Hpma-多西他賽或吉西他濱綴合物及其用圖【專利摘要】本發明公開了HPMA?多西他賽或吉西他濱綴合物及其用途，具體地公開了通過將吉西他濱或多西他賽綴合到水溶性聚合物(例如N?2?羥丙基異丁烯酰胺(HPMA))上而形成的吉西他濱和多西他賽水溶性組合物。本發明還公開了使用本發明組合物治療癌癥的方法。【專利說明】ΗΡΜΑ-多西他賽或吉西他濱綴合物及其用途[0001]本申請是中國專利申請CN200980148874.9的分案申請，原申請是國際申請號PCT/US2009/059869于2011年6月3日進入中國國家階段的申請。
技術領域：
[0002]本發明設及包含抗癌劑(例如吉西他濱或多西他賽)和/或祀向配體(例如RGDfK、EPPT1膚或葉酸)與N-(2-^丙基)異下締酷胺化PMA)之綴合物的組合物，W及利用所述組合物將運些綴合物遞送至細胞的方法。【
背景技術：
】[0003]多西他賽(泰索帝（Taxotere))是最重要的一類新型腫瘤藥物的成員之一。然而，其差的溶解性提出了藥學上的挑戰，且新出現的數據表明了特定的組織暴露特性(例如延長時間的低藥物濃度)可增強有益的抗腫瘤機制。由于多西他賽主要的缺點在于其高度親脂并且幾乎不溶于水，因此配制多西他賽制劑所考慮的因素已被廣泛地研究。為了臨床使用，在共溶劑體系中將其配制和施用。將藥物在聚山梨醋-80(USPDI)中W40mg/ml包裝。使用前，使用包含13%(V/V)乙醇的水溶液將其稀釋到lOmg/ml。施用前，將藥物在250ml鹽水或葡萄糖中進一步稀釋，達到0.3-0.9mg/L的終濃度。所述溶液在4小時內使用。一些明顯的特有副作用與多西他賽制劑相關。延緩發生的胸腔積液和水腫已在一些病例導致中止治療。由于與施用紫杉燒(taxane)所需的共溶劑相關的毒性，已經研究了多種替代性的多西他賽組合物，其包括合成多西他賽類似物、包埋到脂質體中和制備聚合物-多西他賽綴合物。關于制備聚合物-多西他賽綴合物，已經提出了一些聚合物，包括聚氨基酸(W02007/067417)和合成聚合物(例如聚乙二醇(PEG))。[0004]在過去幾年中，吉西他濱（Gemzar?,-種新喀晚核巧類似物)已經成為用于膜腺癌患者的標準化療劑。膜腺腺癌是美國癌癥死亡的第四大原因。全國每年新診斷28,000例病例。化學療法和放射療法在很大程度上無效，甚至在可能為治愈性的手術后也頻繁發生腫瘤轉移性疾病。該癌癥的1年生存率為20%，5年生存率只有1-3%。不多于25%的膜腺癌患者將受益于吉西他濱。很明顯，迫切需要對該破壞性疾病的有效治療。為了提高吉西他濱在癌癥患者中的益處，在本發明中首次公開了聚合物-吉西他濱綴合物的新制劑。[0005]基于上述內容，現有技術中仍然需要對多西他賽和吉西他濱的修飾，所述修飾可保持或增加其腫瘤特異性活性，同時降低其毒性。【
發明內容】[0006]本發明設及抗癌劑(例如吉西他濱或多西他賽)和/或祀向配體(例如RGDfK、EPPT1膚或葉酸）與水溶性聚合物聚N-(2-^丙基)異下締酷胺化PMA)的綴合物，W及運些綴合物作為多西他賽或吉西他濱的特異性細胞內載體進入腫瘤血管內的用途。本發明還設及運些綴合物降低多西他賽或吉西他濱的毒性的用途W及治療癌癥的方法。[0007]在一個實施方案中，所述抗癌劑是多西他賽或吉西他濱。[0008]在另一個實施方案中，組合物還包含溶酶體可降解的氨基酸序列和寡膚，其包括但不限于G1廠Phe-Leu-Gly(SEQIDNO:1)、G1廠Ileu-Phe、Gly-Val-Phe、Gly-Gly-Phe、Gly-Gly-Phe-Phe(SEQIDN0:2)、Gly-Ileu-Tyr、曲e、Gly、Gl廠Gly、Ala、Ser、Gl}r^he、G1廠Leu-I%e、G1廠曲e-I%e、G1廠D-曲e-I%e、Ala-Gl廠化1-化日（SEQIDNO:3)、G1廠Gl}^-Val-曲e(WQIDN0:4)、Gly-Phe-Tyr、Gly-B-Ala-Tyr、Gly-Lue、Gly-Phe-Gly、His-Ser-86尸1^73-1^日11-6111(5日910側：5)^及戊二酷-4-徑脯氨酷-41日-5日尸環六甘氨酷-6111-56尸Leu(沈QIDN0:6)。[0009]在另一個實施方案中，所述組合物包含HPMA共聚物-多西他賽或HPMA共聚物-吉西他濱的祀向膚，例如RGDfK、EPPT1膚或葉酸。在此情況下，所述祀向系統包括將祀向配體(例如RGMK、EPPT1膚或葉酸)共價連接于所述聚合物。[0010]在本發明的又一個實施方案中，包含重均分子量（Mw)范圍在從約lOkDa到約250kDa、從約20kDa到約170kDa、從約50kDa到約250kDa、或從約lOOkDa到約170kDa的HPMA共聚物-藥物綴合物。本發明的另一些實施方案包含重均分子量(Mw)至少約20kDa、至少約50kDa、至少約lOOkDa、至少約125kDa或至少約150kDa的HPMA共聚物-藥物綴合物。[0011]因此，在某些實施方案中，本發明的特征在于具有或不具有祀向配體的高分子量HPMA共聚物-藥物綴合物。高分子量HPMA共聚物-藥物綴合物提供了未被當前藥物聚合物綴合物所啟示的優勢。例如，高分子量HPMA共聚物-藥物綴合物具有更長的血漿半衰期(ti/2)，致使在血流中循環時間更長。因為聚合物的鏈更長，所W即使藥物滲入具有相似的程度，也有更多的藥物連于每一條聚合物鏈上。因此，使用高分子量HPMA共聚物-藥物綴合物可提供將更大量藥物遞送到腫瘤部位。[0012]進一步，將祀向配體或部分連接到聚合物-藥物綴合物上導致藥物對腫瘤細胞的特異性增強。在一些實施方案中，所述祀向配體可為RGDfK、EPPTl或葉酸。此效果與高分子量HPMA共聚物-藥物綴合物的被動腫瘤聚積作用一起，通過增加腫瘤特異性、提高穩定性和降低毒性而產生高治療效果。因此，該系統在遞送用于癌癥治療的治療劑方面具有巨大的潛力。[0013]本發明的另一實施方案提供了遞送治療劑的方法，包括向對象施用有效劑量的與HPM共聚物綴合的多西他賽或吉西他濱。[0014]本發明的另一實施方案提供了使用包含與多西他賽或吉西他濱綴合的HPMA共聚物的組合物來遞送治療劑到細胞的方法。【附圖說明】[0015]圖1為顯示HPMA-G化G-多西他賽(D0C)綴合物在皮下注射了Mia-化ca人膜腺癌細胞之裸鼠中對腫瘤生長的抑制作用的圖。有效性表示為作為時間（天)之函數的腫瘤尺寸變化倍數。[0016]圖2為顯示HPMA-G化G-多西他賽(D0C)綴合物在皮下注射了HCT116人結腸癌細胞之裸鼠中對腫瘤生長的抑制作用的圖。有效性表示為作為時間（天)之函數的腫瘤尺寸變化倍數。[0017]圖3為顯示HPMA-GFLG-吉西他濱(GEM)綴合物在皮下注射了HCT116人結腸癌細胞之裸鼠中對腫瘤生長的抑制作用的圖。效力表示為作為時間（天)之函數的腫瘤尺寸變化倍數。"G化護如沈QIDNO:1所公開。【具體實施方式】[0018]下面詳細地描述本發明的實施方案。在描述實施方案時，出于清楚的目的，使用特定術語。然而，本發明不意在限于所選擇的特定術語。當討論具體的示例性實施方案時，應當理解運樣做僅僅是為了說明意圖。