角膜支架材料及其制備方法和角膜支架的3d打印方法
【專利摘要】本發明提供一種角膜支架材料及其制備方法和角膜支架的3D打印方法，實現的是使用3D打印技術制備角膜支架的技術效果。用碳酸鈉水溶液對蠶繭脫膠后，用溴化鋰水溶液將其溶解后，經過透析、抽濾和離心處理得到濃縮的絲素蛋白水溶液，使得絲素蛋白形成納米結構，能夠模仿細胞外基質的結構；再將經超聲分散處理的氧化石墨烯水溶液與絲素蛋白水溶液混合，且絲素蛋白與氧化石墨烯的質量比為10000:1?1000:1，提高材料的力學強度和透明性；在得到的混合水溶液中加入明膠水溶液和交聯劑，并在溫度為30℃?50℃的條件下攪拌均勻來調控材料降解速度以及保證角膜支架能夠打印成型，從而能夠使用3D打印技術打印角膜支架。
【專利說明】
角膜支架材料及其制備方法和角膜支架的3D打印方法
技術領域
[0001]本發明屬于醫療器械中植入材料和器官技術領域，具體地說，涉及一種角膜支架材料及其制備方法和角膜支架的3D打印方法。
【背景技術】
[0002]人類的角膜基質層占角膜厚度的90%，主要由角膜基質細胞和膠原纖維等細胞外基質成分規則排列而成，透明且具有一定的曲率半徑，有利于光線通過和折曲，在維持整個角膜的透明度和曲光率等方面具有至關重要的作用。
[0003]絕大多數角膜基質病盲患者均可以通過角膜移植手術來治愈，但由于捐獻角膜的高度匱乏致使絕大部分患者得不到供體角膜而無法復明。
[0004]近年來，三維打印技術在制備組織工程用三維支架方面得到了快速發展和應用，通過控制打印平臺冷凍溫度，在較短時間內使材料分子冷凍成型，尤其是對于一些容易變性的天然生物材料，能使不易成型的天然生物材料液體快速冷凍成型且能夠保留其在溶液中的構象以及生物活性，該技術使構建與天然角膜結構類似的角膜基質支架的體外重建及其臨床應用成為可能，也為角膜基質病盲患者重見光明創造了條件。
【發明內容】
[0005 ]本發明提供了一種角膜支架材料及其制備方法和角膜支架的3D打印方法，實現的是使用3D打印技術制備角膜支架的技術效果。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現:
提出一種角膜支架材料，包括按質量分的如下原料:30%_70%的明膠水溶液、29.5%-69.9%的絲素蛋白與氧化石墨稀混合水溶液以及0.1%-0.5%的交聯劑;其中，所述絲素蛋白與氧化石墨烯混合水溶液中，絲素蛋白與氧化石墨烯的質量比為10000:1-1000:1。
[0007]進一步的，所述明膠水溶液中明膠的質量占比為30%-60%。
[0008]提出一種角膜支架材料的制備方法，所述角膜支架材料包括按質量分的如下原料:30%-70%的明膠水溶液、29.5%-69.9%的絲素蛋白與氧化石墨烯混合水溶液以及0.1%-0.5%的交聯劑;其中，所述絲素蛋白與氧化石墨烯混合水溶液中，絲素蛋白水溶液與氧化石墨烯水溶液的質量比為10000:1-1000:1;包括如下步驟:1)用碳酸鈉水溶液對蠶繭脫膠后，用溴化鋰水溶液將其溶解，再經過透析、抽濾和離心處理得到絲素蛋白水溶液;2)將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散處理后，與步驟I)中得到的絲素蛋白水溶液混合得到混合水溶液;所述混合水溶液中絲素蛋白與氧化石墨烯的質量比為10000:1-1000:1 ;3)在步驟2)中得到的混合水溶液中加入明膠水溶液和交聯劑，并在溫度為30°C-5(TC的條件下攪拌均勻；其中，所述明膠水溶液在共混溶液中的質量占比為30%-70%，所述交聯劑在共混溶液中的質量占比為0.1%-0.5%。
[0009]進一步的，步驟I)中的透析處理包括:將溶解有脫膠蠶繭的溴化鋰水溶液用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析72小時;期間，每2小時換水一次。
[0010]進一步的，步驟I)中，在經過透析、抽濾和離心處理后，需在10°C_78°C的環境下濃縮3-200小時得到所述絲素蛋白水溶液。
[0011 ]進一步的，步驟3)中，所述明膠水溶液中明膠的質量占比為30%_60%。
[0012]提出一種角膜支架的3D打印制備方法，包括如下步驟:在生物打印機的噴頭中裝入按照上述角膜支架材料的制備方法制備的角膜支架材料;在50°C的條件下，根據設定程序逐層打印出角膜支架。
[0013]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:本發明提出的角膜支架材料及其制備方法和角膜支架的3D打印方法中，絲素蛋白與氧化石墨烯的混合水溶液，從本質上利用了絲素蛋白的自組裝性質，使其形成納米結構，模仿了細胞外基質的結構，提高了角膜支架材料的生物相容性;氧化石墨烯能夠改變絲素蛋白的二級結構而促進絲素蛋白結晶結構的形成，能夠提高角膜支架材料的力學強度和透明性；明膠水溶液的混合以及比例的調控，改善了明膠降解速度過快的問題同時，提高了角膜支架材料的可凝性和韌性，保證了角膜支架材料能夠打印成型，使得該角膜支架材料能夠應用于3D打印技術，通過3D打印技術實現角膜支架的制備。
[0014]使用本發明提出的角膜支架材料，通過3D打印技術打印成型的角膜支架，生物降解性好、仿生性能優、力學強度高且透明性好，使用后能夠更好的促進眼角膜的修復。
[0015]結合附圖閱讀本發明實施方式的詳細描述后，本發明的其他特點和優點將變得更加清楚。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明提出的角膜支架材料的制備方法和角膜支架的3D打印方法的流程圖；
圖2為根據實施例一制備的角膜支架材料的掃描電鏡圖；
圖3為根據實施例三制備的角膜支架材料的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0017]
下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細地說明。
