Rsv特異性抗體及其功能部分的制作方法

Rsv特異性抗體及其功能部分的制作方法
【專利摘要】本申請提供了能夠特異性地結合RSV的抗體及其功能等效物，連同用于生產它們的手段和方法。
【專利說明】RSV特異性抗體及其功能部分 繼續申請資料
[0001] 本申請要求于2014年1月15日提交的美國臨時申請序列號61/927,819的權益，將 其通過引用結合在此。 說明書 領域
[0002] 本申請涉及生物技術和醫藥領域。 背景
[0003] 呼吸道合胞病毒(RSV)是屬于副粘病毒科的普通感冒病毒。RSV是具劇毒的，易傳 播，并且在小于2歲齡的兒童中是下呼吸道疾病的最常見病因。在單個RSV季節，高達98%的 參加日托的兒童會被感染。感染有RSV的0.5%和3.2 %之間的兒童需要住院。在美國每年報 道大約有90,000例入院以及4,500例死亡。歸因于RSV而住院的主要風險因素是早產、慢性 肺病、先天性心臟病、免疫功能受損、以及在其他健康兒童中年齡小于6周。除以充足營養形 式進行的支持性護理和氧療外，還需要另外的針對RSV陽性細支氣管炎的治療。抗病毒療法 例如利巴韋林未被證明在RSV感染中有效。一種單克隆抗體帕利珠單抗(又稱Synagis，被 登記用于針對RSV感染的預防。帕利珠單抗是針對RSV融合蛋白的基因工程化的(人源化的） 單克隆抗體。雖然帕利珠單抗已經成為非常有效的預防藥，提供針對RSV的另外的覆蓋度的 替代性抗體和療法將是有利的。
[0004] 本發明的目的是提供用于消除和/或預防RSV感染的手段和方法。本發明的又一目 的是提供針對RSV的替代性和/或改進抗體或此類抗體的功能等效物，以及提供能夠產生針 對RSV的抗體或其功能等效物的穩定細胞。 概述
[0005] 根據本說明書，能夠特異性地結合呼吸道合胞病毒的合成的、重組的或分離的抗 體或其功能部分包括： a. 重鏈可變區CDR1序列，其包括與序列NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)至 少70%-致的序列，以及 b. 重鏈可變區CDR2序列，其包括與序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)至少75%-致的序列，以及 c. 重鏈可變區CDR3序列，其包括與序列ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQIDN0:11)至少70%-致的序列，以及 d. 輕鏈可變區CDR1序列，其包括與序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)至少85% -致的序 列，以及 e. 輕鏈可變區CDR2序列，其包括與序列VASNLET(SEQ ID N0:5)至少70%-致的序列， 以及 f. 輕鏈可變區⑶R3序列，其包括與序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)至少70%-致的序列。 并且其中在重鏈中至少一個氨基酸不同于SEQ ID N0:7,并且所述至少一個氨基酸選 自：
[0006] 在另一個實施例中，該抗體或功能部分包括：
a. 重鏈可變區CDR1序列，其包括與NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)相差一 個氨基酸的序列， b. 重鏈可變區CDR2序列，其包括與GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)相差一個或兩個氨基酸的序列， c ·重鏈可變區CDR3序列，其包括與ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQIDN0:11)相差一個或兩個氨基酸的序列， d. 輕鏈可變區CDR1序列，其包括與QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一個氨基酸的序 列， e. 輕鏈可變區⑶R2序列，其包括與VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一個氨基酸的序列，和/ 或 f. 輕鏈可變區⑶R3序列，其包括與QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一個氨基酸的序列。
[0007] 在另一個實施例中，該抗體或功能部分包括 a. 重鏈可變區CDR1 序列，其包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)， b. 重鏈可變區 CDR2 序列，其包括 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID NO:10), c ·重鏈可變區 CDR3 序列，其包括 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID NO:11), d. 輕鏈可變區CDR1序列，其包括QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)， e. 輕鏈可變區CDR2序列，其包括VASNLET(SEQ ID N0:5)，以及 f. 輕鏈可變區CDR3序列，其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6)。
[0008] 在又一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0010] 在又一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0011] 在另外的實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0013] 在又一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0014] 在另外的實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
[0015] 在另外的實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0017]在另外的實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0018] 在又一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0019] 在另外的實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0020] 在又一個實施例中，該重鏈可變區⑶R1序列包括與NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN (SEQ ID勵:9)相差一個氨基酸的序列，該重鏈可變區〇)1?2序列包括與611?￥1^17!^4?1^06 (SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID勵：10)相差一個或兩個氨基酸的序列，和/ 或該重鏈可變區CDR3序列包括與ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID NO: 3)或ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11)相差一個或兩個氨基酸的序列。
[0021] 在又一個實施例中，該輕鏈可變區CDR1序列包括與QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相 差一個氨基酸的序列，該輕鏈可變區⑶R2序列包括與VASNLET(SEQ ID NO:5)相差一個氨基 酸的序列，和/或該輕鏈可變區⑶R3包括與QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一個氨基酸的序列。
[0022] 在又一個實施例中，該重鏈可變區⑶R1序列包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN (SEQIDN0:9)，該重鏈可變區CDR2序列包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID N0:10)，和/或該重鏈可變區CDR3序列包括 ETALWSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)。
[0023] 在另外的實施例中，該輕鏈可變區CDR1序列包括QASQDIVNYLN(SEQIDN0:4)，該 輕鏈可變區CDR2序列包括VASNLET(SEQ ID N0:5)，和/或該輕鏈可變區CDR3序列包括 QQYDNLP(SEQ ID N0:6)〇
[0024] 在一個實施例中，能夠特異性地結合至RSV F抗原的合成的、重組的或分離的抗體 或其功能部分包括 a. 重鏈可變區CDR1序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID N0:9)，以及 b. 重鏈可變區CDR2序列，其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)，以及 c. 重鏈可變區CDR3序列，其包括氨基酸序列ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)，以及 d. 輕鏈可變區CDR1序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，以及 e. 輕鏈可變區⑶R2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，以及 f. 輕鏈可變區CDR3,其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)。
