一種基于單壁氧化碳納米角裝載多西紫杉醇的載藥體系的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種聚維酮修飾氧化單壁碳納米角的方法，并特別涉及采用納米沉淀法構建基于單壁碳納米角-聚維酮復合物裝載多西紫杉醇的新型載藥體系。通過聚維酮對單壁碳納米角的非共價修飾，有效改善單壁碳納米角在水和磷酸鹽緩沖溶液中的分散性和穩定性。利用π-π作用，復合物單壁碳納米角-聚維酮裝載抗腫瘤藥物多西紫杉醇，可有效改善多西紫杉醇的水不溶性，改善生物相容性，體系載藥率高，緩釋效果顯著，擴展了單壁碳納米角在納米生物醫學領域的應用。
【專利說明】
一種基于單壁氧化碳納米角裝載多西紫杉醇的載藥體系
技術領域
[0001]本發明涉及一種聚維酮修飾單壁氧化碳納米角的方法，并特別涉及采用納米沉淀法構建基于單壁氧化碳納米角-聚維酮裝載多西紫杉醇的新型載藥體系。通過聚維酮對單壁氧化碳納米角的非共價修飾，有效改善其在鹽溶液中的分散性和穩定性；利用單壁氧化碳納米角-聚維酮復合物裝載多西紫杉醇，可有效改善多西紫杉醇的水不溶性，體系載藥率高，實現緩釋效果，擴展了單壁碳納米角在納米生物醫學領域的應用。
【背景技術】
[0002]納米藥物通常指運用納米技術，特別是納米化制備技術(包括藥物的直接納米化和納米載藥體系)研究開發的一類藥物制劑。與傳統藥物相比，納米藥物具有更好的溶解性或分散性、更優良的緩控釋性質、更準確的靶向性以及更高的生物利用度等，從而有效地提高藥效、降低不良反應的影響。本發明旨在構建這樣一種新型的穩定分散、載藥率高、緩釋效果好的載藥平臺。
[0003]作為一種新型石墨稀材料，單壁碳納米角(Single Wall Carbon Nanohorns,SffNHs)是1999年由科學家Ijima首次發現，它是由一種由五邊形環限定圓錐頂點，被六邊形石墨結構擴展成大的圓錐結構。由于具有其獨特的結構，近年來被作為抗腫瘤、抗炎等多種藥物的載體進行應用研究。SffNHs具有圓錐形尖端的角狀結構，直徑約為2?3nm，長度約為20?50nm，錐角約為20°，通常情況下以直徑為80?10nm的聚集體狀態存在，每個聚集體約由2000個單壁碳納米角組成。SWNHs的形態分為3種:大麗花型(dahlia-like)、落蕾型(bud-like)和種子型(seed-like)。SWNHs可通過激光消融石墨或電弧放電法合成，此方法具有不使用金屬催化劑，產物的產率和純度較高，便于純化，無毒副作用等優勢。在應用方面，SWNHs作為一種生物毒性較低的環保型材料，在藥物運載體系、光動力治療、生物傳感器、磁共振分析、催化劑載體、氣體貯存材料、燃料電池等方面都具有巨大的應用前景。
[0004]通過氧化能在單壁碳納米角壁上開口，氧化后的單壁碳納米角(oxSWNHs)表面積增大約4倍，比表面積可達1300?1400m2-g \其內部具有獨特的中空結構，便于負載更多藥物。由于oxSWNHs聚集體的尺寸能夠進入并聚集于腫瘤組織部位，有增強通透保留效應(EPR)的功能；同時，該尺寸無法被網狀內皮系統(RES)所攝取，因此選擇oxSWNHs作為藥物載體可減少小分子藥物進入正常組織，靶向蓄積在腫瘤組織(EPR效應)，實現被動靶向的作用。
[0005]然而，oxSWNHs在高鹽體系中不易穩定分散，極易沉降，此缺陷已成為限制其生物應用的主要阻礙。近年來，研究者們采用共價鍵或非共價鍵等方法對oxSWNHs進行表面修飾，以提高oxSWNHs在鹽溶液中的分散性。與共價修飾相比，非共價修飾具有更多便于應用的優勢。非共價修飾是利用具有兩親性的表面活性劑或者聚合物對碳納米角進行表面修飾，通過31-31共軛作用、疏水作用、靜電或氫鍵作用，使大分子或者聚合物吸附到碳納米角表面，從而增強其分散性，提高生物相容性。而且，這種表面修飾能有效避免影響單壁碳納米角的η電子網絡結構。現已報道過的多種聚合物如PEG、殼聚糖、多肽等對oxSWNHs進行非共價修飾以增加其分散性。
