一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備及應用
【專利摘要】本發明公開了一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備及應用，以羧甲基纖維素（CMC）為載體，通過羧甲基纖維素的親水基和疏水基熊果酸自組裝形成納米粒子CMC?UA·NPs，它可以負載雙氫青蒿素疏水藥物，制備具有核殼結構的納米粒子CMC?UA(DHA)·NPs，核是雙氫青蒿素（DHA），殼是載有熊果酸（UA）的自組裝層。本發明的核殼結構納米藥物的納米粒子形貌為球型，粒徑較為均一，大小在20nm?50nm之間，分散性好，載藥量高，有穩定的包封率，生物相容性好，毒性小，具有緩釋功能的一種新型的水溶性納米藥物，可抑制多種癌細胞的生長，使癌細胞凋亡。本發明屬于生物制藥和納米技術領域，核殼結構納米藥物的制備，操作方便，制備技術工藝周期短，成本低，有很大的工業化前景。
【專利說明】
-種自組裝的核亮結構納米藥物的制備及應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物制藥和納米技術領域，設及藥物遞送系統，具體設及一種自組裝 的核殼結構納米藥物的制備及應用。
【背景技術】
[0002] 簇甲基纖維素鋼（Sodium carboxymethylcellulose，簡稱CMC-Na)是一種天然高 分子化合物纖維素簇甲基化的衍生物，又名纖維素膠，是陰離子型線性高分子，由D-化喃 葡萄糖通過β-α一4)-巧鍵結合而成。CMC-化無毒無味，具有優良的水溶性、粘膠性、乳化 性、擴散性好、抗過酶性和很好的穩定性，適合做藥物載體。
[0003] 熊果酸(Ursolic acid,簡稱UA)又名烏索酸、烏蘇酸，是一種五環Ξ祗類化合物， 化學分子式為C30化0〇3,廣泛存在于熊果、女貞、白花蛇舌草、山植、烏梅、夏枯草、接骨木、批 把和蘋果等天然藥用植物和果實中，具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞調亡、抗突變、保肝、 調節機體免疫等多種生物活性，經過研究發現，熊果酸對多種腫瘤具有抑制作用，如熊果酸 能夠誘導子宮內膜癌細胞調亡，可W通過p53介導誘導人肝癌SMMC-7721細胞調亡，抑制肺 癌A549及SPCA1細胞株的增殖，對?-388和心1210白血病細胞有顯著的細胞毒性作用，熊果 酸同時對胃癌、卵巢癌、TSCCA人舌鱗癌、食管癌、皮膚癌、膜腺癌、骨髓癌、結腸癌、宮頸癌、 乳腺癌、白血病等具有顯著的抑制增殖作用。
[0004] 雙氨青葛素(D化y化oartemisinin，簡稱DHA)是一種青葛素類藥物中活性較強的 衍生物，是由青葛素經四氨棚鋼還原而成，具有獨特的過氧橋結構、DHA具有良好的吸收性、 排泄和代謝迅速、毒性低等優點，它作為一種有效的抗追疾藥被廣泛應用于臨床，其抗追疾 是青葛素的4~8倍，近年研究發現，DHA不但可W抗追疾，還具有抗腫瘤特性，如可誘導前列 腺癌PC-3細胞的調亡，人骨肉瘤143B、U-20S調亡，抑制人卵巢癌細胞的增殖，誘導人肺腺癌 A549細胞調亡，對人肺鱗癌細胞株YTMLC有抑制作用，抑制神經膠質瘤干細胞侵襲遷移，誘 導干癌癌細胞SMMC-7721調亡，抑制人胃癌細胞SGC-7901增殖，同時對人結腸癌HCT116細 胞、肺癌SPC-A-1、乳腺癌、宮頸癌、骨髓瘤、骨髓系白血病細胞系K562和化60等多種癌細胞 具有抑制增殖，誘導癌細胞調亡作用。
[0005] 癌癥已成為危害人類生命健康的最主要疾病，臨床主要通過藥物治療的手段治療 癌癥，然而許多抗癌藥物如UA多為難溶于水，口服給藥體內吸收差，體外釋放度小，難于透 皮吸收，生物利用度較差，運些都限制了UA在藥學領域的廣泛應用，因此，解決其水溶性的 問題、增加藥物穩定性、提高對癌細胞的緩釋殺傷能力是UA臨床應用的關鍵。
