一種pH與葡萄糖雙重響應性藥物載體及其制備和應用

一種pH與葡萄糖雙重響應性藥物載體及其制備和應用
【專利摘要】本發明屬于納米材料制備和生物醫學領域，具體涉及一種pH與葡萄糖雙重響應性藥物載體及其制備和應用。所述的藥物釋放載體是Uio66?CBA?α?CD?CeO2?RGD復合納米顆粒；其制備過程為：先由苯硼酸改性金屬有機框架材料Uio66?NH2制得Uio66?CBA，再以環糊精修飾CeO2納米顆粒制得α?CD?CeO2，然后將Uio66?CBA和α?CD?CeO2通過硼酸酯鍵進行組裝，并且在組裝的材料表面修飾RGD靶分子，而獲得復合納米顆粒。所制得的復合納米顆粒在酸性條件為pH≤6，葡萄糖濃度1~10mM的雙重刺激下，能釋放所負載的抗癌藥物，具有集靶向、pH及葡萄糖雙重響應刺激功能等優點。
【專利說明】
一種pH與葡萄糖雙重響應性藥物載體及其制備和應用
技術領域
[0001]本發明屬于納米材料制備和生物醫學領域，具體涉及一種pH與葡萄糖雙重響應性藥物載體的制備與應用。
【背景技術】
[0002]納米載體技術是納米生物技術的重要發展方向之一。納米藥物載體是指粒徑大小在10?1000 nm的一類新型載體，它是以納米顆粒作為藥物載體，將藥物治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，在細胞攝取作用下進入細胞內，實現安全有效的靶向藥物輸送和基因治療。目前常用的藥物載體主要是有聚合物納米顆粒，脂質體，氧化鐵，金納米顆粒等。其中金屬有機骨架(Metal organicframeworks, MOFs)是一種由金屬離子與含氧或氮的有機配體橋鏈形成的網狀骨架材料，其中金屬或金屬簇為頂點，剛性或半剛性的有機配體為橋鏈。例如U166-NH2是以鋯為金屬中心，2-氨基對苯二甲酸為有機配體組裝而成的三維剛性微孔MOFs，由于其密集的無機結構單元與較強的Zr-O鍵，U166顯示出較強的化學和熱穩定性，以及較好的載藥能力和生物相親性。另一方面，CeO2是一種常見的催化材料，具有很高的實用及研究價值。在納米尺度下，由于表面氧缺陷的產生，氧化鈰中部分Ce4+被還原為Ce3+以穩定缺陷。此時材料中的Ce3+和Ce4+能夠可逆的轉化，這一性質使得納米CeO2能夠催化分解生物體內的過量自由基，具有多種生物酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、磷酸酶、過氧化物酶和氧化酶等的模擬活性，以及具有羥基自由基及氮氧化物自由基清除的能力。這些多重酶活性使CeO2在生物方面有著眾多極具前景的潛在應用價值。目前，在生物領域其已被開發用于生物檢測、疾病診斷及治療、藥物載體及生物支架等方面。
[0003]環糊精分子與苯硼酸分子在堿性條件下易形成硼酸酯鍵，而硼酸酯鍵在低pH時會發生水解，在有葡萄糖存在時發生競爭反應。因此，利用環糊精分子修飾的金屬氧化物納米顆粒與苯硼酸修飾的介孔材料組裝成受PH及葡萄糖刺激響應的藥物釋放體系很有研究意義。

【發明內容】

本發明的目的在于提供一種具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性藥物載體及其制備和應用。本發明所制得的U166-CBA-a-CD-Ce02-RGD復合納米顆粒藥物載體具有在腫瘤部位受pH及葡萄糖雙重響應藥物釋放特性，同時還具有高藥物負載率及良好的生物相親性等優點，可實現對腫瘤或炎癥組織的藥物遞釋、靶向一體化的治療。
[0004]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種具有PH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體:所述的藥物釋放載體是U166_CBA-a-CD-Ce02-R⑶復合納米顆粒;其是先由苯硼酸改性金屬有機框架材料仍066-順2制得U166-CBA，再以環糊精修飾CeO2納米顆粒制得a-CD-Ce02，然后將U166-CBA和a-CD-Ce02通過硼酸酯鍵進行組裝，并且在組裝的材料表面修飾R⑶靶分子而獲得的復合納米顆粒。
[0005]—種制備如上所述的具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，包括如下步驟:
a)苯硼酸修飾的U166-CBA材料合成:
將一定量的EDC，NHS加入至4-羧基苯硼酸溶液中，加入U166-NH2，在室溫條件下反應12h，離心，去離子水洗2次，獲得U166-CBA材料；
b)表面α-⑶修飾的Ce02納米顆粒合成
將六水硝酸鈰與α-CD在水中攪拌Ih，之后加入30ml濃氨水，在25?100° C攪拌24h，3000rpm離心處理得上清液，然后將上清液繼續高速18000rpm離心處理，得到淺黃色α-⑶-Ce〇2納米顆粒；
