葡萄渣提取物在制備減輕急性肺損傷藥物中的應用
【專利摘要】本發明涉及葡萄渣提取物在制備減輕急性肺損傷藥物中的應用。本發明采用水提法以釀酒后的葡萄渣為原料制備葡萄渣提取物(GPEs)，通過測定GPEs的有效成份，評價其體外和體內的抑制肺損傷的活性，為葡萄渣的回收利用、新型功能性食品的開發提供有價值的參考。
【專利說明】
葡萄渣提取物在制備減輕急性肺損傷藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發明涉及制藥領域，具體地說，涉及一種葡萄渣提取物在制備減輕急性肺損傷 藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 我國是葡萄生產大國，年種植葡萄數百萬畝，其中40%以上用于釀酒，由釀造葡萄 酒而產生的葡萄渣資源極其豐富，釀酒后的葡萄渣中含有大量的單體多酚和聚合多酚類物 質，包括原花青素、黃酮類化合物等，目前葡萄渣的利用率普遍較低，絕大多數都被作為廢 渣排放，不僅造成環境污染，也是對原料的極大浪費，葡萄渣綜合利用已成為葡萄酒加工產 業增值的新方向。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供從釀酒后的葡萄渣中獲得的葡萄渣提取物（grape pomace extractions，GPEs)及其制備方法。
[0004] 本發明的另一目的是提供所述葡萄渣提取物在制備用于減輕急性肺損傷的藥物 及功能性食品開發中的應用。
[0005] 為了實現本發明目的，本發明提供的葡萄渣提取物，所述葡萄渣提取物是采用水 提法以釀酒后的葡萄渣為原料制備得到的；所述提取物的有效成分為如下分子式的化合 物：Cl3Hl6〇lQ、Cl3Hl2〇9、C45H38〇18、Cl3Hl2〇8、C3〇H26〇12、Cl5Hl4〇6、C45H38〇18、C45H38〇18、C3〇H26〇12、 C3〇H26〇12、C45H38O18、Cl5Hl4〇6、C2lH22〇ll、C45H38O18、C2lHl8〇13和C2lH2Q〇12，上述有效成分占提取物 總重量的2-7 %。
[0006] 本發明中使用的葡萄渣原料來自釀制紅酒的葡萄品種，包括Cabernet Franc(品 麗珠 ）、Cabernet Sauvignon(赤霞珠）、Carignan(佳麗釀）、Pinot Noir(黑皮諾又叫黑品 樂）、Merlot(梅洛又叫美樂、美露輒）、Cabernet Gernischt(蛇龍珠)等。
[0007] 本發明還提供所述葡萄渣提取物的制備方法，收集釀酒后的葡萄渣，風干后研磨 成粉，向lg粉末中加 l〇_15ml水，搖床300-800轉/分鐘過夜提取，2000-5000轉/分鐘離心10-30分鐘，去上清冷凍干燥。
[0008] 優選地，所述葡萄渣提取物的制備方法如下：收集釀酒后的葡萄渣，風干后研磨成 粉，向lg粉末中加 l〇ml水，搖床500轉/分鐘過夜提取，4000轉/分鐘離心20分鐘，去上清冷凍 干燥。
[0009] 本發明更優選以葡萄品種'品麗珠 (Cabernet Franc)'為原料，收集釀酒后的葡萄 渣，自然風干至含水量約9.8%，研磨成粉，向lg粉末中加10ml水，搖床500轉/分鐘過夜提 取，4000轉/分鐘離心20分鐘，去上清冷凍干燥。
[0010] 本發明使用的葡萄渣原料是經過葡萄酒釀造工藝獲得的，葡萄酒釀造工藝參見國 際葡萄與葡萄酒局頒布的0IV國際標準工藝。
[0011] 本發明還提供所述葡萄渣提取物在制備用于減輕因感染、休克、吸煙、創傷、毒物 中毒、吸入刺激性氣體、輻射、高氧或低氧等引起的肺損傷，特別是急性肺損傷的藥物或功 能性食品中的應用。
[0012] 所述感染包括流感病毒感染，優選H1N1、H5N1、H3N2亞型流感病毒感染，更優選 H1N1及其適應株，例如WSN。
[0013] 所述刺激性氣體選自光氣、雙光氣、三光氣、氯氣、氮氧化物、甲醛、硫酸二甲酯、氯 化氫、溴化氫、氟化氫、氨、臭氧、二氧化硫等。
[0014] 本發明還提供一種用于治療肺損傷的藥物，其有效成分為所述的葡萄渣提取物。
[0015] 所述藥物還包括藥學上可接受的輔料或輔助性成分。