[0025] 在另一個實施例中，能夠特異性地結合至RSV F抗原的合成的、重組的或分離的抗 體或其功能部分包括： a. 重鏈可變區CDR1序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID N0:9)，以及 b. 重鏈可變區CDR2序列，其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)，以及 c. 重鏈可變區CDR3序列，其包括氨基酸序列ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)，以及 d. 輕鏈可變區CDR1序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，以及 e. 輕鏈可變區⑶R2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，以及 f. 輕鏈可變區CDR3,其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)。
[0026] 在又一個實施例中，該抗體或功能部分具有在位置252Y具有Y、在位置254T具有T 并且在位置256具有Ε的Fc區域，其中編號對應于卡巴特(Kabat)的EU索引。
[0027] 在仍又一個實施例中，抑制受試者體內的RSV感染的方法包括向該受試者給予在 此描述的抗體或功能部分。
[0028] 在仍又一個實施例中，合成的、重組的或分離的核酸序列編碼在此描述的抗體或 功能部分。
[0029] 將在之后的說明書中部分地闡述另外的目的和優點，并且從說明書中部分是顯而 易見的，或者通過實踐可以獲知。這些目的和優點將通過在所附權利要求中具體指出的要 素和組合來實現和獲得。
[0030] 應當理解的是，前面的一般描述和下面的詳細描述僅僅是示范性的和說明性的， 并且不限制權利要求書。
[0031] 附圖（它們被結合在本說明書中并且構成了本說明書的一部分)展示了一個(若干 個)實施例并且與本說明書一起用來解釋在此描述的原理。 附圖簡要說明
[0032]圖1A和B是D25重鏈和若干重鏈變體(J、L和LA)的序列的表示。
[0033]圖2是若干優化變體(167、1?5、2010)的重鏈的序列的表示。
[0034]圖3A和B是優化變體1G7的四種另外的變體的重鏈的序列的表示。通過摻入種系殘 基制備這些變體（1G7-GLM、B12-1、E3-5和E9-2)以改變pi。
[0035]圖4A和B示出了 D25和若干變體在微量中和測定中的體外活性。
[0036] 圖5A和B顯示，D25和若干變體提供了針對RSV A2和RSV B亞型攻擊的保護。
[0037]圖6示出了在用1G7、1F5、D25(在圖中被命名為D25wt)或無抗體處理的動物中棉鼠 RSV A2攻擊的結果。
[0038] 圖7A和B顯示，1G7針對RSV A2和RSV B9320二者提供保護。將RSV的肺滴度標繪為 在收獲時人類IgG的血清濃度的函數。
[0039] 圖8A和B示出了通過各種抗體中和RSV A2和RSV B9320二者。
[0040] 圖9A和B示出了用于結合1G7的表位，如通過單克隆抗體抗性突變體所定義的。 [0041 ]圖10示出了針對RSV的臨床分離株的中和測定的結果。 序列說明
[0042 ]表1提供了本發明實施例中提及的某些序列的列表。
實施例說明 I.抗體或其功能部分
[0043]提供了與其他抗體相比具有改進的特性的改進RSV特異性抗體或其功能部分。抗 體或功能部分，例如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物，包括但不限于多克隆抗體、單 克隆抗體、人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、表位結合片段，例如Fab、Fab '和F (ab'）2、Fd、Fvs、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fvs(sdFv)、包括VL或VH±或的片 段、由Fab表達文庫產生的片段。ScFv分子在本領域中是已知的并且描述于例如美國專利5， 892,019之中。本披露涵蓋的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例 如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY)、類別（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl以及IgA2)或 子類。
[0044]例如，諸位發明人成功產生了超過之前的RSV特異性抗體的具有改進特性的RSV特 異性抗體，這些改進特性包括針對RSV A亞型和RSV B亞型改進的保護，改進的中和以及降 低的IC50值。此類抗體對RSV具有特別高或強的親和力，并且因此特別適于消除和/或至少 部分地預防RSV感染和/或RSV感染的不良反應。抗體及其功能部分與RSV特異性結合分子同 義，并且包括能夠特異性地結合RSV的任何全長抗體或抗體部分。 A.非種系殘基變為種系殘基的抗體或功能部分 [0045] 在一個實施例中，將D25的重鏈可變區（SEQ ID N0:7)的至少一個非種系殘基變為 種系殘基。在另一個實施例中，將D25殘基的重鏈可變區的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或 12個非種系殘基轉換回種系殘基。在又一個實施例中，可以將至少一種非種系殘基變為種 系殘基，并且相對于SEQ ID N0:7,可以修飾至少一個⑶R位置。
[0046] -個實施例包括分離的、合成的或重組的抗體或其功能部分，其能夠特異性地結 合呼吸道合胞病毒并且包括： a) 重鏈CDR1序列，其包括與序列NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)至少 70%、75%、80%、85%、90%或94%-致的序列， b) 重鏈 CDR2 序列，其包括與序列 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID NO: 10)至少70%、75%、80%、85%、90%或94% -致的序列， c) 重鏈 CDR3 序列，其包括與序列 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID NO: 11)至少70%、75%、80%、85%、90%或94% -致的序列， d) 輕鏈CDR1 序列，其包括與序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)至少70%、75%、80%、 85%、90 %或94 %-致的序列， e) 輕鏈CDR2序列，其包括與序列VASNLET(SEQ ID N0:5)至少70%、75%、80%、85%、 90%或94%-致的序列，以及 f) 輕鏈CDR3序列，其包括與序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)至少70%、75%、80%、85%、 90 %或94 %-致的序列。 并且其中在重鏈中至少一個氨基酸不同于SEQ ID N0:7,并且所述至少一個氨基酸選 自：
[0047] "重鏈可變區中至少一個氨基酸不同于SEQ ID N0:7"意指該抗體或功能部分必須 包括來自SEQ ID N0:7的至少一個氨基酸差異，但是在一些實施例中，它可以包括來自SEQ ID N0:7的不止一個差異。在一些實施例中，它包括表2中所述的取代，在表2中列出的位置 處的缺失或替代性氨基酸，或沒有在表2中列出的位置中的差異(包括缺失、取代或添加）。 在表2中提供了相對于SEQ ID N0:7的位置編號，并且該位置編號最終可能不與基于感興趣 的抗體或功能部分中氨基酸的連續編號的位置編號相同。相反，基于與SEQ ID N0:7的比 對，指定位置編號。
[0048] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈和/或輕鏈，其中該重鏈可變區與 SEQIDN0:7或SEQIDN0:15至少90%-致，并且其中該輕鏈可變區與SEQIDN0:8至少 90%-致。在另一個實施例中，該重鏈可變區與SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:15至少91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%-致。在另一個實施例中，該輕鏈可變區與 SEQ ID N0:8至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%-致。
[0049] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區⑶R1序列，其包括與NYIIN (SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)相差一個氨基酸的序列。
