蛋白酶體抑制劑mln9708單獨或聯合阿霉素在制備治療乳腺癌藥物中的用圖

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蛋白酶體抑制劑mln9708單獨或聯合阿霉素在制備治療乳腺癌藥物中的用圖
【專利摘要】本發明公開了蛋白酶體抑制劑MLN9708單獨或聯合阿霉素在制備治療乳腺癌藥物中的用途，屬于醫藥技術領域。本發明人以腫瘤細胞中蛋白質代謝所必需的蛋白酶體及其抑制劑的生理作用與阿霉素的抗腫瘤機制為理論依據，通過研究發現，蛋白酶體抑制劑MLN9708作為單藥，能夠誘導癌細胞凋亡，在一定程度上可能減緩癌細胞的惡性程度，進一步的，本發明發明人還發現將蛋白酶體抑制劑MLN9708與阿霉素聯用可以有效提高阿霉素化學治療的敏感性。本發明的提出為乳腺癌的化學治療提供了一種新的有效的技術手段，蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素能夠有效增強化學治療乳腺癌的敏感性，降低細胞毒性化學藥物的使用劑量，延緩了腫瘤耐藥的發生以及腫瘤細胞的惡性進展。
【專利說明】
蛋白酶體抑制劑MLN9708單獨或聯合阿霉素在制備治療乳腺癌藥物中的用途
技術領域
[0001] 本發明設及一種治療乳腺癌的新藥物，特別設及一種蛋白酶體抑制劑單獨或聯合細胞毒性化學治療藥物在治療乳腺癌中的用途，本發明屬于醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 根據2013年全國腫瘤登記分析，乳腺癌的發病率位于女性癌癥發病率之首，因乳腺癌導致的死亡率在全部女性癌癥中位列第四。浸潤性乳腺癌占全部病例的90 % W上。根據癌細胞的不同類型，對治療的敏感性也存在較大的差異，但目前為止，化學治療仍是乳腺癌非手術治療中基礎性的組成部分。公認并推薦的化學治療方案中含有細胞毒性化學治療藥物阿霉素(doxorubicin, Dox)。運是一種主要作用于DNA的細胞周期非特異性的蔥環類化療藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。自上世紀70年代起，阿霉素廣泛應用于多種血液系統惡性腫瘤如白血病及何杰金淋己瘤W及多種惡性實體瘤包括乳腺癌等的治療。該藥能嵌入DNA而抑制核酸的合成從而發揮廣譜的細胞毒性作用。但阿霉素的持續使用會導致一系列的副作用，包括白細胞和血小板減少、脫發等，最重要的是屯、臟毒性，可W引起屯、律失常、屯、肌損傷、屯、功不全甚至可在停藥半年后引起遲發性嚴重屯、力衰竭。屯、臟毒性與累積給藥劑量密切相關。總劑量超過550mg/m2者，此類副反應發生率可達30 %。
[0003] 蛋白酶體是位于真核細胞內的具有多重蛋白降解能力的蛋白復合物，分布于細胞質及細胞核中。主要的功能是對泛素化的細胞內蛋白進行降解，是實現細胞內蛋白質組穩態的關鍵性結構，從而使細胞能動態地適應由于各種內外環境變化而引起的蛋白質組改變。超過80%的細胞內蛋白會經過由蛋白酶體參與構成的泛素化-蛋白酶體通路而被降解。運些細胞內的蛋白種類繁多，參與了細胞功能調節的各種環節，如細胞周期、細胞調亡、轉錄、DNA損傷修復、抗原呈遞等。自從上世紀70年代起，研究者逐步了解到蛋白酶體的結構與功能，發現人類的26S蛋白酶體是由20S的核屯、催化區與19S的催化功能調節區構成。20S的催化核屯、區呈空屯、柱狀，是由4個環狀結構Κα-β-β-α的順序累加而成。其主要的催化功能區位于β環，又是由3類具有不同催化特性的亞單位構成，分別稱為m(caspase-Uke，C-L)、 02(1:巧93；[]1-1化6，1'-]^)和05((3115〇]1〇1:巧93；[]1-1146，〔1'-]^)亞單位。目前已證實主要有5類化合物能作為蛋白酶體抑制劑，由于代謝活性不穩定、抑制能力差或缺乏特異性等原因，真正已經應用于臨床治療的主要還是W第一代蛋白酶體抑制劑PS-341(Bortezomib，棚替佐米）為代表的棚氨酸類膚的類似物。本發明中使用的是新一代蛋白酶體抑制劑MLN9708 αxazom化），是PS-341的下一代藥物，該藥現已獲得美國抑A許可，用于難治性/復發性多發骨髓瘤的臨床治療。目前對MLN9708的相關研究主要集中在血液系統惡性腫瘤，已公開發表的文獻中尚無應用于浸潤性乳腺癌相關報道。

【發明內容】

