低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑的應用

低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑的應用
【專利摘要】本發明屬于醫藥領域，涉及低氘水(DDW)在逆轉腫瘤多藥耐藥性和抗腫瘤藥物增敏劑的應用。低氘水是天然產物，具有腫瘤細胞多藥耐藥的逆轉的作用，可以作為腫瘤多藥耐藥的逆轉劑；同時，低氘水具有增加腫瘤多藥耐藥細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的作用，可以作為抗腫瘤細胞藥物增敏劑。本發明提供了低氘水作為腫瘤治療的輔助治療劑，可選擇性的單獨使用或聯合一種或一種以上抗腫瘤藥物一起使用。本發明還涉及在日常的腫瘤治療中，單獨使用或聯合一種或一種以上抗腫瘤藥物使用低氘水，所述低氘水含氘量為0.01-100ppm。
【專利說明】
低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑的應用
技術領域
[0001]本發明屬于腫瘤多藥耐藥的逆轉以及增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的醫藥學領域，具體涉及低氖水(deuterium depleted water, DDff)在逆轉腫瘤多藥耐藥性和抗腫瘤藥物增敏劑的應用。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤(癌癥)是導致人類死亡的主要原因之一，據世界衛生組織報告，每年有700多萬人死于腫瘤，其中60%死于肺癌、胃癌、乳腺癌、結直腸癌、口腔癌、肝癌、宮頸癌及食管癌，死于腫瘤者約占所有死亡人數的13%。隨著世界人口日趨老齡化，預計全世界癌癥死亡人數將繼續上升，到2030年可能超過1310萬。化療是目前臨床治療惡性腫瘤的主要手段之一，腫瘤細胞多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的產生是目前腫瘤化學藥物治療失敗的一個主要原因。多藥耐藥性是指腫瘤細胞在接受抗癌藥物治療過程中對一種抗腫瘤藥物產生抗藥性的同時，對結構和作用靶點完全不同的抗腫瘤藥物產生交叉抗藥性。多藥耐藥一旦產生，更換藥物種類或增加藥物劑量，反而會進一步誘導耐藥的產生和產生更強的細胞毒性。據美國癌癥協會估計，90%以上的腫瘤患者死于不同程度的多藥耐藥。多藥耐藥的研究已成為目前腫瘤治療及藥物研究的熱點。
[0003]腫瘤細胞的多藥耐藥性的產生有多種機制，原因極其復雜，主要包括藥物吸收減少，細胞內藥物栗出增多，細胞凋亡的抑制，藥物活性作用減弱，細胞解毒作用增強，抗腫瘤藥物的代償性代謝增強，DNA損傷修復能力增強，靶分子的改變等。研究表明，腫瘤的多藥耐藥的形成過程復雜，這些耐藥機制常常同時存在，參與腫瘤多藥耐藥的產生。ABC結合盒轉運體(ATP-binding cassette transporters)是跨膜轉運蛋白超家族，可能量依賴性的將結構和作用機制不同的抗癌藥物栗出細胞外，在多藥耐藥形成中發揮重要作用。調控ABC轉運蛋白的表達與功能成為有效逆轉MDR策略之一。
[0004]目前針對ABC轉運蛋白介導的腫瘤多藥耐藥的逆轉策略有很多，其中基于化學藥物逆轉策略研究的最多。早在1981年Tsuruo等，就發現鈣通道阻滯劑維拉帕米(verapamil)能逆轉P388/VCR細胞對長春新堿的耐藥性，此后又發現了環孢素A、奎寧等非特異性MDR逆轉劑。雖然后來在各種化學藥物的基礎上進行結構改造，但由于化學藥物的毒副作用，嚴重限制了其臨床應用的前景。值得注意的是，當人們還在為努力解決化學藥物的毒副作用的時候，研究人員發現許多大然產物及其衍生物具有逆轉ABC轉運蛋白介導的腫瘤MDR作用，如紫杉烷類衍生物、黃酮類衍生物、麥角生物堿等。由于天然產物及其衍生物具有高效低毒的特點，使其日益受到醫藥學界的重視并逐漸成為研究的熱點。
[0005]人體中高濃度的氘能抑制某些生物酶破壞氫鍵的能力，損傷DNA修復酶，在DNA的螺旋結構中產生附加應力，造成雙螺旋的錯配、斷裂、替換，是核糖核酸排列混亂，甚至重新合成，影響遺傳因子功能，出現突變、惡性腫瘤。研究表明，隨著生物體內到濃度的增加，氫鍵間交聯發生改變，從而使細胞質剛性顯著增加，有絲分裂受阻。大然水中，氘和氕的比率(D/Η)大約是1: 6600，即水中氘的體積分數約為0.015%。以水為原料，人們采用特殊的分離技術將水中的氘分離，降低水中氘的濃度，成為制備低氘水的主要方法。飲用低氘水可以預防疾病、延緩衰老、活化機體免疫細胞，特別是對某些腫瘤等疾病的輔助治療，是近年來國內外核醫學領域和水生理學領域對低氘水應用研究的重大突破。目前，關于低氘水作為腫瘤治療的輔助治療逆轉腫瘤多藥耐藥性，增加腫瘤細胞藥物敏感性尚未見報道。

