一種香菇多糖修飾的碳納米管及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明公開了一種香菇多糖修飾的碳納米管，它是以共價鍵修飾的方法將香菇多糖接枝在碳納米管上制備得到的。本發明還公開了該香菇多糖修飾的碳納米管的制備方法和在制備免疫增強藥物中的應用。與現有技術相比，本發明解決了香菇多糖成分易氧化、不易制劑等問題，而且便于藥物的吸收，可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長藥效，能顯著提高動物免疫功能，對抵抗疫病有重要意義。同時，本發明作為一種新型中獸藥，沒有副作用。
【專利說明】
一種香菇多糖修飾的碳納米管及其制備方法與應用
技術領域
[0001]本發明屬于藥物制備領域，具體涉及一種香菇多糖修飾的碳納米管及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]香菇多糖的免疫調節活性是其生物活性的重要基礎。香菇多糖是典型的T細胞激活劑，體內外均能促進細胞毒T淋巴細胞(CTL)的產生，提高CTL的殺傷活力，增強正常或免疫功能低下小鼠的遲發型超敏反應(DTH)，提高抗體依賴性細胞毒細胞(ADDC)活性。體內給藥還能誘生r-干擾素(IFN)。香菇多糖還能促進T細胞產生巨噬細胞活化因子，在體內可使腹腔巨噬細胞擴增、活化，并可誘導殺傷性巨噬細胞和抗體依存性巨噬細胞的細胞毒活性，還受靶細胞的敏感性影響。香菇多糖還可使由巨噬細胞誘導的各種類型的生物活性因子，如IL-l、IL-3、IL-6、和CSF(集落刺激因子)水平提高，從而導致免疫活性因子進一步分泌和免疫活性細胞的成熟、分化和增殖，參與機體的應答和免疫調節。Oka等通過體外香菇多糖與宿主細胞共培養，流式細胞儀免疫熒光檢測，研究香菇多糖免疫調節活性的觸發機制，結果發現多數香菇多糖能結合到人單核細胞上，認為香菇多糖結合到人單核細胞上可能是影響免疫系統的首要因素。
[0003]碳納米管為晶形碳同素異形體，由六邊形排列的碳原子構成數層到數十層的同軸圓管，層與層之間保持固定距離(約0.34nm)。多壁碳納米管直徑一般為2?20nm。因其獨特結構，碳納米管在電子、能源、分子傳感器及生物載體領域都有潛在的應用價值。碳納米管為納米材料，其空腔管體還可容納生物特異性分子及藥物，因此可載送生物活性分子及藥物進入細胞或組織。生物大分子(蛋白、核酸等)的細胞穿透性較差，可將其吸附或偶聯到可穿透細胞的載體上，載送它們進入細胞。新型碳納米管材料具備了優良的細胞穿透性能，從而在載體領域倍受關注.碳納米管不溶于有機溶劑和水，從而限制了它在藥物載體領域的應用。而功能化修飾碳納米管則可改善其溶解性，并可提高其生物相容性，使碳納米管在藥物載體領域得以應用。從載送藥物、疫苗等生物活性分子乃至基因進入細胞，碳納米管在載體領域中的應用與研究日益深入。
[0004]本發明首次利用用共價鍵修飾的方法將香菇多糖枝接在碳納米管上，并對其制備工藝進行優化比較，并將其和模式抗原OVA—起應用免疫，建立了香菇多糖碳納米管的制備方法，優化了制備條件，發現香菇多糖碳納米管能顯著提高香菇多糖的免疫增強作用，提高其生物利用度。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種香菇多糖修飾的碳納米管，以解決現有技術存在的香菇多糖不穩定、體內代謝快、生物利用度低和用藥量大等問題。
[0006]本發明還要解決的技術問題是提供上述香菇多糖修飾的碳納米管的制備方法。
[0007]本發明最后要解決的技術問題是提供上述香菇多糖修飾的碳納米管的應用。
[0008]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0009]—種香菇多糖修飾的碳納米管的制備方法，它包括如下步驟:
[0010](I)將氯化亞砜和羧基化碳納米管混合后進行超聲，加入DMF作為催化劑后繼續超聲，超聲結束后，經回流、減壓蒸餾和干燥，得到乙酰化碳納米管；
[0011](2)將乙酰化碳納米管溶于DMF后，加入預處理過的香菇多糖進行超聲，加入吡啶作為催化劑繼續超聲，超聲結束后進行反應，產物經離心、洗滌和冷凍干燥后，得到香菇多糖修飾的碳納米管粉末。
[0012]步驟(I)中，羧基碳納米管和氯化亞砜的固液比為lg:43?50mL，二甲基甲酰胺體積為氯化亞砜體積的4?6%。