相關領域的技術人員將認識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下，也可使用其他的組分和結構。本文中引用的所有參考文獻通過引用并入本文，如同其各自均單獨并入本文中一樣。[0019]A.基于聚合物的治療法[0020]游離的抗癌藥物擴散在整個細胞中，而不能集中到特定的亞細胞部位。另外，如果運些藥物通過靜脈施用，則它們全身性地分布于身體的所有組織。運些藥物在非目的分布部位的作用導致可觀測的全身性副作用。因此，使藥物定位于作用所需的身體部位是優選的。將運些藥劑祀向至它們最有效的亞細胞部位，提高了它們的效力且降低了它們的毒性。[0021]抗癌藥物的腫瘤祀向可通過"被動祀向"和"主動祀向"來實現。被動祀向通過將抗癌藥物滲入或連接于大分子載體(例如水溶性聚合物)上來實現。主動祀向通過滲入對癌細胞表面的識別分子(受體)具有特異性的細胞祀向部分來實現。[0022]當與正常組織比較時，聚合物優先定位于實體瘤。運是由于被稱為增強的滲透和駐留化nhanced化rmeabilityandRetention,^PR")效應而發生，該效應歸因于腫瘤組織的形態學改變，其中由于新血管發生產生的有漏隙的血管系統導致血管內容物泄漏到細胞外組織中。另外，淋己系統可被阻滯，其導致大分子藥劑在腫瘤細胞周圍的細胞外組織中聚積。可利用該現象將藥物與聚合物連接而祀向腫瘤細胞。由于聚合物定位于腫瘤細胞周圍，因此連接于聚合物的藥物也可W更高的濃度圍繞腫瘤周圍。與聚合物連接的藥物W內吞作用攝取到細胞內。然而，由于藥物保持共價連接于聚合物骨架，因此它們可能不像游離藥物一樣有效。運可W通過使用可生物降解或可水解的膚序列將藥物連接到聚合物骨架上來克服。選擇序列使得它們能夠在特定環境下在細胞內降解。[0023]基于聚合物的治療具有大的流體力學體積，其轉化為更長的血管內半衰期。基于聚合物的治療法還增大了難溶性藥物的溶解度和生物利用度。由基于聚合物的治療法所帶來的其他優勢包括最大耐受劑量增加、非特異性毒性降低、調亡誘導作用增強和替代性信號途徑的活化化opecek等，AdvancesinPolymerScience,122(Biopolymers11):55-123(1995))。[0024]另外，腫瘤細胞常具有表面分子，所述表明分子或者在正常組織不具有，或者與正常組織相比過表達。運些可包括生長因子受體和/或某些抗原。將結合運些分子的識別分子與聚合物相連產生在腫瘤局部環境中的高濃度聚合物。運些祀向部分包括抗體和細胞表面受體的膚配體。由運些識別分子中的一些與其受體的結合所引發的受體介導的內吞作用可導致增加的細胞內濃度和相應的增強的治療效果。[0025]處于臨床試驗中的幾種聚合物-藥物綴合物包括基于HPMA-共聚物或基于PGA的綴合物。HPMA共聚物是生物相容的、非免疫原性且無毒的載體，其能夠特異性遞送入腫瘤細胞，克服藥物相關毒性的限制（Duncan等，Hum.E邱.Toxicol.,17:93-104(1998))。此外，它們的體內分布得到了良好表征，且已知它們由于增強的滲透和駐留化PR)而選擇性地聚積在腫瘤部位。該綴合物也包括針對內皮細胞增殖部位或癌細胞或與增殖細胞相關的特異性受體或標記物的祀向配體。目前有兩種聚谷氨酸-藥物綴合物和六種HPMA共聚物-藥物綴合物處在臨床試驗的不同階段，且進一步地包括葡聚糖-藥物綴合物和PEG-藥物綴合物的聚合物-藥物綴合物也報道處于臨床或臨床前開發中。[0026]本發明的化合物具有運些屬性，其增加抗癌劑的遞送，此外，與其他抗癌藥的策略相比，所公開的組合物增強對特定細胞類型的祀向和被祀向癌細胞的攝取。[00的]B.化合物[0028]本文中使用的術語"HPMA"表示化合物N-(2-^丙基)異下締酷胺，為下述結構代表的親水聚合物：[0029][0030]本發明的"抗癌劑"在特定的實施方案中是多西他賽或吉西他濱。[0031]相比于其它HPMA-藥物綴合物，本發明的優勢在幾個方面：[0032]首先，本發明綴合物的分子量大于臨床上評價的HPMA藥物綴合物。已知的處于臨床前或臨床試驗中的HPMA共聚物-藥物綴合物的分子量為~25-50W)a，而本發明的某些實施方案設及分子量為~100-170kDa的HPMA。分子量增加的HPMA綴合物具有更長的血漿駐留時間和通過增強的EPR而增加的被動腫瘤祀向。本發明的另一些實施方案的HPMA共聚物-藥物綴合物的重均分子量(Mw)范圍為約lOkDa至約250kDa、約20kDa至約170W)a、約50kDa至約250kDa、或約lOOkDa至約170kDa。本發明的另一些實施方案包含至少約20kDa、至少約50kDa、至少約100W)a、至少約125kDa、或至少約150kDa的重均分子量(Mw)的HPMA共聚物-藥物綴合物。高分子量藥物-聚合物綴合物可利用本文中公開的合成方法獲得。[0033]除增加的循環時間外，使用高分子量綴合物還可提供對特定部位提高的藥物遞送。尤其是在藥物滲入的程度(基于百分比或摩爾百分比)對低分子量和高分子量類型是相似的情況下，單個聚合物鏈將比更低分子量的鏈具有更高數量的藥物分子。因此，當本應使用低分子量時使用高分子量鏈，更多藥物將遞送至特定部位或腫瘤。運使得顯著更高局部濃度的藥物出現在腫瘤周圍。[0034]第二，本發明的另一個新穎性在于制備包含腫瘤特異性祀向配體（例如RGDfK、EPPT1膚或葉酸)的第二代HPMA-多西他賽或吉西他濱綴合物。通常，被動祀向的HPMA綴合物在臨床試驗中成功的是少數，主要是由于藥物僅通過被動擴散在實體瘤中聚積有限和臨床上癌癥的異質性。考慮到腫瘤生理學的變化，主動祀向策略允許祀向到多種細胞類型，在最大限度地分布于實體瘤的微環境中，同時使它們在其它器官中的非特異性攝取最小化。主動祀向策略還可W通過(1)增加腫瘤特異性；（2)改善藥代動力學;和(3)降低毒性而顯著提高治療效率。近些年來已經出現了幾個此類的策略，可利用此策略來顯著改善抗腫瘤藥的腫瘤定位。通過連接分子標記物(例如膚或抗體)實現的聚合物藥物遞送系統的主動祀向已經表現出顯著改善腫瘤定位。[0035]粘蛋白-1是一種在多數腺上皮細胞中表達的跨膜分子。幾個重要的特性使得粘蛋白-1成為具有吸引力的腫瘤祀向遞送的受體。[0036]首先，粘蛋白-1在幾乎所有的人類上皮細胞腺癌上過表達，包括90%的人乳腺癌、卵巢癌、膜腺癌、結腸直腸癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌和胃癌。此外，粘蛋白-1的表達已在非上皮細胞癌細胞系（星形細胞瘤、黑色素瘤和神經細胞瘤）中得到證實，W及在惡性血液病例如多發性骨髓瘤和一些B細胞非何杰金氏淋己瘤中得到證實，總共占人類中所有腫瘤的50%。[0037]其次，在腺癌組織中，由于腺體結構的遺失，粘蛋白-1在整個細胞表面上普遍表達。由于其桿狀結構，該分子在表面上伸出l〇〇-2(K)nm，其為多數膜分子長度的5-10倍。該性質使得粘蛋白-1成為治療探針可接近的祀點。[0038]第Ξ，盡管在正常組織中粘蛋白-1被嚴重糖基化(其分子量的50-90%是糖類），但粘蛋白-1在癌組織中被低糖基化。減少的糖基化作用允許免疫系統進入腫瘤相關的低糖基化粘蛋白-1抗原的膚核屯、，并顯露出在正常細胞中被掩蔽的表位。