c)U166-CBA_a-CD-Ce02復合納米顆粒的合成
將步驟a)制得的U166-CBA材料分散于pH=8.0的PBS緩沖液中，按一定質量比加入0.2mg/mL步驟b)制得的Ct-CD-CeO2納米顆粒，室溫攪拌12h，通過硼酸酯鍵的構建獲得U166-CBA-a-CD-CeO2 復合納米顆粒；
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒的制備
在pH=7.4緩沖液中將R⑶靶分子與CBA分子按1:1摩爾比混合后，加入EDC與NHS分子活化，通過酰胺反應獲得CBA-RGD分子，透析后，冷凍干燥；
然后將一定量步驟c)制得的U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒分散于pH=8.0的PBS緩沖液中，按一定摩爾比加入CBA-R⑶分子，反應4h，獲得Ui o66-CBA-a-CD-CeO2-R⑶復合納米顆粒。
[0006]步驟a)中U166_NH2與4-羧基苯硼酸的反應摩爾比例是1:1 ；
步驟b)中六水硝酸鋪與α-⑶的摩爾比為1:2?1:8。
[0007]步驟c)中U166-CBA與Q-CD-CeO2的質量比為1:2?1:10。
[0008]步驟d)中CBA-R⑶分子與U166-CBA-a-CD-Ce02的反應摩爾比是1:10。
[0009]步驟a)制備的U166_CBA納米顆粒直徑為100± 10 nm；
步驟b)制得的α-⑶-Ce02納米顆粒直徑為5±2 nm，表面帶負電荷。
[0010]如上所述的制備方法制得的藥物釋放載體的應用:U166-CBA-a-CD-Ce02-RGD復合納米顆粒在酸性及葡萄糖的雙重響應刺激條件下釋放所負載的抗癌藥物。
[0011 ]更具體地，酸性條件為pH < 6，葡萄糖濃度I?10mM，所述的抗癌藥物是為阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇中的一種或多種。
[0012]更具體地，一種制備如上所述的具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，包括如下步驟:
a)表面苯硼酸修飾的U166-CBA材料合成:
稱取104.8 mg四氯化鋯加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下攪拌1min形成溶液I;同時稱取80.6 mg 2-氨基對苯二甲酸加入到5 mLDMF，超聲1min溶解形成溶液2;將溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去離子水，轉移至50 mL反應釜中，置于120° C烘箱中反應24 h，離心處理得到樣品，依次用DMF，去離子水洗滌2次，最后樣品重新分散于去離子水中，得到U1ee-NH2，室溫保存備用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩爾比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC與3.3mgNHS，在pH=8.0緩沖液中室溫條件下反應12h，離心，去離子水洗2次，獲得U166_CBA材料； b)表面α-⑶修飾的Ce02納米顆粒合成
將2.5 mL I M的六水硝酸鈰與一定量的環糊精混合于水中，攪拌l-2h，之后加入30 mL質量濃度28wt%的氨水，在一定溫度下攪拌24 h，3000 rpm離心處理得上清液，上清液繼續在18000 rpm下離心30分鐘，并用蒸饋水洗，分散于蒸饋水中，得到環糊精修飾的a-CD_Ce02納米顆粒，室溫保存備用；
六水硝酸鋪與環糊精摩爾比為1:2?1: 8，優選摩爾比是1:4;反應溫度為25?100° C，優選溫度是60° C。
[0013]c)U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒的合成
將一定量U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS緩沖液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2納米顆粒，在室溫下攪拌12h，離心處理獲得U166-CBA_a-⑶-CeO2復合納米顆粒。
[0014]步驟c中U166_CBA與Q-CD-CeO2的質量比是1:2?1:10，最優質量比是1:4。
[0015]d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD 復合納米顆粒的制備
在pH=7.4緩沖液中將R⑶靶分子與CBA分子按1:1摩爾比混合后，加入EDC與NHS分子活化，通過酰胺反應獲得CBA-RGD分子，透析后，冷凍干燥備用。