[0013]步驟(I)中，加入二甲基甲酰胺前，超聲功率為400?600W，超聲時間為10?15min;加入二甲基甲酰胺后，超聲功率為400?600W，超聲時間為3?5min。
[0014]步驟(I)中，
[0015]回流方法為在70?72°C下回流10?12h，回流時每2h超聲lOmin，超聲功率為400?600W；
[0016]減壓蒸餾方法為75?77°C下回流I?2h;
[0017]干燥方法為50?55 °C下真空干燥。
[0018]步驟(2)中，所述的預處理過的香菇多糖是指將香菇多糖在110?120°C下加熱2?3h。
[0019]步驟(2)中步驟(2)中，乙酰化碳納米管和二甲基甲酰胺的固液比為lg:43?50mL，乙酰化碳納米管和香菇多糖的質量比為3?4:1，吡啶體積為二甲基甲酰胺體積的4?6%。。
[0020]步驟(2)中，加入吡啶前，超聲功率為400?600W，超聲時間為10?15min;加入吡啶后，超聲功率為400?600W，超聲時間為3?5min。
[0021]步驟(2)中，反應溫度為110?115°C，反應時間為20?24h;反應時，每3h超聲lOmin，超聲功率為400?600W。
[0022]步驟(2)中，離心方法為以8000rpm的轉速離心20min，離心結束后棄去液體部分。
[0023]步驟(2)中，洗滌的方法為用DMAC/LICL(體積比95/5)溶液超聲離心(8000rpm，15min)洗滌5次后，再用PBS洗滌2次，溫水(20?30 °C)洗滌5次。
[0024]上述制備方法中任意一項制備得到的香菇多糖修飾的碳納米管也在本發明的保護范圍之內。
[0025]上述香菇多糖修飾的碳納米管在制備免疫增強藥物中的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0026]按此方法制備的香菇多糖碳納米管，平均接枝率為9.1±1.1%。得到香菇多糖碳納米管后，利用紫外光譜掃描儀對香菇多糖碳納米管表面進行了分析，并通過高分辨投射電鏡、紅外光譜掃描儀、熱重分析儀對香菇多糖碳納米管的結構進行研究。
[0027]將香菇多糖碳納米管和OVA—起應用免疫小鼠，能顯著提高小鼠血清OVA特異性IgG抗體效價、不同亞型抗體水平和細胞因子含量，同時發現香菇多糖碳納米管能夠促進抗原轉運到附近淋巴結，同時提高淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例，表明了其具有較好的免疫增強功能，對提高動物機體的免疫功能，防治疾病具有重要應用價值。
[0028]有益效果
[0029]動物疫病主要靠疫苗來預防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱等缺點，需要免疫增強劑輔助才能產生強大的免疫應答。現有的常用免疫增強劑如油佐劑、鋁膠佐劑等常存在刺激性強、有殘留等缺點。由于中藥具有綠色安全的特點，從中藥中開發免疫增強劑已成為熱點。
[0030]香菇多糖是靈芝中所含的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤和增強免疫功能等廣泛的生物學功能和藥理學作用。然而，香菇多糖作為一種免疫增強劑直接用于獸醫臨床，存在著高用藥量、體內代謝較快、作用時間較短、成分復雜，質量控制有一定困難等不足之處，免疫增強作用相對較弱，從而限制了臨床應用。利用碳納米管搭載香菇多糖，不僅可以防止香菇多糖被氧化不穩定，解決用藥量大等問題，而且可以有效維持香菇多糖在機體內的有效濃度，提高其生物利用度。
[0031]本發明采用共價鍵修飾的方法將香菇多糖接枝在碳納米管上，香菇多糖碳納米管接枝率高，不僅可以解決香菇多糖成分易氧化、不易制劑等問題，而且便于藥物的吸收，可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長藥效，能顯著提高動物免疫功能，對抵抗疫病有重要意義。本發明作為一種新型中獸藥，沒有副作用。
[0032]與現有技術相比，本發明優點如下:
[0033]1.香菇多糖碳納米管的制備國內外未見報道，本發明提供了一種香菇多糖碳納米管的制備方法，填補了國內外研究的空白。