該特性使設計區分正常細胞和腺癌細胞的探針成為可能。[0039]第四，粘蛋白-1的胞外結構域(通過存在PDTRP(SEQIDN0:7)序列而定義)伸出細胞表面，因此干設腫瘤細胞表面上的粘附分子與其淋己細胞上配體間的相互作用，使得腫瘤表位更難W被免疫識別。因此，腫瘤抗原沒有應答于免疫治療的下調趨勢，且在腫瘤和腫瘤轉移期間粘蛋白-1表達同樣保持上調。運些特性在設計用于腫瘤進程不同階段的祀向藥物遞送中是重要的。[0040]許多研究已經關注于使用粘蛋白-1作為免疫治療祀標的可能性。已生產了多種單克隆抗體來識別串聯重復的免疫原性APDTRP(SEQIDNO:8)序列。然而，當抗體用作祀向分子時，運些蛋白質的免疫原性和長血漿半衰期是有害的。因此，使用小膚可減少運些弊端，因為膚配體是非免疫原性的且對受體具有高親和力和選擇性。名為EPPT1(YCAREPPTRTFAYWG(SEQIDN0:9)的合成膚已被開發作為特異性配體并且已表現出顯著的親和力化d=20μΜ)。用(99mTc)標記的EPPT舊被用于體內乳腺癌成像。W上列出的粘蛋白-1蛋白的所有特性使EPPT1成為用作腫瘤祀向配體的理想候選物。[0041]還已鑒定出許多腫瘤細胞W及相關的血管特異性受體將腫瘤細胞與正常細胞區分開來。ανβ3整聯蛋白是其中研究最多的一種且選擇性地在與新生血管相關的腫瘤中和在一些轉移性癌癥中過表達（Felding-化bermann等，Clin.Ε邱.Metastasis，19:427-436(2002))。包含Ξ膚序列Arg-Gly-Asp(RGD)的高親和力αν盼選擇性配體已經通過隧菌體展示研究而被鑒定出來。構象受限的RGD序列（即環狀RGD)包含二硫鍵且比線性RGD膚結合ανβ3的程度高20-40倍化oivunen，E.，Wang，B.和Ruoslahti，E.，Biotechnology(N.Y.)，13:265-270(1995))。已將RGD膚與阿霉素綴合（Arap，W.，Pasqualini，R.和Ruoslahti，E.，Science,279:377-380(1998))用于祀向化療和祀向放療（Capello，A.等，J.Nucl.Med.，45:1716-1720(2004))。它們已被綴合到人源化抗體、脂質體、聚乙二醇和HPMA共聚物上，來改善生物分布和增加腫瘤聚積和抗腫瘤效力。運些研究使得RGD成為研究抗腫瘤藥物祀向的理想祀向配體。[0042]葉酸，其鹽，和/或其相應還原物(統稱為"葉酸"）由于用于核巧酸堿基生物合成的一碳轉移反應而被真核細胞所需要。葉酸的細胞攝取被身體許多細胞中存在的低親和力的還原葉酸載體化m~ΙμΜ)或者被表現出高度有限分布的高親和力連接糖基憐醋酷肌醇的葉酸受體(FRKKD=~1(Κ)ρΜ)所促進。FR在健康細胞上表現出有限的表達，但常大量存在于癌細胞上。例如，FR在卵巢、乳腺、結腸、肺、前列腺、鼻、咽喉和腦的上皮癌上過表達。FR還在骨髓源性造血系統惡性腫瘤(包括慢性和急性骨髓性粒細胞性白血病)上過表達。已經觀察到在FR表達與腫瘤的分級和組織學階段之間的強相關性。已經設計了多種葉酸連接的分子和復合物，其能夠將藥物選擇遞送到癌細胞的FR上并活化巨隧細胞。其他特性包括低分子量(MW441)，水溶性，對多種溶劑、抑和熱的穩定性、化學上易于綴合，無免疫原性W及對其受體的高親和力等使得葉酸成為有吸引力的用于藥物祀向的配體。[0043]本文中公開了可用于例如抗癌治療的化合物。運些化合物通常增加或改變抗癌化合物或其它治療化合物的祀向遞送。運些化合物可包含抗癌劑、載體分子、任選的連接分子和任選的祀向配體。在某些實施方案中，所述連接劑可W是寡膚，例如Gly-Phe-Leu-Gly(SEQIDN0:1)。在某些實施方案中，所述祀向配體可W是例如RGMK、EPPT1或葉酸。[0044]本文還公開了包含抗癌劑、載體分子、W及任選的連接分子和任選的祀向配體的化合物，其中所述抗癌劑、所述載體分子、所述連接分子和所述祀向配體通過一個或多個共價鍵相互連接。[0045]所述抗癌劑、載體分子、任選的連接分子和任選的祀向配體可W有多種方式相互連接。在一些實施方案中，所述抗癌劑、載體分子、任選的連接分子和任選的祀向配體可直接相互連接。在另一些實施方案中，所述抗癌劑通過共價鍵或者通過連接分子連接到載體分子上。[0046][0047]在另一些實施方案中，連接分子通過共價鍵與載體分子直接連接，且所述抗癌劑與所述連接分子直接連接。[004引[0049]在另一些實施方案中，抗癌劑通過共價鍵與所述載體分子直接連接，且祀向配體通過共價鍵與所述載體分子直接連接。[(K)加][0051]在另一些實施方案中，連接分子通過共價鍵與所述載體分子直接連接，所述抗癌劑與所述連接分子直接連接，并且祀向配體通過共價鍵與所述載體分子直接連接。[0化2][0053]在另一些實施方案中，連接分子通過共價鍵與所述載體分子直接連接，祀向配體與所述連接分子直接連接，并且抗癌劑通過共價鍵與所述載體分子直接連接。[0化4][0055]在另一些實施方案中，連接分子通過共價鍵與所述載體分子直接連接，抗癌劑與所述連接分子直接連接，且祀向配體與不同的連接分子直接連接，所述不同的連接分子通過共價鍵與所述載體分子直接連接。[0化6][0057]W下詳述用于制備化合物的所述抗癌劑、載體分子、連接分子和祀向配體。[0化引1.抗癌劑[0059]抗癌劑意為可用于抗擊癌癥的任何藥劑。可使用任何可與載體分子和/或連接分子直接或間接連接的抗癌劑。可與所公開的組合物一起使用的抗癌劑的部分清單可在例如美國專利5,037883中找到，其在此通過引用并入本文，并且其中所引用的包括抗癌劑的任何公開物和專利或專利申請也并入本文。美國專利6，348，209、6，346，349和6，342，221也描述了與抗癌化合物相關的試劑。抗癌劑的類別包括但不限于化療劑、細胞毒素、抗代謝物、燒化劑、蛋白激酶抑制劑、蔥環類、抗生素、抗有絲分裂劑(例如抗微管蛋白劑）、皮質激素、放射性藥物、和蛋白類(例如細胞因子、酶或干擾素）。具體的實例包括但不限于多西他賽、吉西他濱、伊馬替尼(Gleevec液)、5-氣尿喀晚、9-氨基喜樹堿、氨基修飾的格爾德霉素(geldanamycin)、阿霉素、紫杉醇（化又0瞄）、丙卡己阱、徑基脈、內消旋-e-二氨化酪J員銷、Gd(+3)化合物、天冬酷胺酶和放射性核素(例如Ι-131、Υ-90、Ιη-111和Tc-99m)。有許多抗癌劑是本領域所知的且許多在繼續開發。[0060]基于W下說明，本領域技術人員能夠對抗癌劑進行必要的化學修飾，W將抗癌劑連接到載體分子或連接分子上。[0061]2.載體分子[0062]可使用任何載體分子。典型的載體分子是聚合物分子。典型的載體聚合物分子為至少約5,000道爾頓的大分子。在另一些實施方案中，所述載體分子為至少約25,000道爾頓、至少約50,000道爾頓、至少約100,000道爾頓、至少約125,000道爾頓或至少約150,000道爾頓。載體分子可從約5，000道爾頓到約25，000道爾頓，或從約25，000道爾頓到約100，000道爾頓，或從約50，000道爾頓到約130，000道爾頓，或從約100，000道爾頓到約170，000道爾頓，或從約120，000道爾頓到約200，000道爾頓，或從約120，000道爾頓到約1，000，000道爾頓的范圍內變化。