[0004] 針對浸潤性乳腺癌的常規化學治療過程中存在阿霉素的劑量依賴性的毒副作用，本發明的目的在于提供一種新的化學藥物治療策略來治療乳腺癌。
[0005] 為了達到上述目的，本發明采用了 W下技術手段：
[0006] 本發明人W腫瘤細胞中蛋白質代謝所必需的蛋白酶體及其抑制劑的生理作用與阿霉素的抗腫瘤機制為理論依據，通過研究發現，蛋白酶體抑制劑MLN9708作為單藥，能夠誘導癌細胞調亡，在一定程度上可能減緩癌細胞的惡性程度，進一步的，本發明人還發現將蛋白酶體抑制劑MLN9708與阿霉素聯用可W強化阿霉素誘導的MAPK的激活，延緩NF-KB的激活，有效地降低阿霉素的使用劑量，從而減輕阿霉素的毒副作用。本發明針對不同分子亞型的浸潤性乳腺癌聯合應用上述組合方案，檢測發現腫瘤細胞MAPK的激活增強，NF-KB的激活延遲，而PARP，Caspase3的降解得到增強，細胞增殖能力明顯下降，細胞調亡提前出現，證明該組合可W有效提高阿霉素化學治療的敏感性。本發明的方法改進了浸潤性乳腺癌的化學治療策略，蛋白酶體抑制劑聯合應用阿霉素有效增強了化學治療乳腺癌的敏感性，降低了腫瘤細胞的惡性程度。
[0007] 因此，在上述研究的基礎上，本發明提出了蛋白酶體抑制劑MLN9708作為唯一有效成分在制備治療乳腺癌藥物中的用途，所述的蛋白酶體抑制劑MLN9708 ( 4- (carboxymethyl)-2-((R)-1-(2-(2,5-dichlorobenzamido)acetamido)-3-methylbutyl)- 6-oxo-l, 3,2-dioxabo;rinane-4-ca;rbo巧lie acid，4-簇基-2-[ (lR)-1-[ [2-[ (2,5-二氯苯甲酯基)氨基]乙酷基]氨基]-3-甲基下基]-6-氧代-1，3,2-二氧棚雜環己-4-乙酸）的分子式為C20出濁CI2N2O9，分子量517.12162，其化學結構式如式I所示：
[000引
[0009] 所述的蛋白酶體抑制劑MLN9708可購自美國APExBIO公司（貨號#A4007)。
[0010] 在本發明中，優選的，所述的乳腺癌為浸潤性乳腺癌。
[0011] 進一步的，本發明還提出了蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合阿霉素在制備治療乳腺癌，特別是浸潤性乳腺癌藥物中的用途。W及一種用于治療乳腺癌的藥物組合物，其有效成分由蛋白酶體抑制劑MLN9708 W及阿霉素組成。
[0012] 相較于現有技術，本發明的有益效果是：
[001引（1)提出了蛋白酶體抑制劑MLN9708在治療乳腺癌中的用途，即為乳腺癌的治療提供了一種新的，有效的技術手段；
[0014] (2)提出了蛋白酶體抑制劑MLN9708與阿霉素聯用治療乳腺癌的方法，相較于單獨使用阿霉素，該方法提高了腫瘤細胞對W阿霉素為代表的現有細胞毒性化學治療的敏感性，降低了細胞毒性化學藥物的使用劑量，延緩了腫瘤耐藥的發生，延緩了腫瘤細胞的惡性進展；
[001引（3)由于本發明的蛋白酶體抑制劑MLN9708可W 口服，因此今后臨床應用會更為方便。
【附圖說明】
[0016] 圖1是單獨加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后乳腺癌細胞存活曲線圖；
[0017] 包括乳腺癌細胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、肥 C1954、MDA-MB-468、MDA-MB- 231和BT-549;
[0018] 圖2是單獨加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后乳腺癌細胞存活狀態圖；
[0019] 包括乳腺癌細胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、肥 C1954、MDA-MB-468、MDA-MB- 231和BT-549;
[0020] 圖3是單獨加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后乳腺癌細胞細胞平板克隆形成示意圖；
[0021] 包括乳腺癌細胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、肥 C1954、MDA-MB-468、MDA-MB- 231和BT-549;