[0016]將一定量U166-CBA-a-CD_Ce02復合納米顆粒分散于pH=8.0的PBS緩沖液中，按一定摩爾比加入CBA-R⑶分子，反應4h，獲得U166-CBA-a-CD-CeO2-RGD復合納米顆粒。
[0017]步驟d中CBA-R⑶分子與Ui o66-CBA-a-CD-Ce02的反應摩爾比是1:1O，R⑶分子的固定率是91.76%。
[0018]U166-CBA-a-CD-Ce02-R⑶復合納米顆粒可作為藥物載體，在酸性及葡萄糖的雙重響應刺激條件下釋放所負載的抗癌藥物。體外釋放實驗結果顯示在酸性及葡萄糖的雙重刺激下，藥物釋放量在48h后達到89.69 %，說明復合納米顆粒具有良好的刺激響應釋放效果。細胞毒理實驗結果表明1^066-08六-0(?-€^0-0602濃度為12.5 yg/ml時，癌細胞抑制率可達到54.07%，U166-CBA-D0X-a-CD-CeO2-R⑶對癌細胞的抑制率為79.05%。
[0019]與其他藥物釋放體系相比，本發明的顯著優點在于:
(1)本發明所述的金屬有機框架/金屬氧化物復合納米顆粒制備簡單，合成顆粒尺寸均一;Ct-CD-CeO2粒徑小于10 nm，對金屬有機框架具有很好的封堵效果，48h預泄漏量低至于9.1%；
(2)本發明所述的金屬有機框架/金屬氧化物復合納米顆粒生物相容性好，在腫瘤細胞內易受酸性及葡萄糖雙重刺激響應，硼酸酯鍵解離，釋放出所負載藥物，可實現對腫瘤或炎癥組織的藥物遞釋、靶向一體化的治療功能。
【附圖說明】
[0020]圖l(A)U166-NH2顆粒的低倍透射電鏡圖(TEM);(B)U166-CBA顆粒的低倍透射電鏡圖(TEM) ； (C)Q-CD-CeO2 納米顆粒的低倍透射電鏡圖(TEM) ； (D)U166-CBA-a-CD_Ce02 納米顆粒的低倍透射電鏡圖(TEM):照片中白色箭頭所指小黑點為α-⑶-CeO2納米顆粒；
圖2(A)U166-NH2納米顆粒的X射線衍射圖像(XRD);圖2(B)a-CD-Ce02和U166-CBA-a-CD-CeO2復合納米顆粒的X射線衍射圖像(XRD);橫坐標為2Θ角度，縱坐標為衍射強度；
圖3為U166-NH2、U166-CBA和U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒在373K的氮氣吸附脫附曲線； 圖4為U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02復合納米顆粒針對不同pH以及1mM葡萄糖濃度刺激響應的藥物體外釋放曲線圖；橫坐標為釋放時間，縱坐標為釋放百分率；
圖5為考察U166-CBA_a-CD-CeO2復合納米顆粒的生物相容性測試;橫坐標為復合納米顆粒濃度，縱坐標為細胞生存率；
圖6為加入不同組樣品培養后所得的細胞存活率柱狀圖；橫坐標為不同組樣品，縱坐標為細胞生存率；UControl，2、U166-CBA-a-CD-Ce02 Nps，3、U166-CBA_D0X- Q-CD-CeO2Nps，4、U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02_RGD Nps，5、Free DOX0
【具體實施方式】
[0021]下面以具體實施示例對本發明的技術方案做進一步說明，但是不能以此限制本發明的范圍。
[0022]實施例1
一種制備具有PH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，包括如下步驟:
a)表面苯硼酸修飾的U166-CBA材料合成:
稱取104.8 mg四氯化鋯加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下攪拌1min形成溶液I;同時稱取80.6 mg 2-氨基對苯二甲酸加入到5 mLDMF，超聲1min溶解形成溶液2;將溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去離子水，轉移至50 mL反應釜中，置于120° C烘箱中反應24 h，離心處理得到樣品，依次用DMF，去離子水洗滌2次，最后樣品重新分散于去離子水中，得到U1ee-NH2，室溫保存備用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩爾比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC與3.3mgNHS，在pH=8.0緩沖液中室溫條件下反應12h，離心，去離子水洗2次，獲得U166_CBA材料；
b)表面α-⑶修飾的Ce02納米顆粒合成