[0018]本發明提出一種角膜支架材料，包括按質量分的如下原料:30%_70%的明膠水溶液、29.5%-69.9%的絲素蛋白與氧化石墨烯混合水溶液以及0.1%-0.5%的交聯劑;其中，絲素蛋白與氧化石墨烯混合水溶液中，絲素蛋白與氧化石墨烯的質量比為10000:1-1000:1。其中，明膠水溶液中，明膠的質量占比為30%-60%。
[0019]該角膜支架材料的制備方法，如圖1所示，包括如下步驟:
步驟S1:用碳酸鈉水溶液對蠶繭脫膠后，用溴化鋰水溶液將其溶解，再經過透析、抽濾和離心處理得到絲素蛋白水溶液。
[0020]這里，碳酸鈣水溶液的質量百分比為0.5%_1%，溴化鋰水溶液的摩爾濃度為9.5 土0.3mol/L。
[0021]透析處理具體為:將溶解有脫膠蠶繭的溴化鋰水溶液用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析72小時;期間，每2小時換水一次。
[0022]在經過透析、抽濾和離心處理后得到的絲素蛋白水溶液，還需放置在10°C_78°C的環境下濃縮3-200小時，得到的是濃縮的絲素蛋白水溶液，在該濃縮的絲素蛋白水溶液中，絲素蛋白的質量占比為10%_30%。通過對絲素蛋白的調控，使其形成納米結構，能夠使絲素蛋白溶液進行自組裝，從而獲得類ECM(細胞外基質)結構，提高生物相容性。
[0023]步驟S2:將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散處理后，與步驟SI中得到的絲素蛋白水溶液混合得到混合水溶液，該混合水溶液中絲素蛋白與氧化石墨烯的質量比為10000:1-
1000:1ο
[0024]氧化石墨烯水溶液的濃度為0.l_5mg/ml，將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散處理的超聲時間控制為2-20分鐘。
[0025]該步驟中得到的混合水溶液，實質上能夠改變絲素蛋白的二級結構，促進絲素蛋白結晶結構的形成，不僅能夠提高絲素蛋白材料的力學強度和穩定性，保證材料能夠打印成型；同時因為氧化石墨烯的高折射率特性，使得獲得的角膜支架材料透明性提高。
[0026]步驟S3:在步驟S2中得到的混合水溶液中加入明膠水溶液和交聯劑，并在溫度為30 0C -50 0C的條件下攪拌均勻。
[0027]這其中，明膠水溶液在共混溶液中的質量占比為30%_70%，交聯劑在共混溶液中的質量占比為0.1%-0.5%。而明膠水溶液中明膠的質量占比為30%-60%。
[0028]明膠與絲素蛋白和氧化石墨烯共混的過程中，通過控制絲素蛋白與明膠的比例來調控角膜支架材料的降解速度滿足人工角膜修復的需要。同時，明膠提高了角膜支架材料的可凝性和韌性，保證了角膜支架材料能夠打印成型。
[0029]在保證了角膜支架材料的力學性能、透明度、降解速度、可凝性和韌性后，該角膜支架材料能夠應用于3D打印技術，通過3D打印技術打印角膜支架。
[0030]基于上述，本發明還提出一種角膜支架的3D打印方法，如圖1所示，包括如下步驟: 步驟S4:在生物打印機的噴頭中裝入角膜支架材料。
[0031]該角膜支架材料為上述按照步驟S1-步驟S31的角膜支架材料的制備方法制備出來的角膜支架材料。
[0032]步驟S5:在50°C的條件下，根據設定程序逐層打印出角膜支架。
[0033]具體的打印操作按照打印參數需求，以現有的生物打印機的打印過程實現即可，本發明實施例不予限制。
[0034]下面以一些具體的實施例，對本發明提出的角膜支架材料及其制備方法和角膜支架的3D打印制備方法做具體說明。
[0035]實施一將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0036]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6%。
[0037]將上述絲素蛋白溶液在60 0C的環境下進行濃縮處理，濃縮時間為120小時，絲素蛋白濃縮后溶液濃度為10%?30%左右。
[0038]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理后與絲素蛋白水溶液混合，搖勻;其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:10000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比1:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0039]將上述共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為75MPa，斷裂伸長率為50%，斷裂能為8J/g。
[0040]如圖2所示，本實施例一中經濃縮處理后的絲素蛋白與氧化石墨烯和明膠水溶液共混打印出來人工角膜支架材料表面形貌圖，可見其表面有很多纖維狀的結構，這種類ECM的結構能夠促進細胞在材料上的生長。
[0041 ] 實施例二將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0042]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6%。
[0043]將上述絲素蛋白溶液在60 0C的環境下進行濃縮處理，濃縮時間為120小時，絲素蛋白濃縮后溶液濃度為10%?30%左右。
[0044]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻；其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:1000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比1:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0045]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為80MPa，斷裂伸長率為70%，斷裂能為10J/g。