載體分子協助抗癌劑跨細胞膜的運輸。因此，當抗癌劑與載體分子直接或間接地相連時，其通常比單獨使用抗癌劑更好地跨越細胞膜。存在本領域中已知的多種載體和大分子載體，其作為載體分子發揮作用。載體分子的實例還描述于名稱為"Drugdeliverysystemforthesimultaneousdeliveryofdrugsactivatablebyenzymesandli曲t"的美國專利5,258,453;名稱為"Syntheticpolymeric化ugs"的美國專利5,037,883;名稱為"Hy化ophilicN，N-diethylacrylamidecopolymers"的美國專利4,074,039;名稱為"CopolymersbasedonN-substitutedacrylamides，N-substitutedmethacrylamidesandN,N-disubstitutedacrylamidesandthemethodoftheirmanufacturing"的美國專利4,062,831;名稱為"Solublehydrophilicpolymersandprocessforproducingthesame"的美國專利3,997,660;名稱為"Hy化ophilicnitritecopolymers"的美國專利3,931,123和名稱為"Solublehydrophilicpolymersandprocessforprocessingthesame"的美國專利3,931,111中。每一篇專利均單獨且特別地通過引用全文并入本文。[0063]在一個實施方案中，所述載體分子包括通過不飽和單體聚合反應而生產的聚合物。單體的實例包括但不限于丙締酸醋和甲基丙締酸醋。在一個實施方案中，所述載體分子是由N-(2-^丙基)異下締酷胺化PMA共聚單體)與包含共聚單體的藥物或祀向部分或顯像劑之聚合反應生產的共聚物。所得到的聚合物-藥物綴合物在本文中稱為HPMA共聚物。[0064]根據本發明制備的聚合物可具有從約1.0至約2.0的多分散性。在示例性實施方案中，所述多分散性從約1.3至約1.8,從約1.3至約1.5或從約1.5至約1.7。一些實施方案具有約1.4的多分散性，而另一些實施方案可具有約1.7的多分散性。[00化]3.連接分子[0066]"接頭"（"linker")指將藥物或祀向配體與載體分子在空間分隔開的基團。所述接頭可W是任何種類的實體，例如但不限于聚乙二醇、氨基酸、聚氨基酸(例如膚或寡膚）、或多膚(例如蛋白質），其任一端能夠與載體分子形成共價鍵，其另一端能夠與藥物或祀向配體形成共價鍵。接頭還可包含易于被溶酶體降解的特定序列的短膚，例如Gly-Phe-Leu-Gly(SEQIDN0:1)。對前列腺癌而言，其他實例包括祀向到前列腺細胞且和前列腺特異性抗原(PSA)的具有序列特異性蛋白水解能力的連接。例如，PSA水解His-Ser-Ser-Lys-Leu-Gln(沈910側：5)和戊二酷-4-徑基脯氨酷-41日-56'-環六甘氨酷-6111-56尸1^611(56910顯：6)。[0067]所述連接子通常可斷裂，從而可釋放出抗癌劑，例如，在還原條件下、氧化條件下，或者通過水解醋、酷胺、酷阱或形成連接子和抗癌劑間共價鍵的類似連接而進行。此外，連接子的類型可通過允許在細胞附近或在細胞內選擇性釋放抗癌劑來增強選擇性細胞毒性(并因此提高治療指數）。[0068]4.祀向配體[0069]術語"祀向配體"指可將本發明化合物遞送至特定部位W發揮所期望活性的分子，即，其提供化合物的定位。定位是由分子決定子的特異性識別、祀向劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水相互作用等所介導的。將藥劑祀向至特定組織或部位的其它機制是本領域技術人員已知的。祀向配體包括例如與祀細胞表面上的分子相結合的分子。示例性的祀向配體包括抗體、抗體片段、有機小分子、膚、類膚、蛋白質、多膚、寡糖、轉鐵蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β糖蛋白、6-〔5尸、61-〔5尸、1-〔5尸、6口0等。在本發明的示例性實施方案中，所述祀向系統包括將諸如RGDfK、ΕΡΡΤ1膚或葉酸的祀向配體共價連接到載體分子、連接子或抗癌劑上。[0070]5.細胞攝取的效力和特異性[0071]本文中所描述的化合物可其允許抗癌劑利用與單獨使用抗癌劑時不同的機制被細胞攝取來表征。有多種方法來確定載體分子是否增加了攝取的效力和/或特異性。效力和/或特異性的典型提高可W大于或等于至少2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5，000倍或10，000倍。[0072]C.制備化合物的方法[0073]可使用本領域已知的技術來制備本發明的化合物。正如所述的，使用多達4種組分來制備化合物:抗癌劑、載體分子、任選的祀向配體和任選的連接分子。在特別的實施方案中，本發明的化合物包括載體分子、抗癌劑、祀向配體和至少一個連接分子。前述任何組分均可W任何可能的組合或順序彼此反應來制備本發明的化合物。有時優選將兩種組分偶聯(即反應)在一起W制備新的反應產物或中間體，之后將所述中間體與下一組分化學連接。例如，抗癌劑可與載體分子反應生成抗癌/載體分子。類似地，抗癌劑可與連接分子反應生成抗癌/連接分子，或連接分子可與載體分子反應生成連接/載體分子。運些中間體中的每一種然后可與個體組分反應(例如，抗癌劑/連接子與載體分子反應W制備載體/連接子/抗癌劑），或者每一種中間體可彼此反應來制備化合物(例如，抗癌/連接分子與抗癌/載體分子的反應）。[0074]在一個實施方案中，所述化合物可通過下述方法來制備：（1)使連接子與用于制備載體分子的單體反應W制備單體/連接子分子，（2)使所述單體/連接子分子與抗癌劑反應來制備單體/連接子/抗癌劑，和(3)使所述單體/連接子/抗癌劑與至少一種共聚單體進行聚合反應。在某些實施方案中，所述至少一種共聚單體是HPMA共聚單體。[0075]在另一些實施方案中，所述化合物可通過下述方法來制備：（1)使連接子與用于制備載體分子的單體反應W制備單體/連接子分子，（2)使所述單體/連接子分子與抗癌劑反應來制備單體/連接子/抗癌劑，（3)使所述單體/連接子/抗癌劑與至少一種共聚單體進行聚合反應，和(4)使祀向配體與共聚物反應。在運些實施方案中，所述至少一種共聚單體包含可與祀向配體反應的反應位點。在某些實施方案中，所述至少一種共聚單體是HPMA共聚單體。在另一些實施方案中，所述至少一種共聚單體包含HPMA共聚單體和具有可被祀向配體替換的離去基團的第二共聚單體。[0076]在一個示例性實施方案中，所述化合物可通過下述方法來制備：（1)使異下締酷氯(MCI)與Gly-Phe(GF)反應并將產物與Leu-Gly(LG)偶聯來得到M-G化G-OH分子；（2)使MA-GFLG-OH分子與吉西他濱或多西他賽反應來得到MA-GFLG-抗癌分子；（3)使MA-GFLG-抗癌分子與HPMA共聚單體反應來制備HPMA共聚物-藥物綴合物。