將2.5 mL I M的六水硝酸鈰與一定量的環糊精混合于水中，攪拌lh，之后加入30 mL質量濃度28wt%的氨水，在60° C下攪拌24 h，3000 rpm離心處理得上清液，上清液繼續在18000rpm下離心30分鐘，并用蒸餾水洗，分散于蒸餾水中，得到環糊精修飾的Ct-CD-CeO2納米顆粒，室溫保存備用;六水硝酸鈰與環糊精摩爾比是1:4;
c)U166-CBA_a-CD-Ce02復合納米顆粒的合成
將U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS緩沖液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2納米顆粒，在室溫下攪拌12h，離心處理獲得U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒;U166_CBA與Q-CD-CeO2的質量比是1:4;
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒的制備
在pH=7.4緩沖液中將R⑶靶分子與CBA分子按1:1摩爾比混合后，加入EDC與NHS分子活化，通過酰胺反應獲得CBA-RGD分子，透析后，冷凍干燥備用。
[0023]將U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒分散于pH=8.0的PBS緩沖液中，然后加入CBA-RGD分子，反應4h，獲得U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒；CBA-RGD分子與U166-CBA-a-CD-CeO2的反應摩爾比是1:10，R⑶分子的固定率是91.76%。
[0024]實施例2
一種制備具有PH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，包括如下步驟:
a)表面苯硼酸修飾的U166-CBA材料合成: 稱取104.8 mg四氯化鋯加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下攪拌1min形成溶液I;同時稱取80.6 mg 2-氨基對苯二甲酸加入到5 mLDMF，超聲1min溶解形成溶液2;將溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去離子水，轉移至50 mL反應釜中，置于120° C烘箱中反應24 h，離心處理得到樣品，依次用DMF，去離子水洗滌2次，最后樣品重新分散于去離子水中，得到U1ee-NH2，室溫保存備用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩爾比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC與3.3mgNHS，在pH=8.0緩沖液中室溫條件下反應12h，離心，去離子水洗2次，獲得U166_CBA材料；
b)表面α-⑶修飾的Ce02納米顆粒合成
將2.5 mL I M的六水硝酸鈰與環糊精混合于水中，攪拌2h，之后加入30 mL質量濃度28界七％的氨水，在100°(:下攪拌24 h，3000 rpm離心處理得上清液，上清液繼續在18000 rpm下離心30分鐘，并用蒸餾水洗，分散于蒸餾水中，得到環糊精修飾的Q-CD-CeO2納米顆粒，室溫保存備用；
c)U166-CBA_a-CD-Ce02復合納米顆粒的合成
將U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS緩沖液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2納米顆粒，在室溫下攪拌12h，離心處理獲得U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒;U166_CBA與Q-CD-CeO2的質量比是1:2;
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒的制備
在pH=7.4緩沖液中將R⑶靶分子與CBA分子按1:1摩爾比混合后，加入EDC與NHS分子活化，通過酰胺反應獲得CBA-RGD分子，透析后，冷凍干燥備用。
[0025]將U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒分散于pH=8.0的PBS緩沖液中，然后加入CBA-RGD分子，反應4h，獲得U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒；CBA-RGD分子與U166-CBA-a-CD-CeO2的反應摩爾比是1:10。
[0026]實施例3
一種制備具有PH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，包括如下步驟:
a)表面苯硼酸修飾的U166-CBA材料合成:
稱取104.8 mg四氯化鋯加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下攪拌1min形成溶液I;同時稱取80.6 mg 2-氨基對苯二甲酸加入到5 mLDMF，超聲1min溶解形成溶液2;將溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去離子水，轉移至50 mL反應釜中，置于120° C烘箱中反應24 h，離心處理得到樣品，依次用DMF，去離子水洗滌2次，最后樣品重新分散于去離子水中，得到U1ee-NH2，室溫保存備用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩爾比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC與3.3mgNHS，在pH=8.0緩沖液中室溫條件下反應12h，離心，去離子水洗2次，獲得U166_CBA材料；
b)表面α-⑶修飾的Ce02納米顆粒合成
將2.5 mL I M的六水硝酸鈰與環糊精混合于水中，攪拌l-2h，之后加入30 mL質量濃度28wt%的氨水，在25° C下攪拌24 h，3000 rpm離心處理得上清液，上清液繼續在18000 rpm下離心30分鐘，并用蒸餾水洗，分散于蒸餾水中，得到環糊精修飾的Q-CD-CeO2納米顆粒，室溫保存備用；
c)U166-CBA_a-CD-Ce02復合納米顆粒的合成
將一定量U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS緩沖液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2納米顆粒，在室溫下攪拌12h，離心處理獲得U166-CBA_a-CD-Ce02復合納米顆粒;U166_CBA與a-CD-CeO2的質量比是1:10;
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒的制備
在pH=7.4緩沖液中將R⑶靶分子與CBA分子按1:1摩爾比混合后，加入EDC與NHS分子活化，通過酰胺反應獲得CBA-RGD分子，透析后，冷凍干燥備用；
將U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒分散于pH=8.0的I3BS緩沖液中，然后加入CBA-RGD分子，反應4h，獲得U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒;CBA-RGD分子與U166_CBA-Q-CD-CeO2的反應摩爾比是1:10。
[0027]性能檢測:
1、將實施例1制得納米顆粒水溶液滴在銅網上，晾干后進行TEM掃描(見圖1)，結果見圖1所示，從圖1-A中可以看出Ui o66-NH2顆粒為四面體結構，尺寸均一，平均粒徑約為100 ± 5nm;從圖1-B中可以看出U166-CBA顆粒為四面體結構，表面有輕微改變，尺寸均一，平均粒徑約為100±10 nm;從圖1-C中可以看出Q-CD-CeO2 nps平均粒徑約為5±2 nm;從圖1-D中可以看出U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒四面體結構變形，表面較U166-CBA顆粒變粗糙，可看出分布均勾的a-CD_Ce02 Nps (白色箭頭所指)。
[0028]2、粉末衍射儀器 Bruker D8 Advance powder X-ray diffractometer 使用Cu靶，在室溫條件下，以2Θ步長為0.02得到的掃描衍射峰數據:光譜用晶面距離d表示。對于同種化合物的同種晶型，XRD譜圖在整體上具有相似性，標準峰的d值相對誤差值在±2%以內。因此我們選擇U166-NH2化合物的標準衍射圖譜作對比(圖2(A):a)，U166-NH2的標準圖片衍射峰位置:7.38、8.52、12.06、14.15、25.75。本發明所合成的U166_NH2的衍射峰位置(圖2(八):13):7.40、8.54、12.08、14.17、25.72。本發明所合成1]1066-冊2與標準衍射圖片對比，位置基本吻合，可以判斷出它們屬于同種晶型。同理我們選擇CeO2化合物的標準衍射圖譜做對比，其中CeO2化合物標準圖片衍射峰位置:28.55、33.08、48.49、59.34、59.09、69.42、76.71、76.08。本發明所合成的Q-CD-CeO2 nps和U166-CBA-a-CD-Ce02 nps的衍射峰位置分別為(圖2(8)):28.48、33.06、47.51、56.40、69.68、76.08;28.43、33.04、47.53、56.50、69.66、76.19。由于在混合物鑒定中，可能由于含量的下降，導致某些衍射峰的缺失，因此我們選擇某些衍射峰來判斷。本發明所合成的Q-CD-CeO2 nps和U166-CBA_a-CD-Ce02 Nps與標準衍射圖片對比，位置基本一致，可以判斷出它們晶型相同。
