用于治療和預防良性前列腺增生的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于治療和預防良性前列腺增生的組合物，以及使用該組合物治療和預防良性前列腺增生的方法。更具體地，本發明涉及一種用于有效治療和預防良性前列腺增生的包含來源于端粒酶的肽的組合物和使用該組合物治療和預防良性前列腺增生的方法。所述組合物包含根據本發明的肽，其在治療和預防良性前列腺增生方面表現出卓越的有效性。
【專利說明】
用于治療和預防良性前列腺増生的組合物
技術領域
[0001] 本發明設及一種用于治療和預防良性前列腺增生的組合物。更具體地，本發明設 及一種包含來源于端粒酶的膚的組合物并且所述組合物用于治療和預防良性前列腺增生。
【背景技術】
[0002] 良性前列腺增生(BPH)是男性老年性疾病中最常見的疾病，其伴有下尿路癥狀。相 關的癥狀從40歲開始出現，但大部分臨床癥狀在50多歲后期出現。由于生活質量的下降， BK1可引起性功能障礙，對于的治療及手術可影響性功能。
[0003] 導致增生的BPH依賴于雄性激素。特別是雄性激素對前列腺的正常細胞增殖和正 常調亡的抑制是必需的。最眾所周知的內因是衰老。前列腺由于衰老和正常睪丸功能而變 大。作為前列腺依賴的雄性激素，睪酬在前列腺的生長和分化中發揮重要的作用，并且通過 5α-還原酶代謝產生二氨睪酬(DHT)，其在前列腺生長和前列腺基因的表達中發揮重要作 用。
[0004] 作為引起前列腺增長的外因，有雄性激素、雌激素、糖皮質激素和與內分泌酶有關 的物質，其通過飲食和環境誘導。運些外因的生理學效應經由多種生長因子膚出現。
[0005] ΒΡΗ發生在20多歲早期到40多歲晚期，其由組織學變化引起，此時，雄性激素和雌 激素協同作用引起ΒΡΗ。隨著年齡增長，雌激素/DHT比例增加，然后ΒΡ出曽加。
[0006] 同時，眾所周知，前列腺生長直至20多歲早期，并且保持其大小直到50歲，其依賴 于使前列腺保持其平衡的非常復雜的相互作用，如內源生長因子、信號通路、細胞周期調 節、細胞分裂和調亡。如果細胞周期調節因子發生轉變，ΒΡΗ可能被誘發。
[0007] 遺傳因素是影響ΒΡΗ的一個主要因素。據報道，具有ΒΡΗ家族史的患者顯示超過 60%的ΒΡΗ增加，同時也報道5α-還原酶抑制劑的治療在具有ΒΡΗ家族史的患者是不太有效 的。其原因在于，在運種情況下，ΒΡΗ依賴于非雄激素依賴性途徑。
[000引對于治療ΒΡΗ，可W使用手術和藥物治療。對于藥物治療，藥物施用根據患者的年 齡和臨床進程而調節。最近，大量的ΒΡΗ患者在韓國和全球范圍內顯著增加并且年輕患者的 患病率也在增加。大量的藥物被用于治療但是它們的使用因為副作用而受到限制。
[0009] 舒必利（sulpiride)是2型多己胺受體括抗劑，其常用作治療抑郁癥的藥物。多己 胺是一種腎上腺素和去甲腎上腺素合成過程中產生的中間產物，是一種抑制性神經遞質。 舒必利抑制多己胺與其受體結合，運抑制作為多己胺能作用的催乳素分泌，并且提高血液 內催乳素的濃度。通過舒必利的連續施用而增加的催乳素會引起高催乳素血癥。
[0010] 據報道催乳素與前列腺的增生、前列腺癌和BPH的發展及調節有關。同時已知催乳 素與雄激素協同提高前列腺的增殖。作為另一個機制，也已知催乳素作為應激激素提高5α- 還原酶的表達并且誘發前列腺的增生。催乳素是一種非醬體類因子，其與前列腺的增生和 ΒΡΗ的誘發有關。隨著年齡的增長，催乳素增加而睪酬水平下降。據報道催乳素在老年人中 誘發ΒΡΗ。對于大鼠和人類，報道催乳素與前列腺的增生和分化有關。根據此報道，認為催乳 素通過信號傳導通路由受體所誘導。
[0011]現有技術文件 [0012]專利文件
[0013] KR 2011-0062943 A
[0014] KR 2011-0057049 A
[001 引 EP 1020190 A3
[0016] 非專利文件
[0017] MCC0N肥化，John D.，等"The effect of finasteride on the risk of acute urinary retention and the need for surgical treatment among men with benign prostatic hyperplasia"，New England Journal of Medicine，1998,338卷，第9其月，557- 563 頁。
[001引發明詳述 [0019] 技術問題
[0020] 于是，本發明人嘗試開發一種用于治療和預防的組合物，其具有最小的副作用 和優異的治療效果，并且完成了本發明。
[0021] 本發明的發明人已經發現了來源于端粒酶的膚用于治療和預防BPH可W具有卓越 的效果并且完成了本發明。
[0022] 本發明的目的是提供一種在治療和預防BPH方面有效的組合物。
[00剖技術方案
[0024] 為了解決上述技術問題，根據本發明，提供一種用于治療和預防BPH的包括膚或膚 的片段的組合物，所述膚或膚的片段包含SEQ ID N0:1的序列下為"PEPr、"GV10〇r或 %r)或與沈Q ID NO: 1具有80% W上同源性的序列。
[0025] 在根據本發明的用于治療和預防BPH的組合物中，所述片段可包含3個W上的氨基 酸。