[0006]聚維酮(PVP_k30)作為一種具有良好生物相容性的材料，在醫學領域被廣泛應用。在PVP_k30的結構中，形成其鏈和吡咯烷酮環上的亞甲基是非極性基團，具有疏水性；分子中的內酰胺是強極性基團，具有親水性和極性基團作用，這種結構特征使PVP_k30易溶于水和許多有機溶劑。PVP-k30作為非共價修飾的修飾劑，具有以下特點:首先，其增溶作用可以增加某些基本不溶于水而有藥理活性的物質的水溶性；第二，其分散作用可使物質分散均勻并保持穩定；第三，其具有優良的生理惰性，不參與人體新陳代謝；第四，其具有生物相容性好、可生物降解等優良性能。本文采用PVP_k30作為修飾劑，通過非共價作用修飾oxSWNHs，利用疏水長鏈的疏水作用纏繞于oxSWNHs上，以提高其親水性和生物相容性。
[0007]惡性腫瘤是當前危害人類健康的重大疾病之一。隨著科學技術的發展，治療手段正在逐步改進，死亡率依然居高不下，傳統的治療手段包括手術、化療、放療等仍然存在很多缺點。化療是采用化學物質治療癌癥，但是例如化療藥物靶向性較低，對正常組織影響較大等。因此，更為有效安全的手段以實現腫瘤的早期治療成為研究重點。多西紫杉醇(Docetaxel, DTX)是建立在紫杉醇基礎上的第二代紫杉烷類抗癌藥的代表，在抗癌試驗中其活性比紫杉醇的活性要高。主要對治療晚期乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌，對頭頸部癌、非小細胞肺癌具有良好的療效；對前列腺癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤和多種軟組織腫瘤等也有一定療效，是目前臨床化療藥物的一線用藥。但是目前的多西紫杉醇制劑還存在一些如非水溶性、無靶向性、致敏性和毒副作用等缺點。構建新型的載藥體系裝載多西紫杉醇，以期改善多西紫杉醇的水不溶性與生物相容性以及緩釋效果。
【發明內容】
[0008]本發明的目的之一在于采用聚維酮(PVP_k30)非共價修飾單壁碳納米角oxSWNHs,改善oxSWNHs在水、鹽溶液中的分散性和穩定性。oxSWNHs在鹽溶液中分散性差，嚴重影響其作為藥物載體的應用，選擇非共價修飾的方法，利用疏水作用，使得PVP-k30的疏水長鏈纏繞在oxSWNHs上，在oxSWNHs周圍形成空間位阻層，使相鄰oxSWNHs產生斥力不能靠近團聚。經PVP-k30非共價修飾于oxSWNHs角狀結構表面，PVP_k30分子中的內酰胺是強極性基團，具有良好的親水性，因此在oxSWNHs表面形成一層親水層，綜合以上兩個因素，由PVP-k30非共價修飾的oxSWNHs具有良好的分散性。
[0009]本發明的目的之二在于采用納米沉淀法構建基于oxSWNHs-PVP復合物裝載多西紫杉醇(DTX)的載藥體系，以期實現該新型的載藥體系載藥率高、藥物緩釋等優點，同時顯著改善DTX的水不溶性，從而提高其生物利用度。采用oxSWNHs-PVP對DTX進行裝載，利用JT-JT作用，采用納米沉淀法，獲得載藥體系DTXOoxSWNHs-PVP。
[0010]本發明提供了以聚維酮為修飾劑，oxSWNHs作為載體的裝載多西紫杉醇的載藥體系及其制備方法，采用的技術方案如下:
[0011 ] (I)將oxSWNHs溶于去離子水中，超聲0.5?2小時，制備oxSWNHs的分散液I。
[0012](2)將PVP-k30分散于溶液I中，超聲分散0.5?2小時，得到混合溶液2。
[0013](3)將混合溶液2進行加熱攪拌，待反應完全后，于12500r離心15分鐘，得到沉淀物3。
[0014](4)將沉淀物3用去離子水離心清洗2?3次，冷凍干燥，既得oxSWNHs-PVP粉末4。
[0015](5)將粉末4置于反應瓶中，加入無水乙醇2?6mL，超聲15?40分鐘，快速攪拌15?40分鐘，得到oxSWNHs-PVP的乙醇分散液5。
[0016](6)將DTX的乙醇溶液加入分散液5中，攪拌均勻從而獲得混合溶液6。
[0017](7)將混合溶液6用氮氣保護揮干溶劑，將粉末充分分散于2?5mL無水乙醇中，得到分散液7。
[0018](8)將分散液7進行離心分離，得到沉淀物8。
[0019](9)將沉淀物8重復分散離心步驟3?5次，進行純化，離心后收集沉淀9。
[0020](10)在-60 ?-100°C真空冷凍干燥 10 ?15h，既得 DTXOoxSWNHs-PVP 產物 10。