[0029]3、樣品于100°C下抽真空處理，使用儀器美國康塔N0VA2000e表面及孔徑分析儀測定了樣品在373K的氮氣吸附和脫附行為。實驗結果顯示U166-NH2、U166-CBA和U166-CBA-Q-CD-CeO2 Nps復合納米顆粒的比表面積分別為804.13 m2/ g,674.29 m2/ g、177.76m2/ g，孔容為0.406 cm3/g、0.388 cm3/g、0.172 cm3/g，孔徑為1.867 nm、1.589 nm、0.723nm，說明CBA分子修飾沒有影響U166-NH2的比表面積和孔徑，后者仍具有較高的吸附能力；而U166-CBA-a-Q)-Ce02復合納米顆粒比表面積和孔徑相比如兩者減小，說明a-Q)-Ce02納米顆粒成功的封堵U166-CBA。如圖3所示氮氣吸附-脫附等溫曲線具有明顯的回滯環曲線，說明Ui o66納米材料是介孔材料。
[0030]4、取2 ml I mg/ml實施例1制得的U166_CBA納米顆粒加入至2 ml I mg/ml的DOX(阿霉素)充分混合，室溫避光攪拌12 h，離心，水洗兩次收集上清液，沉淀與α-⑶-CeO2繼續反應進行封堵。用焚光分光光度計(Ex=488 nm)，記錄波長在500 nm至800 nm間的發射光譜最大吸收值，并根據阿霉素標準曲線計算出每克U166-CBA納米化合物可負載443 mg的鹽酸阿霉素。考察負載了阿霉素的U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02復合納米顆粒在不同緩沖溶液中的釋放效果，具體的實驗步驟如下:將I mg吸附藥物后的U166-CBA-a-CD-Ce02 Nps復合納米顆粒分散于3 ml PBS (pH=7.4，10 mM)溶液中，放入透析袋后將透析袋加入47 mlPBS溶液中透析48 h，每隔1.5 h，3 h，5 h，7 h，12 h，24 h，42 h，48 h取3ml溶液測熒光，原溶液再補入3ml PBS，測試的結果如圖4所示。曲線I為37 °C，pH=7.4;曲線2為37 °C, pH=7.4,10 mM葡萄糖；曲線3為37 °C，pH=5;曲線4為37 °C，pH=5，10 mM葡萄糖;從圖4中可以看出在pH=5，10 mM葡萄糖條件下所釋放出的DOX熒光強度最高，說明在此條件下更有利于DOX的釋放，可有效的用于腫瘤細胞的藥物治療。
[0031 ] 5、用HeLa細胞作為目標細胞評價U166_CBA-a-CD-Ce02 Nps復合納米顆粒的生物相親性:取已消化成單分散的HeLa細胞懸濁液用培養液稀釋，以100 yL/孔的密度接種到96孔板，每孔的細胞個數控制約為15個。將96孔板置于37 °C，5% CO2的培養箱中培養24 h后，移去培養液，加入含有不同濃度的U166-CBA_a-⑶-CeO2 Nps復合納米顆粒細胞培養液，每組設置4個重復孔。繼續培養4.5 h后，移去培養液，用PBS緩沖液(pH=7.4)清洗兩次，加入200yL培養液繼續培養20 h后，每孔分別加入10 度為5 mg/mL的ΜΤΤ，繼續培育4 h，小心移去培養液，加入150 yL DMS0，37°C培養25 min，震蕩均勻后，在酶標儀上測490 nm處的吸收值，計算細胞存活率，評價U166-CBA- Q-CD-CeO2復合納米顆粒生物相親性。圖5顯示U166-CBA-a-CD-CeO2復合納米顆粒濃度在5?100 yg/ml區間，細胞存活率均在80%以上，說明U166-CBA_a-⑶-CeO2復合納米顆粒生物具有很好的生物相親性，適于當藥物載體。
[0032]6、取已消化成單分散的HeLa細胞懸濁液用培養液稀釋，以100 yL/孔的密度接種至IJ96孔板，每孔的細胞個數控制約為15個，每組設置4個復孔作為重復組。將96孔板置于37°C，5% CO2的培養箱中培養24 h后，移去孔中培養液，分別加入含有I ,Control 2，U166-CBA-Q-CD-CeO2 Nps (12.5 yg/ml)3,U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02 Nps (12.5 yg/ml)4,U166-CBA-D0X-a-CD -CeO2-RGD Nps(12.5 yg/ml) 5,Free DOX(5 yg/ml)，其中3、4組中DOX的濃度為5 yg/ml，加入細胞培養液，繼續培養4.5 h，移去培養液，用PBS緩沖液清洗兩次，加入200 yL培養液繼續培養20 h后，每孔分別加入10 yL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培育4 h，小心移去培養液，加入150 yL DMS0，37 °C培養20 min，震蕩均勻后，在酶標儀上測490 nm處的吸收值，計算細胞存活率，評價各組治療效果。從圖6可以看出U166-CBA_D0X-a-CD -CeO2-RGD復合納米顆粒對癌細胞在24 h內抑制率達到79.05%，說明該藥物載體能用于腫瘤的治療。