該方法詳細描述于W下的實施例1-2至1-8中。"G化護如沈QIDNO:1所公開。[0077]在另一個示例性實施方案中，使MA-G化G-OH與多西他賽（DCT)反應W產生MA-G化G-DCT，或與吉西他濱(GEM)反應W產生M-G化G-GEM。然后，使HPMA共聚單體與MA-G化G-DCT或MA-GFLG-GEMW及另一種包含離去基團的共聚單體（例如異下締酷基-甘氨酷-甘氨酸-對硝基苯醋(MA-GG-0化，如圖6所示））發生共聚W制備HPMA-GFLG-藥物-GG0化。然后使HPMA-GFLG-藥物-GG0化與祀向配體反應W得到HPMA-G化G-藥物-祀向配體。在某些實施方案中，所述祀向配體可W是例如RGDfK、EPPTl膚或葉酸。該方法詳細描述于W下的實施例1-9至1-12中。"G化護如沈QIDNO:1所公開。[007引如上所述，所述抗癌劑、載體分子和連接子可彼此直接或間接連接。此外，各組分彼此間的連接可根據所選擇組分的類型和所允許的組分間相互反應順序而不同。[0079]D.化合物的使用方法[0080]所公開的化合物可用于將抗癌劑祀向遞送至細胞。本文中公開的化合物可藥學可接受的形式W有效量施用給需要遞送抗癌劑或類似化合物的對象。所述對象可W是例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬，或者靈長類如猴、大猩猩、猩猩、黑猩猩或人。[0081]本文中所公開的綴合抗癌劑可用于抑制癌細胞增殖。抑制癌細胞增殖意指減少或防止癌細胞增長。抑制劑可通過利用癌細胞測定來確定。例如，可將任一癌細胞系在存在或不存在綴合抗癌劑或單獨抗癌劑或另外制備的不同于所述公開組合物的抗癌劑(例如，只是抗癌劑和載體)的情況下在96孔板上培養設定的任何時間段。然后可測定細胞。在某些實施方案中，所述綴合抗癌化合物是當通過所述測定法測定時相對于任何對照組將抑制10%或15%或20%或25%或30%或35%或40%或45%或50%或55%或60%或65%或70%或75%或80%或85%或90%或95%的生長的那些。其他實施方案包括抑制轉移腫瘤形成的組合物。運些組合物可W減少對照化合物的至少10%或15%或20%或25%或30%或35%或40%或45%或50%或55%或60%或65%或70%或75%或80%或85%或90%或95%的腫瘤轉移形成。[0082]在某些實施方案中，所公開的化合物可用于治療多種需要遞送抗癌劑或相似藥劑的病癥。在某些實施方案中，所公開的組合物可用于治療發生細胞增殖失控的疾病，例如癌癥。本文中使用的"治療"是指在被該狀況威脅或受該狀況折磨的對象中抑制、減少、調節、改善或阻斷至少一種癥狀，所述癥狀為病理學狀況的特征。不同類型癌癥的非限定性清單如下:癌、實體組織癌、鱗狀細胞癌、腺癌、肉瘤、膠質瘤、高級別膠質瘤、母細胞瘤、神經母細胞瘤、漿細胞瘤、組織細胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、含氧量低的腫瘤、骨髓瘤、轉移癌、或一般性癌癥。可用所公開的組合物來治療的具體實例包括B細胞淋己瘤、T細胞淋己瘤、葦樣肉芽腫病、霍奇金病、髓細胞性白血病、膀脫癌、腦癌、神經系統癌、頭頸癌、頭頸鱗狀細胞癌、腎癌、肺癌如小細胞肺癌和非小細胞肺癌、神經母細胞瘤/膠質母細胞瘤、卵巢癌、膜腺癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌、黑色素瘤，口、咽、喉和肺的鱗狀細胞癌，結腸癌，宮頸癌癥，宮頸癌，乳腺癌和上皮癌，腎癌癥，生殖泌尿器癌癥，肺癌癥，食管癌，頭頸癌，大腸癌，造血系統癌癥；睪丸癌;結直腸癌，前列腺癌或膜腺癌。[0083]本文中公開的化合物也可用于治療癌前病癥，例如子宮頸和肛口發育異常、其它發育異常、嚴重發育異常、增生、非典型增生和瘤形成。[0084]E.劑量[0085]化合物施用的劑量范圍為足W在遞送處產生所期望效果的量。劑量不應大到引起不良副作用，例如不想要的交叉反應、過敏性反應等。通常，劑量隨年齡、病況、性別和患者疾病的程度而不同，且可由本領域技術人員來確定。在存在任何禁忌癥的情況下，所述劑量可由各醫師調節。劑量可W每天一劑或多劑施用，可從約Img/kg至30mg/kg變化，給予一天或數天。[00化]F.可藥用載體[0087]任何化合物可W與一種或多種可藥用載體相組合而治療性地用于藥物組合物中。[0088]藥學載體是本領域技術人員所熟知的。它們大多通常為用于將組合物施用給人的標準載體，包括溶液例如無菌水、鹽水和生理抑下的緩沖溶液。其他化合物可根據本領域技術人員使用的標準程序來施用。[0089]可將旨在用于藥物遞送的分子配制為藥物組合物。除所選擇的分子外，藥物組合物還可包含載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等。藥物組合物還可W包含一種或多種有效成分，例如抗菌劑、抗炎劑、麻醉劑等。[0090]胃腸外施用的制劑包括無菌水或非水溶液、混懸液和乳液，其也可包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄攬油，和可注射的有機醋例如油酸乙醋。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或混懸液，其包括鹽水和緩沖介質。胃腸外載體包括氯化鋼溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鋼、乳酸化林格氏液或不揮發性油。靜脈內載體包括液體和營養補充劑、電解質補充劑(例如那些基于林格氏葡萄糖溶液的）等。還可存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、馨合劑和惰性氣體等。[0091]本文中所述的組合物也可W作為通過與無機酸或有機酸或無機堿或有機堿反應而形成的酸或堿加成鹽來施用，所述無機酸例如鹽酸、氨漠酸、高氯酸、硝酸、硫氯酸、硫酸和憐酸，所述有機酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酬酸、草酸、丙二酸、班巧酸、馬來酸和延胡索酸，所述無機堿例如氨氧化鋼、氨氧化錠、氨氧化鐘，所述有機堿例如單烷基胺、二烷基胺、Ξ烷基胺和芳基胺W及取代的乙醇胺。[0092]G.藥物組合物[0093]可W與載體材料組合W制備單劑量形式的活性成分的量可根據所治療的對象和特定施用方式而不同。[0094]使用本發明的化合物和/或組合物治療疾病狀況的施用方案根據多種因素來選擇，所述因素包括患者的類型、年齡、體重、性別、飲食和醫療條件，疾病的嚴重程度，施用途徑，藥理學考量因素如所應用特定化合物的活性、效力、藥代動力學和毒理學特性，是否利用藥物遞送系統W及是否所述化合物作為藥物組合之一部分施用。因此，實際上使用的施用方案可廣泛變化，并因此可能偏離上述的優選施用方案。[0095]可注射的制劑(包括例如無菌可注射水性或油性混懸液)可根據現有技術使用合適的分散劑或潤濕劑和助懸劑來配制。