【發明內容】

[0006]本發明提供了氘含量在0.0l-1OOppm的低氘水(DDW)作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑中的新用途。
[0007]本發明涉及具有0.0l-1OOppm氘含量的低氘水作為抗腫瘤細胞藥物增敏劑中的應用。
[0008]所述的腫瘤可以是對化療藥物產生耐藥性的鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌或結直腸癌等各種腫瘤。所述的腫瘤細胞可以是對化療藥物產生耐藥性的肺癌、肝癌、乳腺癌或宮頸癌等各種腫瘤細胞。例如實施例中所采用的多藥耐藥腫瘤A549/DDP細胞。
[0009]所述的抗腫瘤藥物可以是抗肺癌藥物、抗肝癌藥物或抗乳腺癌藥物等各種已知抗腫瘤藥物。
[0010]低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑與抗腫瘤細胞藥物增敏劑，可以為藥物輔助溶劑，即作為藥物載體，可與多種腫瘤藥物組合，其組合配方可以是口服藥劑、注射藥劑或洗液，所述口服藥劑可以為:滴丸、軟膠囊、緩釋制劑、控釋制劑、糖漿劑或口服液等；所述注射藥劑可以為:靜脈注射劑、靜脈注射乳劑、腹腔注射劑、腹腔注射乳劑、肌肉注射劑、肌肉注射乳劑、皮下注射劑或皮下注射乳劑等；所述洗液可以為:皮膚洗液、吸入性溶液或灌腸溶液等。
[0011]本發明所述的低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑以及抗腫瘤細胞增敏劑，可以單獨使用或與一種或一種以上的抗腫瘤藥物組成的組合物。該組合物包括低氘水和一種或一種以上的抗腫瘤藥物。所述的抗腫瘤藥物為已知的具有抗腫瘤活性的化學藥物、中草藥等。低氘水也可以與外科手術聯合使用，與放射性治療聯合使用。
[0012]本發明所述的低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑以及抗腫瘤細胞增敏劑的機制是降低天然水中氘的含量。
[0013]另外，本發明還提供了一種體外增加多藥耐藥腫瘤細胞對已知的抗腫瘤藥物的敏感性的實驗方法，即低氘水作為培養基溶劑溶解培養基粉末，使用此培養基培養細胞。
[0014]所述的腫瘤可以是對化療藥物產生耐藥性的鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌或結直腸癌等各種腫瘤。所述的腫瘤細胞可以是對化療藥物產生耐藥性的肺癌、肝癌、乳腺癌或宮頸癌等各種腫瘤細胞。例如實施例中所采用的多藥耐藥腫瘤A549/DDP細胞。
[0015]所述的抗腫瘤藥物可以是抗肺癌藥物、抗肝癌藥物或抗乳腺癌藥物等各種已知抗腫瘤藥物。
[0016]上述培養基使用氘濃度為0.0l-1OOppm的低氘水配制。多藥耐藥腫瘤細胞能在抗腫瘤藥物濃度不變的條件下，對抗腫瘤藥物產生更強的敏感性，并且隨著培養基中氘濃度的下降，多藥耐藥腫瘤細胞在抗腫瘤藥物濃度不變的條件下，對抗腫瘤藥物的敏感性更強。
[0017]本發明提供了低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑以及抗腫瘤細胞藥物增敏劑的新用途。水是天然產物，通過分離技術把水中氘分離出來，降低水中氘的濃度，并不改變水的大然性質。因此低氘水作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑以及抗腫瘤細胞藥物增敏劑應用于臨床，不但本身不具有任何毒副作用，還可以克服腫瘤細胞的多藥耐藥性，減少抗腫瘤藥物的毒性，為癌癥的治療提供了更好的方法。
【附圖說明】
[0018]圖1:細胞毒性MTT實驗。(A)顯示的是低氘水培養基(50ppm)或普通培養基(150ppm)和順鉑聯合作用肺癌A549細胞；(B)顯示的是低氘水培養基(50ppm)或普通培養基(150ppm)和順鉑聯合作用肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞。圖中橫坐標為培養基中順鉑的濃度，縱坐標為細胞的抑制率。實驗重復3次。
