基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于聚氨基酸的納米粒子的制備方法。首先以疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯為原料，反應得到對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子；然后以對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子和二胺化合物為反應物，反應制備疏水性胺基化合物；再以疏水性胺基化合物作為引發劑，開環聚合α?氨基酸?N?羧基內酸酐化合物得到基于聚氨基酸的聚合物；最后將基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后加入聚合物的丙酮溶液，攪拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子。得到的載藥靶向納米粒子具有很高的穩定性，其可以與靶向分子結合很好地富集到腫瘤部位，并對包括人乳腺癌在內的多種固體腫瘤具有很好地治療作用和低的毒副作用。
【專利說明】
基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種聚合物粒子，具體設及一種基于聚氨基酸的功能性生物可降解納 米粒子的制備方法。
【背景技術】
[0002] 聚(乳酸-徑基乙酸KPLGA)是一種抑A批準的生物可降解聚合物，被廣泛地應用于 手術縫合線、組織工程支架、藥物控制釋放載體等生物醫用領域。基于PLGA的生物可降解納 米粒子和微米粒子已成為實現藥物祀向長效治療的最重要載體之一。例如，多種包載蛋白 藥物和多膚藥物的PLGA微球如Depot?，Decapeptyl?，Soma1:ulline?，Nut;ropin?，D邱ot?，已 被臨床用于治療前列腺癌、肢端肥大癥、生長激素缺乏癥。PLGA納米粒子和微米粒子通常是 用乳化-溶劑揮發法或納米沉淀法制備，運通常要用表面活性劑來穩定分散的小液滴，減小 表面張力和防止絮積。聚乙締醇(PVA)、泊洛沙姆(poloxamer)和聚丙締化咯燒酬(PVP))等 表面活性劑因具有在水溶液中粘度高，能很好地吸附在分散小液滴的表面等優點而成為制 備PLGA納米粒子和微米粒子最常用的表面活性劑。但運些表面活性劑存在不能生物降解、 體內存在潛在的毒性、缺少功能基團等缺點。例如，PVA不僅可能致癌，而且動物實驗發現皮 下或靜脈注射PVA會導致高血壓、器官損傷、貧血、中樞神經抑制等問題（J. Biomed. Mater. Res. Part A: lOOA; 1998-2005, 2012)〇
[0003] 最近，聚乙二醇1000維生素 E班巧酸醋(TPGS)作為一種生物相容性表面活性劑被 廣泛用于納米粒子制備(Biomaterials 33; 4889-4906，2012)。例如，用TPGS制備得到了 一系列包裹紫杉醇等藥物的PLGA、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒子;運 些納米粒子的粒徑可控制在200-800nm之間。與傳統PVA乳化劑相比，TPGS展現出了更好的 乳化效果和包載效率。研究還發現TPGS乳化劑能通過抑制腫瘤細胞表面P-糖蛋白功能來阻 止抗癌化療藥物被細胞累出，從而大大增強抗癌藥物(阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇等)對耐 藥腫瘤細胞的毒性。而且，TPGS還被發現本身就有抗癌活性，能抑制移植在裸鼠身上的人肺 癌細胞的生長。但用TPGS乳化的PLGA等納米微球通常穩定性較低，而且表面很難進行功能 化。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種基于聚氨基酸的納米粒子，可用來作為納米藥物載體。
[0005] 為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:一種基于聚氨基酸的功能性生物可 降解納米粒子的制備方法，包括如下步驟： (OW疏水性徑基化合物、對硝基苯基氯甲酸醋為原料，在無水二氯甲燒和化晚中，反 應得到對硝基苯基氯甲酸醋活化的功能性疏水小分子;然后W對硝基苯基氯甲酸醋活化的 功能性疏水小分子和二胺化合物為反應物，在無水二氯甲燒和化晚中，反應制備疏水性胺 基化合物； (2 ) W疏水性胺基化合物作為引發劑，開環聚合α-氨基酸-N-簇基內酸酢化合物得到基 于聚氨基酸的聚合物;所述α-氨基酸-N-簇基內酸酢化合物為丫-寡聚乙二醇-k谷氨酸-N- 簇基內酸酢或0-寡聚乙二醇-心天冬氨酸-N-簇基內酸酢； (3)將基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后逐滴加入PLGA、PLA、P化或陽G-PLA的丙 酬溶液，攬拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子。