無菌可注射制劑也可W是在無毒的胃腸外可接受稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或混懸液(例如在1，3-下二醇中的溶液）。在可使用的可接受載體和溶液中包括水、林格氏溶液和等滲氯化鋼溶液。此外，無菌的不揮發性油通常作為溶劑或助懸介質使用。出于該目的可使用任何溫和的不揮發油，包括合成的甘油一醋或甘油二醋。此外，發現脂肪酸(例如油酸)用于可注射制劑中。[0096]雖然本發明化合物可作為唯一的藥物活性劑施用，但是它們也可W與一種或多種治療劑(例如免疫調節劑、抗病毒劑或抗感染劑)聯合使用。[0097]上述內容僅是對本發明的舉例說明，且不意在將本發明限于所公開的化合物。對本領域技術人員來說顯而易見的變化和改變旨在落入所附權利要求中所定義的本發明的范圍和本質內。從W上描述的內容來看，本領域技術人員可W容易地確定本發明的必要特征，而不背離本發明的精神和范圍，可對本發明作出多種變化和修改W使其適用不同的應用和條件。[0098]具體實施方案[0099]參考W下實施例，可進一步闡明本發明，所述實施例用于舉例說明一些優選的實施方案，但不W任何方式限制本發明。[0100]實施例1:用于藥物遞送的HPMA-吉西他濱或多西他賽綴合物的合成[0101]HPMA共聚單體藥物綴合物通過HPMA單體與活化的MA-GFLG-藥物(SEQIDN0:1)共聚單體W不同摩爾比的聚合作用來合成。[0102]1)HPMA共聚單體的合成[0103]如W前所述進行冊MA單體的合成化opecek和Bazilova，Eu;r.Polym.J.,9:7-14(1973))，如圖1所示。通過改良的多步反應制備了MA-GG-0化共聚單體化opecek等，Ann.NΥAcad.Sci.,446:93-104(1985))。[0104]方案1[0105][0106]在-5°C下于劇烈攬拌下向1-氨基-2丙醇(65.6ml，0.84mol)的250ml乙臘溶液中逐滴加入新蒸饋的異下締酷氯(14(：1)(411111，0.42111〇1，2〇1111乙臘中）。向溶液中加入少量抑制劑叔辛基鄰苯二酪。反應混合物在室溫下再攬拌30分鐘。作為副產物形成的1-氨基-2-丙醇鹽酸鹽沉淀且被濾除。將殘余物用預冷的乙臘洗涂。濾液冷卻至-70°C，HPMA沉淀出來。待平衡至室溫后，將產物濾出并用預冷的乙臘洗涂。從丙酬中重結晶分離出純品（烙點：67-69。(：）〇MS(ESI)m/z144(M+1).1hNMR(400MHz，CDCl3):δ1.20和1.22(d，J=6.4Hz，3H))，1.97(s，3H)，3.18-3.21(m，IH)，3.48-3.51(m，1H)，3.95-3.96(m，lH)，5.36(s，lH)，5.74(s，lH).[0107]2)MA-GF-OH的合成[0108]如圖2所述，通過異下締酷氯(MACl)與甘氨酷苯丙氨酸(GF)的反應制備了異下締酷基甘氨酷苯丙氨酸(M-GF-OH)。[0109]將甘氨酷苯丙氨酸(617-曲6,5.0旨，22.5111111〇1)溶于5.6111141^化細(22.5111111〇1)中并冷卻至0-5°C。逐滴加入在10ml二氯甲燒中的新蒸饋的MAC1(2.3g，22.5mmol)。加入少量抑制劑叔辛基鄰苯二酪w防止單體的聚合作用。同時但稍有延遲，向反應混合物中逐滴加入5.6ml(22.5mmol)4N化0H溶液。在加入MAQ和化0H后，將反應混合物溫熱至室溫并使其反應一小時。使pH保持在約8-9。將二氯甲燒層與水層分離，用2ml水洗涂并棄之。將合并的水層與40ml乙酸乙醋混合。在劇烈攬拌和冷卻下，緩慢加入稀肥1直到抑達到2-3。分離有機層并用乙酸乙醋萃取水層Ξ次。將合并的有機層用無水硫酸鋼干燥過夜。過濾經干燥的溶液并用乙酸乙醋洗涂。通過旋轉蒸發除去乙酸乙醋，得到白色粉末產品。從乙酸乙醋中重結晶（烙點：141.8-143.4°C)〇1h匪R(400MHz，CDCl3):Sl.96(s，3H)),3.06-3.20(2m，2H)，3.85-4.11(2m，2H)，4.83-4.85(m，lH)，5.41(s，lH)，5.79(s，lH)，7.20-7.30(m，5H).[0110]3)LG-0Me肥1的合成[0111]如圖2所示，由亮氨酷甘氨酸(LG)與亞硫酷氯/甲醇反應制備了亮氨酷甘氨酸-OMe(XG-〇me)。[0112]將亮氨酷甘氨酸化eu-Gly，4.0g21mmol)溶于35ml甲醇中并冷卻至-15°C。攬拌下逐滴加入稍過量的亞硫酷氯(S0Cl2)(2ml，26mmol)。待平衡至室溫后將混合物回流3小時。蒸發溶劑至干，將殘留物溶于甲醇中并再次蒸發除去痕量的HC1和S0C12。將殘留物溶于苯并蒸發W獲得白色無定形固體。粗產物化G-OMe.HCl)不經純化而用于隨后的步驟中。iHNMR(400MHz，DMS〇-d6):S〇.89-0.93(m，細），1.56-1.61(m，2H)),1.71-1.78(m，lH)，3.65(s，3H)，3.77-3.85(m，2H)，3.88-4.00(m，1H)，5.41(s，IH)，5.79(s，lH)，7.25-7.28(m，5H).[0113]4)MA-GFLG-0Me(沈QIDN0:1)的合成[0114]如圖2所示，由異下締酷基甘氨酷苯丙氨酸(MA-GF-OH)與亮氨酷甘氨酸-OMe(LG-OMe)反應制備了異下締酷基甘氨酷苯丙氨酷亮氨酷甘氨酸0Me(M-GFLG-0Me)(SEQIDNO:Do[0115]將4.0g1-徑基苯甲臘化0BT，25mmol)、4.0mlN，N'-二異丙基乙胺（DIEA，25mmol)和6.0gMA-Gly-Phe(20.7mmol)加入到含有5.0gLeu-Gly-OMeHCl(21mmol)的40ml二甲基甲酯胺(DMF)溶液中。攬拌反應混合物并冷卻至-10°C。在5分鐘內逐滴加入含5.2gN，N'-二環己基碳二亞胺(DCC，25mmol)的20mlDMF。將溶液在0°C攬拌2小時，然后在室溫下攬拌24小時。在將所析出的副產物攬拌過夜后，濾出二環己基脈(DCU)。將濾液旋轉蒸發W完全除去DMF。將殘留物與40ml5%化肥化溶液混合并用乙酸乙醋萃取Ξ次。將萃取物用40ml5%巧樣酸溶液、40ml5%化肥化溶液和飽和鹽水洗涂，并用無水硫酸鋼干燥。在濾出干燥劑后，將濾液在真空下濃縮W獲得產物(MA-GFLG-OMe(SEQIDNO:1))。由乙酸乙醋重結晶（烙點：140.9-143.0°C)。[0116]5)MA-GFLG-OH(沈QIDN0:1)的合成[0117]如方案2所示，由異下締酷基甘氨酷苯丙氨酷亮氨酷甘氨酸0Me(MA-GFLG-0Me(SEQ10^):1))的水解制備了異下締酷基甘氨酷苯丙氨酷亮氨酷甘氨酸(14-6化6-0則56910N0:1))。[011引將過量的1N化0H(18ml，18mmol)在攬拌下逐滴加入到含6.9gMA-GFLG-OMe(沈QIDNO:1)(14.5mmol)的80ml甲醇冷溶液中。在加入少量抑制劑(叔辛基鄰苯二酪)后將反應混合物在0°C攬拌一個半小時，然后室溫下攬拌2小時。來自之前反應的額外量的DCU副產物析出并被濾出。