包含聚合抑制劑的一組分纖維蛋白膠的制作方法

包含聚合抑制劑的一組分纖維蛋白膠的制作方法
【專利摘要】本文提供了包含纖維蛋白單體和可逆纖維蛋白聚合阻斷劑的穩定液體封閉劑制劑、制劑的制備和使用方法。
【專利說明】
包含聚合抑制劑的一組分纖維蛋白膠
[0001 ] 序列表
[0002] 本申請含有WASCII格式通過EFS-Web與本申請同時提交并且據此全文W引用方 式并入的序列表。2013年12月22日創建的所述ASCII副本命名為"序列表"并且大小為8千字 T。
技術領域
[0003] 本文提供一種單一組分液體封閉劑制劑、它的制備方法和它用于尤其是止血、封 閉、愈合和/或外科的使用方法。具體地，本文公開一種包含纖維蛋白原單體和GPRP膚的液 體封閉劑制劑。制劑表現出穩定性和延長的儲存壽命并且在阻斷、中和、稀釋和/或除去膚 之后為可用的。
【背景技術】
[0004] 纖維蛋白封閉劑也稱為纖維蛋白膠，已在臨床中使用了數十年(參見例如，Tab有le 等人，J F*harm 曲armaceut Sci 2012,15 :124-140 ;Dickneite G等人，Thrombosis Res 2003,112:73-82)。通常，纖維蛋白封閉劑由兩種液體組分組成，包含纖維蛋白原的組分和 包含凝血酶的組分，此類組分由于它們固有的不穩定性被冷凍儲存。有時纖維蛋白封閉劑 產品由兩種冷凍干燥的組分組成，所W需要就在使用之前重構W及通過連接的注射器或其 它雙筒遞送裝置進行遞送。冷凍干燥的制劑通常是穩定的，但是纖維蛋白原組分難W重構。 在將兩種組分溶液混合之后，凝血酶裂解纖維蛋白原，因此使纖維蛋白原生成纖維蛋白聚 合物。
[0005] 纖維蛋白封閉劑凝塊通過設及纖維蛋白原、凝血酶和因子XIII的酶促反應形成。 纖維蛋白原是血凝炔基質的前體蛋白質。它具有約340,000Da的分子量，并由通過二硫鍵連 接的3對不同多膚鏈Αα、郵和丫組成。纖維蛋白原具有Ξ結節結構:兩個相同的D末端球狀域 和一個中屯、Ε球狀域，它們通過超螺旋的α螺旋連接。凝血酶通過酶促作用將纖維蛋白原轉 化成纖維蛋白單體，速率由凝血酶的濃度決定。
[0006] 因子XIII為血液凝固系統的酶，通常存在于膠制劑中，當通過凝血酶活化并且存 在巧時使纖維蛋白凝塊交聯并穩定。此過程繞過了正常凝固的大多數步驟，并且模擬其最 終階段。一些制造商將抗蛋白溶解劑添加到纖維蛋白膠制劑中（例如，如W093/05822中所 述)或特異性除去纖溶酶原W使纖維蛋白溶解停止或延遲(例如，如美國專利5,792,835和 7,125,569 中所述）。
[0007]
【背景技術】包括Laudano和Doolittle(PNAS 75(7) :3085-9)?及美國專利5,219， 328；5,318,524；8,367,802；5,750,657；6,262,236；6,268,483；6,500,427；5,723,579；5, 478,810;5,607,858;6,908,899和8,513,380。

【發明內容】

[0008] 纖維蛋白封閉劑在使用之前的制備是耗時的并且是繁瑣的。市售的封閉劑由兩種 組分組成，包含纖維蛋白原的組分和包含凝血酶的組分，此類組分通常呈干粉或獨立的冷 凍液體的形式供應。用于重構粉末的過程由于纖維蛋白原組分的受限的溶解度而為耗時 的，并且常常需要加熱。一旦重構或融化，就要將組分轉移到兩個獨立的注射器中從而立即 使用。存在已知的單一組分封閉劑，此類封閉劑需要繁瑣的處理和/或具有短的儲存壽命。
[0009] 本文提供包含纖維蛋白單體和GPRP膚或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑的單一組 分穩定的封閉劑制劑、制造方法和使用方法，從而克服了已知封閉劑產品制劑、制造方法 和/或使用方法的缺點。
[0010] 可逆纖維蛋白聚合阻斷劑可為大小小于約一（l)kD的試劑。在一些實施方案中，試 劑為小分子和/或分離的膚、它們的衍生物或鹽，此類試劑能夠可逆地結合纖維蛋白單體并 且防止或延遲纖維蛋白聚合。在一些實施方案中，可逆纖維蛋白聚合阻斷劑包含小化學分 子或分離的膚。可逆纖維蛋白聚合阻斷劑可為對纖維蛋白單體的親和力低并且對纖維蛋白 聚合不具有永久性作用的結合試劑。因此，通常稀釋和/或小分子交換將引發聚合。本文中 的阻斷劑通過將抑降低至酸性抑不起作用。
[0011] 在一個方面，提供一種液體封閉劑制劑，其包含濃度為1%至13% (w/v)的纖維蛋 白單體;和GPRP膚和/或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑;其中阻斷劑和/或GPRP膚W相對于 纖維蛋白單體摩爾過量超過約100或超過約340的量存在;并且其中液體制劑在選自由W下 項組成的組的環境溫度下穩定至少14天:約20°C、21°C、22°C、23°C、24°C和25°C。
[0012] 在一個實施方案中，液體制劑在選自由W下項組成的組的環境溫度下穩定多至90 天：約 20 °C、2 rC、22 °C、23 °C、24 °C 和 25 °C。
[0013] 在一個實施方案中，液體制劑在選自由W下項組成的組的環境溫度下穩定在14天 和多至90天的范圍內的時間段:約20°(：、21°(：、22°(：、23°(：、24°(：和25°(：。
[0014] 在一個實施方案中，GPRP膚W相對于纖維蛋白單體摩爾過量約超過100至約460或 超過100至約340、或約340至約460倍的量存在。