[0050] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區CDR2序列，其包括與 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)相差一個或兩個 氨基酸的序列。
[0051] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區CDR3序列，其包括與 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQIDN0:3)或ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQIDN0:11)相差一個或兩個 氨基酸的序列。
[0052]在一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區CDR1序列，其包括與 QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一個氨基酸的序列。
[0053] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區⑶R2序列，其包括與VASNLET (SEQ ID N0:5)相差一個氨基酸的序列。
[0054] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區⑶R3,其包括與QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一個氨基酸的序列。
[0055]在又一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區⑶R1序列（其包括與NYIIN (SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)相差一個氨基酸的序列）、重鏈可變區CDR2序列（其 包括與GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)相差一個 或兩個氨基酸的序列）、重鏈可變區CDR3序列（其包括與ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3) 或ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID勵：11)相差一個或兩個氨基酸的序列）、輕鏈可變區0?1序 列（其包括與QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一個氨基酸的序列）、輕鏈可變區CDR2序列 (其包括與VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一個氨基酸的序列）和/或輕鏈可變區⑶R3序列（其 包括與QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一個氨基酸的序列）。
[0056]在一些實施例中，該抗體或功能部分包括至少一個或多達所有與SEQ ID N0:7(重 鏈)和/或SEQ ID N0:8(輕鏈)一致的CDR。
[0057] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區⑶R1序列，其包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)。
[0058] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區CDR2序列，其包括 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID N0:10)。
[0059] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區CDR3序列，其包括 ETALWSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)。
[0060] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區⑶R1序列（其包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9))，重鏈可變區CDR2序列（其包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID觀：10))，和/或重鏈可變區〇?3序列（其包括 ETALWSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11))。
[0061] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區CDR1序列，其包括 QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)〇
[0062] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區⑶R2序列，其包括VASNLET (SEQ ID NO:5)〇
[0063] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區⑶R3,其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6)〇
[0064] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區CDR1序列（其包括 QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4))，輕鏈可變區CDR2序列（其包括VASNLET(SEQ ID N0:5))，和/ 或輕鏈可變區CDR3(其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6))。
[0065] 在又一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區⑶R1序列（其包括NYIIN (SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID 勵:9))、重鏈可變區〇?2序列（其包括611?￥1^17!^4?肝06 (SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID 觀：10))、重鏈可變區〇?3序列（其包括 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQIDN0:3)或ETALVVSTTYRPHYroN(SEQIDN0:ll))、輕鏈可變區 CDR1序列（其包括QASQDIVNYLN( SEQ ID NO: 4))、輕鏈可變區CDR2序列（其包括VASNLET (SEQ ID N0:5))和/或輕鏈可變區CDR3序列（其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6))。
[0066] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區，其包括在框架區內與選自 SEQ ID N0:12-21的序列95%-致的序列。
[0067] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區，其包括在框架區內與選自 SEQ ID N0:12-21的序列一致的序列。
[0068] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO: 7的氨基酸：
在另一個實施例中，表3中提供的差異是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在一個實施例中， 表3中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區包括 SEQ ID N0:8。
[0069] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表4中提供的差異是與SEQ ID NO:7僅有的差異。在一個實施例中， 表4中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區包括 SEQ ID N0:8。
[0070] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表5中提供的差異是與SEQ ID NO:7僅有的差異。在一個實施例中， 表5中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區包括 SEQ ID N0:8。
[0072] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表6中提供的差異是與SEQ ID NO:7僅有的差異。在一個實施例中， 表6中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區包括 SEQ ID N0:8。
[0073] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表7中提供的差異是與SEQ ID NO:7僅有的差異。在一個實施例中， 表7中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區包括 SEQ ID N0:8。