[0006] 上述技術方案中，步驟（1)中，疏水性徑基化合物包括維他命E、膽固醇、香豆素、膽 酸、喜樹堿、伊立替康;二胺化合物選自W下化合物中的一種：乙二胺、下二胺、辛二胺、賴氨 酸甲醋、賴氨酸乙醋、鳥氨酸甲醋、鳥氨酸乙醋、脫氨酸甲醋、脫氨酸乙醋、脫胺;步驟（1)中， 疏水性徑基化合物、對硝基苯基氯甲酸醋和化晚的摩爾比為1:2:5;對硝基苯基氯甲酸醋活 化的功能性疏水小分子、乙二胺和化晚的摩爾比為1:20:20。
[0007] 上述技術方案中，步驟(1)中，制備對硝基苯基氯甲酸醋活化的功能性疏水小分子 時，在〇°C度條件下滴加對硝基苯基氯甲酸醋，再在30°C反應24小時；制備疏水性胺基化合 物時，反應溫度為室溫，時間為24小時。
[0008] 上述技術方案中，步驟(2)中，疏水性胺基化合物、α-氨基酸-N-簇基內酸酢化合物 的摩爾比為1:3~25;疏水性胺基化合物的分子量大于240;步驟(2)中，制備基于聚氨基酸 的聚合物時，反應溫度是25~50°C，反應時間為12~72小時。
[0009] 上述技術方案中，步驟(3)中，將基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后在抓C/ NHS催化條件下，與短膚、單糖、葉酸、生物素或者抗體分子反應，制得含祀向分子表面活性 劑;然后含祀向分子表面活性劑中逐滴加入PLGA、PLA、P化或陽G-PLA的丙酬溶液，得到基于 聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子;步驟(3)中，在室溫下攬拌揮發除去有機溶劑，離 屯、收集得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子。
[0010] 本發明公開的基于聚氨基酸的聚合物的化和結構式可W為：
[00川疏水功能小分子Ri作為憎水的頭，水溶的聚（丫-寡聚乙二醇-レ谷氨酸）和聚(β- 寡聚乙二醇天冬氨酸）的聚氨基酸鏈段作為親水的尾己，其中X為2~5，η為3~20;町分 子量大于240 Da。
[0012] 疏水性徑基化合物包括維他命E、膽固醇、香豆素、膽酸、喜樹堿、伊立替康等，其結 構式如下：
二胺化合物結構為^^化^^^^心劑約?，選自^下化合物中的一種：乙二胺、下二胺、辛二胺、 賴氨酸甲醋、賴氨酸乙醋、鳥氨酸甲醋、鳥氨酸乙醋、脫氨酸甲醋、脫氨酸乙醋、脫胺等，其具 體結構如下：
其中y為2,4,8。
[0013] 上述制備過程可表示如下： (1)中間體對硝基苯基氯甲酸醋活化的疏水小分子(Ri-4-NC)的制備:在0°C條件下，將 對硝基苯基氯甲酸醋的二氯甲燒溶液滴加到疏水性徑基化合物和化晚的二氯甲燒溶液中。 滴加完畢后，將反應液轉移到30°C油浴中反應24小時后過濾將除去化晚鹽，旋蒸除去二氯 甲燒得到粗產品。將粗產品溶解在石油酸中，然后在-5°C度離屯、除去不溶物，再旋蒸除去溶 劑得到黃色油狀的中間體Ri-4-NC;末端氨基的疏水小分子(Ri-N此）的制備:將對硝基苯基 氯甲酸醋活化的疏水小分子(Ri-4-NC)溶解在無水二氯甲燒溶液中，用恒壓滴液漏斗10秒 每滴滴加到二胺和化晚的溶液中，室溫反應24小時后，用去離子水洗涂，有機相用無水硫酸 儀干燥過夜，過濾，旋轉蒸發除去二氯甲燒，真空干燥24小時，得到產品。干燥后，抽濾除去 硫酸儀，收集有機相濾液，旋轉蒸發除去二氯甲燒，并真空干燥24小時，得到末端氨基的疏 水小分子(R廣畑2); (2 )將步驟（1)制備的末端氨基的疏水小分子(Ri-N此)溶解在無水二氯甲燒或二甲基 甲酯胺中并置于密閉反應器中，再將丫-寡聚乙二醇-1^-谷氨酸-N-簇基內酸酢(EGx-Glu- NCA)或β-寡聚乙二醇-1^-天冬氨酸-N-簇基內酸酢(EGx-Asp-NCA)的二氯甲燒或二甲基甲酯 胺溶液在氮氣環境下快速加入到引發劑溶液中，然后在25~50°C反應12~72小時。反應結 束后，將反應液用冰乙酸沉淀，離屯、，真空干燥，得到基于聚氨基酸的聚合物； 末端氨基的疏水小分子(Ri-N出)與丫-寡聚乙二醇-k谷氨酸-N-簇基內酸酢(EGx-Glu- NCA)或β-寡聚乙二醇-1^-天冬氨酸-N-簇基內酸酢(EGx-Asp-NCA)的摩爾比根據需要控制在 1:3~25。所用有機溶劑可W是二氯甲燒、Ξ氯甲燒、N，N-二甲基甲酯胺、二甲基亞諷、N-甲 基-2-化咯燒酬，本發明優選二氯甲燒。