[0019]圖2:平皿克隆實驗。(A)顯示的是低氘水培養基(50ppm)或普通培養基(150ppm)和順鉑聯合作用肺癌A549細胞；(B)顯示的是低氘水培養基(50ppm)或普通培養基(150ppm)和順鉑聯合作用肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞。(C)是對㈧和⑶圖中細胞克隆數目的統計結果。實驗重復3次。*表示P <0.05。
[0020]圖3:流式細胞術。(A)顯示的是低氘水培養基(50ppm)或普通培養基(150ppm)和順鉑聯合作用肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞。(B)是對(A)圖細胞周期變化的統計結果。實驗重復3次。*表示P < 0.05。
[0021]圖4:細胞ATP酶活力檢測。(A)顯示的是低氘水培養基(50ppm)或普通培養基(150ppm)和順鉑聯合作用肺癌A549細胞；(B)顯示的是低氘水培養基(50ppm)或普通培養基(150ppm)和順鉑聯合作用肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞。實驗重復3次。*表示P< 0.05，** 表示 P < 0.01.
[0022]圖5:Western blot實驗檢測肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞多藥耐藥相關蛋白MRPl、MDRl、ATP的表達情況。
具體實施方案
[0023]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以相互組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再累述。
[0024]以下實施例所用的低氘水購自蘇州奧特泉公司，氘含量為50ppm ;順鉑購自Sigima公司，純度為X ;新生牛血清(NBCS)與RP頂1640培養基購自Gibco ；PI染料、RNaseA與MTT試劑購自北京索萊寶公司；ATP酶活性檢測試劑盒購自南京建成公司；anti_ATP 和 ant1-MDRl 購自 Santa Cruz ；ant1-MRP-1(C-19)購自 R&D Systems ；ant1-β-actin (13E5)貝勾自 Abeam ;Alexa Flour 700 goat ant1-mouse IgG 和 Alexa Flour800 goat ant1-rabbit IgG antibody 貝勾自 invitrogen。
[0025]細胞培養
[0026]肺癌A349細胞培養于含10%新生牛血清與I %青鏈霉素的1640培養基中；肺癌多藥耐藥細胞A549/DDP細胞培養于含10%新生牛血清、I %青鏈霉素和I μ g/ml的1640培養基中以維持細胞的耐藥性。
[0027]實施例1:
[0028]MTT法檢測低氘水與順鉑對肺癌A549細胞和肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞抑制影響的作用。用不含血清的1640培養基饑餓培養肺癌A549細胞和肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞12小時后，用含EDTA胰酶消化，分別以5 X 13個細胞/孔的密度接種于96孔板中。于種有肺癌A549細胞的96孔板中分別加入100 μ I含順鉑濃度為0、0.5、1.0,1.5,2.0、
2.5、3.0 μ g/ml的普通1640培養基，于種有肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞的96孔板中分別j^0、2、4、6、8、10、12、14、16yg/ml的低氘水培養基(50ppm)。培養24h后，每孔分別加入20 μ I的MTT溶液繼續培養4b，吸去培養液，每孔分別加入150 μ I 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩lOmin。在490nm博長短檢測各孔的吸光值(OD)。抑制率(％ ) = (1-實驗組OD/對照組OD) X 100%。實驗重復三次。結果顯示，低氘水作為順鉑的輔助治療劑，對肺癌A549細胞及肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞的生存率有抑制作用，對肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞抑制作用更加明顯。結果見圖1。
[0029]實施例2:
[0030]平皿克隆試驗低氘水與順鉑對肺癌A549細胞和肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞克隆形成能力的影響。用不含血清的1640培養基饑餓培養肺癌A549細胞和肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞12小時后，用含EDTA胰酶消化，分別以500個細胞/孔的密度接種于6孔板中。相應地，孔板中每孔分別加入氘濃度為150ppm、75ppm、50ppm的培養基，培養基中含順鉑濃度為I μ g/ml ο 2-3周后，當孔板中細胞克隆集落快融和時，終止培養。吸去培養基，用PBS小心清洗2-3次。每孔分別加入4%多聚甲醛3ml固定15min ;吸去多聚甲醛，每孔分別加入結晶紫染液染色20min，回收結晶紫。用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。計算細胞克隆集落數。實驗重復三次。結果顯示，隨著培養基中氘濃度的下降，在順鉑濃度不變的條件下，肺癌A549細胞及肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞的克隆形成能力減弱，其中對肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞的克隆形成能力抑制更加明顯。結果見圖2.
[0031]實施例3:
[0032]流式細胞術檢測低氘水與順鉑對肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞的細胞周期的影響。用不含血清的1640培養基饑餓培養肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞12小時后，用含EDTA胰酶消化，以I X 14個細胞/孔的密度接種于6cm培養皿中。分別加入氘濃度為150ppm、100ppm、75ppm、50ppm的含順鉑濃度為I μ g/ml的培養基培養24h后，吸去培養基，用PBS清洗2-3次，用不含EDTA胰酶消化并收集細胞。1500rpm/min的轉速離心3min，棄上清；PBS吹打重懸，1500rpm/min離心3min ;棄上清；重復一次重懸、離心、棄上清；加入70%乙醇lml，4°C固定過夜。1500rpm/min離心3min，棄上清；重復兩次重懸、離心、棄上清。每管加入500 μ I染色液(500 μ I PBS+2.5 μ I ΡΙ+2 μ I RNaseA)，室溫避光30min。流式細胞儀上機分析，觀察細胞周期分布特征。實驗重復三次。從細胞周期分布圖可以看出，隨著培養基中氘濃度的下降，在順鉑濃度不變的條件下，肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞的生長受到抑制，主要表現為Gl其增加，S期減少，證明細胞生長受到抑制，細胞的生長更多的停留在合成前期。結果見圖3.
[0033]實施例4:
[0034]超微量ATP酶活力檢測實驗檢測低氘水與順鉑對肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞ATP酶的活力的影響。用不含血清的1640培養基饑餓培養肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞12小時后，用含Η)ΤΑ胰酶消化，以IX 13個細胞/孔的密度接種于6cm培養皿中。分別加入氘濃度為150ppm、100ppm、75ppm、50ppm的含順鈾濃度為I μ g/ml的培養基培養24h后，吸去培養基，用生理鹽水清洗2-3次，胰酶消化并收集細胞。1500rpm/min離心3min，棄上清；生理鹽水再清洗I次，1500rpm/min離心3min，棄上清；加入200 μ I生理鹽水，吹打混勻后，超聲粉碎，用NanoDrop微量紫外分光光度計測定蛋白含量。ATP酶活力測試按超微量ATP酶試劑盒說明書操作。ATP酶活力計算公式:組織中ATPase活力(U/mgprot)=(測定管OD值-對照管OD值)/ (標準管OD值-空白管OD值)X標準管濃度(0.02 μ mo I/ml) X 6 X 7.8/勻漿蛋白濃度(mgprot/ml)。實驗重復三次。結果顯示，隨著培養基中氘濃度的下降，在順鉑濃度不變的條件下，肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞的Na K-ATP酶、Ca Mg-ATP酶與Total-ATP酶都出現了不同程度的下降。證明低氘水能通過抑制腫瘤細胞中ATP酶的活性，從而達到抑制腫瘤細胞的增殖、代謝、迀移和凋亡等細胞活動。結果見圖4.