[0026] 在根據本發明的用于治療和預防BPH的組合物中，所包含的膚的濃度可為O.Olmg 至 Img，優選0.56mg (4nmo 1 膚/kg體重）。
[0027] 在根據本發明的用于治療和預防BP哺勺組合物中，所述組合物可W是藥物組合物。 [00%]在根據本發明的用于治療和預防BP哺勺組合物中，所述組合物可W是食物組合物。
[0029] 根據本發明的另一個實施方式，提供通過給需要的受試者施用治療和預防BPH的 組合物來治療和預防BPH的方法。
[0030] 在根據本發明用于治療和預防BP哺勺方法中，所述組合物的施用可一周進行3次。
[0031] 發明效果
[0032] 根據本發明的組合物，包含具有SEQ ID NO: 1的序列的膚或者具有與SEQ ID NO: 1 具有80% W上同源性的序列的膚對于治療和預防WH具有卓越的效果和較少的副作用。
[0033] 附圖描述
[0034] 圖1示出移除祀標器官W測量其重量的過程的照片。
[0035] 圖2示出在驗證陽P1對BPH的治療作用的實驗中的電泳照片，通過使用RT-PCR，其 顯示每個實驗組的腹側前列腺中對5α-還原酶表達的影響的結果。
[0036] 圖3示出在驗證ΡΕΡ1對ΒΡΗ的治療作用的實驗中的顯示在每個實驗組中測量的精 囊重量的結果的圖。
[0037]圖4示出在驗證PEPl對ΒΡΗ的治療作用的實驗中的顯示在每個實驗組中測量的前 列腺重量的結果的圖。
[003引圖5示出顯示在ΒΡΗ誘發動物模型的基質細胞系(WPMY-1)中用ΡΕΡ1處理后細胞增 殖量的圖。
[0039] 圖6示出顯示在ΒΡΗ誘發動物模型的上皮細胞系（RWPE-1)中用ΡΕΡ1處理后細胞增 殖量的圖。
[0040] 圖7示出顯示在ΒΡΗ誘發動物模型的基質細胞系(WPMY-1)中通過使用ΡΕΡ1-門TC (異硫氯酸巧光素)綴合物測量ΡΕΡ1對雄激素受體的結合能力的圖。
[0041 ] 圖8示出顯示在ΒΡΗ誘發動物模型的表皮細胞系（RWPE-1)中通過使用ΡΕΡ1-門TC (異硫氯酸巧光素)綴合物測量ΡΕΡ1對雄激素受體的結合能力的圖。
[0042] 圖9示出顯示ΡΕΡ1對PCNA(增殖細胞核抗原讀達巧在ΒΡΗ誘發模型中增加)影響 的電泳照片。
[0043] 圖10示出一幅顯示陽Ρ1對Ki67(MK67)表達影響的免疫染色照片，所述Ki67表達在 BPH被誘發時在BP出秀發模型中增加。
[0044] 圖11示出在BPH動物模型的實驗中通過H&E染色方法顯示出陽P1對BPH組織相關細 胞的影響的結果的照片。
[0045] 圖12示出在BPH動物模型的實驗中通過MassonS色染色方法顯示出PEP1對BPH組 織相關細胞的影響的結果的照片。
[0046] 圖13示出顯示在測定PEP1在BPH動物模型中的影響的實驗中所述動物體重的變化 的圖。
[0047] 圖14示出顯示在測定PEP1在BPH動物模型中的影響的實驗中所述動物模型的前列 腺重量的變化的圖。
[0048] 圖15示出顯示在測定PEP1在BPH動物模型中的影響的實驗中所述動物的精囊重量 的變化的圖。
[0049] 發明的最佳實施方式
[0050] 因為本發明可適用于多種應用領域和進行多種變化，接下來對本發明進行更詳細 的描述。然而，運并不意味著限定了實際應用的形式;應該理解，主旨在于包括所有的變化 形式、等同形式或替代形式中的概念和技術程度。在本發明的描述中，如果任何關于現有技 術的詳細描述被認為會破壞本發明的基本原則，則忽略該描述。
[0051] 端粒已知是在染色體末端發現的遺傳物質的重復序列，其防止染色體損傷或合并 到其它的染色體。端粒的長度在每次細胞分裂時縮短，并且在一定次數的細胞分裂后，端粒 長度極度縮短W致細胞停止分裂并且死亡。另一方面，已知端粒的延長會延長細胞壽命。例 如，癌細胞制造一種稱為端粒酶的酶，其阻止端粒的縮短，因此導致癌細胞的繁殖。本發明 的發明人鑒定出一種來源于端粒酶的膚，其有效治療和預防BPH并且完成了本發明。
[0052] 在本發明的一個實施方式中，SEQ ID NO: 1氨基酸序列的膚、上述膚的膚片段或具 有與上述膚的氨基酸序列的80% W上序列同源性的膚包括端粒酶，特別是來源于人類的端 粒酶。本文公開的膚可包括包含與沈Q ID NO: 1的膚具有至少80%、至少85%、至少90%、至 少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同源性的氨基酸序列的膚或其片 段。另外，本發明公開的膚可包括與SEQ ID N0:1或其片段在至少1個氨基酸、至少2個氨基 酸、至少3個氨基酸、至少4個氨基酸、至少5個轉化氨基酸、至少6個轉化氨基酸或至少7個氨 基酸上存在差異的膚。
[0053] 在本發明的一個實施方式中，氨基酸的變化包括膚的物理和化學性質的修飾。例 如，可W進行氨基酸修飾W提高膚的熱穩定性，改變底物特異性，及改變最優pH。