[0015] 如本文所用的術語"纖維蛋白單體"包括纖維蛋白單體、二聚體和具有多個纖維蛋 白單元的低聚體，使得纖維蛋白在選自由W下項組成的組的環境溫度下在水性液體溶液中 呈可溶形式保持:約 20 °C、2 rC、22 °C、23 °C、24 °C 和 25 °C。
[0016] 在一個實施方案中，低聚體含有多至10個纖維蛋白單元。
[0017] 如本文所用的術語"纖維聚合物"包括多個具有多個纖維蛋白單元的纖維蛋白單 元，從而限制了纖維蛋白在選自由W下項組成的組的環境溫度下在水性液體溶液中的溶解 度:約 20 °C、2 rC、22 °C、23 °C、24 °C 和 25 °C。
[0018] 在一個實施方案中，聚合物含有超過10個纖維蛋白單元。
[0019] "環境溫度"為纖維蛋白制劑的周圍環境的溫度。
[0020] 在一個實施方案中，制劑當在較低溫度例如2-8°C下保存或被冷凍時穩定較長時 間段。在融化之后，制劑可被轉移到具有約20-25°C環境溫度的位置并在那個溫度下保持穩 定至少14天。制劑還可在除上文所具體描述的溫度之外的溫度下為穩定的。
[0021 ] 在各種實施方案中，纖維蛋白單體W1 %至4% (w/v)或3.5 %至13 % (w/v)的濃度 存在。
[0022] 在一些實施方案中，制劑還包含藥學上可接受的載體。
[0023] 術語"藥學上可接受的載體"是指適于人或其它動物使用的任何稀釋劑或媒介物。
[0024] 在一些實施方案中，制劑基本上不含添加的凝血酶。"基本上不含"是指小于約一 (1) IU的凝血酶每毫升化/ml)的制劑。
[0025] 在一些實施方案中，GPRP膚包括包含Gly-Pro-Arg-Pro四膚氨基酸序列的膚、它們 的衍生物或鹽。
[0026] 在一些實施方案中，GPRP膚為具有SEQ ID NO: 1中所列出的氨基酸序列的四膚或 它們的衍生物或鹽。
[0027] 在一些實施方案中，GPRP膚為由SEQ ID NO: 1中所列出的氨基酸序列組成的四膚 或它們的衍生物或鹽。
[0028] 在各種實施方案中，"GPRP膚"包括選自由具有選自W下的氨基酸序列的膚或它們 的衍生物或鹽的膚：SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:42(沈Q ID N0:1;SEQ ID N0:2;SEQ ID NO: 3;沈Q ID N0:4;SEQ ID N0:5;SEQ ID N0:6;SEQ ID N0:7;SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:9;SEQ ID N0:10;沈Q ID N0:11;沈Q ID N0:12;沈Q ID N0:13;沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15;沈Q ID N0:16;沈Q ID N0:17;沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:19;沈Q ID N0:20;沈Q ID N0:21;沈Q ID N0:22;沈Q ID N0:23;沈Q ID N0:24;沈Q ID N0:25;沈Q ID N0:26;沈Q ID N0:27;沈Q ID N0:28;沈Q ID N0:29;沈Q ID N0:30;沈Q ID N0:31;沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:34;沈Q ID N0:35;沈Q ID N0:36;沈Q ID N0:37;沈Q ID N0:38;沈Q ID N0:39;沈Q ID NO:40;沈Q ID NO:41;和沈Q ID NO:42)。
[00巧]在各種實施方案中，GPRP膚選自具有選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:42的氨基酸 序列的膚或它們的衍生物或鹽。
[0030] 在各種實施方案中，GPRP膚選自由由選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:42的氨基酸 序列組成的膚或它們的衍生物或鹽。
[0031] 在一些實施方案中，GPRP膚為GPRP膚酷胺。
[0032] 在一些實施方案中，制劑還包含凝血酶活化的因子XIII。制劑可還包括巧馨合劑。 巧馨合劑可為巧樣酸根離子、草酸根離子、邸TA、EGTA、或此類巧馨合劑的組合。在各種實施 方案中，巧馨合劑為例如巧樣酸鋼所提供的巧樣酸根離子。巧樣酸鋼可W約ImM至約50mM濃 度存在于制劑中。制劑可包括邸TA和/或EGTA，例如約0.1 mM至約2.5mM的邸TA和/或EGTA。
[0033] 在一些實施方案中，制劑具有中性抑，例如約6-8的抑或約6.5-7.5的抑或約6.7- 7.2的抑。
[0034] 在一些實施方案中，制劑含有緩沖液。通常，緩沖液為防止pH的極端偏移的成分。 在一個實施方案中，緩沖液選自由W下項組成的組:巧樣酸鋼、草酸鋼、乙酸鋼、甘氨酸、精 氨酸、W及它們的組合。
[0035] 制劑可用于止血、愈合、封閉和/或外科，例如組織封閉、創傷愈合、硬腦膜愈合、縫 合線替換或吻合。
[0036] 在另一個方面，本文提供一種容納如本文所公開的液體封閉劑制劑的容器。在一 些實施方案中，容器為安飯、小瓶或包含制劑的預填充的注射器。在一些實施方案中，制劑 或制劑的各個組分是凍干的。本文提供一種容納凍干制劑的容器，凍干制劑在重構之后提 供如本文所公開的液體封閉劑制劑。