[0033]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體，其特征在于:所述的藥物釋放載體是U166-CBA-a-CD-Ce02-RGD復合納米顆粒;其是先由苯硼酸改性金屬有機框架材料U166-NH2制得U166-CBA，再以環糊精修飾CeO2納米顆粒制得a-CD-Ce02，然后將U166-CBA和a-⑶-CeO2通過硼酸酯鍵進行組裝，并且在組裝的材料表面修飾RGD靶分子而獲得的復合納米顆粒。2.—種制備如權利要求1所述的具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，其特征在于:包括如下步驟: a)苯硼酸修飾的U166-CBA材料合成: 將一定量的EDC，NHS加入至4-羧基苯硼酸溶液中，加入U166-NH2，在室溫條件下反應12h，離心，去離子水洗2次，獲得U166-CBA材料； b)表面α-⑶修飾的Ce02納米顆粒合成: 將六水硝酸鈰與α-CD在水中攪拌Ih，之后加入30ml濃氨水，在25?100° C攪拌24h，3000rpm離心處理得上清液，然后將上清液繼續18000rpm離心處理，得到淺黃色a-⑶-CeO2納米顆粒； c)U166-CBA_a-CD-Ce02復合納米顆粒的合成 將步驟a)制得的U166-CBA材料分散于pH=8.0的PBS緩沖液中，按一定質量比加入0.2mg/mL步驟b)制得的Ct-CD-CeO2納米顆粒，室溫攪拌12h，通過硼酸酯鍵的構建獲得U166-CBA-a-CD-CeO2 復合納米顆粒； d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD復合納米顆粒的制備 在pH=7.4緩沖液中將R⑶靶分子與CBA分子按1:1摩爾比混合后，加入EDC與NHS分子活化，通過酰胺反應獲得CBA-RGD分子，透析后，冷凍干燥； 然后將一定量步驟c)制得的U166-CBA-a-CD-Ce02復合納米顆粒分散于pH=8.0的PBS緩沖液中，按一定摩爾比加入CBA-R⑶分子，反應4h，獲得U166-CBA-a-CD-CeO2-R⑶復合納米顆粒。3.根據權利要求2所述制備具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，其特征在于:步驟a)中U166-NH2與4-羧基苯硼酸的反應摩爾比例是1:1。4.根據權利要求2所述制備具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，其特征在于:步驟b)中六水硝酸鋪與α-⑶的摩爾比為1:2?1:8。5.根據權利要求2所述制備具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，其特征在于:步驟c)中U166-CBA與Q-CD-CeO2的質量比為1:2?1:10。6.根據權利要求2所述制備具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，其特征在于:步驟d)中CBA-R⑶分子與U166-CBA-a-CD-Ce02的反應摩爾比是1:10。7.根據權利要求2所述制備具有pH和葡萄糖雙重刺激響應性的藥物釋放載體的方法，其特征在于:步驟a)制備的U166_CBA納米顆粒直徑為100± 10 nm； 步驟b)制得的α-⑶-Ce02納米顆粒直徑為5±2 nm，表面帶負電荷。8.—種如權利要求2所述的制備方法制得的藥物釋放載體的應用，其特征在于:U166-CBA-Q-CD-CeO2-RGD復合納米顆粒在酸性及葡萄糖的雙重響應刺激條件下釋放所負載的抗癌藥物。9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:酸性條件為pH< 6，葡萄糖濃度I?10mM，所述的抗癌藥物是為阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇中的一種或多種。
【文檔編號】A61K47/02GK105902519SQ201610400817
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】朱春玲, 曾胚羨, 謝增鴻, 林旭聰
【申請人】福州大學