[0021]修飾投料質量比例W (oxSWNHs: PVP) = I: 10?1: 40，優選1: 20 ;載藥投料質量比例 W(oxSWNHs: DTX) = I: 5 ?1: 15，優選 1:1O0
[0022]修飾反應條件為45°C?55°C條件下加熱攪拌6?18小時，優選50°C攪拌12小時；載藥過程條件為納米沉淀法，反應溶液攪拌8?24小時，優選12小時，用氮氣保護吹干6?15h，優選12小時。
[0023]分離DTX@oxSWNHs-PVP時，離心條件為1000r?13000r離心3?8分鐘，優選12500r 離心 5min。
[0024]純化DTX@oxSWNHs-PVP時，分別依次分散于80?70%乙醇、65?45%乙醇、40?20%乙醇、去離子水中，離心后收集沉淀，真空冷凍干燥10?15h，優選條件為:將DTXOoxSWNHs-PVP依次分散于75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、去離子水中，離心后收集沉淀，真空冷凍干燥12小時，得到DTX@oxSWNHs-PVP。
[0025]對于本發明的表征測試如下:
[0026](I)取適量載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP分散液(0.5mg -mL ')，進行透射電鏡表征，評價納米粒徑及Zeta電位的測定，對該載藥體系的微觀形貌進行評價。
[0027](2)取適量載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP、復合物oxSWNHs-PVP的真空干燥樣品，進行熱重測試，與oxSWNHs的熱重曲線對比，考察DTX的載藥量及PVP的修飾量。
[0028](3)對于該載藥體系的藥物釋放行為進行評價，取適量載藥體系DTXOoxSWNHs-PVP分散液(0.5mg.mL %置于透析袋(MW:3500)中，分別置于37°C的磷酸鹽緩沖液(pH = 7.4，含0.05 %吐溫-80) 50mL中以模擬體液環境，在100r/min的搖床中進行體外釋放實驗考察。在特定時間點(0.5、l、2、4、8、12、24、36、48、72、96、120、144h)取出ImL釋放介質用高效液相色譜法測定溶出液中藥物濃度，且每次補充ImL新鮮的PBS溶液。以DTX溶液進行對照，根據231nm處的吸光度檢測藥物DTX的釋放量。色譜條件:C18柱為固定相，甲醇-水(80: 20，v/v)為流動相，流速為1.0mL.η?η 1C3采用標準曲線法計算樣品中DTX濃度。
[0029]本發明相對于現有發明，具有以下優點:
[0030](I)載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP的平均粒徑為135?145nm，粒子粒徑分布集中，聚維酮的修飾含量為28%?32%，可以有效改善oxSWNHs在水、鹽溶液中的分散性。
[0031](2)該載藥體系的Zeta電位為-25?-30mV，電位分布集中，體系穩定分散。同時，由于載藥體系表面所帶負電荷，不易與體內細胞表面帶負電荷的物質吸引，不具有明顯的生物毒性。
[0032](3)該載藥體系采用納米沉淀法，裝載多西紫杉醇的含量為57%?74%，載藥率較高。
[0033](4)該載藥體系，在體外37°C條件下，藥物釋放率在O?12h僅釋放20%?25%，在72h可達到53%?57%，呈現緩慢釋放的形式，有效改善純藥DTX突釋的缺點。
[0034]綜上所述，該載藥體系的構建方法簡明，操作簡便。通過PVP_k30對oxSWNHs的非共價修飾，由于PVP-k30具有良好的水溶性，可以明顯改善oxSWNHs在溶液中的分散性和穩定性，在磷酸鹽緩沖溶液中可穩定分散15?21天，為oxSWNHs作為藥物載體提供了優勢條件。
[0035]載藥體系DTXOoxSWNHs-PVP較高的載藥率，在鹽溶液中分散穩定性良好，釋藥率高，緩釋效果良好，擴展了 oxSWNHs的應用，為后期應用于抗腫瘤提供了新穎的平臺。
【附圖說明】