[0037] 在另一個方面，本文提供一種試劑盒，該試劑盒包括包含如本文所公開的液體封 閉劑制劑的容器和任選地小分子交換裝置或G除去裝置(W及任選地使用說明）。
[0038] 小分子交換裝置可為含有用容許纖維蛋白聚合的小分子預平衡的樹脂的任何模 塊。制劑內的小分子被交換為所述容許聚合的小分子。
[0039] 通常，小分子交換為將至少一種小分子用至少另一種小分子置換。柱中的樹脂用 一種或多種最終制劑中所需的小分子和/或容許纖維蛋白聚合的分子預平衡。樹脂珠粒通 常為多孔的，孔在待置換的那些分子的分子量的范圍內。
[0040] 在一個實施方案中，使包含纖維蛋白單體和GPRP膚的液體制劑通過裝填有多孔樹 脂的柱。制劑中的纖維蛋白單體將太大W至于不能進入樹脂的孔并且將快速地通過柱。不 受機制的束縛，溶液中的小分子例如GPRP膚，將沿一條更曲折的路徑行進，因為它們能夠進 入并再離開樹脂的孔，因此大大減緩了它們通過樹脂的遷移速率。不受理論的束縛，那些使 樹脂預平衡的小分子具有顯著領先的優點，并由此與蛋白質(例如纖維蛋白單體)一起離開 樹脂。因此，緩沖液、鹽和其它小分子在運個步驟中得W交換。
[0041] 在一個實施方案中，在施用制劑之前和/或期間，將GPRP相對于纖維蛋白單體進行 稀釋并且比率為等于或小于100,諸如比率為1-60,例如3、4、11、11.3、17、22.7、23、34、45、 56.7或57。
[0042] 在另一個實施方案中，試劑盒中的制劑或制劑的各個組分為凍干的。因此，試劑盒 包括了包含呈粉末或液體的纖維蛋白單體的容器、包含呈粉末或液體的GPRP膚的容器和任 選地包含重構液體的容器，重構液體諸如水、乙酸鹽緩沖液或甘氨酸緩沖液或W中性pH的 精氨酸緩沖液或W中性pH的巧樣酸鹽緩沖液。在一個實施方案中，干燥纖維蛋白單體和 GPRP膚粉末提供于相同的容器中。
[0043] 容器或試劑盒中的制劑可還包含藥學上可接受的載體。
[0044] 在又一個方面，提供一種用于在表面處制備封閉劑的方法，該方法包括：
[0045] a)提供如本文所公開的液體封閉劑制劑；W及
[0046] b)在促進纖維蛋白在表面處聚合的條件下將制劑施用至表面。
[0047] 在一些實施方案中，表面為受治療者的出血或未出血器官/組織。受治療者包括哺 乳動物，包括人，并且可為人患者。在一些實施方案中，人患者為外科患者。
[0048] "表面"為人們期望形成封閉劑或膠的位置或方位。表面取決于封閉劑的使用。封 閉劑可用于例如止血、組織固定、移植物固定、創傷愈合和吻合。本文所公開的制劑、方法和 試劑盒可在內部或在外部用于組織和器官移植物固定、封閉外科創傷、包括提供止血的血 管外科和吻合，諸如動脈、胃腸和氣管吻合。
[0049] 表面可W是可裸眼視力可見的皮膚的外表面W及為生物體內部解剖結構一部分 的體內部分的表面。外表面包括但不限于面部、咽喉、頭皮、胸部、背部、耳朵、頸、手、肘、臀、 膝蓋的皮膚W及其它皮膚部位。體內部分的示例包括但不限于暴露于外部環境和內部器官 的體腔或解剖學開口，諸如鼻孔;唇;生殖器區域，包括子宮、陰道和卵巢;肺;肛口；脾;肝； 和屯、肌。表面可為出血或未出血的部位。表面還可為工作表面。
[0050] 在一些實施方案中，條件包括除去、阻斷、中和和/或稀釋GPRP膚。GPRP膚可通過將 制劑直接施用到表面來除去或稀釋。另選地，GPRP膚可通過使制劑通過小分子交換裝置來 除去或稀釋。另外，GPRP膚可通過使制劑在施用到表面之前或期間通過基于尺寸排阻和/或 親合力的裝置來除去或稀釋。其它除去或稀釋選項包括將GPRP-互補部分添加到裝置。裝置 中的互補部分可基本上為親合力方法。
[0051 ]另選地或除此之外，制劑中的GPRP可通過添加膚例如GPRP膚的互補部分或能夠置 換與纖維蛋白結合的GPRP的抗體來中和和/或阻斷。
[0052] 在又一方面，提供一種在有需要的受治療者中愈合、封閉和/或減少失血的方法， 該方法包括向受治療者施用治療有效量的本文所公開的液體封閉劑制劑。制劑在促進纖維 蛋白聚合的條件下施用到受治療者。在一些實施方案中，條件包括除去、阻斷、中和和/或稀 釋Grap膚。
[0053] 術語"治療有效量"是指預防、改善和/或治療疾病、病癥或病狀所需的劑量。有效 劑量可根據受治療者的年齡和體重、疾病或病狀和它的嚴重性W及本領域技術人員可認識 到的其它因素而變化。
[0054] 在另一個方面，提供一種如本文所公開的液體封閉劑制劑，其用于愈合、封閉、減 少失血和/或外科。
[0055] 在又一個方面，本文提供一種制造如本文所公開的液體封閉劑制劑的方法，該方 法包括：
[0056] a)提供包含纖維蛋白單體的組分；
[0057] b)提供GPRP膚或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑、它們的衍生物或鹽；
[0058] C)滲和a)和b)W便獲得液體封閉劑制劑，所述液體封閉劑制劑包含相對于纖維蛋 白單體摩爾過量超過100或超過至少340倍的量的GPRP和濃度為1 %至13% (w/v)的纖維蛋 白單體。
[0059] 在某一實施方案中，比率為相對于纖維蛋白單體摩爾過量約超過100至約460或超 過100至約340、或約340至約460倍。
[0060] 術語"滲和"意指W任何次序、任何組合和/或亞組合的形式混合組分。
[0061 ]另外提供一種可通過該方法獲得的液體封閉劑制劑。