[0046]實施例三將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0047]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6%。
[0048]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻;其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:10000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比1:1加入明膠水溶液形成紅混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0049]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為73MPa，斷裂伸長率為62%，斷裂能為13J/g。
[0050]如圖3所示，是實施例三所述的新鮮絲素溶液與氧化石墨烯和明膠溶液共混打印出來人工角膜支架材料表面形貌圖，其表面不具有纖維狀的結構。
[0051 ]實施例四將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0052]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6%。
[0053]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻；其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:1000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比1:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0054]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為68MPa，斷裂伸長率為67%，斷裂能為15J/g。
[0055]實施例五將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0056]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ο將上述絲素蛋白溶液在60°C的環境下進行濃縮處理，濃縮時間為120小時，絲素蛋白濃縮后溶液濃度為10%?30%左右。
[0057]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻;其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:10000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比2:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0058]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為85MPa，斷裂伸長率為73%，斷裂能為13J/g。
[0059]實施例六將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0060]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ο將上述絲素蛋白溶液在60°C的環境下進行濃縮處理，濃縮時間為120小時，絲素蛋白濃縮后溶液濃度為10%?30%左右。
[0061 ]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻;其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:1000的。然后按照絲素蛋白與明膠質量比2:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0062]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為83MPa，斷裂伸長率為62%，斷裂能為20J/g。
[0063]實施例七將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0064]取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ο將上述絲素蛋白溶液在60°C的環境下進行濃縮處理，濃縮時間為120小時，絲素蛋白濃縮后溶液濃度為10%?30%左右。
[0065]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻;其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:10000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比2:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0066]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為86MPa，斷裂伸長率為73%，斷裂能為20/g。