[0014] 上述制備方法可表示如下：
本發明公開的由上述末端氨基的疏水小分子(Ri-N也）引發丫 -寡聚乙二醇-k谷氨酸- N-簇基內酸酢(EGx-Glu-NCA)或β-寡聚乙二醇-心天冬氨酸-N-簇基內酸酢(EGx-Asp-NCA)聚 合制備的聚合物，其分子量為0.5~6.5 kDa，其中聚氨基酸的重量百分數為20~95%。其末 端胺基可用來連接生物活性分子，運些生物活性分子包括但不僅限于祀向分子：cRGD、 iRGD、AP、奧曲膚、ACUPA等短膚分子，抗體及其片段、鐵轉移蛋白等蛋白分子，半乳糖(Gal) 和透明質酸等單糖或多糖分子，葉酸，生物素等；和穿膜分子:TAT、Angiopep-2、iRGD、T7、 Cilengitide 等。
[0015] (3)先將基于聚氨基酸的聚合物溶解在水等溶劑中，然后在抓C/NHS催化條件下， 與短膚、單糖、葉酸、生物素、抗體等生物活性分子反應，制得含祀向分子等生物活性分子的 表面活性劑;然后向該表面活性劑的水溶液中逐滴加入化GA、PLA、P化或PEG-PLA等生物相 容性聚合物的丙酬溶液，再在室溫下攬拌揮發除去有機溶劑，離屯、收集到表面含有祀向分 子等生物活性分子的多功能性納米粒子。由于上述聚合物由功能性疏水小分子和親水聚氨 基酸組成，因此具有良好的生物相容性和生物降解性。同時憎水功能性疏水小分子頭和親 水聚氨基酸尾己都有大分子結構和大表面積，具備成為優良表面活性劑的基本特征。而且， 聚合物親水鏈段長度能通過調節聚氨基酸的聚合度來控制，從而得到不同親疏水比例的聚 合物，可方便制備具有不同乳化性能的聚合物。另外，聚氨基酸親水鏈段的末端含有胺基， 可用來引入祀向分子等生物活性分子，從而制得多功能的納米藥物載體，負載藥物用于腫 瘤的安全高效治療。
[0016] 也可W不加入祀向分子，制備得到納米粒子，可W負載多種藥物，用于多種疾病的 體內治療。
[0017] 本發明還公開了一種藥物，包括疏水藥W及上述方法制備的基于聚氨基酸的功能 性生物可降解納米粒子;疏水藥包括紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿、伊立替康、長春新堿、拓 撲替康、貝洛替康、長春瑞濱。
[0018] 由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點： 1.本發明用基于聚氨基酸的聚合物作為高分子表面活性劑與化GA、PLA、P化或PEG- PLA等生物相容性聚合物制備的多功能納米藥物載體的表面由聚氨基酸鏈段構成，很好克 服了現有大多納米粒子表面由聚乙二醇構成所帶來的不能生物降解、容易引發過敏反應和 很難進行納米粒子表面修飾等問題;親水聚氨基酸鏈不僅具有很好的生物降解性，而且其 末端的胺基能方便在納米粒子表面引入祀向分子和穿模膚等生物活性分子，從而增強納米 藥物在病灶處的富集量。
[0019] 2.本發明公開的基于聚氨基酸的生物可降解聚合物作為高分子表面活性劑能很 好克服現有高分子表面活性劑(PVA，poloxamer，PVP等）不具有生物可降解性、生物相容性 不好、很難進行官能化修飾等缺點；W其作為表面活性劑與PLGA、PLA、P化或PEG-PLA等生物 可降解聚合物聚合制備藥物載體，成功解決了現有載體存在的不能生物降解、體內存在潛 在的毒性、缺少功能基團等缺點，取得了意想不到的技術效果。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例對本發明作進一步描述： 實施例一引發劑維他命E氨基(VE-N出)的合成 (1) 中間體VE-4-NC的制備:氮氣環境下，將對硝基苯基氯甲酸醋(4-NC，1.98 g，9.8 mmol)的二氯甲燒(30 mL)溶液在0°C條件下W5秒一滴的速度滴加到維他命E(VE，2.12 g， 4.9 mmol)和化晚（1.98 mL, 24.5 mmol)的二氯甲燒（10血)溶液中。滴加完畢后，轉移到 30°C油浴中反應24小時。反應后，過濾除去副產物化晚鹽，再用旋轉蒸發儀旋干濾液，得到 淡黃色粘稠的VE-4-NC粗產品。然后用石油酸(b. P: 60-90 °C )溶解粗產品，離屯、除去雜質， 旋蒸、最后真空干燥得到黃色粘稠油狀產品VE-4-NC，產率93.4%; (2) 引發劑維他命E氨基(VE-N此)的制備:氮氣環境下，將步驟(1)制備的對硝基苯基氯 甲酸醋活化的VE-4-NC(0.6 g, 1.0 mmol)的二氯甲燒(14 mL)溶液用恒壓滴液漏斗10秒每 滴滴加到乙二胺（1.35 ιΛ, 20.0 mmol)和化晚（1.6血，20 mmol)混合的二氯甲燒(4血） 溶液中，室溫磁力攬拌反應24小時。然后加入一定體積的二氯甲燒，并用去離子水萃取，直 到水相變得沒有顏色。將收集到的二氯甲燒相用無水硫酸儀在-24°C條件下干燥24小時，抽 濾除去硫酸儀，旋轉蒸發除去二氯甲燒，最后真空干燥24小時，得到黃色粘稠油狀產品VE- N出，產率78.1%。