[0006] 目前，高分子膠束藥物載體一般采用線性高分子膠束，不需要改變藥物分子的結 構就能實現了藥物的遞送及緩釋功能，使藥物可W穿過生物屏障傳輸至組織細胞，并能輸 送多種不同性質的藥物。但很多高分子膠束納米藥物存在膠束穩定性差，增溶效果不明顯， 藥物釋放率低等問題，未能實現藥物的大量遞送及緩釋功能，限制其在臨床方面的應用。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種自組裝的核殼結構納米藥物的 制備方法，CMC-UA在水介質中可自組裝形成納米膠束，W解決UA的水溶相差，生物利用度低 等問題，而且避免大量使用化學試劑，造成的試劑回收困難，使用簇甲基纖維素為藥物載 體，解決高分子膠束納米藥物的穩定性差，藥劑包封率不高，不完全釋放和突釋情況。本發 明具有制備工藝簡單，抗腫瘤活性強，載藥量高，藥效顯著提高，毒副作用低等優點。
[0008] -種自組裝的核殼結構納米藥物制備的技術方案如下： 所述的自組裝的核殼結構納米藥物的制備，W簇甲基纖維素鏈段為載體，簇甲基纖維 素的簇基與熊果酸的徑基通過醋鍵相連，所述自組裝的核殼結構納米藥物前體具有如下結 構：
式中，所述簇甲基纖維素鏈段的重均分子量為2000~300000。
[0009] 所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備方法，其納米粒子中UA的載藥量為 0.01%-40%，納米粒子的質量百分比0.01%-95%，納米粒子半徑10-200nm。
[0010] 本發明所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備方法，包括W下步驟： (1) 取一定量的簇甲基纖維素鋼，緩慢加入20%硫酸溶液中，攬拌均勻，出現白色絮狀沉 淀，反應化，離屯、沉淀，去除上清液，去離子水多次洗涂沉淀，反復離屯、，至pH=7.0，冷凍干 燥，獲得簇甲基纖維素白色粉末A; (2) 取（1)中簇甲基纖維素，緩慢加入含10ml化晚的50ml圓底燒瓶中，并超聲10-30min， 攬拌溶解化，然后在溶液中加入激活劑1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)、催化劑4-二甲氨基化晚(DMAP)，攬拌30min，加入一定量的熊果酸，35°C下水浴反應 4她，并通氮氣，排出反應生成的水； (3) 對(2)中反應后的藥物進行純化，向反應后的混合物中加入3倍體積的乙酸沉淀，振 蕩均勻，離屯、去上清液，再將化晚加入到沉淀物中，充分溶解，加入3倍體積乙酸沉淀，攬拌 均勻，離屯、去上清液，重復操作Ξ次，將最終的沉淀于乙酸中洗涂多次，離屯、，收集沉淀，置 于8W)a MWC0的半透膜里，在PBS溶液中透析2地，每隔化換一次PBS液，透析膜內的透析液冷 凍干燥，收集固體粉末B; (4) 取一定質量(3)中的冷干物溶于20ml二甲基亞諷，溶解比，逐滴滴入高速攬拌的PBS 溶液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透析膜中的透析液 冷凍干燥，得白色粉末C;向（3)中冷干物加入雙氨青葛素，溶于二甲基亞諷，溶解化，逐滴滴 入高速攬拌的PBS溶液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透 析膜中的透析液冷凍干燥，得白色粉末D。
[0011] 優選地，步驟（1)所述的簇甲基纖維素鋼與20%硫酸溶液固液比為1:15~l:50(g/ ml)； 優選地，步驟(2)所述的簇甲基纖維素與化晚的固液比為1:20~l:100(g/ml); 優選地，步驟(2 )所述的UA與邸C、DMAP的摩爾比為1:2:0.2; 優選地，步驟(2)所述的CMC與UA的反應溫度為20~40°C，反應時間為36~60h; 優選地，步驟(3)所述的反應溶液與乙酸的體積比為l:3(v/v)，透析過程每化換一次 ro幻夜； 優選地，步驟(4)所述的粉末B與雙氨青葛素的摩爾比為1:0.1~1:1; 優選地，步驟(4)所述的粉末B在水介質中進行自組裝性能的納米顆粒體系，即得到所 述的抗癌核殼結構的納米藥物； 優選地，（1)-(4)所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備具有緩釋功能。
[0012] 本發明所述的抗癌高分子膠束的自組裝采用本領域熟知的現有技術進行。
[0013] 本發明將UA與親水線性聚合物CMC鍵接，所得的CMC-UA鍵合物自組裝制備納米粒 子，結構比較穩定，制作工藝簡單，實現藥物的水溶性和緩釋功能，并具有較高載藥量。