[0016] 所述葡萄渣提取物還可與其它活性劑組合，所述活性劑包括但不限于利尿劑、β-阻斷劑、ACE抑制劑、血管緊張素拮抗劑、媽通道阻斷劑、α-阻斷劑、α-β-阻斷劑、神經系統抑 制劑、血管擴張劑、抗氧化劑等。
[0017] 所述藥物為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、泡騰片或注射劑等 劑型。
[0018]所述藥物的單次劑量單元為葡萄渣提取物10-60mg/Kg體重，優選40g/Kg體重。
[0019] 優選地，所述藥物是將葡萄渣提取物溶解于水或生理鹽水中制成的溶液劑;或者， 將葡萄渣提取物溶解于食用油(例如玉米油）中制成的乳劑。
[0020] 本發明還提供一種功能性食品，其有效成分為所述的葡萄渣提取物。
[0021] 本發明進一步提供所述葡萄渣提取物在治療急性肺損傷中的應用。
[0022] 本發明通過測定葡萄渣提取物(GPEs)的有效成份，評價其體外和體內的抑制肺損 傷的活性，為葡萄渣的回收利用、新型功能性食品的開發提供有價值的參考。
[0023] 本發明首次揭示了葡萄渣提取物對流感病毒感染后小鼠肺組織的保護作用，該機 制的發現具有較強的臨床意義，可以為流感的預防措施和治療方法優化提供堅實的基礎。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明實施例2中實驗組及對照組小鼠感染甲型流感病毒WSN株后體重(A)、 體溫(B)、存活率(C)的變化情況。
[0025] 圖2為本發明實施例2中實驗組及對照組小鼠肺泡灌注液中總細胞數量(A)以及中 性粒細胞數量(B)、巨噬細胞數量(C)變化圖。
[0026] 圖3為本發明實施例2中感染病毒WSN 9天后肺泡巨噬細胞中Ml(iNos和IL-6基因， 對應A和B)和M2 (Chi 13和MGL2基因，對應C和D)相關基因的表達情況。
【具體實施方式】
[0027] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0028]實施例1葡萄渣提取物的制備
[0029]以葡萄品種'品麗珠 (Cabernet Franc)'為原料，收集釀酒后的葡萄渣，自然風干 至含水量約9.8 %，研磨成粉，向lg粉末中加10ml水，搖床500轉/分鐘過夜提取，4000轉/分 鐘離心20分鐘，去上清冷凍干燥，即得葡萄渣提取物(GPEs)。測定GPEs中所含的有效成份， 方法如下：
[0030] 1、標準和化學品
[0031] ( + )_兒茶素、表兒茶素（_)，原花青素和原花青素 B2、B1，購自Chr〇maDex，Inc· (Irvine，加州，美國）。甲酸和高效液相色譜級甲醇和乙腈購自VWR國際有限公司。使用 Milli-Q系統(Millipore實驗室，馬里蘭，美國）制備HPLC級水。
[0032] 2、樣品制備
[0033]葡萄渣提取物凍干粉250毫克溶解在5毫升水中，超聲抽提15分鐘。上清液經孔徑 為0.45μπι的PVDF注射過濾器(VWR國際有限公司，華盛頓，美國）過濾處理。5μ1樣品溶液進行 uhplc-pda-esi/HRMS MSN反相高效液相色譜法定量分析。原花青素含量的測定重復三次。 [0034] UHPLC-PDA-ESI/HRMSn分析系統中使用LTQ Orbitrap XL質譜儀的Accela 1250二 元栗，一個PAL HTC Accela ΤΜ0自動進樣器，光電二極管陣列（PDA)探測器（Thermo Scientific，加州，美國）及一個G1316A柱室(安捷倫，加州，美國）。在超高效液相色譜柱上 進行（10〇111111\內徑2.1111111，'?^^6^八0〇1]幾￥8^1(：18，1.74111)分離（高效液相色譜/1^^(：柱 器，Ultrashield分析科學儀器，加州，美國），流速0.25毫升/分鐘(液相結合物，A為0.1%甲 酸水，v/v，B為0.1 %甲酸乙腈，v/v)。梯度洗脫，保持3分鐘，A從2%到20 % (v/v)取10分鐘， 4015分鐘，5030分鐘，9040分鐘，9045分鐘。
[0035] MS是在負離子模式下操作:70鞘氣(任意單位），AUX掃氣15(任意單位），電源電壓 4.5V，毛細管溫度200°C，毛細管電壓14V、50V，管鏡掃描范圍從100到2000m/z具有15000位 的分辨率，FTMSAGC目標2e5，高分辨質譜AGC目標1E5，500毫秒最大離子注入時間。