[0021] VE-N出核磁表征；IhNMR (400MHz, CDC13): δ 3.33 (t, -NHC此邸2畑2); 2.90 (t, -N肥此CH2畑2); 2.58 (t,-曲（C曲）3CH2C此-);2.08，2.02 (s,-曲（C曲）3-):1.77 (t，-Ph (C出）3C出細2-); 1.52 (m，C出（CH (C出）C出C出細2) 3-) ; 1.37-1.07 (m，C出（CH(C出） CH2CH2CH2) 3-; s，-C(咖)0-); 0.87-0.83 (d，咖(CH(咖)CH2CH2CH2)廠）。
[0022] 將維他命E更換為膽固醇，可W制備引發劑膽固醇氨基(化ol-N此）；iH醒R (400 MHz, CDCI3): δ 5.37 (t,-畑=〇);4.49(111，-(-邸2)2畑0(：0畑-);3.214，- 畑師師畑2); 2.81(t,-畑師師畑2); 2.：M，2.27(d，-CH=CCH2CH(-C出）0-)。
[0023] 實施例二維他命E-聚（丫-二乙二醇單甲酸-k谷氨酸）(VE-poly化G2-GIU))的合 成 將引發劑維他命E氨基VE-N出（1.16 g，2.25 mmol)溶于37 mL二氯甲燒溶劑中并置于 密閉反應器中。氮氣環境下，將丫-二乙二醇單甲酸-レ谷氨酸-N-簇基內酸酢^62-6111- NCAX3.71 g，13.50 mmol)單體的二氯甲燒溶液(37 mL)快速加到引發劑中，25 °C反應12 小時。反應過程用傅里葉紅外光譜儀監測。反應結束后，將反應液旋轉蒸發濃縮至約18毫 升，用冰乙酸沉淀，低溫離屯、（-5Γ，5000巧m)收集沉淀。最后用冰乙酸洗涂Ξ次，真空干 燥48小時，得到淡黃色產品，產率55.8%。
[0024] VE-polHEG2-Glu)核磁表征；iH 應 R (600 MHz, CDC13): δ 4.24 (m,- NHCOCH-; t, CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.68-3.54 (m, CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.40-3.36 (t, -NHCH2C出NH-; s, C出OC出CH2OCH2C此-);2.66-2.34 (t, -I%(C出）3CH2C出-，t，-COCH (NH)C出CH2-); 2.07，2.03 (s, -Ph(CH3)3-); 1.99-1.88 (m, -COCH(NH)C出CH2-); 1.78 (t, -I%(C曲）3CH2C此-);1.53 (m, C出（CH(CH3)CH2C此 C此）3-); 1.37-1.07 (m, C曲（CH 畑3)師師師)3-; s，-C(CH3)(CH2)-); 0.87-0.83 化咖畑畑3)師師師)3-)。
[0025] 將引發劑維他命E氨基VE-N出更換為引發劑膽固醇氨基(化ol-N出），得到淡黃色固 體Chol-poly化G2-Asp)i9.i，產率62.1%</HNMR (400 MHz, CDC13): δ 5.35 (t, -CH=C-); 4.46 (m, -(-CH2)2C冊C0NH-); 4.24 (m, -NHC0CH-; t, C曲OC出CH2OCH2C出-)3.65-3.54 (m, CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.42-3.34 (t, -NHCH2CH2NH-; s, CH3OCH2CH2OCH2CH2-) 〇
[0026] 用相似的方法，通過選用不同單體(EGx-Glu-NCA或EGx-Asp-NCA)和控制單體/引發 劑的投料比，可W制備得到一系列聚合度不同的VE-poly化Gx-Glu)n和￥6-9〇17化61~43口)。 兩親性聚合物，其表征見表1。
[0027] 表 1 聚合物V E-poly化Gx-Glu)n和VE-pol^EGx-Asp)n的制備和表征