將濾液在真空下濃縮W除去甲醇，與160ml蒸饋水混合，用濃巧樣酸酸化至抑為2.0。將游離酸用4x200ml乙酸乙醋萃取，用飽和鹽水洗涂并用無水硫酸鋼干燥過夜。真空下蒸除溶劑后，將四膚產物（MA-GFLG-OH(SEQIDNO:1))由乙酸乙醋重結晶（烙點：161.4-165.6°C)0MS(ESI)m/z483(M+Na).[0119]方案2"GFL護如沈QIDN0:1所公開。[0120][0121]6)異下締酷基甘氨酷苯丙氨酷亮氨酷甘氨酷基-吉西他濱(MA-G化G-吉西他濱）(SEQIDN0:1)的合成(方案3)。[0122]持續攬拌下將1-徑基苯并Ξ挫（1.2X)溶液加入MA-GFLG-OH(沈QIDN0:1)的DMF溶液(lx)中。將溫度冷卻至-l〇°C并在攬拌下逐滴加入DCC(1.2x)的DMF溶液。然后向反應混合物中加入鹽酸吉西他濱的DMF溶液和N，N'-二異丙基乙胺。使反應混合物達到室溫。將析出的DCU濾出，旋轉蒸發除去DMF。通過柱色譜純化產物(硅膠，洗脫劑：乙酸乙醋/甲醇)并通過質譜(M+l=706.3)和化C進行分析。[0123]方案3"GFL護如沈QIDN0:1所公開。[0124][0125]7)異下締酷基甘氨酷苯丙氨酷亮氨酷甘氨酷基-多西他賽(MA-G化G-多西他賽）(SEQIDN0:1)的合成(方案4)。[01%]將MA-GFLG-〇H(SEQIDN0:1)溶于無水DMF中，在0°C下向該溶液中加入二異丙基碳二亞胺(DIPC，lx)、多西他賽（lx)和4-二（甲氨基）郵晚(DMAP，1.5x)。將所得溶液溫熱至室溫并放置16小時。將反應混合物用0.1NHC1洗涂，干燥，并真空干燥得白色固體產物，將其通過柱色譜純化（硅膠，洗脫劑：乙酸乙醋/甲醇）。產物通過薄層色譜和質譜驗證m/z1272.3(M+Na)〇[0127]方案4"GFL護如沈QIDN0:1所公開。[012引[0129]8)聚合物-藥物綴合物的合成[0130]ΗΡΜΑ共聚物-藥物(其中藥物代表吉西他濱和多西他賽)綴合物由共聚單體合成，如方案5所示，通過在丙酬（0.72ml)/DMS0(0.08ml)中在5(rC下使用N，N'-偶氮二異下臘(ΑΙΒΝ，4.4mg)作為引發劑，由ΗΡΜΑ共聚單體(86.7mg，0.603mmol)與MA-GFLG-藥物(SEQIDN0:1)(其藥物為多西他賽的情況為5mg，0.004mmol)24小時的自由基沉淀共聚作用而制得。改變共聚單體的原料組成，使之分別包含0、2和lOmol%的MA-GFLG-藥物(SEQIDNO:1)。共聚單體：引發劑:溶劑的比例保持恒定的12.5:0.6:86.9wt%。通常，將AIBN和ΗΡΜΑ溶于丙酬中并與少量DMS0中的MA-GLFG-藥物(SEQIDNO:1)溶液混合。將混合物在氮氣下密封于安飯中并使之在攬拌下于50°C聚合24小時。將析出的聚合物溶于甲醇并在20倍體積的酸中再沉淀。將小分子量的未反應單體和其他雜質通過重溶于蒸饋水中并用蒸饋水透析除鹽而與聚合綴合物分離，隨后凍干獲得純品。[0131]方案5"GFL護如沈QIDN0:1所公開。[0132][0133]9)HPMA共聚物-RGDfK-多西他賽綴合物的合成[0134]如方案6所示，在兩步方法中合成了聚合綴合物。在第一步中，通過HPMA、MA-GFLG-多西他賽(SEQIDNO:1)和異下締酷基甘氨酷甘氨酷-對硝基苯基醋(MA-GG-ONp)共聚單體在丙酬/5%DMS0中的自由基沉淀共聚反應合成了ΗΡΜΑ共聚物-藥物綴合物。所述共聚單體的原料組成分別為89.34%、0.66%和10%。使用Ν，Ν'-偶氮二異下臘(ΑΙΒΝ)作為引發劑。簡而言之，將冊]^((54.24111邑，0.38111111〇1)、]^-6。1^；-多西他賽（56910^:1)(3.5111邑，0.0028mmo1)和MA-GG-0化（13.62mg，0.0424mmo1)W及ΑΙΒΝ(3.43mg)溶于1ml丙酬（5%DMS0)中。共聚單體：引發劑:溶劑的比率保持在恒定的12.5:0.6:86.9wt%。將混合物在氮氣下密封于安飯中并50°C攬拌下使之聚合24小時。將析出的聚合物前體溶于甲醇中并在20倍體積的酸中再沉淀。將小分子量的未反應單體和其他雜質通過重溶于蒸饋水中并用蒸饋水透析除鹽而與聚合綴合物分離，隨后凍干獲得純品。聚合物的0化含量通過分光光度法于272nm測定。[0135]在第二步中，通過氨解反應將祀向膚RGDfK與聚合物前體綴合。簡而言之，將35.69mgHPMA-(GFLG-多西他賽)-GG-ONp(沈QIDN0:1)前體(含有0.02mmolο化基團）溶于1.6ml無水DMF中（經3乂分子篩干燥）。W相對于聚合物前體中MA-GG-0化的含量1.3倍摩爾過量的量加入RGDfK(16.7mg，0.03mmol)。反應在氮氣下于室溫下行24小時。使用1-氨基-2丙醇(0.02mmo1)終止反應。將綴合物用去離子水透析并凍干。[0136]方案6"GFL護如沈QIDN0:1所公開。[0137][0138]10)HPMA共聚物-RGMK-吉西他濱綴合物的合成與表征。[0139]標題的聚合物-藥物綴合物可使用與HPMA-共聚物-RGDfK-多西他賽綴合物相似的方法來制備。[0140]11)HPMA共聚物-EPPT1-多西他賽綴合物或HPMA共聚物-EPPT1-吉西他濱綴合物的合成。[0141]標題的聚合物-藥物綴合物可使用與HPMA-共聚物-RGDfK-多西他賽綴合物相似的方法來制備。[0142]12)HPMA共聚物-葉酸-多西他賽綴合物或HPMA共聚物-葉酸-吉西他濱綴合物的合成。[0143]使用與HPMA-共聚物-RGMK-多西他賽綴合物相似的方法制備了標題的聚合物-藥物綴合物。[0144]13)聚合物-藥物綴合物的物理化學表征[0145]成功地合成了一系列聚合物藥物綴合物，如表1所列。通過用Superose12HR10/30柱(AmershamBiosciences)的尺寸排阻色譜在快速蛋白液相色譜化化C)系統(AmershamBiosciences)上評估了所合成聚合物-藥物綴合物的重均分子量（Mw)和多分散性。W0.4ml/分鐘的流速用PBS作為洗脫溶劑洗脫Img/ml的樣品。使用已知分子量的聚HPMA級分由校準曲線估計了聚合物的數均分子量(Μη)、重均分子量(Mw)和多分散性(n=Mw/Mn)。利用氨基酸分析(CommonwealthBiotechnologiesInc,Richmond，VA)獲得了藥物含量。結果顯示在表1中。聚合物的總體尺寸分布與文獻中所報道的相似系統的確定值相符。[0146]表1.聚合物-藥物綴合物的物理化學特性，"GFL護如SEQIDN0:1所公開。[0147][0148]實施例2:生物學試驗[0149]1)癌細胞系的生長[0150]用于測定HPMA-藥物綴合物作用的癌細胞系從W下來源獲得：人MDA-MB-23U乳腺）、HCT116(結腸)和PANC-1(膜腺)來自美國標準培養物中屯、(ATCC)(Manassas，VA)。UMRC2(腎）來自美國國家癌癥研究所（Bethesda，MD)。細胞保存在添加有10%FBS、P/S和lOmM肥陽S的Du化ecco改良伊格爾培養基r'DMEM"，Invitrogen)中。