[0014] 本發明制備的抗癌高分子膠束納米藥物的粒徑在10-50nm，粒徑較均一，有利于在 腫瘤部位的富集，提高藥物的緩釋功能，減少對正常細胞的毒副作用。
[0015] 相對現有技術，本發明具有W下有益效果： 本發明的自組裝的核殼結構納米藥物生物相容性好，毒副作用低，CMC與UA鍵合的同 時，自組裝過程還包裹DHA，增大了載藥量，聯合UA和DHA共同作用于腫瘤部位，在腫瘤部位 的弱酸環境中，納米藥物的納米粒子解聚，暴露出受體結合位點，W達到誘導腫瘤調亡的目 的。本發明的制備方法簡單，自組裝過程無需大量有機溶劑，只需在水介質中形成納米粒 子，納米粒子穩定，粒徑小，有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為合成高分子化合物CMC-UA的核磁圖 圖2為納米粒子的透射電鏡形貌圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合【具體實施方式】，對本發明作進一步說明。
[0018] 實施例1、一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備方法： (1)簇甲基纖維素鋼酸化 取一定量的簇甲基纖維素鋼(分子量10000~30000)，緩慢加入20%硫酸溶液中，攬拌均 勻，出現白色絮狀沉淀，反應化，離屯、沉淀，去除上清液，去離子水多次洗涂沉淀，反復離屯、， 至抑=7.0，冷凍干燥，得到簇甲基纖維素。
[0019] (2)高分子藥物合成 取（1)中簇甲基纖維素〇.2g，緩慢加入含10ml化晚的50ml圓底燒瓶中，并超聲10- 30min，攬拌溶解化，然后在溶液中加入0.4g激活劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽(EDC)、0. (Mg催化劑4-二甲氨基化晚(DMAP)，攬拌30min，加入ο.4g的熊果酸，35°C下 水浴反應4她，并通氮氣，排出反應生成的水。
[0020] (3)藥物的純化 對(2)中反應后的藥物進行純化，向反應后的混合物中加入3倍體積的乙酸沉淀，振蕩 均勻，離屯、去上清液，再將化晚加入到沉淀物中，充分溶解，加入3倍體積乙酸沉淀，攬拌均 勻，離屯、去上清液，重復操作Ξ次，將最終的沉淀于乙酸中洗涂多次，離屯、，收集沉淀，置于 8kDa MWCO的半透膜里，在PBS溶液中透析24h，每隔化換一次PBS液，透析膜內的透析液冷凍 干燥，收集固體粉末。
[0021] (4)藥物的自組裝 取一定質量(3)中的冷干物溶于20ml二甲基亞諷，溶解化，逐滴滴入高速攬拌的PBS溶 液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透析膜中的透析液冷 凍干燥，得白色粉末A;向（3)中冷干物加入雙氨青葛素，溶于二甲基亞諷，溶解比，逐滴滴入 高速攬拌的PBS溶液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透析 膜中的透析液冷凍干燥，得白色粉末B。
[0022] (5)載藥量及粒徑大小測定 取7份0.1 g CMC于20ml圓底燒瓶中，加入10ml化晚，分別加入10%、20%、30%、40%、50〇/〇、 80%、90%的UA于燒瓶中，反應4她，同步驟(2)(3 )操作，將純化后的7個不同樣品取等量1 Omg， 溶于0.5ml DMS0，攬拌30min后，逐滴加入5ml PBS溶液中，劇烈攬拌，透析12h，透析液用紫 外分光光度計在波長210nm處測得吸光度，計算載藥量，剩余納米溶液超聲lOmin，測得粒徑 大小為20~40nm，分散指數(PDI)為0.159。
[0023] (6)釋藥量的測定 取lOmg CMC-UA，加入0.5ml DMS0,攬拌30min后，逐滴加入5ml PBS溶液中，將溶液轉入 透析袋中，透析去除DMS0，冷凍干燥，得到白色粉末C，將粉末C溶于PBS液，配成Img/ml溶液， 裝入透析袋中，至于裝有200ml PBS溶液500ml燒杯中，水浴下輕微攬拌，調節溫度為37°C。
[0024] (7^EM檢測：取(3)中純化藥物A、B不同質量于5ml二甲基亞諷中，攬拌比，取0.5ml 溶液，緩慢滴入高速攬拌的PBS液中，分別攬拌15、25、35、45、55min，取不同時間、不同濃度 的溶液20μ1，滴到200目篩網上，得到的納米粒子最佳分散配比為2:l(mg/ml)，攬拌時間為 35min〇