[0054] 本文中的術語"氨基酸"不僅包括天然組成膚的22種標準氨基酸，也可W是D-異構 體和修飾的氨基酸。因此，在本發明的具體的實施方式中，此處的膚包括具有D型氨基酸的 膚。另一方面，膚可包括非標準氨基酸，諸如那些被翻譯后修飾的氨基酸。翻譯后修飾的實 例包括憐酸化、糖基化、酷基化(包括乙酷化、豆違酷化、棟桐酷化）、烷基化、簇基化、徑基 化、糖化、生物素化、泛素化、化學性質的修飾(例如β-消除脫酷胺化、脫酷胺化)和結構修飾 (例如二硫鍵的形成）。同時，氨基酸的變化包括由于在用于形成膚綴合物的采用交聯劑的 結合過程中的化學反應而發生的氨基酸變化，如氨基、簇基和側鏈的變化。
[0055] 本文公開的膚可為從天然來源被鑒定和分離出的野生型膚。另一方面，當與SEQ ID NO: 1或其片段比較時，本文公開的膚可W為人工變體，其包含一個或多個氨基酸取代、 刪除和/或插入。野生型多膚(不僅人工變體)的氨基酸變換包括不會顯著影響活性的蛋白 的折疊和/或氨基酸的保守取代。保守取代的實例可在W下的組內：堿性氨基酸(精氨酸、賴 氨酸和組氨酸）、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸(谷氨酷胺和天冬酷胺）、疏 水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、鄉氨酸和甲硫氨酸）、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪 氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸）。通常不改變特定活性的氨基酸取代 是本領域已知的。最常發生的變換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/ Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、 Ala/Glu和Asp/Gly，及其反向變換。保守取代的其它實例顯示在下表1中：
[0化6][表1]
[0化7]
[0058]通過在下述功效中選擇進行顯著不同的取代來進行膚的生物性質的顯著轉化： (a)在取代區域保持多膚骨架的結構(如片狀或螺旋狀的Ξ維結構）的功效，（b)在祀標區域 保持分子的電荷或疏水性的功效，或(C)保持側鏈的體積的功效。天然殘基通過一般側鏈性 質分為W下幾組：
[0化9] (1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile;
[0060] (2)中性親水性：cys，se;r，t虹；
[0061] (3)酸性:曰39，邑111;
[0062] (4)堿性：日311，邑1]1，1113，173，日1'邑；
[0063] (5)影響鏈取向的殘基:gly，p;ro;及
[0064] (6)芳香族：t;rp，ty;r，phe。
[0065] 非保守取代可W通過將上述類組的成員交換為不同類組的成員來進行。與保持合 適的膚Ξ維結構無關的任何半脫氨酸殘基通常可W被取代為絲氨酸，W此增加分子的氧化 穩定性和避免不合適的交聯。相反，可W通過對膚添加半脫氨酸鍵獲得穩定性的提高。
[0066] 另一種類型的膚的氨基酸變體為那些具有改變的膚糖基化模式的膚。本文的術語 "改變"意味著刪除在膚中存在的至少一個糖殘基和/或添加至少一個在膚中不存在的糖基 化殘基。
[0067] 膚的糖基化通常為N連接或者0連接。本文的術語"N連接"指糖殘基與天冬酷胺殘 基的側鏈相連。作為Ξ膚序列，天冬酷胺-X-絲氨酸和天冬酷胺-X-蘇氨酸(其中X為除了脯 氨酸的任何氨基酸)為用于W酶促方式將糖殘基連接至天冬酷胺側鏈的識別序列。因此，在 多膚中存在運樣的Ξ膚序列中之一時，創立了潛在的糖基化位點。"0連接糖基化"意味著將 作為糖的N-乙酷半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一個連接至徑基氨基酸。所述徑基氨基酸最 典型為絲氨酸或蘇氨酸，但也可W使用5-徑基脯氨酸或5-徑基賴氨酸。
[0068] 通過改變氨基酸序列W包含上述的Ξ膚序列（對N連接糖基化位點而言），可方便 地添加多膚的糖基化位點。所述變化可W通過將來自絲氨酸或蘇氨酸的至少一個殘基添加 至第一抗體序列或通過用運些殘基進行取代來進行(對0連接糖基化位點而言）。
[0069] 同時，根據本發明包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的膚、包含與上述序列具有大于 80%同源性的氨基酸序列的膚、或上述膚的片段在有生命物質中具有低毒性和高穩定性的 優勢。本文使用的SEQ ID No: 1是源自端粒酶的由16個氨基酸組成的膚。
[0070] 沈Q ID N0:1EARPALLTSRLRFIPK
[0071] 在本發明的一個實施方式中，提供用于治療和預防ΒΡΗ的組合物，其包含含有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的膚、包含具有與上述序列大于80%同源性的氨基酸序列的膚、或上 述膚的片段。
[0072] 在本發明的一個實施方式中，所述組合物可具有包含人、狗、雞、豬、牛、綿羊、豚鼠 和猴的所有動物的應用。
[0073] 在本發明的一個實施方式中，提供用于治療和預防WH的藥物組合物，其包含含有 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的膚、包含具有與上述序列大于80%同源性的氨基酸序列的膚、 或上述膚的片段。在根據本發明的一個實施方式的藥物組合物，其可通過口服、直腸、經皮、 靜脈內、肌內、腹膜內、骨髓內、硬膜外或皮下途徑施用。