[0062] 纖維蛋白單體可通過在允許纖維蛋白原裂解成纖維蛋白的條件下使包含水性纖 維蛋白原的溶液與凝血酶接觸來獲得。在此類實施方案中，纖維蛋白單體的制備是在纖維 蛋白聚合受到抑制的條件下進行，例如在存在GPRP或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑時。在 一個實施方案中，纖維蛋白在抑制聚合(例如通過降低溫度）的條件下從纖維蛋白原獲得， 并且稍后添加 GPRP膚。
[0063] 凝血酶可在溶液中是游離的或被固定在珠粒上。
[0064] 如果凝血酶被固定在珠粒上，例如W分批的形式或在柱中的珠粒，并且纖維蛋白 原組分穿過/接觸珠粒，那么所得的制劑/組分可包含殘余量的凝血酶。在一些實施方案中， 制劑基本上不含凝血酶，例如具有小于約一(1) lU/ml的凝血酶。
[0065] 在一些實施方案中，制劑/組分包括凝血酶活化的因子XIII。
[0066] 另選地，制劑中的纖維蛋白單體可通過在允許纖維蛋白原裂解成纖維蛋白的條件 下使包含水性纖維蛋白原的溶液與凝血酶樣酶接觸來獲得。此類酶的示例為裂解纖維蛋白 膚A(巧A)的蛇毒酶，如己曲酶(Batroxobin)。在此類實施方案中，纖維蛋白單體的制備是在 纖維蛋白聚合受到抑制的條件下進行，例如在存在GPRP或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑 時。
[0067] 在一些實施方案中，纖維蛋白單體組分/制劑還包括巧馨合劑。
[0068] 在一些實施方案中，制造方法包括干燥步驟W提供干燥制劑。
[0069] GPRP膚和/或包含纖維蛋白單體的組分可呈粉末和/或液體形式。
[0070] 還提供一種使用本文所提供的方法所制造的封閉劑制劑。
[0071] 纖維蛋白原可由初始血液組合物制備。血液組合物可為全血或血液級分，即全血 制品，諸如血漿。纖維蛋白原可為自體的、人來源(包括匯集血漿)或非人來源。還可能的是， 纖維蛋白原通過重組方法來制備或可被化學改性。
[0072] 在本發明的一個實施方案中，纖維蛋白原溶液包含作為來源于血漿的蛋白質溶液 的生物活性組分(BAC)，纖維蛋白原溶液可還包含纖維蛋白溶解劑諸如氨甲環酸和/或穩定 劑，諸如精氨酸、賴氨酸、它們藥學上可接受的鹽、或它們的混合物。BAC可來源于冷析出物， 尤其是濃縮的冷析出物。
[0073] 術語"冷析出物"是指得自由全血制備的冷凍血漿的血液組分。當將冷凍血漿在寒 冷條件下(通常在〇-4°C的溫度下)解凍，導致形成含有纖維蛋白原和因子XIII的析出物時， 可獲得冷析出物。析出物可例如通過離屯、來收集并溶解于合適的緩沖液中，諸如含有120mM 的氯化鋼、ImM的氯化巧、lOmM的巧樣酸Ξ鋼、120mM的甘氨酸、95mM的鹽酸精氨酸的緩沖液。 BAC的溶液可包含附加因子，諸如像因子VIII、纖粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻連蛋 白等，例如US 6，121，232和W09833533中所述。BAC的組合物可包含穩定劑，諸如氨甲環酸和 鹽酸精氨酸。BAC的溶液中氨甲環酸的量可為約80mg/ml至約11 Omg/ml。
[0074] 在另一個實施方案中，例如扣g/ml或更低的纖溶酶原，例如使用如US 7,125,569、 EP 1，390,485和W002095019中所述的方法，將BAC組合物中纖溶酶原和纖溶酶的濃度降低 至等于或低于15μg/ml。在另一個實施方案中，當將BAC組合物中纖溶酶原和纖溶酶的濃度 降低時，組合物不含有氨甲環酸或抑膚酶。
[00巧]纖維蛋白原溶液可為含有BAC2組分（來自EVICEL?)或任何其它纖維蛋白原的 溶液，諸如經純化的重組纖維蛋白原或從人血漿產生的冷析出物。
[0076] 在另一個實施方案中，制劑為充分溶解的溶液，例如溶質和溶劑成分僅構成一個 相例如液相的溶液。
[0077] 在參閱W下詳細的【具體實施方式】和附圖后，本發明的運些和其它方面和實施方案 將變得顯而易見。
【附圖說明】
[0078] 圖1為示出在固定的纖維蛋白濃度下GPRP膚濃度對纖維蛋白聚合時間的影響的 圖。
[0079] 圖2A示出包含GPRP膚和纖維蛋白的液體制劑。
[0080] 圖2B示出在除去GPRP膚之后發生纖維蛋白聚合。在該實施方案中，GPRP通過使制 劑經受小分子交換裝置來除去。
【具體實施方式】
[0081] 本公開部分基于在一定濃度下包括纖維蛋白單體和GPRP膚的穩定封閉劑制劑的 發現。
[0082] 本文提供W某一摩爾比包含纖維蛋白單體和GPRP膚的液體封閉劑制劑，從而克服 了當前可用的封閉劑制劑的不足。本文另外提供封閉劑的制造方法和使用方法。
[0083] 本文提供一種液體封閉劑制劑，其包含a)纖維蛋白單體;和b)GPRP膚或其它可逆 纖維蛋白聚合阻斷劑。纖維蛋白單體W約1%至約13% (重量每體積(w/v))的濃度存在。在 一個實施方案中，GPRP膚具有氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Pro(GPRP; SEQ ID NO: 1)、它們的衍 生物或鹽，并且W相對于纖維蛋白單體摩爾過量超過100倍、相對于纖維蛋白單體摩爾過量 超過或等于約340倍或摩爾過量約340至約460倍的量存在。
[0084] 在另一個實施方案中，GPRP膚包含氨基酸序列G1廠Pr〇-Arg-Pro(SEQ ID N0:1)或 Gly-Pro-Arg-VaK沈Q ID N0:23)。
[00化]在各種實施方案中，GPRP膚選自具有選自SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:42的氨基酸序 列的膚。