[0034]2.香菇多糖碳納米管的免疫增強活性未見報道。通過本發明的實施，證明香菇多糖通過制備成香菇多糖碳納米管后能夠顯著提高其免疫增強活性，表現為提高小鼠血清OVA特異性IgG抗體效價、不同亞型抗體水平和細胞因子含量，同時發現香菇多糖碳納米管能夠促進抗原轉運到附近淋巴結，同時提高淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例，與香菇多糖相比，能夠誘導機體記憶細胞的分化，從而長時間增強動物免疫功能。因此，香菇多糖碳納米管可以作為研制新型免疫增強劑的材料，為研制新型免疫增強劑提供了材料和示范。
【附圖說明】
[0035]圖1為原始碳納米管和香菇多糖碳納米管的透射電鏡圖；其中，a為原始碳納米管，b為香菇多糖碳納米管；
[0036]圖2為原始碳納米管和香菇多糖碳納米管的紫外光譜圖；
[0037]圖3為原始碳納米管和香菇多糖碳納米管的紅外光譜圖；
[0038]圖4為原始碳納米管和香菇多糖碳納米管的熱失重曲線圖；
[0039]圖5為實施例2中各組的抗體水平、抗體亞型及細胞因子的變化示意圖；其中，a為總體免疫球蛋白，b*IgGl和IgG2a，c為IFN-γ和TNF-a，d為IL-4和IL-6;
[0040]圖6為實施例2中淋巴結中樹突狀細胞的變化示意圖；其中a為首免24h后數據，b為首免48h后數據。
【具體實施方式】
[0041]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0042]實施例1香菇多糖碳納米管的制備
[0043]在蒸饋燒瓶內加入30ml氯化亞砜，0.7g羧基化碳納米管后超聲1min JpAlmlDMF超聲3min，70°C回流1h(每2h超聲10min)，73°C減壓蒸餾l_2h，50°C真空干燥(每隔3h換氣)至完全干燥，得到乙酰化碳納米管，用30mlDMF溶解乙酰化碳納米管，將0.2g經過120°C2h預處理過的香菇多糖加入DMF，超聲處理30min，加入Iml吡啶超聲3min，控溫110°C反應24h(每3h超聲lOmin)，冷卻至室溫，離心傾倒，用DMAC/LICL(95/5)溶液超聲離心洗滌反復5次，PBS洗滌2次，溫水洗滌5次，冷凍干燥，低溫干燥處保存。
[0044]由圖1的透射電鏡圖片(a:原始碳納米管(C-MWCNTs)，b:香菇多糖碳納米管(L-MffCNTs))可知，香菇多糖(Ientinan)確實附著在碳納米管表面;從紫外光譜圖(圖2)和紅外光譜圖(圖3)分析可知，香菇多糖在枝接過程中發生一定程度的分解，但仍可在香菇多糖碳納米管上找到香菇多糖的特征峰，同時推測出香菇多糖是以酯鍵連接在碳納米管上。同時碳納米管，香菇多糖和香菇多糖碳納米管的熱失重曲線(圖4)顯示香菇多糖的接種率為9.1%。電鏡及紅外、紫外光譜及熱重分析數據表明香菇多糖以共價鍵的方式枝接在了碳納米管上。
[0045]實施例2香菇多糖碳納米管免疫增強活性比較
[0046]以實施例1中制備的香菇多糖碳納米管(L-MWCNTs)為研究對象，以香菇多糖(Ientinan)和羧基碳納米管(C-MWCNTs)作為對照，測定了它們對模式抗原(OVA)免疫后機體IgG抗體水平、抗體亞型、淋巴結樹突狀細胞的活化、淋巴結中OVA抗原及細胞因子IFN-γ、丁,-€[、11^-12口70、11^-4和11^-17含量的影響。
[0047](I)動物分組及處理
[0048]60只6-8周齡的Blab/c小鼠隨機均分為5組，分別為香菇多糖碳納米管組(L-MffCNTs)、香菇多糖組(Ientinan)、羧基碳納米管組(C-MWCNTs)、陽性對照組(FCA)和PBS對照組(PBS)。皮下免疫小鼠3次，每次免疫間隔I周。分別于首免后7、14、21和28天檢測機體I gG抗體水平、抗體亞型、淋巴結樹突狀細胞的活化、淋巴結中OVA抗原及血清中細胞因子IFN-γ、1,-<1、11^-4和11^-6含量變化。
[0049](2)香菇多糖碳納米管對抗體水平以及對血清中細胞因子的影響
[0050]就總體免疫球蛋白而言，首免后第7天，L-MffCNTs組就與FCA組顯著高于其他組，并且在14天時高于陽性對照組，并且直到21天仍與陽性對照組效果相同，在28天時低于FCA組但顯著高于其他各組(圖5a)。對于IgGl和IgG2a，香L-MWCNTs組IgGl在初期與C-MWCNTs持平，低于陽性對照組但顯著高于其他組，在28天時則與FCA效果相同。L-MWCNTs組IgG2a在初期低于FCA，但在28天時顯著高于包括FCA在的其他組(圖5b)。
[0051 ] 首免后的第7天L-MffCNTs組TNF-α就表現出顯著高于其他對照組，并且IFN- γ僅低于FCV組，在28天，L-MffCNTs組IFN- γ顯著高于FCA組，但L-MWCNTs組TNF-α與其他組無顯著性差異(圖5(3)兒-1^^^8組11^-4的分泌在整個過程都低于?04組但顯著高于其他組，11^-6則在第7天與FCA相同顯著高于其他組，但在28天時高于所有組(圖5d)。