[0074] 口服施用的形式可W為但不限于：片劑、丸劑、軟膠囊或硬膠囊、顆粒、粉末、溶液 或乳液。非口服施用的形式可W為但不限于:注射劑、滴劑、洗劑、軟膏、凝膠、乳膏、懸浮液、 乳劑、栓劑、貼劑或噴霧。
[0075] 在本發明的一個實施方式中，在必要時，所述藥物組合物可包含添加劑，如稀釋 劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、分散劑、表面活性劑、著色劑、芳香劑或甜味 劑。在本發明的一個實施方式中，所述藥物組合物可通過本領域的傳統工業方法制造。
[0076] 在本發明的一個實施方式中，所述藥物組合物的活性成分的劑量可根據患者的年 齡、性別、體重、病理學和狀態、施用路徑或處方者的判斷而改變。根據所述因素的劑量可在 本領域技術人員的水平內確定，且每日劑量例如可為但不限于：0.0 lyg/kg/天至lOg/kg/ 天，特別是0.化g/kg/天至Img/kg/天，更特別是化g/kg/天至0.1 g/kg/天，更特別是化g/kg/ 天至lOmg/kg/天，優選是化g/kg/天至Img/kg/天，優選是0.005mg/kg/天至0.05mg/kg/天， 最優選是O.Olmg/kg/天，但是如果根據施用劑量的效果不同其可W進行調整。對于成人，優 選施用劑量是0.1 mg至Img，優選是0.4mg至0.6mg，特別是最優選的劑量是0.56mg。
[0077] 在本發明的一個實施方式中，所述藥物組合物可W但不限于每天施用1至3次。
[0078] 在本發明的一個實施方式中，所述組合物可包含O.Olg/L至Ikg/L、特別是O.lg/L 至lOOg/L、更特別是Ig/L至lOg/L的膚，所述膚包含SEQ ID N0:1、包含具有與上述序列至少 80%同源性的氨基酸序列的膚、或上述序列的片段中的至少一種的氨基酸序列。當所述膚 的含量在上述范圍內時，組合物的安全性和穩定性均可被滿足，且所述范圍在成本效益方 面是合適的。
[0079] 在本發明的一個實施方式中，提供用于治療和預防的食物組合物，其包含含有 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的膚、包含具有與上述序列大于80%同源性的氨基酸序列的膚、 或上述膚的片段。
[0080] 在本發明的一個實施方式中，食物組合物不限于特別形式，但是例如可為片劑、顆 粒、粉末、液體和固體形式。除活性成分外，每種形式可通過本領域技術人員選擇合適的工 業常用成分形成，并可與其它成分組合產生協同效應。
[0081] 本文使用的術語旨在用于描述實施方式，但不限制本發明。在術語前面沒有數字 并非限制數量，而是表明可W使用多于一個該術語的事物。術語"包含"、"具有"、"包括"、 "含有"應該理解為開放式（即"包括但不限于"）。
[0082] 數值作為范圍被提及的原因僅是因為W范圍描述比個體的數字來描述方便。除非 另外提出，每個個體的數值可被理解為分別描述并被整合到說明書中。所有范圍的闊值都 包括在內并且可W獨立地組合。
[0083] 除非另外提出或語境中明顯矛盾，本文提出的所有方法均W適當的順序進行。除 非其被包含在權利要求中，使用"任何一個實施方式"和"所有實施方式"或者示例性語言 (例如，"諸如"、"如"）是用來更清楚地描述本發明，而不是限制本發明的范圍。本文中除了 權利要求W外的任何語言均不應該被解釋為本發明的必要條件。除非另外限定，此處使用 的科技術語具有本發明所屬領域的技術人員通常理解的意義。
[0084] 本發明優選的實施方式包括發明人所知的本發明的最佳實施方式。優選實施方式 的變化形式在本領域技術人員閱讀上述說明后可變得顯而易見。本發明發明人希望本領域 技術人員可W充分利用所述變化形式，并且本發明可除了本文所列出W外的其它方式 進行實施。因此，本發明在專利法允許的情況下包括權利要求中所陳述的本發明的關鍵點 的等同形式、修改形式和變化形式。另外，在上述成分的任何組合內的所有可能的變化形式 都包括在本發明之內，除非另有明確聲明或與上下文相惇。雖然已通過示例性實施方式描 述并展示了本發明，本領域技術人員可W清楚知曉，在不脫離本發明的主旨和后文權利要 求所限定的范圍的情況下，可W進行形式和細節方面的各種變化。
[0085] 用于建立本發明的實施方式
[0086] 在下文中，將通過實施例和測試例詳細描述本公開。但是，下列的實施例和測試例 僅W說明為目的，并且對于領域普通技術人員顯而易見，本公開的范圍不受所述實施例和 測試例所限制。
[0087] 實施例1.膚的合成
[008引SEQ ID N0:1的膚根據固相膚合成的傳統已知方法合成。更具體地，利用ASP48S (Peptronjnc.，Daejeon R0K)，通過Fmoc固相膚合成（SPPS)從C端偶聯每個氨基酸來合成 所述膚。如下使用其第一個氨基酸在C端連接到樹脂的那些膚：
[0089] N肥-Lys(Boc)-2-氯Ξ苯甲基樹脂
[0090] N肥-Ala-2-氯Ξ苯甲基樹脂
[0091] N肥-4巧。6門-2-氯^苯甲基樹脂