[0074] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表8中提供的差異是與SEQ ID NO:7僅有的差異。在一個實施例中， 表8中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區包括 SEQ ID N0:8。
[0075] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸。
在另一個實施例中，表9中提供的差異是與SEQ ID NO:7僅有的差異。在一個實施例中， 表9中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區包括 SEQ ID N0:8。
[0077] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表10中提供的差異是與SEQ ID NO:7僅有的差異。在一個實施例 中，表10中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區 包括SEQ ID N0:8。
[0078] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表11中提供的差異是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在一個實施例 中，表11中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區 包括SEQ ID N0:8。
[0079] 在一個實施例中，該抗體或功能部分在重鏈可變區中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一個實施例中，表12中提供的差異是與SEQ ID NO: 7僅有的差異。在一個實施例 中，表12中提供的差異不是與SEQ ID N0:7僅有的差異。在另一個實施例中，該輕鏈可變區 包括SEQ ID N0:8。
[0080] 在一個實施例中，該抗體或功能部分包括重鏈可變區序列，其包括與SEQ ID NO: 12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20或SEQ ID N0:21 的序列至少70%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%-致的序列。在另一個實施例中，該抗體或功能部分包 括重鏈序列可變區，其包括與SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、 SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20或SEQ ID NO: 21 的框架（即，非CDR)序列至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 一致的序列。
[0081] 在另一個實施例中，該抗體或功能部分包括輕鏈可變區序列，其包括與序列 DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISS LQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV(SEQIDN0:8)至少70%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99% 或 100%-致的序列。
[0082] 在其他實施例中，應用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代涉及一個氨基酸被 另一個具有大體相似特性(大小、疏水性等）的氨基酸取代，這樣使得整體功能可能不會受 到嚴重影響。 B.具有改進的CDR的抗體或功能部分
[0083] 在一個實施例中，相對于存在于SEQ ID N0:7中的⑶R，該抗體或功能部分可以包 括至少一個CDR突變。在一個實施例中，該抗體或功能部分可以包括表13中變化的至少一 種。在另一個實施例中，該抗體或功能部分可以包括表13中變化的一種、兩種或所有三種。
[0084] 另一個實施例包括分離的、合成的或重組的抗體或其功能部分，其能夠特異性地 結合至RSV F抗原并且包括重鏈可變區⑶R1序列（其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID N0: 9))、重鏈可變區CDR2序列（其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO: 2))、重鏈可 變區CDR3序列（其包括氨基酸序列ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID NO: 3))、輕鏈可變區CDR1序 列（其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4))、輕鏈可變區CDR2序列（其包括氨基酸 序列VASNLET(SEQ ID N0:5))以及輕鏈可變區CDR3(其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6))〇
[0085] 另一個實施例包括分離的、合成的或重組的抗體或其功能部分，其能夠特異性地 結合至RSV F抗原并且包括重鏈可變區⑶R1序列（其包括氨基酸序列NYIIN(SEQ ID N0: 1))、重鏈可變區CDR2序列（其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID NO: 10))、重鏈 可變區CDR3序列（其包括氨基酸序列ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID NO: 3))、輕鏈可變區CDR1 序列（其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4))、 輕鏈可變區⑶R2序列（其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5))以及輕鏈可變區 CDR3(其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6))。
[0086] 另一個實施例包括分離的、合成的或重組的抗體或其功能部分，其能夠特異性地 結合至RSV F抗原并且包括重鏈可變區⑶R1序列（其包括氨基酸序列NYIIN(SEQ ID N0: 1))、重鏈可變區CDR2序列（其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO: 2))、重鏈可 變區CDR3序列（其包括氨基酸序列ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID如：11))、輕鏈可變區0?1 序列（其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID勵:4))、輕鏈可變區0?2序列（其包括氨基 酸序列VASNLET(SEQIDN0:5))以及輕鏈可變區CDR3(其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQID N0:6))〇
[0087] 在另一個實施例中，分離的、合成的或重組的抗體或其功能部分包括重鏈可變區 (其包括重鏈⑶Rl、CDR2和⑶R3)以及輕鏈(其包括輕鏈⑶Rl、CDR2和⑶R3)，其中重鏈⑶R中 的至少一種、兩種或所有三種選自表14中的列A，剩余的重鏈CDR(如果有的話)選自表14中 的列B，并且輕鏈CDR包括表14中的列C。因此，在一個實施例中，在表14的列C中提供了輕鏈 ⑶R，并且只要重鏈具有各⑶R1、⑶R2和⑶R3之一，重鏈⑶R便可以從列A和B混合和匹配。
[0088] 各個替代性CDR實施例不一定包含以上在部分I.A中討論的任何非種系至種系突 變，但是任何或所有那些突變可任選存在。
[0089] 在一個實施例中，該抗體或功能部分可以包括來自表14的替代性重鏈⑶R中的至 少一種，并且可以具有至少一種其他CDR修飾。確切地，在又另一個實施例中，該抗體或功能 部分可以包括重鏈⑶R1序列（其包括與NYIIN(SEQ ID N0:1)相差一個氨基酸的序列）、重鏈 CDR2序列（其包括與GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)相差一個或兩個氨基酸的序列）、重 鏈CDR3序列(其包括與ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID N0:3)相差一個或兩個氨基酸的序列）、 輕鏈CDR1序列（其包括與QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一個氨基酸的序列）、輕鏈CDR2序 列（其包括與VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一個氨基酸的序列）和/或輕鏈⑶R3序列（其包括 與QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一個氨基酸的序列），其中重鏈CDR1中的至少一種是DYIIN (SEQ ID N0:9)，重鏈CDR2是GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID 腸：10)，或重鏈001?3是 ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)。 C. 具有改進的半衰期的抗體或功能部分