[0067]實施例八將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0068]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的LiBr溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60°C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ο將上述絲素蛋白溶液在60°C的環境下進行濃縮處理，濃縮時間為120小時，絲素蛋白濃縮后溶液濃度為10%?30%左右。
[0069]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻；其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:1000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比2:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0070]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為88MPa，斷裂伸長率為69%，斷裂能為17J/g。
[0071 ]實施例九將50g蠶絲放入0.5 %的Na2CO3溶液中進行脫膠處理并烘干，脫膠時以100 °C煮沸I小時，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干。
[0072]稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g放入于10mL濃度為9.3mol/L的溴化鋰(LiBr)溶液中進行溶解處理，溶解處理時在60 0C下溶解4小時。然后對上述溶解有蠶絲的LiBr溶液進行透析處理，透析時用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，以去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6%。將上述絲素蛋白溶液在60°C的環境下進行濃縮處理，濃縮時間為120小時，絲素蛋白濃縮后溶液濃度為10%?30%左右。
[0073]將濃度為2mg/ml氧化石墨烯水溶液作超聲分散處理與絲素蛋白水溶液混合，搖勻；其中，氧化石墨烯與絲素蛋白的質量比為1:1000。然后按照絲素蛋白與明膠質量比2:1加入明膠水溶液形成共混溶液，并將質量比為5:1的EDC(可溶于水的碳二亞胺):NHS(琥珀酰亞胺)加入共混溶液，使混合溶液交聯。最后，在30?50°C條件下混合均勻。
[0074]將共混溶液裝入生物打印機的噴頭中，在50°C的條件下，根據設定的程序，逐層打印，形成所需人工角膜材料。將材料在25°C、相對濕度50%、恒溫恒濕條件下存放平衡48小時，即得到所述的一種增強增韌再生蠶絲纖維，其斷裂強度為83MPa，斷裂伸長率為20%，斷裂能為3J/g。
[0075]應該指出的是，上述說明并非是對本發明的限制，本發明也并不僅限于上述舉例，本技術領域的普通技術人員在本發明的實質范圍內所做出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種角膜支架材料，其特征在于，包括按質量分的如下原料:30%-70%的明膠水溶液、.29.5%-69.9%的絲素蛋白與氧化石墨烯混合水溶液以及0.1%-0.5%的交聯劑;其中，所述絲素蛋白與氧化石墨烯混合水溶液中，絲素蛋白水與氧化石墨烯的質量比為10000:1-1000:1o2.根據權利要求1所述的角膜支架材料，其特征在于，所述明膠水溶液中明膠的質量占比為 30%-60%。3.—種角膜支架材料的制備方法，用于制備如權利要求1所述的角膜支架材料，其特征在于，包括如下步驟: 1)用碳酸鈉水溶液對蠶繭脫膠后，用溴化鋰水溶液將其溶解，再經過透析、抽濾和離心處理得到絲素蛋白水溶液； 2)將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散處理后，與步驟I)中得到的絲素蛋白水溶液混合得到混合水溶液;所述混合水溶液中絲素蛋白與氧化石墨烯的質量比為10000:1-1000:1 ； 3 )在步驟2 )中得到的混合水溶液中加入明膠水溶液和交聯劑，并在溫度為30 °C-50 °C的條件下攪拌均勻；其中，所述明膠水溶液在共混溶液中的質量占比為30%-70%，所述交聯劑在共混溶液中的質量占比為0.1%-0.5%。4.根據權利要求3所述的角膜支架材料的制備方法，其特征在于，步驟I)中的透析處理包括:將溶解有脫膠蠶繭的溴化鋰水溶液用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析72小時;期間，每2小時換水一次。5.根據權利要求3所述的角膜支架材料的制備方法，其特征在于，步驟I)中，在經過透析、抽濾和離心處理后，需在10°C_78°C的環境下濃縮3-200小時得到所述絲素蛋白水溶液。6.根據權利要求3所述的角膜支架材料的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述明膠水溶液中明膠的質量占比為30%-60%。7.角膜支架的3D打印方法，其特征在于，包括如下步驟: 在生物打印機的噴頭中裝入按照權利要求3-6任一項所述的角膜支架材料的制備方法制備的角膜支架材料； 在50 V的條件下，根據設定程序逐層打印出角膜支架。
【文檔編號】A61L27/08GK105903071SQ201610238728
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月18日
【發明人】王紅, 韓芳芳, 張楠, 顧敬新
【申請人】青島三帝生物科技有限公司