[0035]實施例5:
[0036]Westernblot檢測檢測低氘水與順鉑對ATP、MRP1與MDRl蛋白表達的影響。用不含血清的1640培養基饑餓培養肺癌多藥耐藥A549/DDP細胞12小時后，用含EDTA胰酶消化，以5X 15個細胞/孔的密度接種于6cm培養皿中。分別加入氘濃度為150ppm、100ppm、75ppm、50ppm的含順鉑濃度為I μ g/ml的培養基培養24h后，吸去培養基，PBS清洗2_3次，加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液，于冰上裂解15min，細胞刮子將細胞刮下收集。4°C，12000rpm/min離心15min，吸取上清。用NanoDrop微量紫外分光光度計測定蛋白含量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，將蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜浸泡于封閉液中，室溫封閉2h0 PBS清洗3次，每次1min ;根據目標蛋白大小，分別孵育ATP、MRPU MDR1,β -actin為內參蛋白，4°C孵育過夜。PBST清洗3次，每次1min ;根據一抗屬性，分別閉關孵育二抗 Alexa Flour 700 goat ant1-mouse IgG 和 Alexa Flour 800 goat ant1-rabbitIgG antibody兩個小時。PBST避光清洗3次，每次5min。Odyssey雙色紅外激光成像系統顯影。實驗重復三次。結果顯示，隨著培養基中氘濃度的下降，在順鉑濃度不變的條件下，腫瘤多藥耐藥相關蛋白MDRUMRP1與ATP的表達都出現了不同程度的減弱。結果見圖5。
[0037]結論:
[0038]低氘水作為腫瘤的輔助治療劑，聯合抗腫瘤藥物治療多藥耐藥腫瘤時，能夠逆轉腫瘤的多要耐藥性以及增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。
【主權項】
1.低氘水(DDW)作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑的應用，其特征在于，所述的應用是指低氘水在制備抗腫瘤藥物的耐藥逆轉劑以及抗腫瘤藥物細胞增敏劑的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于低氘水是腫瘤多藥耐藥逆轉劑，或是抗腫瘤藥物的增敏劑。3.根據權利要求1所述的應用，所述的腫瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、口腔癌、宮頸癌、結直腸癌、胰腺癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌或白血病。4.根據權利I所述的應用，其特征在于，低氘水作為腫瘤治療的輔助治療，可單獨使用或聯合一種或一種以上的抗腫瘤藥物使用。5.根據權利5所述的應用，其特征在于，所述的聯合應用的組合配方可以是口服藥劑、注射藥劑或洗液，所述口服藥劑可以為:滴丸、軟膠囊、緩釋制劑、控釋制劑、糖漿劑或口服液等；所述注射藥劑可以為:靜脈注射劑、靜脈注射乳劑、腹腔注射劑、腹腔注射乳劑、肌肉注射劑、肌肉注射乳劑、皮下注射劑或皮下注射乳劑等；所述洗液可以為:皮膚洗液、吸入性溶液或灌腸溶液。6.根據權利5所述的應用，單獨使用或聯合一種或一種以上的抗腫瘤藥物使用的低氘水，其氖含量為0.0l-1OOppmo7.根據權利5所述的應用，其中所述的抗腫瘤藥物可以是:長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、赫賽汀、特羅凱、健擇、吉西他濱、阿伐斯汀、愛寧達、安得卡、依立適、諾雷德、希羅達、多柔比星、伊立替康。8.一種增加體外增加多藥耐藥腫瘤細胞對已知的抗腫瘤藥物的敏感性的實驗方法，其特征在于，耐藥腫瘤細胞的培養基由低氘水配制。9.根據權利9所述的方法，配制多藥耐藥腫瘤細胞的培養基的低氘水的含氘量為0.01-100ppmo10.根據權利9所述的方法，根據權利要求1所述的應用，所述的腫瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、口腔癌、宮頸癌、結直腸癌、胰腺癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌或白血病D
【文檔編號】A61P35/00GK105878270SQ201410858081
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月31日
【發明人】楊慧齡, 張瀚彬, 祝葆華, 王宏強, 陳楚言
【申請人】廣東醫學院