[0022] 圖4是單獨加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后乳腺癌細胞錯定非依賴生長示意圖；
[0023] 包括乳腺癌細胞了470、]\?3^7、]\?^-18-361、]\?^-18-468、]\?^-18-23巧郵1'-549;
[0024] 圖5是單獨加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后乳腺癌細胞錯定非依賴生長統計圖；
[00 巧]A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:MDA-MB-468;E:MDA-MB-231;F:BT-549;
[00%] 圖6是單獨加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后乳腺癌細胞中PARP和化spase 3裂解的 Western blot圖；
[0027] A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC19 5 4;F:MDA-MB-46 8;G:MDA-MB- 231；H：BT-549；
[0028] 圖7是蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素后乳腺癌細胞存活柱形圖；
[00 巧]A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC1954;F:MDA-MB-468;G:MDA-MB- 231；H：BT-549；
[0030] 圖8是蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素后乳腺癌細胞中PARP和化spase 3 裂解的Western blot圖；
[0031] A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC19 5 4;F:MDA-MB-46 8;G:MDA-MB- 231；H：BT-549；
[0032] 圖9是蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素后乳腺癌細胞中JNK、p3如溝酸化和 ΙκΒα表達的Western blot圖。
[0033] A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC1954;F:MDA-MB-468;G:MDA-MB- 231；H：BT-549〇
【具體實施方式】
[0034] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，應該理解的是，運些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。
[0035] 實施例1蛋白酶體抑制劑MLN9708對乳腺癌細胞惡性程度的影響
[0036] 1、蛋白酶體抑制劑MLN9708單獨對乳腺癌細胞的作用
[0037] (1 )MLN9708單獨對乳腺癌細胞存活能力的影響
[0038] 從ATCC中選擇乳腺癌細胞系作為研究對象，包括了 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK- BR-3、HCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和 BT-549,分別代表 ER/PR+/-、HER2+和 ER/PR/ 肥R2-型乳腺癌類型，具體分型如表1所示。
[0039] 表1.乳腺癌細胞系分子分型
[0040]
[0041 ] 注：AC:腺癌；BaA:Basal A，基底細胞樣型A;BaB:Basal B，基底細胞樣型B;Ca, carcinoma; Due.化：導管癌；IDC:浸潤性導管癌；Lu: luminal;化P:乳頭狀癌；P. Br:原發性乳腺癌;PE:胸腔積液
[0042] 邸/PR/肥R2型:ER/PR陽性和肥R2表達來源于Sanger網站。方括號表示數據來源于 mRNA水平，沒有蛋白數據。
[0043] ①繪制細胞生存曲線檢測加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后的細胞增殖能力變化，計算半數抑制濃度（I巧0)值