[0092] 用W合成膚的所有氨基酸在N端通過化OC保護，所述氨基酸殘基通過能溶解在酸 中的化t、Boc、t-Bu(t-下醋）、饑f(2,2,4,6,7-五甲基二氨苯并巧喃-5-橫酷基)保護。實例 包括W下：
[0093] 化〇(；-41日-0山尸1]1〇(3-4巧。6;1^ )-OH、Fmoc-Glu(0tBu)-OH、Fmoc-P;r〇-OH、Fmoc-Leu- OH、F'moc-Gln(T;rt)-〇H、F'moc-T;rp(Boc)-〇H、F'moc-Met-〇H、F'moc-Asn(T;rt)-〇H、F'moc-Tyr (1:Bu) -OH、Fmoc-Ahx-〇H、Tr t-琉基乙酸。
[0094] 作為偶聯試劑，使用了皿TU[2-( IH-苯并Ξ挫-1-基)-1，1，3，3-四甲基脈六氣憐酸 醋]/冊Bt [ N-徑基苯并Ξ挫]/NMM[ 4-甲基嗎嘟]。使用在20 % DMF中的贓晚溶液W移除Fmoc。 為了從殘基上移除保護基或者將合成的膚從樹脂上分離，使用了切割混合物[TFA(S氣乙 酸)/115(^異丙基硅烷)/出0 = 92.5/2.5/2.5]。
[0095] 膚的合成通過使用固相支架進行并重復下面過程氨基酸保護起始，每個氨基 酸的分離反應，用溶劑沖洗和脫保護。每個膚的合成通過使用固相支架W結合至具有氨基 酸保護基的起始氨基酸，分別使對應的氨基酸反應，用溶劑沖洗和脫保護，并重復此過程。 在從樹脂釋放之后，合成的膚通過HPLC純化，通過質譜驗證，凍干，通過MS來驗證合成，然后 凍干。
[0096] 通過高效液相色譜法發現制備的膚的純度在95%或更高。
[0097] 陽P 1的具體合成過程可W如下：
[009引1)偶聯
[0099] 用N出-Lys(Boc)-2-氯Ξ苯甲基樹脂保護的氨基酸(8當量)與融化于DMF中的偶聯 試劑皿TU(8當量)/冊化(8當量)/NMM(16當量)一起混合，并在室溫(RT)溫育2小時。溫育后， 反應混合物依次用DMF、MeOH和DM巧中洗。
[0100] 2)Fmoc 去保護
[0101] 添加在20%DMF中的贓晚溶液并在RT溫育5分鐘，進行2次，然后依次用DMF、MeOH和 DM巧中洗。
[0102] 3)通過重復上述的反應1)和2)來制造膚的基本框架，N此斗(0*811)-4-1?。6門斗- AAA-T (tBu) -S UBu) -R (Pbf 化-R (Pbf) -F-I-P-K (Boc) -2-氯Ξ苯甲基樹脂。
[0103] 4)切割：向完成合成的膚添加切割混合物，W此從樹脂上切下膚。
[0104] 5)將預冷的乙酸添加至獲得的混合物中，然后離屯、W使收集的膚沉淀。
[0105] 6)在通過Prep-HPLC純化后，通過LC/MS確認分子量，并且凍干W制造成粉末形式。
[0106] 實施例2.通過使用BPH誘發動物模型的實驗驗證陽P1對BPH的作用
[0107] 制備BP出秀發動物模型
[0108] 1)作為雄激素，睪酬是最常使用的體內激素。但是與前列腺發育相關的雄激素中 最有效的激素是5α-二氨睪酬（DHT)，其通過結合睪酬和5α-還原酶產生。在大鼠中，當W 40mg/kg濃度施用舒必利30天，其在體內抑制2型多己胺受體增加催乳素的濃度并且誘發高 催乳素血癥W激活5α-還原酶，并且其通過與睪酬反應表現出協同效應。據報道，通過高催 乳素血癥產生的DHT在前列腺的側葉比背葉或腹葉產生更多的重量增加。基于運個事實，僅 使用根據實施例1的ΡΕΡ1或與其它的測試材料共同施用給ΒΡ出秀發動物模型的實驗如下進 行。成熟Sprague-Dawley雄性大鼠（6周齡)購自Jae-il實驗動物中屯、并且撫養一周（7周齡， 49天）用于純化，然后用于實驗。為了誘發BPH，每天一次口服施用舒必利(40mg/kg)30天。每 次實驗都跟蹤在在先實驗的結果(Van Coppenolle等，2001)。每只動物每日早10點開始施 用測試材料。在施用測試材料后，每天觀察每只動物的一般狀態和特殊癥狀。同時施用測試 材料前，測量并記錄每只動物的體重。
[0109] 2)施用的測試材料和劑量
[0110] 作為測試材料的舒必利購自Sigma化emical仿.（5*丄〇1113，10，美國）并且用于 實驗。本發明人通過每日一次連續腹膜內注射施用舒必利(40mg/kg)60天W通過高催乳素 血癥誘發BPH。每次施用所述測試材料前，舒必利首先溶解在0.1N HC1溶液中，然后通過使 用0.1N化0田容液中和至抑7.0。對于聯合施用組，在施用舒必利后通過腹膜內注射施用根 據實施例1的PEP1和非那司提。陽？1(0.01111旨/1^，0.1111旨/1^，1111旨/1^和10111旨/1^)在使用前新 鮮配置，并且通過皮下注射施用。非那司提通過使用15%乙醇/玉米油（v/v)作為載體每天 制備。施用的劑量基于〇.5ml/kg的濃度計算，反應每天測量的體重。均遵循下表2完成對于7 組的施用W驗證陽P1對BPH的作用。
[0111] [表 2]
[0112]
[0113] (i.p =腹膜內，s.c =皮下）
[0114] 1)對于BP出秀發模型，在施用PEPl和測試材料的實驗之后，收集動物器官，保存所 述器官并測量其重量
