一種基于納秒脈沖電場的可高效促進納米顆粒進入細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種促進納米顆粒進入細胞的方法，即使用納秒脈沖電場對細胞進行前處理，促進納米顆粒進入細胞內的量明顯增加，結合交變磁場作用，可對細胞進行均勻有效的加熱，單純納秒脈沖電場對細胞的活性影響較小，驗證了納秒脈沖電場作為一種安全的前處理物理手段，可有效促進納米顆粒進入細胞內的可行性，這對于細胞的成像及治療具有潛在的臨床應用價值。
【專利說明】
一種基于納秒脈沖電場的可高效促進納米顆粒進入細胞的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物學領域，涉及一種納秒脈沖電場使用來高效促進納米顆粒進入細胞內的方法。
【背景技術】
[0002]納米尺度材料是至少在一個維度上介于1-1OOnm的材料，與大塊材料相比，納米材料具有獨特的光學、電學、力學以及化學性質，可有效用于成像等領域。
[0003]納米材料由于粒徑小而具有較高的比表面積，被廣泛用于染料，藥物或基因載體的研究，用于疾病的診斷及治療，對于藥物運輸，例如磁納米顆粒負載抗腫瘤藥物，進入細胞后可實現對腫瘤的治療，同時磁納米顆粒作為磁共振造影劑可用于磁共振成像，從而監測治療效果;對于金銀納米顆粒及其合金納米顆粒，在光熱治療領域具有廣泛的應用價值，同時研究表明金納米顆粒具有很高的X射線衰減強度，表現出優于臨床上基于碘的造影劑用于CT成像。對于基因治療，基因的導入是基因治療的關鍵，由于裸DNA在細胞內外機體內外不穩定，容易被核酸酶降解，因此，基因的導入需要基因的運載工具，而病毒載體具有細胞毒性，對裝載的外源基因大小具有限制，因此納米顆粒作為非病毒載體用于基因轉染具有非常大的優勢。
[0004]細胞對納米材料的內吞是有局限性的，為實現足夠多的納米材料進入細胞內，目前的方法主要是通過化學手段對納米顆粒表面修飾不同的配基，從而促進細胞對納米顆粒的內吞行為。但細胞對表面修飾納米顆粒的內吞具有細胞依賴性和表面修飾物依賴性，例如，Jordan通過透射電子顯微鏡觀察惡性膠質瘤細胞Rus1-RSl細胞和正常皮質神經元細胞HCN-2細胞內吞不同包被物修飾的磁流體過程，研究證實了細胞內吞磁流體的過程與細胞的種類和磁流體包被物的種類密切相關，HCN-2細胞對氨基硅烷磁顆粒的內吞量遠遠大于對葡聚糖包被磁顆粒的內吞量;而Rus1-RSl細胞對氨基硅烷磁顆粒的內吞量遠遠高于HCN-2細胞對氨基硅烷磁顆粒的內吞量(比例大約為1:1)。Zhang Yong等用熒光顯微鏡觀察了不同的細胞對聚乙二醇及葉酸修飾的磁性納米顆粒的內吞情況，結果表明與無包被劑納米粒子相比，人乳腺癌細胞更容易內吞經聚乙二醇和葉酸修飾后的納米粒子，而對于鼠巨噬細胞則不同，鼠巨噬細胞內吞聚乙二醇修飾后納米粒子遠遠少于無包被劑納米粒子，而對葉酸修飾的納米顆粒的內吞量與無包被劑修飾納米粒子無明顯差異。因此對不同細胞并無統一的使用標準，這將嚴重限制未來的臨床應用。
[0005]納秒脈沖電場技術是近20年來發展起來的生物電新技術。納秒級短脈沖是脈寬寬度僅有幾個到幾百個納秒的電脈沖，具有高功率和低熱量的特點。納秒短脈沖具有獨特的生物學效應，可在細胞膜的脂質雙分子層發生電穿孔作用，從而增強細胞膜的通透性。
[0006]本發明首次引入納秒脈沖電場作為一種有別于傳統化學方法對細胞進行預處理的手段，能夠促進細胞對納米顆粒的快速內吞，增大細胞對納米顆粒的內吞量。
【發明內容】
[0007]技術問題:最常見的使納米顆粒進入細胞內的方法，需要對納米顆粒進行特殊的設計合成，在納米顆粒表面包被不同的配基實現的，但對不同的細胞及納米顆粒無統一的使用標準，本專利首次引入了一種納秒脈沖電場作為細胞的前處理手段，從而促進細胞對納米顆粒的內吞過程。
[0008]為實現上述目的，本發明提出如下技術方案:
[0009]1.一種促進納米顆粒進入細胞內的方法，其特征在于:將納米顆粒與待處理細胞充分相互接觸，在脈沖電場的作用下促進納米顆粒進入細胞內。
[0010]2.如上所述的納米顆粒可為脂質體，無包被劑納米顆粒或多聚物包被納米顆粒等粒徑小于50nm的納米顆粒。