[0086] 穩定性可通過在制劑中觀察到最小限度的或不存在自發聚合或凝結來確定，例如 制劑在存在GPRP膚多至14天時不示出或具有自發聚合或凝結，并且在除去、稀釋、阻斷和/ 或中和GPRP至等于或小于100的摩爾過量時保持它的凝結活性水平。制劑的凝結活性水平 或形成封閉劑的能力可使用本領域中已知的凝結技術體外和/或體內確定。穩定性還可通 過在即可上架(shelf-ready)的液體制劑中測量并觀察到存在最小限度的或不存在纖維蛋 白聚合物或凝塊來確定。
[0087] 在使用時，GPRP作用可例如通過根據預期用途稀釋至一定濃度來減小。對于止血， 將為有利的是獲得小于一分鐘的凝結時間。在一個實施方案中，制劑中的GPRP濃度被稀釋 至等于或小于100倍的摩爾過量或等于或小于34倍的摩爾過量。
[0088] 對于移植物固定，將為有利的是獲得大約15分鐘的凝結時間。在一個實施方案中， 制劑中的GPRP濃度被稀釋至等于或小于100倍的摩爾過量或等于或小于56倍的摩爾過量。
[0089] 術語"穩定的"和"穩定性"當指代液體封閉劑制劑時意指在被施用到表面之前制 劑中不存在纖維蛋白聚合/纖維蛋白凝塊。本文所公開的制劑在如上文所定義的環境溫度 下穩定至少14(十四）天。
[0090] 纖維蛋白聚合或凝結可例如通過在傾斜表面上測量遷移長度(或下落試驗模型） 或通過本領域中已知的任何其它方法來測量。充分聚合可通過液體制劑例如在倒置時的流 動停止來評價。迅速聚合可使用Stat4凝結分析儀Stago Diagnostics或類似的測凝計測 量。
[0091] 對于在2-8 °C下長期儲存例如一年或更長時間，包含纖維蛋白單體和GPRP膚的制 劑可被等分到無菌小瓶、安飯或其它容器中，然后將運些容器封閉。在一個實施方案中，使 用允許利用注射器穿過封閉件移除制劑的封閉件。可根據藥學或醫療裝置領域的標準操作 標記容器。
[0092] 在使用時，液體封閉劑制劑可從容器中被直接施用，可穿過小分子交換裝置，或通 過GPRP除去裝置(例如具有GPRP-互補部分的親和力裝置）；雖然使用方法將由使用者(例如 醫療工作者諸如醫師、護±、醫生）決定，即根據各個患者的需要并且基于出血或病狀的嚴 重性。
[0093] 除非上下文中明確地指出，否則本文所用的不定冠詞"一個(a)"和"一個(an)"意 為"至少一個"或"一個或多個"。
[0094] 如本文所用，術語"包含"、"包括"、"具有"、W及它們的語法變體應被視為指定所 述特征、步驟或組分，但不排除添加一種或多種另外特征、步驟、組分或它們的組。
[0095] 當數值前面為術語"約"時，術語"約"旨在指示+/-10%。
[0096] 如本文所用，術語"膚"廣泛地用于指約4至約50個連續氨基酸的分離化合物或氨 基酸類似物。在膚的定義內包括例如含有一種或多種氨基酸類似物(包括例如合成氨基酸、 類膚等）的膚，具有取代的鍵合、膚鹽W及本領域中已知的其它修飾的膚，運兩種膚為天然 存在的或非天然存在的(例如，合成的）。因此，合成膚、環化膚、支鏈膚等都包括在定義內。
[0097] 術語"膚"還包括本發明氨基酸序列的具有一個或多個取代、添加和/或缺失的衍 生物，包括一種或多種非天然存在的氨基酸。優選地，衍生物表現出與參考序列至少約50% 同一性，優選地至少約70%同一性，更優選地與本文所述的參考序列至少約75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。膚衍 生物可包括對天然序列的修飾，諸如缺失、添加和取代(一般來講在性質上是保守的），只要 膚保持所需的活性即可，例如可逆地抑制纖維蛋白聚合。
[0098] 運些修飾可為故意的，如通過定點突變誘發，或可為偶然的，諸如通過產生蛋白質 的宿主的合成或突變或歸因于PCR擴增的錯誤。本文另外涵蓋的是膚的藥學上可接受的鹽 和此類鹽的衍生物。
[0099] 可逆抑制劑設及對纖維蛋白單體的親和力低并且對纖維蛋白聚合或纖維蛋白凝 塊不具有永久性作用的抑制劑(例如GPRP膚）。因此，通常稀釋、除去和/或小分子交換將除 去抑制作用。
[0100] 術語"可逆聚合抑制劑"可在本文與術語"可逆纖維蛋白聚合阻斷劑"互換使用。
[0101] "GPRP膚"意指SEQ ID N0:1中所列出的四個或更多個連續氨基酸序列的膚，明確 地說，序列Gly-Pro-Arg-Pro eGPRP膚可包含四聚體(GPRP，SEQ ID NO: 1)、它們的衍生物或 類似物。GPRP膚可為長度為4至12個氨基酸的殘基或長度為4至8，優選地4、5、6、7或8個氨基 酸。
[0102] 不受理論束縛，GPRP膚能夠與纖維蛋白單體結合，從而阻斷了纖維蛋白單體的締 合和聚合。GPRP膚可包括例如W引用方式并入的美國專利5，478，810和5，607，858中所公開 的GPRP膚酷胺(酷胺在C末端），具有式GPRP-X-N(RiR2 )，其中G為氨基酸甘氨酸，P為氨基酸心 脯氨酸，R為氨基酸心精氨酸，X為除脯氨酸之外的生蛋白氨基酸或為包括脯氨酸的二膚，N 為氮并且化和化相同或不同或為氨或具有至多4個碳原子的低級烷基鏈。其它GPRP膚包括美 國專利8,513,380中所公開的稱為"纖維蛋白鈕膚(fibrin knob peptide)"的膚，諸如具有 氨基酸序列GPRP(SEQ ID N0:1)、GPRV(沈Q ID N0:2)或GHRP(SEQ ID N0:3)的膚。GPRP膚可 具有氨基酸序列GPRPX(SEQ ID N0:32)、GPRVX(SEQ ID N0:33)、GPRPXX(SEQ ID N0:34)、 GPRVXX(SEQ ID N0:35)、GPRPXXX(沈Q ID N0:36)、GPRVXXX(SEQ ID N0:37)、GPRPXXXX(SEQ ID N0:38)或GPRVXXXX(SEQ ID N0:39)或GPRXXX(SEQ ID N0:40)，其中X為任何氨基酸。
