的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的CD34+CD451田胞。8. 權利要求6的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的⑶34+⑶451田胞。9. 權利要求6的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的⑶34+⑶451田胞。10. 權利要求6的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+⑶451田胞。11. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少6 X 105CD34+⑶3 Γ 細胞。12. 權利要求11的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的⑶34+⑶31+細胞。13. 權利要求11的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的⑶34+⑶31+細胞。14. 權利要求11的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的⑶34+⑶31+細胞。15. 權利要求11的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CD31+細 胞。16. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少5X105CD34+KDR+ 細胞。17. 權利要求16的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的⑶34+KDR+細胞。18. 權利要求16的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的⑶34+KDR+細胞。19. 權利要求16的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的⑶34+KDR+細胞。20. 權利要求16的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+KDR+細胞。21. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少5 X IO5⑶34+CXCR4 +細胞。22. 權利要求21的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的⑶34+CXCR4+細胞。23. 權利要求21的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的⑶34+CXCR4+細胞。24. 權利要求21的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的⑶34+CXCR4+細胞。25. 權利要求21的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CXCR4+細 胞。26. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少6 X 105CD34+⑶38 一 細胞。27. 權利要求26的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的⑶34+⑶38_細胞。28. 權利要求26的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的⑶34+⑶38_細胞。29. 權利要求26的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的⑶34+⑶38_細胞。30. 權利要求26的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CD381田 胞。31. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少7 X 105CD34 + CDl 17-細胞。32. 權利要求31的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的⑶34+⑶117_細胞。33. 權利要求31的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的⑶34+⑶117_細胞。34. 權利要求31的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的⑶34+⑶1171田胞。35. 權利要求31的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CD1171田 胞。36. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少6 X 105CD34 + CDHOa+細胞。37. 權利要求36的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的⑶34+⑶140a+細胞。38. 權利要求36的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的⑶34+CD140a+細 胞。39. 權利要求36的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的⑶34+CD140a+細 胞。40. 權利要求36的組合物，其中該組合物包含基本上純的人胎盤灌注液⑶34+CD140a+細 胞。41. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少3 X 105CD34+巢蛋 白+細胞。42. 權利要求40的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的CD34+巢蛋白+細胞。43. 權利要求40的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的CD34+巢蛋白+細 胞。44. 權利要求40的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的CD34+巢蛋白+細 胞。45. 權利要求40的組合物，其中該組合物是基本上純的人胎盤灌注液CD34+巢蛋白+細 胞。46. 包含分離的人胎盤灌注液的組合物，其中人胎盤灌注液包含至少3X104CD3+CD4+ CD8-CD25hiCD127lOT 細胞。47. 權利要求46的組合物，其中該組合物進一步包含2倍更多數量的CD3+CD4+CDK CD25hiCD127 lOT 細胞。48. 權利要求46的組合物，其中該組合物進一步包含10倍更多數量的CD3+CD4+CDK CD25hiCD127 lOT 細胞。49. 權利要求46的組合物，其中該組合物進一步包含50倍更多數量的CD3+CD4+CDK CD25hiCD127 lOT 細胞。50. 權利要求46的組合物，其中該組合物是基本上純的人胎盤灌注液CD3+CD4+CDK CD25hiCD127 lOT 細胞。51. 權利要求1-50任一項的組合物，其中人胎盤灌注液分離自單一胎盤灌注。52. 治療對象中的中樞神經系統損傷、疾病或障礙的方法，包括對對象給藥權利要求1-50任一項的組合物和來自另一來源的造血細胞。53. 權利要求52的方法，其中所述中樞神經系統損傷、疾病或障礙是缺氧缺血性腦病。54. 治療對象中的肌肉減少癥的方法，包括對對象給藥權利要求1-50任一項的組合物 和來自另一來源的造血細胞。55. 誘導對象中的嵌合體的方法，包括對對象給藥權利要求1 -50任一項的組合物和來 自另一來源的造血細胞。56. 用于對象中的細胞移植的方法，包括對對象給藥權利要求1-50任一項的組合物和 來自另一來源的造血細胞。57. 降低對象中的移植物抗宿主疾病(GVHD)的嚴重程度或持續時間的方法，包括對對 象給藥權利要求1 -50任一項的組合物和來自另一來源的造血細胞。58. 治療對象中的代謝障礙的方法，包括對對象給藥權利要求1-50任一項的組合物和 來自另一來源的造血細胞。59. 治療對象中的血液學疾病或惡性血液病的方法，包括對對象給藥權利要求1-50任 一項的組合物和來自另一來源的造血細胞。60. 用于下述方法的如權利要求1-50任一項中定義的組合物： (a) 治療對象中的中樞神經系統損傷、疾病或障礙，優選的所述中樞神經系統損傷、疾 病或障礙是缺氧缺血性腦病； (b) 在對象中誘導嵌合體； (c) 用于細胞移植； (d) 用于降低對象中移植物抗宿主疾病(GVHD)的嚴重程度或持續時間； (e) 治療對象中的代謝障礙； (f) 治療對象中的血液學疾病或惡性血液病;或 (g) 治療對象中的肌肉減少癥。61. 用于權利要求60中的用途的組合物，其中該組合物進一步包含來自另一來源的造 血細胞。
【文檔編號】A61K45/00GK105916521SQ201480073194
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年11月14日
【發明人】喬迪·P·格尼, 張小葵, 斯泰西·赫布, 羅伯特·J·哈黎里
【申請人】人類起源公司