[0011 ] 3.如上所述的納米顆粒可為磁性納米顆粒。
[0012]4.如上所述的脈沖電場，脈沖寬度為10_500ns。
[0013]5.如上所述的待處理細胞可為在體的組織細胞或離體的細胞。
[0014]6.如上所述的待處理細胞，可為腫瘤細胞或正常細胞。
[0015]7.如上所述的待處理細胞與納米顆粒接觸方式，對于在體組織可為靜脈注射或腹腔注射，對于離體細胞可為直接混合均勻。
[0016]8.如上所述的多聚物包被納米顆粒，多聚物分子為PEG，PVA，葉酸，淀粉等含有親水性功能基團的化合物或者其中任意兩種的混合物，多聚物的終濃度為I %-10%。
[0017]9.一種高效內源性細胞加熱方法，其特征在于:將磁性納米顆粒與待處理細胞充分相互接觸，在脈沖電場的作用下促進納米顆粒進入待處理細胞內，在交變磁場作用下對待處理細胞進行加熱。
[0018]10.如上所述的交變磁場，其發生頻率可為1-500kHz，工作電流可為1-50A。
[0019]本發明的有益效果有:將納秒脈沖電場技術對細胞進行前處理，利用納秒脈沖電場在細胞膜上形成的孔道，使得納米顆粒進入細胞，無需對納米顆粒進行特殊的設計。
[0020]納米顆粒進入細胞后，在交變磁場作用下可對細胞進行均勻有效地加熱。
[0021 ]這種基于納秒脈沖電場技術使得納米顆粒進入細胞的方法對于納米顆粒與細胞均沒有特殊限制要求，納米顆粒可為磁性納米顆粒或非磁性的金銀等納米顆粒，納米顆粒可為無包被劑納米顆粒或者多聚物包被的納米顆粒，待處理細胞可為在體或離體細胞，且此技術對正常細胞或腫瘤細胞均具有效果。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發明納米顆粒進入細胞及其加熱方法的實施步驟圖；
[0023]圖2為本發明使用的磁性納米顆粒的TEM圖；
[0024]圖3為本發明使用的納秒脈沖電場(nsPEF)與交變磁場對HeLa細胞活性的影響；
[0025]圖4為本發明使用的納秒脈沖電場(nsPEF)對HeLa細胞加熱效果的影響；
[0026]圖5為本發明使用的納秒脈沖電場(nsPEF)對HeLa細胞內吞納米顆粒的影響:(A)對照組；(B)單純nsPEF(100ns，20kV/cm，10Pulses)處理HeLa細胞；(C)磁性納米顆粒與HeLa細胞孵育8h; (D)HeLa細胞與磁性納米顆粒混合，使用nsPEF( 100ns，20kV/cm，1Pulses)處理后孵育 8h(bar = 10ym);
[0027]圖6為掃描電子顯微鏡圖觀察納秒脈沖電場nsPEF(100ns，20kV/cm，10Pulses)對HeLa細胞膜的影響。
【具體實施方式】
[0028]以下通過具體實施例對本發明做進一步說明，以便更好地理解本發明，但本發明并不局限于此。
[0029]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法;下述實施例中所用的試劑、材料等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0030]實施例1:
[0031]取處于對數生長期，且貼壁率達80%的人宮頸癌HeLa細胞消化離心重懸為單細胞懸液，通過細胞計數，將細胞濃度調為6 X 15個/mL，進行如下處理:
[0032]I)空白對照組:不做任何處理；
[0033]2)單獨脈沖組:施加 nsPEF:參數選為 100ns，20kV/cm，1Pulses ；
[0034]3)單獨磁顆粒處理組:與平均粒徑為1nm左右的磁性納米顆粒(終濃度為4mg/mL)于6孔板中共孵育8h;
[0035]4)聯合處理組:與平均粒徑為1nm左右的磁性納米顆粒(終濃度為4mg/mL)混合，進行上述納秒短脈沖處理后，將細胞接種到6孔板孵育8h。
[0036]將接種于6孔板上的細胞培養液棄掉，用PBS緩沖液輕輕沖洗，將游離的磁性納米顆粒去掉，每組細胞用濃度為4%的多聚甲醛固定15min，自來水沖洗2次，每次2min，蒸餾水沖洗2次，每次2min，每孔細胞滴加ImL Perls stain染液，染色20min，蒸饋水沖洗5min，核固紅染色液淡染細胞核5min，自來水沖洗1s后，置于倒置光學顯微鏡下觀察拍照。
[0037]實施例2:
[0038]取處于對數生長期，且貼壁率達80%的人正常細胞HaCaT細胞消化離心重懸為單細胞懸液，通過細胞計數，將細胞濃度調為6 X 15個/mL，進行如下處理:
[0039]I)空白對照組:不做任何處理；
[0040]2)單獨脈沖組:施加 nsPEF:參數選為 100ns，20kV/cm，1Pulses ；
[0041 ] 3)單獨磁顆粒處理組:與平均粒徑為1nm左右的磁性納米顆粒(終濃度為4mg/mL)于6孔板中共孵育8h;
[0042]4)聯合處理組:與平均粒徑為1nm左右的磁性納米顆粒(終濃度為4mg/mL)混合，進行上述納秒短脈沖處理后，將細胞接種到6孔板孵育8h。
[0043]將接種于6孔板上的細胞培養液棄掉，用PBS緩沖液輕輕沖洗，將游離的磁性納米顆粒去掉，每組細胞用濃度為4%的多聚甲醛固定15min，自來水沖洗2次，每次2min，蒸餾水沖洗2次，每次2min，每孔細胞滴加ImL Perls stain染液，染色20min，蒸饋水沖洗5min，核固紅染色液淡染細胞核5min，自來水沖洗1s后，置于倒置光學顯微鏡下觀察拍照。
[0044]實施例3:
[0045]收集處于對數生長期，貼壁率達80%的人宮頸癌細胞HeLa細胞消化離心重懸為單細胞懸液，細胞計數將細胞濃度調為6 X 15個/mL，分別進行如下分組處理，處理完畢后，按照每孔3000個細胞數目接種于96孔板，每組3個復孔。將96孔板放置于37°C、5%C02、飽和濕度的培養箱中，培養24h后，按每孔1yL CCK-8溶液的量加入96孔板進行細胞活性檢測。
[0046]實驗分組:
[0047]I)空白對照組:不做任何處理；
[0048]2)單純交變磁場處理組:磁場頻率為287kHz，電流為35A，處理時間為50min;
[0049]3)單獨脈沖組:施加不同參數的 nsPEF 處理:100ns，10/20/30kV/cm，10/30Pulses ；
[0050]4)單獨加熱組:與平均粒徑為1nm左右的磁性納米顆粒(終濃度為4mg/mL)孵育，立即置于交變磁場中，磁場頻率為287kHz，電流為35A，處理時間分別為50min;
[0051 ] 5)加熱結合脈沖處理組:與平均粒徑為1nm左右的磁性納米顆粒(終濃度為4mg/mL)孵育，進行上述納秒短脈沖處理后，立即置于交變磁場中，磁場頻率為287kHz，電流為35A，處理時間分別為50min。
【主權項】
1.一種促進納米顆粒進入細胞內的方法，其特征在于:將納米顆粒與待處理細胞充分相互接觸，在脈沖電場的作用下促進納米顆粒進入細胞內。2.如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于:所述的納米顆粒可為脂質體，無包被劑納米顆粒或多聚物包被納米顆粒等粒徑小于50nm的納米顆粒。3.如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于:所述的納米顆粒為磁性納米顆粒。4.如權利要求1所述的脈沖電場，其特征在于:脈沖寬度為10-500ns。5.如權利要求1所述的待處理細胞，其特征在于:可為在體的組織細胞或離體的細胞。6.如權利要求1所述的待處理細胞，其特征在于:可為腫瘤細胞或正常細胞。7.如權利要求1所述的待處理細胞與納米顆粒接觸方式，其特征在于:對于在體組織可為靜脈注射或腹腔注射，對于離體細胞可為直接混合均勻。8.如權利要求3所述的多聚物包被納米顆粒，其特征在于:多聚物分子為PEG，PVA，葉酸，淀粉等含有親水性功能基團的化合物或者其中任意兩種的混合物，多聚物的終濃度為9.一種高效內源性細胞加熱方法，其特征在于:將磁性納米顆粒與待處理細胞充分相互接觸，在脈沖電場的作用下促進納米顆粒進入待處理細胞內，在交變磁場作用下對待處理細胞進行加熱。10.如權利要求9所述的交變磁場，其特征在于:交變磁場發生頻率可為l_500kHz，工作電流可為1-50A。
【文檔編號】C12N5/071GK105903014SQ201610293499
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】左莎莎, 張銳, 王瑞雪, 張玨, 方競
【申請人】北京大學