[0052]注:*p〈0.05，林p〈0.0l，*林p〈0.0OI相比于對照組，圖6同。
[0053](3)香菇多糖碳納米管對小鼠淋巴結中成熟樹突狀細胞比例的影響
[0054]作為最主要初級免疫反應場所的淋巴結在疫苗免疫過程中發揮著及其重要的作用。抗原在注射進動物機體后，其迀移至淋巴結的效率與誘導機體產生有效的免疫反應息息相關。有效的疫苗遞載系統類佐劑能夠明顯的提高抗原遞呈細胞攝取抗原、運載抗原至淋巴結及遞呈抗原到T淋巴細胞。首免后的24h、48h，L-MWCNTs組顯著地促進了小鼠淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例，淋巴結中成熟樹突狀細胞的比例顯著高于C-MWCNTs組和Ientinan組(圖6)，表明了L-MffCNTs組能有有效的促進成熟樹突狀細胞的歸巢從而更加有效的將抗原遞呈給淋巴細胞，進一步引起強烈的免疫反應。
[0055]根據上述動物試驗結果可以得出香菇多糖碳納米管可以提高小鼠機體IgG抗體水平、不同亞型抗體含量、淋巴結樹突狀細胞的活化、淋巴結中OVA抗原及細胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-4和IL-6含量，從而提高機體免疫功能，說明本發明涉及的香菇多糖碳納米管可用于提高動物機體免疫功能以達到抵抗疾病的目的。
【主權項】
1.一種香菇多糖修飾的碳納米管的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟: (1)將氯化亞砜和羧基化碳納米管混合后進行超聲，加入二甲基甲酰胺后繼續超聲，超聲結束后，經回流、減壓蒸餾和干燥，得到乙酰化碳納米管； (2)將乙酰化碳納米管溶于二甲基甲酰胺后，加入預處理過的香菇多糖進行超聲，加入吡啶繼續超聲，超聲結束后進行反應，產物經離心、洗滌和冷凍干燥后，得到香菇多糖修飾的碳納米管。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，羧基碳納米管和氯化亞砜的固液比為Ig: 43?50mL，二甲基甲酰胺體積為氯化亞砜體積的4?6 %。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，加入二甲基甲酰胺前，超聲功率為400?600W，超聲時間為10?15min;加入二甲基甲酰胺后，超聲功率為400?600W，超聲時間為3?5min。4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，回流方法為在70?72°C下回流10?12h，減壓蒸餾方法為75?77°C下回流I?2h，干燥方法為50?55°C下真空干燥。5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的預處理過的香菇多糖是指將香菇多糖在110?120°C下加熱2?3h。6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，乙酰化碳納米管和二甲基甲酰胺的固液比為Ig: 43?50mL，乙酰化碳納米管和香菇多糖的質量比為3?4:1，吡啶體積為二甲基甲酰胺體積的4?6 %。7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，加入吡啶前，超聲功率為400?600W，超聲時間為10?15min;加入吡啶后，超聲功率為400?600W，超聲時間為3?5min08.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，反應溫度為110?115°C，反應時間為20?24h。9.權利要求1?8中任意一項制備得到的香菇多糖修飾的碳納米管。10.權利要求9所述的香菇多糖修飾的碳納米管在制備免疫增強藥物中的應用。
【文檔編號】A61K47/48GK105903034SQ201610475258
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】王德云, 邢杰, 劉振廣, 伯若楠, 胡元亮, 劉家國, 武毅
【申請人】南京農業大學