[0036] 3、原花青素含量的測定
[0037] 使用Agilent Zorbax SB-C18柱高效液相色譜Agilent 1100系列系統量化的原花 青素含量（150mmX 2 · lmm，3 · 5μπι)。流動相含有水和乙腈(B)。以0 · 3ml/min的流量，于30°C進 行梯度洗脫程序：線性梯度從4%B 50min到20%B 60min再到35%B 60min，100%B 61分 鐘，并在100 65分鐘，最終系統平衡的初始條件（4%B) 10分鐘由安捷倫DAD檢測器在 278nm檢測原花青素，然后通過LCQ Deca XP和質譜儀(Thermo Fisher Scientific公司，馬 里蘭，美國），配有電噴霧電離源。MS參數如下：電源電壓4.5kV;毛細管電壓40V;管鏡頭偏移 5V;毛細管溫度250°C;鞘氣流量，80(任意單位）；輔助氣流量，15(任意單位）。該儀器操作的 負離子模式，掃描從m/100~m/2000。
[0038]采用外標法測量原花青素的含量。進行了六個濃度的兒茶素分析，并根據兒茶素 的峰面積與濃度繪制曲線。表兒茶素、原花青素二聚、原花青素三聚體的量由兒茶素濃度乘 以相應的摩爾相對響應因子計算出(MMI)。原花青素含量單位:微摩爾/克凍干粉。
[0039]經過上述分析，從葡萄渣提取物（GPEs)中確定了十六種化合物（表1)。化合物 Cl3Hl6〇lQ、Cl3Hl2〇9、C45H38〇18、Cl3Hl2〇8、C3()H26〇12、Cl5Hl4〇6、C45H38〇18、C45H38〇18、C3()H26〇12、 C30H26Ol2、C45H38Ol8、Cl5Hl4O6、C2lH22Oll、C45H 38Ol8、C2lHl8Ol3和C2lH20Ol2占 GPEs總重量的2-7%。其 中原花青素單體(兒茶素和表兒茶素)的含量最高(表2)。
[0040]表1GPES中各成份的特性、保留時間、分子式、計算值與實測值之間的誤差、化合物 MSN診斷片段
[0045]
[0046] 注:含量為每克凍干粉中所含μπιο?數，平均值土SD(n = 3) ;MW代表分子量;MRRF代 表摩爾相對響應因子。
[0047] 實施例2減輕流感病毒感染引起機體損傷的藥物、其制備及應用
[0048] 本實施例中提供的用于減輕流感病毒感染引起機體損傷的藥物為乳劑，是將實施 例1制備的葡萄渣提取物加入無菌生理鹽水中，攪拌1 〇分鐘左右，待完全溶解，即得。
[0049] 將2-3月齡、體重約25g的雄性C57BL/6鼠隨機分成對照組、實驗組1-3，每組10只。 每天灌胃給藥，共60天。
[0050] 1、小鼠感染流感病毒：乙醚輕度麻醉后，對照組及三個實驗組小鼠滴鼻接種流感 病毒H1N1小鼠適應株WSN病毒液50μ1 (3000pfu)。對照組小鼠接種病毒后，小鼠灌胃生理鹽 水O.lmL，三個實驗組小鼠接種病毒后，實驗組1小鼠灌胃含葡萄渣提取物的生理鹽水O.lmL (按葡萄渣提取物20g/kg體重給藥），實驗組2小鼠灌胃含葡萄渣提取物的生理鹽水O.lmL (按葡萄渣提取物40g/kg體重給藥），實驗組3小鼠灌胃含葡萄渣提取物的生理鹽水O.lmL (按葡萄渣提取物60g/kg體重給藥）。然后每天記錄小鼠體溫體重情況，以檢測小鼠染病率 及致死率。
[0051] 各實驗組小鼠感染流感病毒WSN后體重、體溫、存活率的變化情況如圖1所示。從圖 1可以看出，按葡萄渣提取物20g/kg體重、40g/kg體重和60/kg體重給藥能夠抑制病毒的感 染，減輕流感引起的體溫（圖1A)、體重的下降（圖1B)，從而能夠提高小鼠的存活率（圖1C)， 且按葡萄渣提取物40g/kg體重給藥的實驗組2效果比實驗組1和實驗組3效果更好。
[0052]圖2為各實驗組小鼠肺泡灌注液中總細胞數(包括中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細 胞)變化圖。
[0053] 2、分離感染WSN病毒9天后的小鼠肺泡巨噬細胞，檢測促炎相關的Ml巨噬細胞的生 物標記物（iNos和IL-6基因）和抑制炎癥相關的M2巨噬細胞的生物標記物(Chil3和MGL2基 因）。結果如圖3所示，細胞水平實驗表明，葡萄渣處理可抑制肺泡巨噬細胞中Ml巨噬細胞的 生物標記物表達，而促進M2巨噬細胞的生物標記物表達。