[0115] 在施用所述測試材料60天的24小時后，所有動物通過乙酸麻醉，然后從腹主動脈 收集的血液分離為血清。分離的血清在-80°C保存W分析激素。
[0116] 對于所有動物，在測試包皮分離(PPS)的出口后，將諸如陰莖頭型(Gp)、精囊和凝 固腺（SV)、腹側前列腺（VP)、尿道球腺（CpG)、肛提肌和球海綿體肌（levator aniplus bu化ocavernosus muscle，LABC)的附屬生殖腺從動物體依次分離。分離的詳細過程遵循 OECD規程。
[0117] 如圖1中提及，對于分離Gp，通過使用綴子錯住Gp部分并且剪下包皮分離線。如圖1 中提及，對于肺，在從腹部肌層分離膀脫后，暴露被脂質層覆蓋的肺左側和右側小葉，暴露 膀脫至SV，通過使用綴子從肺左側和右側小葉分離脂質，通過使用微綴撥離，從尿道剪下肺 左側小葉，通過使用手術錯，在從尿道暴露后剪下肺右側小葉。如圖1中提及，對于包含凝固 腺的SV，在SV下準備紙毛巾W給肌肉、脂質層和腺體分類。通過使用夾子固定包含與尿道相 連的曲細精管的SV的底部，W防止在精囊移除過程中的滲漏。在移除脂質后，清理相關的附 屬器官，移除所述夾子并將精囊放置在盤上W測量其重量。
[011引2)在BP出秀發動物測試模型中，施用陽P1對5α-還原酶表達的影響
[0119] 在施用舒必利和測試材料60天并且收集腹側前列腺后，通過RT-PCR測定其對5α- 還原酶表達的影響。具體地，總RNA從腹側前列腺(25mg)分離，并且通過添加 DEPC處理的水 重懸。其后通過使用分光光度計對RNA進行定量。通過使用Torres和化tega(2004)的方法合 成第一鏈 cDNAePCR 程序為:94°C 變性(30sec)，55°C 退火(30sec)，72°C 延伸（30sec)，進行 30 至35個循環。使用對照GAPDH，在電泳中定量，其表達水平不會因為使用其它藥物而改變。作 為結果，通過施用舒必利，5α-還原酶水平的增加在PEP1施用組中W劑量依賴方式被抑制， 并且在高劑量陽Ρ1施用組(GVlOaOmg陽Ρ1施用組）中所述抑制作用高于非那司提施用組 (參見圖2)。因此PEP1可W提供劑量依賴性的治療并且通過抑制5α-還原酶提高其對BPH的 作用。
[0120] 3)陽Ρ1施用對ΒΡ出秀發測試動物模型器官的影響
[0121] 在下表3中，報道了膚PEPl在每組實驗中影響精囊的重量、前列腺重量和前列腺指 數。表3中描述的前列腺指數通過使用公式"體重/最終前列腺重量"計算。
[0122] [表 3]
[0123]
[0124] 表3中描述的結果轉化成圖片，即，在BP出秀發動物模型中，在施用PEP1和非那司提 (5mg/kg)并隨后施用舒必利后，觀察精囊的測量結果，圖片顯示在高劑量PEP1施用（lOmg/ kg)情況下，精囊重量顯著減少(參見圖3)。同時，在BP出秀發動物模型中，在舒必利和PEP1共 施用的情況下，顯示出前列腺重量的顯著減少(參見圖4)。如果P值小于0.05,表示其為顯著 性結果。
[0125] 因此，通過實施例2的結果，通過施用PEP1至舒必利誘發的BPH動物模型可劑 量依賴方式有效地減少5α-還原酶的表達、減少精囊重量和減少前列腺重量。因此，施用 ΡΕΡ1可有效治療和改善5α-還原酶的表達和生殖器官的重量所致的ΒΡΗ相關疾病癥狀。 [01%]實施例3:通過觀察DHT對前列腺基質細胞和上皮細胞的改變來驗證ΡΕΡ1對ΒΡΗ的 作用
[0127] 1)測試細胞制備和實驗過程
[0128] 睪酬在注射到身體內后被5α-還原酶轉變為DHT，其誘導前列腺細胞增殖而引起 ΒΡΗ。基于此，通過使用根據實施例1中ΡΕΡ1的施用進行實驗W觀察其對前列腺細胞系增殖 的影響。作為細胞系，使用來自動物模型的WPMY-1 (前列腺基質細胞系)和RWPE-1 (前列腺上 皮細胞系）。對于所述實驗，將WPMY-U2.5X 103個細胞)和RWPE-U1 X 104個細胞)接種到具 有如表4中的不同實驗組的96孔板，W觀察增殖變化。在吸出培養基后，所述增殖變化通過 注入每ΙΟμΙ CCK-8溶液到培養基的每個孔中，然后在450nm波長測量光密度1至4小時。
[0129] 2)確認觀察結果和影響
[0130] 在非DHT處理組（1-3組）中，在WPMY-1和RWPE-1中未施用PEP1Q組）和施用陽Pl(2 和3組)之間均沒有顯著性差異。在DHT處理組(4-6組），未施用陽P1 (4組)和施用陽P1 (5和6 組)之間具有顯著性差異，通過PEP1處理的組對增殖顯示顯著地抑制（參見表4和圖5、6)。因 此，PEP1可W有效抑制前列腺細胞的增殖，其影響DHT誘導的BPH。
[0131] [表 4]
[0132] 每組細胞系的處理條件
[0133]
[0134] 實施例4:驗證PEP1對雄激素受體的結合能力和抑制BPH的機制
[0135] 1)測試細胞的制備和實驗過程
[0136] 通過5α-還原酶產生的DHT通過結合雄激素受體促進前列腺細胞的增殖并引起 ΒΡΗ。基于此，通過使用根據實施例1中ΡΕΡ1的施用進行實驗W觀察其對前列腺細胞系增殖 的影響。作為細胞系，使用來自動物模型的WPMY-1和RWPE-1 dWPMY-1和RWPE-1分為抗雄激素 受體組和同型對照組，通過放置PEP1-FITC(異硫氯酸巧光素)在其中，與每種抗體溫育進行 競爭測試，并且測量巧光值的結果。巧光值通過使用流式細胞術方法測量。