用相似的方法，選用不同的引發劑如香豆素胺基化合物（Cou-N也）、膽酸胺基化合物 (CA-N也）、喜樹堿胺基化合物(CPT-N也）、伊立替康胺基化合物（INT-N也）、二硬脂酷基憐脂 酷乙醇胺(DSPE)、二油酷基憐脂酷乙醇胺(DOPE)、艾日布林(Er i )和十六烷基胺(THDA)，開 環聚合NCA單體可制得一系列疏水功能性小分子-親水聚氨基酸聚合物，其表征見表2。
[0028] 表2疏水功能性小分子-親水聚氨基酸聚合物的制備和表征
實施例Ξ用VE-poly(EGx-Glu)n為高分子表面活性劑制備PLGA納米粒子 化GA納米粒子(PLGA NPs)的制備：WVE-poly化G2-G1u)5為高分子表面活性劑為例，將 0.9血PLGA的丙酬溶液（10 mg/mL)逐滴滴加到9 mL VE-poly(EG2-Glu)日水溶液(0.45 mg/ mL)中，室溫攬拌6 h，使丙酬揮發，然后離屯、（12000 ;rpm, 10 min, 4 °C; Sorvall Bio化ge Stratos, Thermo Scientific)收集納米粒子，并用二次水洗一次，除去自由的乳 化劑，制備得到表面含VE-poly化G2-G1u)5的PLGA納米粒子。納米粒子的粒徑和粒徑分布可 用動態光散射測量分別為135 nm和0.06。納米粒子表面含有VE-poly(EG2-Glu)5聚氨基酸鏈 段可通過X射線光電子能譜觀察到N峰的出現得到證實。而且，納米粒子表面含有表面活性 劑的量可用氨譜核磁具體測得，通過比較表面活性劑上E&在3.54-3.68的亞甲基和PLGA 在5.21處的次甲基的峰面積，可計算出PLGA表面含有7.3 wt. %的VE-po 1パEG2-G1U)日。通過 調節￥6-9〇17巧62-6111)日為高分子表面活性劑的濃度為0.15,030 111旨/1^，可^制備得到粒徑 在150 nm的納米粒子(表征結果見表3)。
[0029]實施例四表面含有祀向分子的PLA納米粒子的制備 先將祀向分子連接到高分子表面活性劑的親水聚氨基酸鏈段的末端。W連接ACUPA短 膚祀向分子到VE-poly(EG3-Glu)i4.4聚合物為例，首先將聚合物末端胺基轉化為簇基，具體 方法如下：將VE-polWEG廣G1u)i4.4(900 mg, 0.20 mmol),下二酸酢（24.0 mg, 0.24 111111〇1)，014?(24.4 111旨，0.20 111111〇1)和^乙胺（20.4 111旨，0.20 111111〇1)溶解在9毫升的無水1， 4-二氧六環中，室溫攬拌24小時;反應結束，旋蒸除去溶劑，再用少量二氯甲燒溶解，然后過 濾收集濾液，用無水乙酸沉淀，離屯、，最后真空干燥，得到VE-poly(EG3-Glu)i4.4-C00H，產率 78.1%。接著，用抓C/NHS活化VE-poly 化G3-G1u)i4.4-C00H末端簇基，將VE-polyUG3-Glu )14.廣C00H(680mg，0.15 mmol)，NHS巧 1.8 mg，0.45 mmol)和抓(X57.5 mg，0.30 mmol)溶解 在二氯甲燒（6.8 mL)中，室溫反應24小時后，用無水乙酸沉淀，離屯、，真空干燥，得到VE- poly 化 G3-G1u)i4.4-NHS，產率 87.1%。最后，將制得的 VE-poly 化 G3-G1u)i4.4-NHS 與含氨基的 ACUPA祀向分子反應，具體的，先將ACUPA(44.7 mg，0.14 mmo 1)和VE-po 1 y 化G3-G1U) 14.4-NHS (585mg，0.13 mmol)溶解在DMF(6 mL)中，再在30°C反應2天。反應后，用無水乙酸沉淀，離 屯、，真空干燥，得到帶祀向分子的VE-poly(EG3-Glu)l4.4-ACUPA聚合物，產率77.9%。然后，按 照實施例立類似的方法用VE-poly化G3-G1u)i4.4-ACUPA為高分子表面活性劑制備得到表面 含有ACUPA祀向分子的PLA納米粒子，該納米粒子表面含有的祀向分子密度可W通過調節高 分子表面活性劑的濃度來控制。
[0030] 用相似方法可W將其它祀向分子如cRGD、iRGD、AP、奧曲膚、TAT、Angiopep-2、 1尺60、了7、(：116叫1^(16、抗體及其片段、半乳糖化31)、葉酸、生物素等連接到納米粒子表面， 從而實現納米粒子的表面功能化和作為藥物載體包載藥物后納米藥物的祀向輸送。
[0031] 表3用VE-poly化G2-G1U)日表面活性劑制備PLGA納米粒子(PLGA NPs)及在其表面 引入透明質酸(HA)，制得表面交聯且含祀向分子的納米粒子(HA-PLGA NPs)表征