所有的細胞均在37°C下于加濕的5%C02下解育。[0151]2)針對人腫瘤細胞系的體外細胞增殖測定[0152]使用橫酷羅丹明B("SRB")法（Skehan等，J.NationalCancerInstitute,82:1107-1112(1990))進行了ΗΡΜΑ-藥物綴合物針對人癌細胞系的生長抑制測定。簡而言之，將指數增長的癌細胞W2-3X103個細胞/孔的密度接種于96孔板并在第二天用ΗΡΜΑ共聚物-藥物綴合物處理。每一處理使用一式Ξ份的孔。使用水作為對照。將細胞與ΗΡΜΑ共聚物-藥物綴合物在37°C下在加濕的5%C0巧氛中解育96小時。解育96小時后，將細胞用10%S氯乙酸r'TCA")固定，在4°C解育1小時，用自來水洗涂3次。之后，將細胞用在1%乙酸中的0.4%橫酷羅丹明B染色30分鐘，用1%乙酸洗涂3次，再驚干。在lOmM化is溶液中攬拌5分鐘后，使用BenchmarkPlus酶標儀（Bio-RadLaboratories,Hercules，CA)在530nm處測量每孔的吸光度。吸光度值提供了用ΗΡΜΑ共聚物-藥物綴合物處理后生存細胞數量的直接度量。[0153]為了將0D日3日值轉換成每孔中的生存細胞數，將0D日3日值與那些為每個細胞系產生的標準OD530對細胞數目之曲線上的值進行比較。用下式計算生存百分率：[0154]生存％=生存細胞數[試驗]/生存細胞數[對照]xlOO[01W]通過非線性回歸分析計算了IC50值。[0156]表2歸納了測定的ΗΡΜΑ-共聚物-藥物綴合物的細胞生長抑制（IC50，μΜ)。[0157]表2.游離藥物、HPMA-GFLG、HPMA-GFLG-藥物綴合物和HPMA-G化G-藥物-祀向配體綴合物針對人癌細胞系的體外細胞毒性。"GFLG"如SEQIDNO:1所公開。[015引[0159]實施例3:異種移植研究[0160]為了觀察動物模型中的腫瘤生長抑制，如下所述，使用HPMA綴合的多西他賽或吉西他濱在裸鼠異種移植模型上實施。[0161]在0天時將Mia-化ca人膜腺癌細胞或HCT116細胞懸液（3xl06個細胞)皮下注射于六周齡的雌性化xNl裸鼠的下側肋腹。當腫瘤達到適當的尺寸(例如約50-60mm3的體積)時，每4-5天給小鼠靜脈內注射僅憐酸鹽緩沖液(PBS)或本發明的藥物綴合物。監視動物幾周直到對照腫瘤達到例如約1cm直徑，運時對動物實施安樂死。測定了腫瘤尺寸和腫瘤組成并報告為腫瘤尺寸變化的倍數(圖1-圖3)。[0162]利用本實施例中描述的模型，顯示本發明的藥物綴合物(例如實施例1中所所述的藥物綴合物)能夠抑制或穩定體內細胞增殖，運支持了其抗癌作用和性質。[0163]W下部分對應于母案申請的原始權利要求書：[0164]1.-種化合物，包含載體分子、與所述載體分子共價連接的連接分子、W及與所述連接分子共價連接的抗癌劑，其中所述抗癌劑是吉西他濱或多西他賽。[0165]2.-種化合物，包含載體分子、與所述載體分子共價連接且任選地通過連接分子連接的抗癌劑、和與所述載體分子共價連接且任選地通過第二連接分子連接的祀向配體，其中所述祀向配體選自RGMK、EPPT1和葉酸。[0166]3.根據項2的化合物，其中所述抗癌劑是吉西他濱或多西他賽。[0167]4.根據項1至3中任一項的化合物，其中所述連接分子和所述第二連接分子各自包含氨基酸或寡膚。[0168]5.根據項4的化合物，其中所述氨基酸或寡膚選自[0169]戊二酷-4-徑脯氨酷-Ala-Ser-環六甘氨酷-Gln-Ser-Leu(SEQIDN0:6)。[0170]6.根據項1-5中任一項的化合物，其中所述載體包含聚(N-2-徑丙基異下締酷胺）(聚-HPMA)。[0171]7.根據項1或3的化合物，其中所述載體分子包含聚-HPMA，且所述抗癌劑通過Gly-Phe-Leu-Gly(GFLG(SEQIDN0:1))寡膚鏈連接到所述載體分子上。[0172]8.根據項1至7任一項的化合物，其中所述載體分子包含分子量從約10,000道爾頓到約250,000道爾頓的大分子。[0173]9.根據項8的化合物，其中所述載體分子包括分子量從約10,000道爾頓到約170，000道爾頓的大分子。[0174]10.根據項1的化合物，還包含與所述載體分子共價連接且任選地通過第二接頭連接的祀向配體。[0175]11.根據項10的化合物，其中所述祀向配體通過第二接頭與所述載體分子共價連接。[0176]12.根據項2或11中任一項的化合物，其中所述第二接頭是氨基酸或寡膚。[0177]13.根據項12的化合物，其中所述寡膚包含Gly-Gly(GG)。[0178]14.根據項10或11中任一項的化合物，其中所述祀向配體選自RGDfK、EPPT1和葉酸。[0179]15.根據項3或14中任一項的化合物，其中所述載體分子包含聚-HPMA，所述抗癌劑通過GFLG(SEQIDN0:1)寡膚接頭與所述載體分子相連，并且所述第二接頭是GG寡膚接頭。[0180]16.根據項15的化合物，其中所述載體分子的分子量從約10,000道爾頓到約250，000道爾頓。[0181]17.根據項16的化合物，其中所述載體分子的分子量從約100，000道爾頓到約170，000道爾頓。[0182]18.-種治療癌癥的方法，包括對有此需要的人施用治療有效量的根據項1至17任一項的化合物。【主權項】1.一種化合物，包含：載體分子，與所述載體分子共價連接的連接分子，與所述連接分子共價連接的抗癌劑，和通過第二連接分子與所述載體分子共價連接的祀向配體，或其可藥用鹽，其中所述載體分子包含聚(N-2-羥丙基異丁烯酰胺）（聚-HPM)其中所述抗癌劑是多西他賽，其中所述連接分子是Gly-Phe-Leu-Gly(SEQIDN0:1)寡肽，其中所述靶向配體選自RGDfK、EPPT1和葉酸。2.根據權利要求1的化合物，其中所述第二連接分子包含氨基酸或寡肽。3.根據權利要求1的化合物，其中所述第二連接分子是氨基酸或寡肽。4.根據權利要求1的化合物，其中所述第二連接分子是GG寡肽。5.根據權利要求1-4中任一項的化合物，其中所述載體分子的分子量從約10，OOO道爾頓到約250,000道爾頓。6.根據權利要求1-5中任一項的化合物，其中所述載體分子的分子量從約100，000道爾頓到約170,000道爾頓。7.藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求1-6中任一項的化合物，以及可藥用的載體或稀釋劑。8.根據權利要求1至6中任一項的化合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。9.根據權利要求8的用途，其中所述癌癥選自結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、腎癌以及肺癌和黑色素瘤。【文檔編號】A61P35/00GK105879044SQ201610209937【公開日】2016年8月24日【申請日】2009年10月7日【發明人】李永福,安昌浩,金德中,哈米德雷扎·甘德哈里,阿比西特·雷,安賈·南【申請人】瑞沙恩醫藥公司,巴爾的摩馬里蘭大學