[0054]組織和細胞水平的實驗結果均表明，本發明制備的含葡萄渣提取物的乳劑能夠通 過抑制肺部的炎癥反應，從而有效地降低小鼠病毒的感染，能夠抑制小鼠感染后的發病率， 提高小鼠的存活率。
[0055] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
[0056] 參考文獻
[0057] 1 . L i n , L . Z . &Harn 1 y , J . Μ . ( 2 0 1 2 ) . Quan t i ta t i on of flavanols, proanthocyanidins,isoflavones,flavananes,dihydroxychaleones ,stilbens and benzoic acid derivatives using UV absorbance after identification by LC_ MS.Journal of Agricultural and Food Chemistry,60,5832-5840.
【主權項】
1. 葡萄渣提取物，其特征在于，所述葡萄渣提取物是采用水提法以釀酒后的葡萄渣為 原料制備得到的； 所述提取物的有效成分為如下分子式的化合物:Cl3Hl6〇lQ、C13H12O9、C45H38O18、Cl3Hl2〇8、 C30H26〇12、Cl5Hl4〇6、C45H38〇18、C45H38〇18、C30H26〇12、C3()H26〇12、C45H38〇18、Cl5Hl4〇6、C2lH22〇ll、 C45H38〇18、C21H18OdPC 21H2QO12，上述有效成分占提取物總重量的2-7 %。2. 根據權利要求1所述的葡萄渣提取物，其特征在于，所述葡萄渣提取物的制備方法如 下:收集釀酒后的葡萄渣，風干后研磨成粉，向Ig粉末中加 l〇_15ml水，搖床300-800轉/分鐘 過夜提取，4000轉/分鐘離心20分鐘，去上清冷凍干燥。3. 根據權利要求2所述的葡萄渣提取物，其特征在于，所述葡萄渣提取物的制備方法如 下:收集釀酒后的葡萄渣，風干后研磨成粉，向Ig粉末中加 IOml水，搖床500轉/分鐘過夜提 取，4000轉/分鐘離心20分鐘，去上清冷凍干燥。4. 根據權利要求1-3任一項所述的葡萄渣提取物，所述葡萄渣原料來自釀制紅酒的葡 萄品種，包括Cabernet Franc、Cabernet Sauvignon、Carignan、Pinot Noir、Merlot、 Cabernet Gernischt，其中優選Cabernet Franc。5. 權利要求1-4任一項所述葡萄渣提取物在制備用于減輕因感染、休克、吸煙、創傷、毒 物中毒、吸入刺激性氣體、輻射、高氧或低氧引起的肺損傷的藥物或功能性食品中的應用。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述感染包括流感病毒感染，優選HlNl、 H5N1、H3N2亞型流感病毒感染，更優選HlNl;所述刺激性氣體選自光氣、雙光氣、三光氣、氯 氣、氮氧化物、甲醛、硫酸二甲酯、氯化氫、溴化氫、氟化氫、氨、臭氧、二氧化硫。7. -種用于治療肺損傷的藥物，其特征在于，其有效成分為權利要求1-4任一項所述葡 萄渣提取物。8. 根據權利要求7所述的藥物，其特征在于，所述藥物還包括藥學上可接受的輔料或輔 助性成分;所述藥物為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、乳劑、泡騰片或注 射劑;所述藥物的單次劑量單元為葡萄渣提取物10-60g/Kg體重，優選40g/Kg體重。9. 根據權利要求8所述的藥物，其特征在于，其是將葡萄渣提取物溶解于水或生理鹽水 中制成的溶液劑。10. -種功能性食品，其特征在于，其有效成分為權利要求1-4任一項所述葡萄渣提取 物。
【文檔編號】A61K31/353GK105902698SQ201610224976
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月12日
【發明人】李向東, 王娜
【申請人】中國農業大學