實施例五表面可逆交聯且含有轉鐵蛋白（Tf)祀向分子的PCL納米粒子的制備 首先將轉鐵蛋白的N-糖巧鏈氧化制備醒基官能化的轉鐵蛋白（Tf-CHO)，將轉鐵蛋白 (Tf，25mg)溶解在900 μL的醋酸鋼(0.1M，pH5.5)溶液中，再向其加入225 μL高艦酸鋼溶 液巧0 ml),在室溫下反應1 h后。反應后，在4°C條件下用Se地adex G-25色譜柱（1.8 X 25 cm)提純(流動相為醋酸鋼(0.1 M，pH 5.5)溶液），制備得到Tf-CHO。將Chol-poly化G2-ASP) 19.1的末端胺基轉化為簇基，接著，用抓C/NHS活化;接著與Tf-CHO反應得到祀向聚合物;然 后，用祀向聚合物為高分子表面活性劑制備rcL納米粒子，將0.9 mL P化的丙酬和四氨巧喃 溶液（10 mg/mL)逐滴滴加到9 mL祀向聚合物水溶液(0.45 mg/mL)中，室溫攬拌6 h，使丙 酬和四氨巧喃揮發，然后離屯、收集納米粒子，并用二次水洗一次，除去自由的乳化劑，制備 得到表面含轉鐵蛋白（Tf)祀向分子的PCL納米粒子。動態光散色結果顯示該納米粒子的平 均直徑約為150 nm。
[0032] 實施例六納米粒子對疏水藥物的裝載及體外釋放 用納米粒子包載疏水藥物紫杉醇(PTX)為例，先將PTX和化GA(理論載藥量8 wt.%)溶 解到丙酬溶液中，再逐滴滴加該溶液到VE-poly化G2-G1U)日高分子表面活性劑的水溶液 (0.45 mg/mL)中，室溫攬拌6 h，使丙酬揮發，然后離屯、收集納米粒子，并用二次水洗涂除去 自由的乳化劑，制備得到包載有PTX的PLGA納米粒子(PTX-PLGA NPs)。
[0033] 納米粒子的粒徑和粒徑分布可用動態光散射測量分別為164 nm和0.16。納米粒子 的載藥量可用高效液相色譜(HPLC)測定。先取0.2 mL PTX-化GA NPs的溶液，凍干稱重。再 用水和乙臘巧0:50，v/v)重新溶解，經0.45 μπι濾膜過濾后，用HPLC測定載藥量(DLC)和載 藥效率(DLE)分別為6.4 wt.%和80.1%。用相似的方法可用VE-poly(EG2-Glu)5高分子表面活 性劑制備納米粒子實現對其它憎水性藥物如多西紫杉醇（DTX)、喜樹堿(CPT)、伊立替康 (INT)、長春新堿(VCR)、拓撲替康(TPT)、貝洛替康(BLT)、長春瑞濱(NVB)、阿霉素(D0X)等的 包載，其結果見表4。
[0034] 表4用VE-poly化G2-G1u)5制備的包載疏水藥物的納米粒子
PTX的體外釋放實驗是在37 °C恒溫搖床中震蕩（200 rpm)進行，有Ξ個平行樣。將0.5 mL的PTX-HA-PLGA NPs載藥納米粒子溶液置于透析袋(MWC0 12000-14000 Da, Spec化um Laboratories, USA)中，然后將該透析袋放到含有吐溫80(0.1%, v/v)的PB(10 mM, pH 7.4)緩沖溶液(25 mL)中進行體外釋放實驗。每間隔一定時間，從釋放介質中取出5.0 mL溶 液用作測試，同時向試管中補加5.0 mL相應介質。將取出的釋放介質溶液凍干，再加入0.5 mL乙臘/水（1:4，v/v)溶解，然后用HPLC測定溶液中藥物濃度，最終觀察到PTX從PTX-HA- PLGANPs累計釋放量隨時間變化的行為，結果表明在PBα0mM，pH7.4)介質中，大約有 54.0%的PTX在7天后從HA-PLGA NPs中釋放出來。
[0(X3日]實施例屯MTT法分析空納米粒子(HA-PLGA NPs)的細胞毒性 選用正常細胞（小鼠成纖維L929細胞）和腫瘤細胞（人乳腺癌MCF-7,人腦膠質瘤MG U87)用MTT法測試HA-PLGA NPs的細胞毒性。首先將細胞種在96孔板上（1 X 104個細胞/孔）， 經24小時培養至細胞貼壁約70%。然后，加入不同濃度（10-350 pg/mL)的HA-PLGA空納米粒 子樣品。培養48小時后，向每孔加入10化的MTT巧.0 mg/mL)溶液，再接著培養4小時。隨 后，向每孔加入150化DMSO溶解生成的結晶子，并用酶標儀于492皿處測吸光度值(A),計 算細胞存活率。用細胞空白對照孔和培養基空白孔為參照。測試結果表明空納米粒子導致 腫瘤細胞的存活率明顯降低。例如MCF-7腫瘤細胞與350 pg/mL的空納米粒子作用后，其存 活率下降到約60%。運說明本發明的聚合物作為高分子表面活性劑制得的化GA NPs對腫瘤 細胞具有一定的殺傷力。相反，L929正常細胞即使與濃度高達350 pg/mL的空納米粒子作 用，其存活率仍然大于90%。運說明本發明的聚合物作為高分子表面活性劑制得的PLGA NPs 具有良好的生物相容性，克服了現有乳化劑有毒、生物相容性差的缺陷。