[0036]圖1為本發明實施例3中復合物oxSWNHs-PVP的透射電鏡圖。
[0037]圖2為本發明實施例5中載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP的透射電鏡圖。
[0038]圖3為本發明實施例5中載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP的平均粒徑分布圖。
[0039]圖4為本發明實施例5中載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP的Zeta電位表征圖。
[0040]圖5為本發明實施例5中載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP、實施例3中oxSWNHs-PVP與原始oxSWNHs的熱重分析圖。
[0041]圖6為本發明實施例5中載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP與單純DTX的體外藥物釋放曲線。
【具體實施方式】
[0042]實施例1
[0043]復合物oxSWNHs-PVP的合成:
[0044]將Img oxSWNHs分別加入到5mL去離子水中，其中PVP_k30質量濃度分別為1mg/mL，超聲分散0.511，45°(:攪拌611，12500r離心15min，以除去過量的PVP_k30。將沉淀用去離子水離心清洗2?3次，真空冷凍干燥，得到復合物oxSWNHs-PVP，該復合物在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中可穩定分散15天，該復合物中聚維酮的修飾含量為28%。
[0045]實施例2
[0046]復合物oxSWNHs-PVP的合成:
[0047]將Img oxSWNHs 分別加入到 5mL0.0lmol.L 1PBS (pH = 7.4)中，其中 PVP-k30質量濃度分別為40mg/mL，超聲分散2h，55°C攪拌18h，12500r離心15min，以除去過量的PVP-k30。將沉淀用去離子水離心清洗2?3次，真空冷凍干燥，得到復合物oxSWNHs-PVP，該復合物在PH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中可穩定分散18天，該復合物中聚維酮的修飾含量為32%。
[0048]實施例3
[0049]復合物oxSWNHs-PVP的合成:
[0050]將Img oxSWNHs分別加入到5mL去離子水中，其中PVP_k30質量濃度分別為20mg/mL，超聲分散lh，50°C攪拌12h，12500r離心15min，以除去過量的PVP_k30。將沉淀用去離子水離心清洗2?3次，真空冷凍干燥，得到復合物oxSWNHs-PVP，該復合物在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中可穩定分散21天，該復合物中聚維酮的修飾含量為30%。
[0051]復合物oxSWNHs-PVP的透射電鏡表征圖見圖1，熱重分析圖見圖5。
[0052]實施例4
[0053]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP 的合成:
[0054]取實施例1中Img oxSWNHs-PVP置于1mL的反應瓶中，各加入無水乙醇4mL，超聲0.5h后快速攪拌0.5h，待oxSWNHs-PVP分散均勻后，分別加入DTX 5mg，密封避光攪拌反應8h。采用納米沉淀法進行載藥。將濾液用氮氣保護吹干6h，將粉末充分分散于4mL無水乙醇中，12500rpm離心5min，收集上清液并把離心后的DTX@oxSWNHs_PVP重復分散離心步驟4次，分別依次分散于75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、去離子水中，離心后收集所有的沉淀，真空冷凍干燥12h，既得DTX@oxSWNHs-PVP。該體系中DTX載藥量可達57%，該體系的平均粒徑為145nm，Zeta電位為_25mV，載藥體系體外累積藥物釋放量為在O?12h僅釋放20%，72h時達到累積釋放最高達到53%，釋放曲線具有明顯緩釋行為。