[0090] 在一個實施例中，可以對在此描述的抗體或功能部分進行另外的修飾以改進其半 衰期。在一個實施例中，可以對抗體或功能部分進行突變如缺失、添加或取代突變以改進其 半衰期。在一個實施例中，可以將Fc區域突變為包括以下取代M252Y、S254T以及T256E中的 一種、兩種或所有三種，其中編號對應于卡巴特的EU索引。在一個實施例中，可以將Fc區域 突變為包括所有以下取代M252Y、S254T以及T256E，其中編號對應于卡巴特的EU索引。戴爾' 阿夸(Dall'Acqua)等人，針對提高的對新生兒Fc受體(FcRn)的結合工程化的人類IgGl的特 性（Properties of Human IgGls Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor(FcRn))，生物化學雜志（J Biol Chem)281(33): 23514-23524(2006)。具有所 有三種取代的實施例被表示為YTE變體。換言之，在一個實施例中，該抗體或功能部分具有 在位置252Y具有Y、在位置254T具有T并且在位置256具有E的Fc區域，其中編號對應于卡巴 特的EU索引。 D. 抗體及其功能部分的其他特征
[0091]在某些實施例中，該抗體或功能部分在體外中和測定中具有小于lOng/ml的IC50 值，其中將HEp-2細胞用RSV和抗體或功能部分進行感染。在另一個實施例中，針對RSV亞型A 和/或RSV亞型B，IC50是9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml或2ng/ml 或更小。在一個實施例中，IC50是在實例中描述的體外中和測定中進行測量的，任選地針對 RSV A2和/或RSV B9320。
[0092]在一個實施例中，抗體及其功能部分對中和RSV亞型A株是有效的。在一個實施例 中，抗體及其功能部分對中和RSV亞型B株是有效的。在另一個實施例中，抗體及其功能部分 對中和RSV亞型A和B株二者是有效的。
[0093] 如在此所使用，術語抗體或其功能部分是以最廣泛的意義使用的。其可以為人造 的，如通過常規雜交瘤技術、重組技術產生的單克隆抗體(mAb)和/或其功能片段。它既可以 包括完整的免疫球蛋白分子，例如，多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、單特異性抗體、雙特異 性抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、動物抗體(例如，駱駝抗體）、嵌合抗體，又可 以包括其部分、片段、區域、肽及衍生物（由任何已知的技術產生，例如但不限于，酶促裂解、 肽合成或重組技術），像例如，缺乏輕鏈的免疫球蛋白、？813、？313'、？(313'）2、？￥、8〇?￥、抗體片 段、雙抗體、Fd、CDR區域或能夠結合抗原或表位的抗體的任何部分或肽序列。在一個實施例 中，該功能部分是單鏈抗體、單鏈可變區片段(scFv)、Fab片段或F(ab'） 2片段。
[0094] 如果抗體或功能部分能夠特異性地與分子反應從而將該分子與該抗體結合，那么 將其稱為"能夠結合"該分子。抗體片段或部分可以缺少完整抗體的Fc片段，從循環中更快 速清除，并且可以比完整抗體具有更少的非特異性組織結合。抗體的實例可以使用本領域 中熟知的方法從完整抗體產生，例如，通過用酶(如木瓜蛋白酶（以產生Fab片段)或胃蛋白 酶（以產生F(ab'） 2片段））的蛋白水解裂解。抗體的部分可以通過任何以上方法進行制備， 或者可以通過表達重組分子的一部分進行制備。例如，可以將重組抗體的一個或多個CDR區 域進行分離并亞克隆進適當的表達載體中。
[0095] 在一個實施例中，抗體或功能部分是人類抗體。將人類抗體用于人類療法可以減 少由在人類個體中針對非人類序列的免疫反應造成的副作用的可能性。在另一個實施例 中，該抗體或功能部分是人源化的。在另一個實施例中，抗體或功能部分是嵌合抗體。以此 方式，感興趣的序列(像例如感興趣的結合位點)可以被包括在抗體或功能部分中。
[0096] 在一個實施例中，該抗體可以具有IgG、IgA、IgM或IgE同種型。在一個實施例中，該 抗體是IgG。 II. 編碼抗體及其功能部分的核酸
[0097] 本發明實施例進一步提供了分離的、合成的或重組的核酸序列，其編碼以上部分 I. A或I .B中描述的任何抗體或功能部分。例如，將此類核酸從B細胞中分離，該B細胞能夠產 生抗體或功能部分。此類核酸編碼在此列出的重鏈和輕鏈序列。可替代地，此類核酸編碼重 鏈和輕鏈序列，這些重鏈和輕鏈序列分別包括在此列出的重鏈和輕鏈CDR。在一些實施例 中，這些核酸將編碼在此描述的抗體的功能部分。由于核酸密碼的簡并性，多種核酸將編碼 相同氨基酸并且所有都涵蓋于此。 III. 使用方法 A.抗體或功能部分的使用方法
[0098] 在一個實施例中，可以將抗體或功能部分用于治療方法中或用作藥物。該方法可 以用于消除或至少部分地預防RSV感染或者用于消除或至少部分地預防RSV感染的不良反 應。該方法還包括向對其需要的個體給予治療有效量的如在此描述的抗體或功能部分。在 一個實施例中，對其需要的個體是人類患者。
[0099] 在一個實施例中，為了消除RSV，可以在RSV感染發生前向個體給予抗體或功能部 分，換言之作為預防劑。可替代地，當個體已經被RSV感染時，可以給予抗體或功能部分。可 以將所述抗體或功能部分給予具有增加的RSV感染風險的個體，像例如早產兒童，患有慢性 肺病、先天性心臟病和/或免疫功能受損的個體，小于6周齡的兒童。早產兒童包括處于其生 命的第一年的嬰兒，連同處于其生命的第二年的兒童以及年齡較大仍處于RSV感染風險的 兒童。老年人也具有增加的RSV感染風險，并且因此可以基于風險有針對性的進行給予。還 可以向有事先RSV感染的個體給予抗體或功能部分。
[0100] 用于治療性應用，典型地將抗體或功能部分與藥學上可接受的載體、佐劑、稀釋劑 和/或賦形劑結合。在一個實施例中，將抗體或功能部分與注射用水結合。在另一個實施例 中，他們在具有組氨酸、甘氨酸以及氯化物的無菌無防腐劑的液態溶液中進行制備。例如， 在另一個實施例中，適合的載體的實例包括鑰孔戚血藍蛋白（KLH)、血清白蛋白（例如，BSA 或RSA)以及卵清蛋白。在另一個實施例中，所述適合的載體包括溶液，像例如，鹽水。在其他 實施例中，將抗體或功能部分以凍干形式提供，并且在給予之前與注射用水進行混合。 B.編碼抗體或功能部分的核酸的使用方法
[0101] 在又另一個實施例中，可以給予編碼抗體或功能部分的核酸。在給予這樣的核酸 后，抗體或功能部分通過宿主機器產生。所產生的抗體或功能部分能夠預防和/或消除RSV 感染和/或RSV感染的不良反應。
[0102] 編碼抗體的功能部分的核酸是指至少30個堿基對長的、至少50個堿基對長的或至 少100個堿基對長的核酸，其包括作為編碼抗體的核酸的至少一種表達特征(在種類上未必 在量上）。在一個實施例中，編碼抗體的功能部分的核酸至少編碼氨基酸序列，該氨基酸序 列包括在此描述的抗體的兩種或任選地三種CDR。 IV.制備抗體和功能部分的方法
[0103]還提供了分離的產抗體細胞，其能夠產生抗體或功能部分。在此描述的抗體或功 能部分可以從分泌抗體的雜交瘤中生產，或者從重組產生的細胞中生產，該細胞已經用編 碼抗體或功能部分的一種或多種基因進行轉化或轉染。
[0104] -個實施例包括通過在表達核酸以產生抗體的條件下培養宿主細胞，隨后回收抗 體來產生抗體或功能部分的方法。多種細胞系可以用來表達抗體或功能部分，包括但不限 于哺乳動物細胞系。在一個實施例中，細胞系可以是人類的。在另一個實施例中，可以使用 細菌或昆蟲細胞系。在一個實施例中，細胞系包括中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、CH0細胞變體 (例如DG44)、293細胞和NS0細胞。在另一個實施例中，細胞系包括VERY、BHK、HelaXOS、 1?0(、293卩、2931'、3了3、￥138、8了483、抱5781\耵82、8了20和了470、0^7030以及抱57888技田胞。
[0105] 重組體表達利用包含多核苷酸的表達載體的構建，該多核苷酸編碼抗體或功能部 分。一旦獲得了多核苷酸，便可以通過本領域中熟知的重組DNA技術生產用于產生抗體的載 體。表達載體可以包括適當的轉錄和翻譯控制信號。這可以使用體外重組DNA技術、合成技 術和體內基因重組來完成。在一個實施例中，復制型載體包括編碼抗體或功能部分的可操 作地連接至異源性啟動子的核酸序列。
[0106] 多種宿主表達載體系統可被用以表達抗體或功能部分，如美國專利號5，807,715 中所描述的。例如，哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CH0)，與載體如來自人巨細胞病毒 的主要立即早期基因啟動子元件相結合是抗體的有效表達系統（福金(Foecking)等人，基 因（Gene)，45:101(1986);和科克特（Cocke tt)等人，生物技術（Bio/Techno logy )，8 : 2 (1990))。另外，可選擇調節所插入序列的表達、或以所希望的特定方式來修飾并且加工基 因產物的宿主細胞株。蛋白質產物的此類修飾(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)對于蛋白 質的功能來說可能是重要的。不同的宿主細胞對于蛋白質和基因產物的翻譯后加工和修飾 具有特征性和特異性機制。可以選擇適當的細胞系或宿主系統以確保本發明蛋白質的正確 修飾和加工。為此，可以使用具有用于初級轉錄物的適當加工、基因產物的糖基化和磷酸化 的細胞機器的真核宿主細胞。