[0036] 實施例八載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)體外細胞毒性 用MTT法分析PTX-HA-化GA NPs對MCF-7 (表面過度表達CD44受體)腫瘤細胞的毒性。首 先將細胞種在96孔板上（IX 104個細胞/孔），經24小時培養至細胞貼壁約70%。然后，加入 PTX-HA-PLGA NPs，PTX濃度范圍選定為0.0005、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 和10 yg/mL。培養4小時后，吸出含載藥納米粒子的培養液，然后添加新鮮培養基繼續解育 44 h。再向每孔加入10化的MTT巧.0 mg/mL)溶液，接著培養4小時。隨后，向每孔加入150 化DMS0溶解生成的結晶子，并用酶標儀于492 nm處測吸光度值(A)，計算細胞存活率。實驗 用PTX臨床制劑Taxol作對照。另外為證實表面含HA的納米粒子具有祀向性，我們添加了一 組細胞表面受體封閉實驗，具體方法是：首先將MCF-7細胞與過量的HA大分子巧mg/mL)解 育4 h，使HA大分子結合并占據了細胞表面的CD44受體，然后再加入PTX-HA-PLGA NPs,分析 其細胞毒性。實驗結果顯示PTX-HA-PLGA NPs對過量表達CD44受體的MCF-7腫瘤細胞有較高 毒性，其半致死濃度aC5G= 0.37 yg/mL)低于化xoiaC5G= 0.82 yg/mL)，運說明載藥納米 粒子在體外有較高的抗腫瘤活性。另外，載藥納米粒子對表面受體封閉后的MCF-7細胞的毒 性大大降低，其IC50為2.16蛇/血，運說明PTX-HA-化GA NPs主要是通過受體介導方式進入 腫瘤細胞，具有很好的腫瘤祀向性。
[0037] 實施例九載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)的體內抗腫瘤活性 體內抗腫瘤活性實驗是用荷MCF-7人乳腺癌Ba化/c裸鼠（18~20克，4~6周齡)進行。首 先通過在裸鼠皮下注射MCF-7人乳腺癌細胞巧X106個/只）建立皮下乳腺癌腫瘤模型，等腫 瘤長大到約50-80 mm3時（大約1周）開始進行治療。治療共分兩組，即載藥納米粒子(PTX- HA-PLGA NPs)和PTX臨床制劑(Taxol)，用空納米粒子(HA-PLGA NPs)和生理鹽水(PBS)作為 對照組。將給藥起始日定義第0天，分別在第〇、3、6、9和12天通過小鼠尾靜脈注射給藥(PTX 藥量為5 mg/kg)。在治療期間，觀察荷瘤小鼠的腫瘤體積、體重變化和存活率。小鼠的體重 是每S天稱量一次。小鼠的腫瘤體積用游標卡尺測量，計算方法為:V=化XWXH)/2,（其中L 為腫瘤的長度，W為腫瘤的寬度，Η為腫瘤的厚度）。持續觀察小鼠的生存到38天。實驗過程中 小鼠自然死亡或腫瘤體積大于1000 mm3時，判定為死亡。結果發現PTX-HA-PLGA NPs和 Taxol都能在一定程度上抑制腫瘤的生長，而且PTX-HA-PLGA NPs表現出了明顯更優越的抑 制腫瘤生長效果，在靜脈注射載藥納米21天后，腫瘤仍能得到很好地抑制，無明顯增長。體 重測試結果顯示PTX-HA-PLGA NPs不會引起小鼠體重明顯變化，運證實了PTX-HA-PLGA NPs 不會產生明顯的毒副作用。Kaplan-Meier生存曲線觀察結果顯示荷瘤老鼠經靜脈注射ΡΤΧ- HA-PLGA NPs后，在整個治療周期沒有出現死亡；而PBS組和空白納米粒子組動物在治療38 天后全部死亡，Taxol組也有60%的動物在治療觀察結束后死亡。H&E染色后的組織學分析表 明PTX-HA-PLGA NPs能誘導腫瘤細胞大面積壞死，而對肝臟、腎臟等正常組織無明顯毒性； 而化xol雖然能在一定程度上殺死腫瘤細胞，但同時也會導致正常組織(肝臟和腎臟）的損 傷。因此，用本發明的高分子表面活性劑制備的載藥納米粒子能將藥物祀向輸送到病灶部 位，實現明顯增強的療效;同時還大大減小了小分子憎水藥物的毒副作用。
[0038]綜上可知，本發明基于聚氨基酸的生物可降解性聚合物可W作為表面活性劑，與 PLGA、PLA、P化或陽G-PLA等形成納米粒子，增加了聚合物的生物可降解性W及功能性，進一 步的，還可W加入祀向分子，得到祀向納米粒子，用于藥物的載體，不僅增加藥物富集率，提 高藥物祀向能力，更解決了現有載體存在的生物可降解性差、有毒、不穩定的缺陷。
【主權項】