[0103] 膚還可具有C末端氨基酸，諸如像半脫氨酸或賴氨酸，此類氨基酸允許與其它試劑 進行后續的化學反應W產生C末端綴合物。因此，在一些實施方案中，膚的C末端氨基酸為半 脫氨酸。因此，在一些實施方案中，膚的C末端氨基酸為賴氨酸。例如，GPRP可具有氨基酸序 列GPRPAAC(SEQ ID N0:25)、GPRPFPAC(SEQ ID N0:26)、GPRPPERC(SEQ ID N0:27)、
[0104] SEQ ID NOS: 1-42中所列出的任何膚序列可為膚酷胺，例如上文所參考的專利中 所公開的。
[0105]氨基酸和膚序列的常用縮寫如下在表A中所示。
[0酒]表A:常見氨基酸的縮寫、系統命名和化學式
[0107]
[0109]在一個實施方案中，使用氨基酸類似物序列，由此分離膚中的至少一個氨基酸被 類似物或生物類似氨基酸取代(保守取代），如本領域中已知的。氨基酸可W是L形式、D形式 或它們的衍生物(如，偽氨基酸、官能化的氨基酸(例如氣化的氨基酸……等）、β氨基酸、丫 氨基酸……等）。
[0110] 本領域的技術人員將認識到，本文所公開的膚可合成為膚的衍生物，包括"模擬 膚"。模擬膚或"擬膚"為在性質上不完全是膚，但是模擬在結構上所基于的膚的生物活性的 分子。此類擬膚包括含有非天然存在的氨基酸的膚樣分子。擬膚可包括一種或多種氨基酸 類似物或可為膚樣分子，含有例如酷胺鍵電子等排體諸如逆向-反轉修飾;還原酷胺鍵;亞 甲基硫酸或亞甲基亞諷鍵;亞甲基酸鍵;次乙基鍵;硫代酷胺鍵;反式締控或氣締控鍵；1，5- 而取代四挫環;酷亞胺鍵;酬亞甲基或氣代酬亞甲基鍵或另一酷胺電子等排體。術語還包括 包含一種或多種Ν取代的甘氨酸殘基Γ類膚"）和其它合成氨基酸或膚的分子。（對于膚的描 述參見例如，美國專利5,831,005; 5,877,278;和5,977,301;Nguyen等人（2000)Chem Biol.7(7) :463-473;和Simon等人（1992)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 89(20):9367-9371)。 本領域的技術人員理解，運些和其它擬膚都涵蓋在如本文所用的術語"擬膚"的含義內。
[0111] 膚的氨基酸序列根據常規表示法書寫，其中N末端的氨基基團(N此）出現在序列的 左邊，并且C末端的簇基基團（C00H)出現在序列的右邊。
[0112] 本文所公開的膚可通過常規的鹽形成反應形成生理上可接受的鹽。此類鹽可包括 與無機酸諸如鹽酸、硫酸和憐酸的鹽;與有機酸諸如乳酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸、草酸、蘋 果酸、巧樣酸、油酸和棟桐酸的鹽;與堿金屬和堿±金屬諸如鋼、鐘、巧和侶的氨氧化物和碳 酸鹽的鹽;和與胺諸如Ξ乙胺、節胺、二乙醇胺、叔下胺、二環己胺和精氨酸的鹽。
[0113] 鏈間和鏈內二硫鍵可形成，并且由此類二硫鍵的形成所得到的膚形式都由本發明 所涵蓋。
[0114] 在一個實施方案中，本文所公開的膚為化學合成的。在其它實施方案中，本文所公 開的膚通過原核或真核宿主細胞中重組DNA的表達來體內或體外產生。
[0115] 在一些實施方案中，GPRP膚可逆地結合纖維蛋白和纖維蛋白原鏈的C末端區域。應 當理解，優先的相互作用不必需要在特定氨基酸殘基和/或各膚的基序之間的相互作用。
[0116] 術語"基本上不含凝血酶"或"不含凝血酶的"設及組分或制劑具有不超過約1( 一） 個單位的凝血酶每毫升(ml)制劑。
[0117] 術語"有效量"是指本文所公開的組分或制劑形成封閉劑例如W覆蓋受傷表面、減 少出血、增加愈合、改善不期望的病狀等所需的量。
[0118] "藥學上可接受的"或"藥理學上可接受的"載體、溶劑、稀釋劑、賦形劑和媒介物一 般是指不與本文所公開的組分的活性成分反應的惰性、無毒的固體或液體填充劑、稀釋劑 或包封材料。可接受的賦形劑包括但不限于鹽水；乙酸或乙酸鹽;和氯化鋼離子;甘露糖醇； 白蛋白；或它們的組合。
[0119] 本文所公開的膚根據本領域中已知的方法合成，包括但不限于合成（例如從各個 氨基酸化學合成膚)和重組方法(例如合成編碼膚的DNA并且使用該DNA產生重組膚）。
[0120] 膚的化學合成：本文所公開的膚和編碼膚的DNA可通過本領域中已知的方法化學 合成。用于合成膚的合適方法由Stua;rt和Young( 1984)，"Solid化ase Peptide Synthesis ," Sol id Phase Peptide Synthesis ^Methods Enzymol.，第二片反，Pierce Qiemical Company，289，Academic Press，Inc.，NY( 1997)描述。例如，可使用固相合成方法 或液相合成方法。固相合成通常通過用適當的保護基保護氨基基團來進行。例如，可使用 Boc(叔下氧基幾基)或Fmoc(9-巧基甲氧基幾基)或它們的組合。在一個實施例中，本文所公 開的膚通過W下步驟合成：1)將對應于待產生的膚的C末端的氨基酸殘基通過氨基酸的a- C00H基團與不溶于反應溶劑的固相材料結合，或此類固相材料為購買的；2)在朝向膚的N末 端的方向上，在保護了除a-COOH基團之外的其它官能團諸如對應氨基酸或膚片段的a-氨基 基團之后，將對應的氨基酸或膚片段通過縮合與步驟1)的氨基酸結合;3)將形成膚鍵的氨 基基團的保護基諸如a-氨基基團從鍵合的氨基酸或膚片段除去;4)重復步驟2)和3) W伸長 膚鏈W形成對應于所期望的膚的膚鏈;5)使所產生的膚鏈從固相材料脫離并將保護基從所 保護的官能團除去；W及6)將膚純化，從而獲得所期望的膚。