[0107] 在細菌系統中，取決于所表達的抗體或功能部分的預定用途，可以選擇許多表達 載體。例如，在產生大量的這種抗體或功能部分以便產生包括抗體或功能部分的藥物組合 物時，引導容易純化的融合蛋白產物的高水平表達的載體可以是令人希望的。此類載體包 括但不限于大腸桿菌表達載體pUR278(羅塞（Ruther)等人，歐洲分子生物學學會雜志 (EMB0H2:1791(1983))，其中編碼序列可單獨地與lac Z編碼區同框連接至載體中以使得 產生融合蛋白；pIN載體(井上（Inouye)&井上，1985,核酸研究（Nucleic Acids Res. )13: 3101-3109(1985);凡赫克（Van Heeke)& 舒斯特（Schuster)，1989,生物化學雜志 (J.Biol.Chem. )24:5503-5509(1989))等。pGEX載體也可以用于表達作為與谷胱甘肽-S-轉 移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。總體來說，此類融合蛋白是可溶的并且可以通過吸附并 且結合至谷胱甘肽-瓊脂糖親和基質，隨后在存在游離谷胱甘肽的情況下洗脫來容易地從 溶解的細胞中純化。PGEX載體被設計成將凝血酶和/或因子Xa蛋白酶裂解位點引入表達的 多肽中以使得克隆的靶基因產物可以從GST部分上釋放。
[0108] 在昆蟲系統中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus ;AcNPV)用作表達外源基因的載體。該病毒在草地貪夜蛾細胞中生長。 蛋白編碼序列可單獨地克隆進病毒的非必需區（例如，多角體蛋白基因）中并且置于AcNPV 啟動子(例如，多角體蛋白啟動子)的控制下。
[0109] 在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多基于病毒的表達系統。在腺病毒用作表達 載體的情況下，感興趣的編碼序列可以連接至腺病毒轉錄/翻譯控制復合體，例如，晚期啟 動子和三聯前導序列。然后可以通過體外或體內重組將這種嵌合基因插入腺病毒基因組 中。插入病毒基因組的非必需區（例如，區E1或E3)中將產生重組病毒，該重組病毒是有生活 力的并且能夠在被感染宿主中表達抗體或功能部分（例如，參見，洛根（Logan)和山克 (Shenk)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl .Acad. Sci.USA) ,81:355-359(1984))。特定的起 始信號也可能被要求用于插入的抗體或功能部分編碼序列的有效翻譯。這些信號包括ATG 起始密碼子和鄰近序列。另外，起始密碼子通常應當與所希望的編碼序列的閱讀框同框以 便確保整個插入物的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以具有多種來源，天然 的和合成的。表達效率可以通過包含適當的轉錄增強子元件、轉錄終止子等來提高（參見， 例如，特納（Bittner)等人，酶學方法(Methods in Enzymol ·)，153:51-544( 1987)) 〇
[0110] 穩定表達可以用于重組蛋白的長期、高產量生產。例如，可以產生穩定表達蛋白分 子的細胞系。可以用包含表達控制元件(例如，啟動子、增強子、轉錄終止子、聚腺苷酸化位 點等)和選擇性標志基因的適當工程化的載體轉化宿主細胞。在引入外源DNA后，可以允許 細胞在富集培養基中生長1-2天，并且然后切換至選擇性培養基。在重組質粒中的選擇性標 記賦予對選擇的抗性，并且允許將質粒穩定整合進其染色體中的細胞生長并且形成病灶， 進而可以將其克隆并且擴增成細胞系。編碼抗體或功能部分的質粒可以用來將基因 /cDNA 引入適于在培養物中產生的任何細胞系中。
[0111] 可以使用許多選擇系統，包括但不限于單純性皰疹病毒胸苷激酶（威格勒 (Wigler)等人，細胞(Cell) ,11:223(1977))、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(蘇帕斯卡 (Szybalska)&撒波斯基(Szybalski)，美國國家科學院院刊(Proc .Natl. Acad. Sci .USA)， 48 :202( 1992))以及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶（洛伊（Lowy)等人，細胞（Cell) ,22:8-17 (1980))基因可相應地用于tk-、hgprt-或aprT-細胞之中。另外，抗代謝物抗性可以用作選 擇以下基因的基礎:dhf r，它賦予對甲氨喋呤的抗性(威格勒(Wi g ler)等人，美國國家科學 院院刊(Natl. Acad. Sci.USA) ,77:357(1980);奧黑爾(O'Hare)等人，美國國家科學院院刊， 78:1527(1981)) ;gpt，它賦予對霉酚酸的抗性(穆利根(Mulligan)&貝爾格(Berg)，美國國 家科學院院刊，78:2072( 1981)) ;neo，它賦予對氨基葡糖苷G-418的抗性(吳(Wu)和吳，生物 療法（Biotherapy )3:87-95(1991);托斯塔謝夫（Tolstoshev)，藥理學與毒理學年鑒 (Ann ·Rev·Pharmacol · Toxicol ·)32: 573-596( 1993);穆利根（Mulligan)，科學（Science) 260:926-9 32(1993);以及摩根（Morgan )&安德森（Anderson)，生物化學年鑒 (Ann.Rev.Biochem. )62:191-217( 1993);梅（May)，TIB TECH 11 (5) :155-215( 1993));以及 hygro,它賦予對潮霉素的抗性(圣德爾（Santerre)等人，基因（Gene)，30:147(1984))。可以 常規地應用在重組DNA技術領域中通常已知的方法來選擇所希望的重組克隆，并且此類方 法描述于例如奧蘇貝爾(Ausubel)等人(編著），當代分子生物學方案(Current Protocols in Molecular Biology)，約翰&威利父子公司（John Wiley&Sons)，紐約（1993);克里格勒 爾（Kriegler)，基因轉移和表達：實驗手冊（Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，斯托克頓出版社（Stockton Press)，紐約（1990);以及德拉柯波利 (Dracopoli)等人（編著），當前人類遺傳學方案（Current Protocols in Human Genetics)，約翰&威利父子公司，紐約（1994)的第12和13章；庫爾柏利-加拉平(Colberre-Garapin)等人，1981，分子生物學雜志(J.Mol .Biol ·)，150:1。
[0112] 一旦抗體或功能部分已經通過重組表達產生，就可以通過本領域中已知的用于免 疫球蛋白分子的純化的任何方法將其純化，例如，通過色譜法(例如，離子交換色譜、親和色 譜(特別是通過對于特定抗原蛋白A或蛋白G的親和力）以及尺寸分級柱色譜）、離心、差別溶 解度，或者通過用于蛋白質的純化的任何其他標準技術。此外，本發明的蛋白質或其片段可 以融合至在此所描述的或者本領域中另外已知的異源多肽序列，以便促進純化。
[0113] 在一些實施例中，產生產RSV特異性抗體細胞，其穩定至少六個月。在另一個實施 例中，產RSV特異性抗體細胞穩定至少九周、至少三個月或至少六個月。在另一個實施例中， 制備抗體和功能部分的替代性方法在本領域中是熟知的，并且至少描述于美國專利號8， 562,996 中。
[0114] 現在將詳細參考本發明示例性實施例，其實例示于附圖中。在可能的情況下，在整 個附圖中將使用相同的參考號來指示相同或相似的部分。通過考慮在此披露的說明書和實 踐，其他實施例對于本領域技術人員將是清楚的。實施例進一步于以下實例中進行解釋。這 些實例并不限制權利要求書的范圍，而是僅用于闡明某些實施例。說明書和實例的意圖僅 被認為是示例性的，真實范圍和精神通過以下權利要求書指明。 實例 實例1.單克隆抗體的制備和表達
[0115] 將1G7免疫球蛋白可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)(其各自包含改進抗體效力的所 希望的突變）的DNA片段插入人類IgGl表達載體（其包含κ輕恒定區和CH1-鉸鏈-CH2-CH3IgGl重恒定區）中。為了表達1G7抗體，使用293Fectin?試劑(英杰公司（Invitrogen)，卡 爾斯巴德，加利福尼亞州），將人類胚腎293-F細胞用含1G7的載體進行瞬時轉染。使細胞在 37 °C、120rpm下，在5 % %濕度的情況下生長。將培養基在第二天通過添加等體積的 培養基進行補料，并且在轉染后10天收獲。將上清液進行無菌過濾以去除細胞和碎片。使用 蛋白Α柱(Hi - trap蛋白Α柱，西格馬（S i gma))純化I gG，并且將洗脫的蛋白在4 °C下用PBS透析 過夜。在NanoDrop(賽默科技公司（Thermo Scientific))中通過蛋白定量確定IgG濃度。
[0116] 采取同樣的方法來產生其他抗體。 實例2.體外微量中和測定