1. 一種基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特征在于，包括如 下步驟： (1)以疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯為原料，在無水二氯甲烷和吡啶中，反 應得到對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子;然后以對硝基苯基氯甲酸酯活化的 功能性疏水小分子和二胺化合物為反應物，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應制備疏水性胺 基化合物； (2 )以疏水性胺基化合物作為引發劑，開環聚合Ct-氨基酸-N-羧基內酸酐化合物得到基 于聚氨基酸的聚合物;所述氨基酸-N-羧基內酸酐化合物為γ -寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基內酸酐或寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基內酸酐； (3)將基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA的丙 酮溶液，攪拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子。2. 根據權利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特 征在于:步驟(1)中，疏水性羥基化合物包括維他命E、膽固醇、香豆素、膽酸、喜樹堿、伊立替 康；二胺化合物選自以下化合物中的一種：乙二胺、丁二胺、辛二胺、賴氨酸甲酯、賴氨酸乙 酯、鳥氨酸甲酯、鳥氨酸乙酯、胱氨酸甲酯、胱氨酸乙酯、胱胺。3. 根據權利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特 征在于:步驟（1)中，疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯和吡啶的摩爾比為1: 2:5;對 硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子、乙二胺和吡啶的摩爾比為1:20:20。4. 根據權利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特 征在于:步驟(1)中，制備對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子時，在0°C度條件下 滴加對硝基苯基氯甲酸酯，再在30°C反應24小時；制備疏水性胺基化合物時，反應溫度為室 溫，時間為24小時。5. 根據權利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特 征在于:步驟(2)中，疏水性胺基化合物、α-氨基酸-N-羧基內酸酐化合物的摩爾比為1:3~ 25;疏水性胺基化合物的分子量大于240。6. 根據權利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特 征在于:步驟(2)中，制備基于聚氨基酸的聚合物時，反應溫度是25~50°C，反應時間為12~ 72小時。7. 根據權利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特 征在于:步驟(3)中，將基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后在EDC/NHS催化條件下，與 短肽、單糖、葉酸、生物素或者抗體分子反應，制得含靶向分子表面活性劑;然后含靶向分子 表面活性劑中逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA的丙酮溶液，得到基于聚氨基酸的功能性 生物可降解納米粒子。8. 根據權利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解納米粒子的制備方法，其特 征在于:步驟(3)中，在室溫下攪拌揮發除去有機溶劑，離心收集得到基于聚氨基酸的功能 性生物可降解納米粒子。9. 一種藥物，包括疏水藥以及權利要求1所述制備方法制備的基于聚氨基酸的功能性 生物可降解納米粒子。10. 根據權利要求9所述藥物，其特征在于:疏水藥包括紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿、伊 立替康、長春新堿、拓撲替康、貝洛替康或者長春瑞濱。
【文檔編號】C08G69/48GK105879048SQ201610307271
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】鄧超, 武金田, 孟鳳華, 鐘志遠
【申請人】蘇州大學張家港工業技術研究院