[0055]實施例5
[0056]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP 的合成:
[0057]取實施例3中Img oxSWNHs-PVP置于1mL的反應瓶中，各加入無水乙醇4mL，超聲0.5h后快速攪拌0.5h，待oxSWNHs-PVP分散均勻后，分別加入DTX 1mg,密封避光攪拌反應12h。采用納米沉淀法進行載藥。將濾液用氮氣保護吹干12h，將粉末充分分散于4mL無水乙醇中，12500rpm離心5min，收集上清液并把離心后的DTX@oxSWNHs_PVP重復分散離心步驟4次，分別依次分散于75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、去離子水中，離心后收集所有的沉淀，真空冷凍干燥12h，既得DTX@oxSWNHs-PVP。該體系中DTX載藥量可達71.0 %，該體系的平均粒徑為141nm，Zeta電位為-26.8mV，載藥體系體外累積藥物釋放量為在O?12h僅釋放22.8%,72h時達到累積釋放最高達到54.9%，釋放曲線具有明顯緩釋行為。
[0058]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP透射電鏡圖見圖2。
[0059]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP平均粒徑分布見圖3，Zeta電位表征圖見圖4。
[0060]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP熱重分析圖見圖5。
[0061]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP體外藥物釋放曲線見圖6。
[0062]實施例6
[0063]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP 的合成:
[0064]取實施例3中Img oxSWNHs-PVP置于1mL的反應瓶中，各加入無水乙醇4mL，超聲0.5h后快速攪拌0.5h，待oxSWNHs-PVP分散均勻后，分別加入DTX 15mg，密封避光攪拌反應24h。采用納米沉淀法進行載藥。將濾液用氮氣保護吹干15h，將粉末充分分散于4mL無水乙醇中，12500rpm離心5min，收集上清液并把離心后的DTX@oxSWNHs_PVP重復分散離心步驟4次，分別依次分散于75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、去離子水中，離心后收集所有的沉淀，真空冷凍干燥12h，既得DTX@oxSWNHs-PVP。該體系中DTX載藥量可達74.0 %，該體系的平均粒徑為143nm，Zeta電位為_30mV，載藥體系體外累積藥物釋放量為在O?12h僅釋放20%，72h時達到累積釋放最高達到53.5%，釋放曲線具有明顯緩釋行為。
[0065]實施例7
[0066]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP 的合成:
[0067]取實施例3中Img oxSWNHs-PVP置于1mL的反應瓶中，各加入無水乙醇4mL，超聲0.5h后快速攪拌0.5h，待oxSWNHs-PVP分散均勻后，分別加入DTX 1mg,密封避光攪拌反應12h。采用納米沉淀法進行載藥。將濾液用氮氣保護吹干12h，將粉末充分分散于4mL無水乙醇中，1000rpm離心3min，收集上清液并把離心后的DTX@oxSWNHs_PVP重復分散離心步驟4次，分別依次分散于80%乙醇、65%乙醇、40%乙醇、去離子水中，離心后收集所有的沉淀，真空冷凍干燥10h，既得DTX@oxSWNHs-PVP。該體系中DTX載藥量可達73.0 %，該體系的平均粒徑為135nm，Zeta電位為-28.2mV，載藥體系體外累積藥物釋放量為在O?12h僅釋放20.8%,72h時達到累積釋放最高達到53.5%，釋放曲線具有明顯緩釋行為。