[0121 ]固相材料W及溶劑和縮合劑均為本領域中熟知的。
[0122] DNA的化學合成和表達:編碼本文所公開的膚的DNA當在廣泛多種克隆和表達載體 中插入到廣泛多種宿主細胞中之后可被復制并用于表達重組膚。宿主可為原核的或真核 的。DNA可為化學合成的。用于合成DNA和克隆載體(例如用于哺乳動物、昆蟲、織物細胞、細 菌、隧菌體和酵母)的合適方法為可用的。可W融合蛋白的形式表達的重組膚通過本領域中 已知的方法進行純化。
[0123] 雖然下列實施例說明了本發明的某些實施方案，但它們不應被理解為限制本發明 的范圍，而應理解為有助于完善本發明的描述。
[0124] 實施例
[01巧]實施例1: GPRP膚濃度對纖維蛋白聚合時間的影響。
[0126] 為了評估膚的存在和它的濃度對纖維蛋白單體聚合速率的影響，培養GPRP膚:纖 維蛋白單體的混合物并且測量凝塊形成的時間。
[0127] 如下制備GPRP膚:纖維蛋白單體的混合物：
[0128] 將GPRP膚(Gly-Pro-Arg-Pro;由Sigma定制；膚呈凍干形式供應（250mg)并且溶解 于lOOmM的二水合巧樣酸^鋼中；pH = 7產生1M的GPRP)添加到纖維蛋白原溶液（如 EViaEL?纖維蛋白封閉劑中的BAC2溶液）中。溶液中膚最終濃度在W下表1中列出。所使 用的纖維蛋白原最終濃度為1 %、1.5%、3%、3.5%。將含有7 %可凝結纖維蛋白原的BAC2溶 液[EVICEL?的纖維蛋白原組分]溶解于2〇mM pH 7.0的乙酸鋼(化Acetate)緩沖液中W 獲得最終所列出的濃度。
[0129] 為了形成纖維蛋白，將凝血酶（巧IEVICEL/纖維蛋白封閉劑中）在lOIU/ml或 lOOIU/ml的最終濃度下添加到纖維蛋白原溶液中，然后記錄凝結時間。通過評價當將管倒 置時的流動估計凝結。
[0130] 表1提供每個纖維蛋白和膚最終濃度的凝結時間的概要。
[0131 ]將纖維蛋白單體濃度估計為等于纖維蛋白原濃度。
[0。。表1:凝結時間隨纖維蛋白和膚濃度的變化。
[0133]
[0134] 短期實驗的結果：
[0135] -般來講，當GPRP膚的濃度降低時，纖維蛋白單體W較快速率自發聚合。例如，在 1%的纖維蛋白和O.lmM的GPRP(約3.4:1摩爾比的6口1沁:纖維蛋白）下，纖維蛋白凝塊即刻形 成，在1%的纖維蛋白和ImM的GPRP(約34:1摩爾比）下，凝塊在小于5分鐘內形成。在1%的纖 維蛋白和5mM的GPRP(約170:1)下，溶液呈液體形式穩定4小時，并且在1 %的纖維蛋白和 lOmM的GPRP(約340:1)下，溶液呈液體形式穩定大約7-8天，但之后不聚合W形成固體。
[0136] 長期實驗的結果：
[0137] 在1.5 %的纖維蛋白濃度和20mM的GPRP(約453 :1)下，或在3.5 %的纖維蛋白和 40mM的GPRP(約389:1)下，溶液是穩定的但即使在室溫下2周之后仍不形成凝塊。
[0138] 運些實驗示出，340:1的摩爾比（GPRP:纖維蛋白）有利地導致液體溶液穩定約7-8 天。
[0139] 利用所使用的兩種凝血酶濃度觀察到了類似的結果。
[0140] 不受理論的束縛，此結果指出大部分或所有纖維蛋白原由凝血酶裂解，并且凝結 時間的差異與GPRP相對于纖維蛋白的濃度有關。
[0141] 聚合時間和GPRP:纖維蛋白摩爾比之間的關系還示出于圖1中。
[0142] 在此實驗中，使用固定的（3%)纖維蛋白濃度和遞增量的GPRP(0.1mM、0.2mM、 0.5111]\1、1111]\1、1.5111]\1、21111、3111]\1、4111]\1和51111)來延遲聚合。所有運些（具有至多57:1的比率)都低 于纖維蛋白單體的長期穩定所需的最小比率。如上文(通過將GPRP膚添加到纖維蛋白原溶 液中并且將凝血酶添加到GPRP:纖維蛋白原混合物中）制備GPRP:纖維蛋白溶液。接著，如上 記錄凝結時間。
[0143] 圖1示出在纖維蛋白聚合速率和GPRP膚與纖維蛋白的摩爾比之間存在對數相關 性。
[0144] 運指出，纖維蛋白凝塊形成速率可通過調整GPRP膚在溶液內的濃度來控制，W及 將GPRP膚稀釋至甚至很少量都將影響纖維蛋白聚合速率。
[0145] 此外，在一些實施方案中，所定義的相關性允許通過控制施用之后(例如通過小分 子交換裝置)最終GPRP膚濃度來控制聚合速率。
[01W 實施例2:使用小分子交換裝置從包含纖維蛋白和GPRP的溶液的纖維蛋白凝塊形 成。
[0147] W下實施例旨在示出，引發和/或加速纖維蛋白凝塊形成可通過使用小分子交換 裝置稀釋或除去溶液中的GPRP膚來實現。
[0148] 如上所述(通過將GPRP膚添加到3.8%的纖維蛋白原溶液中并且添加凝血酶W將 纖維蛋白原裂解成纖維蛋白）制備含有濃度為大約3.8%的纖維蛋白、濃度為41mM的GPRP膚 的GPRP膚的混合物(摩爾比為約366:1)。發現此摩爾比足W維持制劑穩定。