[0137] 2)確認觀察結果和影響
[0138] 對于每個WPMY-1和RWPE-1，測定W下情形的巧光值:一種情形為首先與抗雄激素 受體同型對照抗體反應(與抗體競爭，最右邊的峰），另一種情形為與抗雄激素受體抗體反 應(與抗體競爭，中間的峰），而再一種情形為不與均未結合FITC的兩種抗體反應(最左邊的 峰）（參見圖7和圖8)。在與抗雄激素受體同型對照抗體競爭的情況下，PEP1結合抗雄激素受 體，所WPEP1-FITC結合物的巧光值增加（圖中峰值位移至直方圖右側）。與抗雄激素受體競 爭的情況下，PEP1較弱地結合抗雄激素受體，所W巧光值減少（圖中峰值位移至直方圖左 偵U)。因此，考慮陽P1抑制了結合抗雄激素受體的DHT所誘導的ΒΡΗ,ΡΕΡΙ可W通過直接結合 抗雄激素受體而影響ΒΡΗ。
[0139] 實施例5:通過使用ΒΡ出秀發動物模型驗證陽Ρ1在體內對ΒΡΗ的有效性
[0140] 1)準備測試動物
[0141] 實驗使用6至8周齡雄性巧7BL/6(n= 10/組)小鼠，所述小鼠在首爾大學醫學院實 驗動物實驗室的SPF(無特定病原體）區域飼養。用于注射的50mg庚酸睪酬(TE，購自EVER Pharma Hena GmbH,德國）和0.5mg戊酸雌二醇(購自EVER Pharma Hena GmbH,德國）分別混 合至70μ1體積的微滲透累(Alzet pump,購自DURECT Co巧oration,美國），所述累在麻醉下 植入小鼠背部。所述累經設計W每小時Ο.??μL的濃度在28天(2周）中通過利用滲透現象釋 放激素給小鼠。
[0142] 2)測試材料和施用劑量
[0143] 作為測試材料，使用睪酬和非那司提。制備動物模型，每一個受試者（25g小鼠模 型）分別每天皮下（注射)施用25化g實施例1所述的PEP1和2500yg非那司提(在DMS0或環糊 精中，購自Sigma A1化ich，美國）。注射測試材料2周后(植入所述累至動物模型4周后），從 眶上靜脈收集血液并在1400化pm于4°C離屯、30分鐘W分離血清，并且提取前列腺并在-70°C 液氮中凍存或固定在固定液中。實驗測試組在下表5中描述。
[0144] 敵]
[0145]
[0146] 3)測量誘發BK1的因子的減少
[0147] 誘發BPH增加前列腺組織中的PCNA(增殖細胞核抗原，復制的必需蛋白）和Ki67 (MK167,細胞增殖的必需蛋白）。基于此，在BP出秀發小鼠模型中進行測試測定PEP1抑制PCNA 和Ki67表達的有效性。使用2D-凝膠電泳用從前列腺組織細胞提取的蛋白測定PCNA，通過免 疫染色方法檢測組織中的表達水平W測定Ki67。作為結果，PCNA和Ki67的表達在BP出秀發動 物的前列腺組織中增加，在用陽P1處理的組中減少(參見圖9和圖10)。因此，PEP1抑制BP出秀 發因子并且對于治療和改善是有效的。
[0148] 4)測量與誘發BPH相關的組織的變化
[0149] 已知BPH由組成前列腺腺體的基質細胞和上皮細胞的異常增殖所誘發。基于此，為 了檢測PEP1在BP出秀發動物模型的前列腺組織中引起的變化，對BP出秀發動物模型進行組織 學分析。使用H&E染色方法檢測一般組織中的變化，并且使用Masson^色染色方法測定炎性 反應水平并更清晰檢測細胞核的形狀。作為結果，表明BP出秀發組的上皮層比對照組的上皮 層要厚，但是在PEP1處理組，表明上皮層W與對照組類似的常規順序排列，且上皮的厚度比 BP出秀發組的薄（參見圖11和12)。因此，PEP1可W有效恢復BP出秀發組織的變化并且將所述 組織轉化為不顯示出BPH的正常組織。
[0150] 5)測量BP財目關器官的變化
[0151] BPH可W通過前列腺和精囊重量的變化檢測。基于此，為了檢測PEP1對前列腺和精 囊重量的影響（其直接顯示相關癥狀），在BP出秀發動物模型中測量體重、前列腺重量和 精囊重量。測量結果作為圖表通過分組顯示在表5中（參見圖13、14和15)。沒有顯示出整體 體重的變化，但是與激素處理組相比，顯示出PEP1處理組的前列腺重量顯著性減少，且PEP1 處理組的減少與施用非那司提組（已知為BPH的治療藥物）的結果相當，所W運證實陽P1處 理組中的減少具有顯著性。對于精囊，PEP1處理組的精囊重量比激素處理組的重量小。因 此，PEP1可W有效地顯著性減少具有BPH癥狀的器官重量。
[0152] 在上述所有的實施例中，通過BPH誘發動物模型的體外和體內實驗，表明PEP1對 BPH相關誘發因子、激素受體和實質生殖器官具有良好的治療效果。因此，認為PEP1對于治 療、改善和預防BPH具有有效性，而將PEP1開發為用于BPH治療的組合物和治療BPH的方法有 很大可能性。
[0153] 序列列表自由文本
[0154] 全端粒酶序列的1132個氨基酸