[0025] 實施例2、一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備方法： 在本實例中，通過與實施例1相同的合成方法及步驟，改變簇甲基纖維素鋼分子量為 30000~90000,測得粒徑大小為30~70nm，分散指數(PDI)為0.177。
[00%]實施例3、一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備方法： 在本實例中，通過與實施例1相同的合成方法及步驟，改變簇甲基纖維素鋼分子量為 90000~150000,測得粒徑大小為50~90nm，分散指數(PDI)為0.149。
[0027]實施例4、一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備方法： 在本實例中，通過與實施例1相同的合成方法及步驟，改變簇甲基纖維素鋼分子量為 150000~250000,測得粒徑大小為60~120nm，分散指數(PDI)為0.199。
【主權項】
1. 一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備及應用，其特征在于，以羧甲基纖維素鏈段 為載體，羧甲基纖維素的羧基與熊果酸的羥基通過酯鍵相連，所述自組裝的核殼結構納米 藥物前體具有如式I所示的結構：式中，所述羧甲基纖維素鏈段的重均分子量為2000~300000。2. 如權利要求1所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備，其特征在于，步驟如 下： (1) 將一定量的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)與20%硫酸溶液以固液比1:15~1:50(g/ml) 混合，室溫下反應，然后用去離子水洗至中性，冷凍干燥，獲得羧甲基纖維素白色粉末A; (2) 取一定量的步驟（1)中的羧甲基纖維素粉末溶于吡啶，羧甲基纖維素與吡啶的固液 比1: 20~1:100(g/ml)，加入激活劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)， 催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)，熊果酸，水浴下反應，反應溫度為20~40°C，反應時間為36 ~60h; (3) 將步驟(2)中得到的反應混合物加乙醚沉淀（l:3，v/v)，離心洗滌，洗滌后的沉淀用 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析，透析液冷凍干燥，得到淡黃色粉末B; (4) 將步驟(3)中粉末B和雙氫青蒿素溶于二甲基亞砜，并滴入PBS溶液中，所得溶液透 析，透析過程每2h換一次PBS液，然后冷凍干燥得到所述自組裝的核殼結構納米藥物。3. 如權利要求1、2所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備，其特征在于，步驟 (2)所述的UA與EDC、DMAP的摩爾比為1:2:0.2。4. 如權利要求1、2所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備，其特征在于，步驟 (4)所述的粉末B與雙氫青蒿素的摩爾比為1:0.1~1:1。5. 如權利要求1、2、3、4所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備，其特征在于，其 納米粒子中UA的載藥量為0.01%-40%，納米粒子的質量百分比0.01%-95%，納米粒子半徑20-100nm〇6. 如權利要求1、2、3、4所述的一種自組裝的核殼結構納米藥物的制備具有穩定的粒徑 大小，緩釋功能。
【文檔編號】A61P35/00GK105879051SQ201610382878
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】雷建都, 劉彥雪, 何靜, 王璐瑩, 劉靜
【申請人】北京林業大學