[0117] 如下進行微量中和測定：簡言之，以15μ!7孔的體積，將MAb的2倍連續稀釋液引入 384孔微量滴定板的HEp-2細胞培養基中。隨后，將15yL的RSV A2或RSV B 9320病毒稀釋于 HEp-2細胞培養基中至濃度范圍從80至150pfu/孔，并且將其添加至各孔，包括僅包含HEp-2 細胞培養基的對照孔，并且將板在37 °C下在5 %⑶2的情況下孵育1.5小時。將30yL的HEp-2 細胞以2.5x 105個細胞/mL添加至各孔中，并且將這些板在37°C下在5%⑶2的情況下進行 孵育。在3天（針對RSV A2)或4天（針對RSV B9320)后，去除培養基，并且添加30yL冰冷的 80%丙酮/20%PBS以固定這些細胞。
[0118] 使用靶向RSV F的C位點的偶聯辣根過氧化物酶的抗-RSV F MAb(1331H)，通過酶 聯免疫吸附測定（ELISA)測量病毒復制（比勒（Beeler)和范?懷克寇林格（van Wyke Coelingh)，病毒學雜志(J Virol. )63(7) :2941-2950(1989))。將1331H MAb以1:6,000 稀釋 于PBS中，并且將30μ1添加至各孔中。在37°C下孵育兩小時之后，將這些板用PBS-T洗滌三 次。將TMB過氧化物酶30yL添加至各孔中，并且將這些板在室溫下在黑暗中孵育15分鐘。將 反應通過向各孔添加15yL的2N H2S04來停止。使用酶標儀通過監測450nm下的吸光度來測 量底物轉化。使用log(抑制劑)對應答與可變斜率曲線擬合，在Graphpad Prism中使用非線 性擬合算法計算IC50值，，并且IC50值表示在450nm下所測量的吸光度減少50%所需要的 MAb濃度。
[0119] 結果提供于圖4中，該圖顯示在微量中和中1G7、1F5、2D10和D25各自抑制了RSV A2 和RSV B9320復制。1G7是最有效的，其次是1F5、2D10，并且然后是D25。 實例3.棉鼠 RSV模型 A)比較D25、J、L和LA變體針對RSV攻擊提供保護的能力
[0120] 以圖中指示的各個劑量水平，通過肌內注射向動物給藥0.1ml的抗體。二十四小時 后，使用異氟烷室對動物進行麻醉，并且通過鼻內滴注lXl〇 6pfu/動物的RSV株A2進行感 染。四天后，通過二氧化碳室息處死動物;將它們的肺經外科手術摘除，切成兩份并且在液 氮中冷凍或立即處理。在處死時，通過心臟穿刺獲得血液樣品。
[0121] 為了評估MAb給予對棉鼠肺中的RSV復制的影響，針對各劑量組確定棉鼠肺勻漿物 中的RSV病毒滴度。出于該目的，在室溫下，用TeenALysing基質管，在10份（重量/體積） Hanks平衡鹽溶液加蔗糖磷酸酯中，使用快速制備型24組織勻漿器將收獲的肺單獨勻漿20 秒。將得到的懸浮液以930 X g在4°C下離心10min，并且收集上清液并儲存在-80 °C下直至分 析。在接種前24小時，將肺勻漿物樣品以1:10和1:100稀釋于培養基中，并且將50yL的未稀 釋的肺勻漿物或稀釋的肺勻漿物樣品添加至HEp-2細胞的一式兩份孔中，這些HEp-2細胞以 2.5\10 5個細胞/孔的細胞密度被種于24孔板中。在37°(：下，在5%〇)2的情況下孵育1小時 后，將接種物用包含0.8%甲基纖維素的培養基替換，并且將這些細胞在37°C下，在5%⑶ 2 的情況下進行孵育。五天后，去除覆蓋物，并且將這些細胞固定并且用山羊抗-RSV多克隆抗 體進行免疫染色，隨后用二級抗-山羊HRP抗體進行免疫染色。將噬斑通過與AEC試劑反應來 進行可視化。在顯微鏡下，使用10 X物鏡量化噬斑。本測定的檢測極限是200pfu/g組織。出 于統計分析的目的，在l〇〇pfu/g(檢測下限的一半)下，指定具有低于檢測極限（<200pfu/g) 的病毒滴度的樣品。結果提供于圖5中，證實在針對RSV A攻擊提供保護方面，J、L和LA變體 都比D25更有效，但是L和LA變體在針對RSV B亞型提供保護方面不太有效(其中L針對一種B 株比針對另一種表現要好）。基于該數據，選擇J作為用于進一步優化的起點。 B) 比較1G7、1F5和D25變體針對RSV攻擊提供保護的能力
[0122] 使用本實例的以上部分(A)中討論的模型來比較1G7、1F5和D25針對RSV攻擊提供 保護的能力。以2mg/kg、lmg/kg、0 · 5mg/kg和0 · 25mg/kg對動物進行給藥。結果顯示于圖6中。 數據顯示，1G7在針對RSV攻擊提供保護方面比1F5表現要好，盡管兩者都能夠將病毒滴度降 至檢測極限。1G7和1F5二者都比D25表現要好。 C) 1G7變體的詳細評價
[0123] 如以上部分(A)中所描述的，使用相同的棉鼠模型。如圖7中所報道的，在存在的抗 體的各個濃度下，每只動物都接受0.1ml的抗體。針對RSV A2和RSV B9320二者，1G7證實了 與RSV肺滴度的劑量-應答關系。 D) 比較變體中和RSV A2和RSV B9320的能力
[0124] 如以上部分(A)中所描述的，使用相同的棉鼠模型。
[0125] 使用ELISA方法確定在肺收獲當天棉鼠血清樣品中的人類IgG濃度。在本測定中， 通過結合至微量滴定板的山羊抗-人類抗體捕獲人類抗體。在4 °C下，在30yL體積中，將山羊 抗-人類IgG(H+L)抗體(0.5yg/mL，在1 XPBS中）涂布在Nunc Maxisorp 384孔微量滴定板上 過夜。將板進行洗滌，然后用60此的PBS+3%熱滅活的山羊血清的溶液在室溫下封閉1小時。 去除封閉緩沖液，并且將樣品進行如下應用：將稀釋于測定緩沖液中的標準人類抗體的兩 倍連續稀釋液用于濃度范圍為500ng/ml至0.488ng/ml的標準曲線。使用4參數曲線擬合來 擬合標準曲線。
[0126] 結果提供于圖8中，該圖顯示，在此描述的變體在中和RSV A2和RSV B9320兩者中 都具有比D25低的IC50。這還證實到，針對A2或B9320病毒不存在活性損失，其中在E9-2和 B12-1的情況下看到增加的活性，并且在1G7GLM和E3-5的情況下針對B9320病毒僅存在名義 活性損失。 實例4.如通過單克隆抗體抗性突變體所定義的表位
[0127] 在250ng/ml的1G7-YTE存在下，將RSV A和RSV B病毒突變體通過傳代三次進行分 離。1G7-YTE是具有以上部分I.C中描述的YTE突變的1G7抗體。在最后的傳代后，確定RSV F 蛋白的序列。突變對應于在RSV F與親本D25抗體的共晶體結構中先前定義的區域。所有的 抗性突變體在氨基酸200-213之間的F1區域中都包含RSV F蛋白的區域改變。在位置294處 的二級突變并沒有顯示提高抗性，并且與在區域200-213中具有單一突變的那些相比并沒 有更多的抗性。F2區域中的N208S突變背景的二級突變產生了提高的抗性。結果提供于圖9 中。 實例5.針對RSV的臨床分離株的中和作用
[0128] 在HEp2細胞感染前，通過用抗體的一系列稀釋液預孵育擴增的臨床分離株病毒來 進行中和測定。將細胞的感染測量為在細胞表面上F蛋白表達的函數。通過中和曲線的非線 性擬合計算IC50值。如在實例2中的測量病毒復制(體外微量中和測定）。
[0129] 結果提供于圖10中。針對在HEp2細胞中中和RSV的A分離株或B分離株，1G7和1F5的 IC50都比D25低。 通過引用結合
[0130] 出于所有目的，在此引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請、論文、教科書等以 及其中引用的參考文獻(如同它們還未曾引用過的程度)通過引用以其全部內容結合在此。 等效物
[0131] 前述書面說明書被認為足以使本領域的技術人員能夠實踐實施例。前述描述和實 例詳述了某些實施例，并且描述了諸位發明人所期望的最佳模式。然而，應領會的是，不論 前述事項可以在文中看起來如何詳盡，這些實施例可以按多種方式進行實踐，并且權利要 求書包括其任何等效物。
【主權項】
1. 一種合成的或重組的抗體或其功能部分，其能夠特異性地結合呼吸道合胞病毒并且 包括： a. 重鏈可變區CDRl序列，其包括與序列NYIIN(沈Q ID N0:1)或DYIIN(沈Q ID N0:9)至 少70 %-致的序列，W及 b. 重鏈可變區CDR2序列，其包括與序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO:2)或 011口￥11；17狀6?邸96(569 10^:10)至少75%-致的序列，^及 C.重鏈可變區CDR3序列，其包括與序列ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID NO:3)或 ￡1八1^晉517￥1??狀。0的沈9 10備：11)至少70%-致的序列，^及 d. 輕鏈可變區CDRl序列，其包括與序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)至少85% -致的序 列，W及 e. 輕鏈可變區CDR2序列，其包括與序列VASNLET(SEQ ID NO:5)至少70%-致的序列， W及 f. 輕鏈可變區CDR3序列，其包括與序列QQY面LP(SEQ ID NO:6)至少70%-致的序列； 并且其中在重鏈中至少一個氨基酸不同于SEQ ID NO:7,并且所述至少一個氨基酸選 白.2. 如權利要求1所述的抗體或功能部分，其中 a.重鏈可變區CDRl序列包括與NYIIN(SEQ ID NO:l)或DYIIN(沈Q ID NO:9)相差一個 氨基酸的序列， b .重鏈可變區 CDR2 序列包括與 GI IPVLGTVHYAPKFQG( SEQ ID NO:2)或 011口￥11；17狀6?邸96(569 10^:10)相差一個或兩個氨基酸的序列， C .重鏈可變區 CDR3 序列包括與 ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID NO:3)或 ￡1八1^晉517￥1??狀。0的沈9 10備:11)相差一個或兩個氨基酸的序列， d. 輕鏈可變區CDRl序列包括與QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一個氨基酸的序列， e. 