[0149] 根據與裝置一起提供的標準旋轉協議使用小分子交換裝置(GE PD-10旋轉柱;產 品代碼：17-0851-01，GE Healthcare) W除去/稀釋GPRP:纖維蛋白單體制劑中的GPRP膚。將 交換裝置用包括20mM的乙酸鋼pH 7.0; 25mM的氯化巧的緩沖液預平衡。使2.5ml的溶液經受 緩沖液交換程序，并且通過將含有緩沖液交換的混合物的管倒置來評價纖維蛋白凝塊形 成。
[0150] 小分子交換的制劑快速凝結（圖2B)，然而未經受緩沖液交換程序的溶液保持液體 形式（圖2A)。
[0151] 雖然本文已描述了各種實施方案，但是可W對那些實施方案實施多種修改和變 型。另外，凡是公開了用于某些組分的材料的，均可使用其它材料。上述【具體實施方式】和下 述權利要求旨在涵蓋所有運樣的修改和變型。
[0152] W引用方式全文或部分地并入本文的任何專利、公布或其它公開材料均僅在所并 入的材料不與本公開所述的現有定義、陳述或其它公開材料相沖突的范圍內并入本文。因 此，并且在必要的程度下，本文明確闡述的公開內容取代W引用方式并入本文的任何沖突 材料。
[0153] 本申請中的任何參考文獻的引用或鑒定不應解釋為承認此類參考文獻可用作本 發明的現有技術。
[0154] 節段標題在本文用于易于理解說明書并且不應理解為必要限制性的。
【主權項】
1. 一種液體封閉劑制劑，所述液體封閉劑制劑包含濃度為1%至13%(w/v)的纖維蛋白單 體和GPRP肽或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑;其中所述阻斷劑或GPRP以相對于所述纖維蛋 白單體摩爾過量超過100倍的量存在于所述制劑中；并且其中所述液體制劑在選自由以下 項組成的組的環境溫度下穩定至少14天:約20°C、21°C、22°C、23°C、24°C和25°C。2. 根據權利要求1所述的制劑，其中所述GPRP肽以相對于所述纖維蛋白單體摩爾過量 超過約340倍的量存在。3. 根據權利要求1所述的制劑，其中所述GPRP肽以相對于所述纖維蛋白單體摩爾過量 約340至460倍的量存在。4. 根據權利要求1至3中任一項所述的制劑，其中所述制劑基本上不含添加的凝血酶。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的制劑，所述制劑還包含凝血酶活化的因子XIII。6. 根據權利要求1至4中任一項所述的制劑，所述制劑還包含鈣螯合劑。7. 根據權利要求6所述的制劑，其中所述鈣螯合劑為檸檬酸根離子。8. 根據權利要求7所述的制劑，其中所述檸檬酸根離子由檸檬酸鈉提供。9. 根據權利要求8所述的制劑，所述制劑包含約ImM至約50mM的檸檬酸鈉。10. 根據權利要求1至9中任一項所述的制劑，其中所述制劑具有中性pH。11. 根據權利要求1至10中任一項所述的制劑，所述制劑用于止血、封閉、愈合和/或外 科。12. -種容器，所述容器包含權利要求1至10中任一項所述的制劑。13. -種試劑盒，所述試劑盒包含權利要求12所述的容器和任選地使用說明。14. 一種用于在表面制備封閉劑的方法，所述方法包括:提供權利要求1至10中任一項 所述的制劑；以及在促進纖維蛋白在所述表面聚合的條件下將所述制劑施用到所述表面。15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述條件包括除去、阻斷、中和和/或稀釋所述 GPRP 肽。16. -種制造液體封閉劑制劑的方法，所述液體封閉劑制劑包含濃度為1 %至13%( w/v ) 的纖維蛋白單體和GPRP肽或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑;其中所述阻斷劑以相對于所述 纖維蛋白單體摩爾過量超過約100倍的量存在于所述制劑中；并且其中所述液體制劑在選 自由以下項組成的組的環境溫度下穩定至少14天:約20°C、21°C、22°C、23°C、24°C^P25°C， 所述方法包括以下步驟： a) 提供包含纖維蛋白單體的組分； b) 提供GPRP肽或其它可逆纖維蛋白聚合阻斷劑、它們的衍生物或鹽；以及 c) 摻和a)和b)以便獲得所述液體封閉劑制劑。17. 根據權利要求16所述的方法，其中所提供的纖維蛋白單體通過在允許纖維蛋白原 裂解的條件下使水性纖維蛋白原溶液與凝血酶或凝血酶樣酶接觸來獲得。18. 根據權利要求16或17所述的方法，其中所述纖維蛋白單體組分包含凝血酶活化的 因子XIII。19. 根據權利要求16或17所述的方法，其中所述纖維蛋白單體組分包含鈣螯合劑。20. -種制劑，所述制劑能夠根據權利要求16至19中任一項所述的方法獲得。21. -種在有需要的受治療者中愈合、封閉和/或減少失血的方法，所述方法包括向所 述受治療者施用有效量的根據權利要求1至10或權利要求20中任一項所述的制劑。22. -種液體封閉劑制劑，所述液體封閉劑制劑包含濃度為1%至13%(w/v )的纖維蛋白 單體和GPRP肽;其中GPRP以相對于所述纖維蛋白單體摩爾過量超過340倍的量存在于所述 制劑中；并且其中所述液體制劑在選自由以下項組成的組的環境溫度下穩定至少14天:約 20。(：、21。(：、22。(：、23。(：、24。(：和25。(：。
【文檔編號】A61L24/10GK105899242SQ201480071021
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月4日
【發明人】Y.皮爾佩, A.迪安格里斯, Y.澤德夫, S.多龍, I.努爾
【申請人】奧姆里克斯生物藥品有限公司, 伊西康公司