[0068]實施例8
[0069]載藥體系DTX@oxSWNHs-PVP 的合成:
[0070]取實施例3中Img oxSWNHs-PVP置于1mL的反應瓶中，各加入無水乙醇4mL，超聲0.5h后快速攪拌0.5h，待oxSWNHs-PVP分散均勻后，分別加入DTX 1mg,密封避光攪拌反應12h。采用納米沉淀法進行載藥。將濾液用氮氣保護吹干12h，將粉末充分分散于4mL無水乙醇中，13000rpm離心8min，收集上清液并把離心后的DTX@oxSWNHs_PVP重復分散離心步驟4次，分別依次分散于70%乙醇、45%乙醇、20%乙醇、去離子水中，離心后收集所有的沉淀，真空冷凍干燥15h，既得DTX@oxSWNHs-PVP。該體系中DTX載藥量可達65.0%，該體系的平均粒徑為141nm，Zeta電位為_27mV ;載藥體系體外累積藥物釋放量為在O?12h僅釋放25%，72h時達到累積釋放最高達到57%，釋放曲線具有明顯緩釋行為。
【主權項】
1.一種基于單壁氧化碳納米角(oxSWNHs)裝載多西紫杉醇(DTX)的新型載藥體系，采用聚維酮(PVP-k30)作為修飾劑，對單壁碳納米角進行非共價修飾，制得聚維酮-單壁碳納米角復合物(oxSWNHs-PVP)，利用PVP-k30其鏈和吡咯烷酮環上的亞甲基這兩種非極性基團，具有疏水性，可通過疏水作用纏繞于oxSWNHs表面，分子中的內酰胺作為強極性基團，具有親水性，從而增強oxSWNHs在水和鹽溶液中的分散性；利用納米沉淀法裝載多西紫杉醇，構建新型載藥體系(DTX@oxSWNHs-PVP)，由于DTX分子結構中的芳香結構，可與oxSWNHs通過J1-JT作用吸附，將DTX裝載于oxSWNHs，可以改變DTX的釋放行為，實現藥物緩釋的效果O2.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于，修飾投料質量比例W(0XSWNHs: PVP)=1: 10 ?1: 40 ;載藥投料質量比例 W(oxSWNHs: DTX) = 1: 5 ?1: 15。3.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于，修飾反應條件為45?55°C條件下加熱攪拌6?18小時；載藥過程條件為納米沉淀法，反應溶液攪拌8?24小時，用氮氣保護吹干6?15h。4.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于，分離DTXOoxSWNHs-PVP時，離心條件為1000r?13000r離心3?8min ;純化DTX@oxSWNHs_PVP時，分別依次分散于80?70%乙醇、65?45%乙醇、40?20%乙醇、去離子水中，離心后收集沉淀，真空冷凍干燥10?15h，得到 DTX@oxSWNHs-PVP。5.根據權利要求1中的復合物，其特征在于，oxSWNHs-PVP在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，可穩定分散15?21天，該復合物中聚維酮的修飾含量為28%?32%;采用納米沉淀法，該體系的裝載多西紫杉醇的含量為57%?74%。6.根據權利要求1中的載藥體系，其特征在于，該體系的平均粒徑為135?145nm，粒徑分布圖峰形尖銳光滑，粒子粒徑分布集中，該體系的Zeta電位為-25mV?_30mV。7.根據權利要求1中的載藥體系，其特征在于，在體外37°C條件下，藥物釋放率在O?12h僅釋放20 %?25 %，在72h可達到53 %?57 %，緩釋效果明顯。8.根據權利要求1中所述的方法的應用，其特征在于，構建的基于單壁碳納米角的載藥體系，擴展單壁碳納米角在納米生物醫學領域的應用。
【文檔編號】A61K31/337GK105879042SQ201510158392
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年4月2日
【發明人】鐘文英, 趙倩, 李囡囡
【申請人】中國藥科大學