輕鏈可變區CDR2序列包括與VASNLET(SEQ ID NO:5)相差一個氨基酸的序列，和/或 f. 輕鏈可變區CDR3序列包括與QQY面LP(SEQ ID NO:6)相差一個氨基酸的序列。3. 如權利要求1所述的抗體或功能部分，其中 a. 重鏈可變區CDRl序列包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)， b. 重鏈可變區CDR2序列包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO:2)或GIIP化GTVHYGPKFQG (沈Q ID NO: 10)， C.重鏈可變區CDR3序列包括ETALWSTTYLPHY抑N(SEQ ID NO:3)或ETALVVSTTYRPHY抑N (沈Q ID NO: 11)， d. 輕鏈可變區CDRl序列包括QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)， e. 輕鏈可變區CDR2序列包括VASNLET(SEQ ID N0:5)，并且 f. 輕鏈可變區CDR3序列包括QQY面LP(SEQ ID N0:6)。4.如權利要求1-3中任一項所述的抗體或功能部分，其中在重鏈可變區中至少W下氨 iM：而忿末同不QT?n …. 7 .14. 如權利要求1-13中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區與SEQ ID N0:7或沈Q ID NO: 13至少90%-致，并且其中該輕鏈可變區與沈Q ID N0:8至少90%-致。15. 如權利要求1-2或4-14中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區CDRl序 列包括與NYIIN(沈Q ID NO: 1)或DYIIN(沈Q ID N0:9)相差一個氨基酸的序列。16. 如權利要求1-2或4-15中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區CDR2序 列包括與611?￥11；17狀4?邸96(569 10側:2)或611?￥11；1^狀6?陽96(569 10側:10)相差一 個或兩個氨基酸的序列。17. 如權利要求1-2或4-16中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區CDR3序 列包括與6141^晉51'1'化?狀抑則沈〇10側:3)或6141^￥￥517￥1^^抑則沈〇10側：11)相差一 個或兩個氨基酸的序列。18. 如權利要求1 -2或4-17中任一項所述的抗體或功能部分，其中該輕鏈可變區CDRl序 列包括與0459〇1￥爪^^(569 1〇^:4)相差一個氨基酸的序列。19. 如權利要求1-2或4-18中任一項所述的抗體或功能部分，其中該輕鏈可變區CDR2序 列包括與VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一個氨基酸的序列。20. 如權利要求1-2或4-19中任一項所述的抗體或功能部分，其中該輕鏈可變區CDR3包 括與QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一個氨基酸的序列。21. 如權利要求1-2或4-14或16-20中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變 區CDRl序列包括NYIIN(沈Q ID NO: 1)或DYIIN(沈Q ID N0:9)。22. 如權利要求1-2、4-15或17-21中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區 CDR2序列包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID N0:10)。23. 如權利要求1-2、4-16或18-22中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區 CDR3序列包括ETALVVSTTYLPHY抑N(沈Q ID N0:3)或ETALVVSTTYRPHY抑N(沈Q ID N0:11)。24. 如權利要求1-2、4-17或19-23中任一項所述的抗體或功能部分，其中該輕鏈可變區 CDRl序列包括QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)。25. 如權利要求1-2、4-18或20-24中任一項所述的抗體或功能部分，其中該輕鏈可變區 CDR2序列包括VASNLET(沈Q ID NO:5)。26. 如權利要求1-2、4-19或21-25中任一項所述的抗體或功能部分，其中該輕鏈可變區 CDR3包括QQYDNLP(SEQ ID NO:6)。27. 如權利要求1-26中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區包括在框架 區內與選自SEQ ID N0:7和12-21的序列95%-致的序列。28. 如權利要求1-26中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區包括在框架 區內與選自SEQ ID NO: 12-21的序列一致的序列。29. 如權利要求1-26中任一項所述的抗體或功能部分，其中該重鏈可變區包括與選自 SEQ ID NO: 12-21的序列至少70%-致的序列。30. 如權利要求1-29中任一項所述的抗體或功能部分，具有輕鏈可變區序列，該輕鏈可 變區序列包括與SEQ ID NO:8至少70%-致的序列。31. 如權利要求1-29中任一項所述的抗體或功能部分，具有輕鏈序列可變區，該輕鏈序 列可變區包括與SEQ ID N0:8-致的序列。32. -種合成的或重組的抗體或其功能部分，其能夠特異性地結合至RSV F抗原并且包 括 а. 重鏈可變區CDRl序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID NO:9)，W及 б. 重鏈可變區〔032序列，其包括氨基酸序列611?￥11；17狀6?陽96(56〇10側:10)，^及 。.重鏈可變區〔01?3序列，其包括氨基酸序列6141^晉517￥1??狀。0則56〇10^:11)，^及 d. 輕鏈可變區CDRl序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，W及 e. 輕鏈可變區CDR2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，W及 f. 輕鏈可變區CDR3,其包括氨基酸序列QQY面LP(SEQ ID N0:6)。33. -種合成的或重組的抗體或其功能部分，其能夠特異性地結合至RSV F抗原并且包 括： а. 重鏈可變區CDRl序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID NO:9)，W及 б. 重鏈可變區〔032序列，其包括氨基酸序列611?￥11；17狀6?陽96(56〇10側:10)，^及 。.重鏈可變區〔01?3序列，其包括氨基酸序列6141^晉517￥1?狀。0則56〇10^:3)，^及 d. 輕鏈可變區CDRl序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，W及 e. 輕鏈可變區CDR2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，W及 f. 輕鏈可變區CDR3,其包括氨基酸序列QQY面LP(SEQ ID N0:6)。34. 如權利要求1-33中任一項所述的抗體或功能部分，其中該抗體或功能部分是完全 的人類、人源化抗體，或嵌合的。35. 如權利要求1-34中任一項所述的功能部分，其中該功能部分是單鏈抗體、單鏈可變 區片段(30。乂）、化6片段或。(曰6'）2片段。36. 如權利要求1-35中任一項所述的抗體或功能部分，其中該抗體或功能部分在RSV A2的中和測定中具有5.化g/ml或更小的IC50。37. 如權利要求1-36中任一項所述的抗體或功能部分，其中該抗體或功能部分在RSV B9320的中和測定中具有3.化g/ml或更小的IC50。38. 如權利要求1-37中任一項所述的抗體或功能部分，其中該抗體或功能部分具有在 位置252Y具有Y、在位置254T具有T并且在位置256具有E的化區域，其中編號對應于卡己特 的抓索引。39. -種抑制受試者體內的RSV感染的方法，該方法包括向該受試者給予如權利要求1- 38中任一項所述的抗體或功能部分。40. 如權利要求39所述的方法，其中該受試者是人類患者。41. 如權利要求40所述的方法，其中該受試者是早產的人類患者。42. -種合成的、重組的或分離的核酸序列，其編碼如權利要求1-38中任一項所述的抗 體或功能部分。43. -種抑制受試者體內的RSV感染的方法，該方法包括向受試者給予如權利要求42所 述的核酸。44. 一種分離的產抗體細胞，其能夠產生如權利要求1-38中任一項所述的抗體或功能 部分。45.根據權利要求44所述的產抗體細胞，其穩定至少九周。
【文檔編號】A61K39/42GK105916520SQ201580003410
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2015年1月14日
【發明人】N·厄布蘭德, N·凱樂瓦德-勒雷, A·Q·袁, B·里齊特
【申請人】米迪繆尼有限公司