[0155] MPRAPRCRAVR化LRSHYREV…LATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCL KELVARVL弧LCERGAKNVLAFGFALLDGARGGP陽AFTTSTRSYLPNTVTDALRGSGAWG化LRRVG孤VLVHLLA RCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVEEAGVPLGLPAPGARRRGGSASRS LPLPKRPRRGAAPEP 邸 TPVGQGSWAHPGRTRGPSDRCFCVVSPARPAEEATSLEGALSGT 畑甜 PSVGRGHHAGPP STSRPPRPWDTPCPPVYAETKH 化 YSSGD 邸化 RPSF 化 SSLRP 化 TGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLP 化 PQR YWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAA 陽邸 DTDPRRLVQ 化 RQ 服 SPWQVY GFVRA 化版LVPPGLWGS 畑肥 RRFLRNT 邸FI 化GKHAKL 化犯 LTWKMSV畑 CAWLRRSPGVGCVPAA邸化 REE ILAKFLHWLMSVYVVE化RSFFYVTETTFQKNRLFFY服SVWSKLQSIGIRQHLKRV化RELSEAEVRQHREARPAL ITS化REIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAE化TSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGU)DIHRAWRTF 化RVRAQDPP陽LYFVKVDVTGAYDTIPQD化TEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAA服HV服AFKSHVSTLTDLQ PYMRQFVAHL 犯 TS 化畑 AVVIEQSSSL肥 ASSGL抑 V化 RFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLC 化 CYG DMENKLFAGIR 畑化化 RLV 孤化 LVTPHLTHAKT 化 RTLVRGV 陽 YGCVV 化服 TVVNFPV 抓 EALGGTAFVQMPA 服LFPWCG化LDTRTLEVQSDYSSYARTSIRA化TFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVN化QTVCTNI YKIL 化 QAYRFHACVL 化 PF 冊 QWKNPWFLRVISDTA 化 CYSILKAKNAGMSLGAKGAAGP。沈 AVQWLC 冊 AF LLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQT化S服LPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
【主權項】
1. 一種用于治療和預防良性前列腺增生的組合物，其中所述組合物包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、具有與所述肽具有80%以上同源性的氨基酸序列的肽、或所述氨 基酸序列的片段。2. -種用于治療和預防良性前列腺增生的組合物，其中所述組合物包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、具有與所述肽具有80%以上同源性的氨基酸序列的肽、或所述氨 基酸序列的片段。3. 如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含一種或多種選自下組的添加劑:稀 釋劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、分散劑、表面活性劑、著色劑、芳香劑或甜味 劑。4. 如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含0 .Olmg至Img的所述肽。5. 如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含0.56mg的所述肽。6. 如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。7. 如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物是食物組合物。8. -種用于治療和預防良性前列腺增生的方法，其中所述方法包含給需要治療的受試 者施用權利要求1至7中任一項所述的組合物的步驟。9. 如權利要求8所述的方法，其中所述組合物以每次0.005mg/kg至0.05mg/kg施用。10. 如權利要求8所述的方法，其中，在總共12周時長的治療中，將所述組合物每2周施 用，其中所述施用在第〇周、第2周、第4周、第6周、第8周、第10周和第12周的一天完成，并且 每次施用的組合物為〇.56mg，其相當于4nmol肽/kg體重。
【文檔編號】A61K38/17GK105899224SQ201480058285
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月23日
【發明人】金商在
【申請人】杰姆維克斯&凱爾有限公司, 金商在