[0044] 乳腺癌細胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3JCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549)分別按每孔5X103個接種入96孔板培養，24h后加入MLN9708使其終濃度分別為 0. (ΠμΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜΚ及ΙΟμΜ，同時設不力日MLN9708的細胞作為對照，培養72h。加入CCK-8解育化后讀取450nm吸光值，繪制細胞存活曲線，結果如圖1所示。從圖1結果可W看出，與對照組細胞相比，加入MLN9708后細胞存活數量明顯降低，說明MLN9708可降低乳腺癌細胞的增殖能力。根據細胞存活曲線計算MLN9708在各種乳腺癌細胞中的IC50值，結果如表2所示，可知IC50值范圍在0.043μΜ(Τ470)至1.007μΜ(ΒΤ-549)之間。
[0045] 表2 .MLN9708在乳腺癌細胞系中的IC50值
[0046]
[0047] ②顯微鏡下觀察加入蛋白酶體抑制劑MLN9708后細胞存活狀態
[004 引上述乳腺癌細胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、HCC1954、MDA-MB-468、MDA- MB-231和BT-549)分別按每孔5乂103個接種入96孔板培養，2地后加入肥腳708使其終濃度分別為0.0化]?、0.0化]?、0.化]\1、0.34]\1、化]\1、34]\1^及1化]\1，同時設不加肥腳708的細胞作為對照，培養72h。顯微鏡下拍照觀察加入MLN9708后細胞的存活狀態，結果如圖2所示（只顯示了 0、0.化1和0.341濃度下的細胞）。從圖2結果可^看出，與對照組細胞相比，加入肥腳708后細胞存活數量明顯降低，進一步證實MLN9708可降低乳腺癌細胞的增殖能力。
[0049]③細胞克隆形成能力檢測
[00 加]乳腺癌細胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3JCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549)分別按每孔5X103個計數，接種于6孔板中培養。4化后加入MLN9708使其終濃度分別為0 . ΙμΜΚ及0 .化M，同時設不加 MLN9708的細胞作為對照，培養7化后，更換成沒有 MLN9708的正常培養液繼續培養兩周。甲醇固定，結晶紫染色后拍照。結果如圖3所示，從圖3 結果可W看出，與對照組細胞相比，加入MLN9708后細胞克隆數量明顯降低，說明抑制劑可降低乳腺癌細胞的增殖能力。
[0051] (2)檢測蛋白酶體抑制劑MLN9708對乳腺癌細胞錯定非依賴生長的影響
[0052]乳腺癌細胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和 ΒΤ-549)分別按每孔5 X ΙΟ3個計數，加入MLN9708使其終濃度分別為0. ΙμΜ和0.3μΜ，同時設不力日MLN9708的細胞作為對照，接種于6孔板軟瓊脂培養基中培養3~4周，直至出現肉眼可見克隆。結晶紫染色后拍照。結果如圖4所示，從圖4結果可W看出，與對照組細胞相比，加入MLN9708后細胞克隆數量明顯降低。統計細胞克隆數目，繪制成圖，通過統計學方差分析（Dunnett's multiple comparison post-test)，沖<0.05、*沖<0.01、**沖<0.001，有統計學意義，結果如圖5所示，說明抑制劑MLN9708可降低細胞的錯定非依賴生長能力。
[0053] (3)檢測蛋白酶體抑制劑MLN9708誘導乳腺癌細胞調亡的作用
[0化4] MLN9708是否可W誘導乳腺癌細胞發生調亡，通過常規Western blot技術，檢測抑制劑作用于細胞是否出現PARP裂解和化spase 3活化。
[0055]乳腺癌細胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549,加入MLN9708使其終濃度分別為0.0341、0.化1、0.341^及化1，同時設不加 MLN9708的細胞作為對照，作用24h。常規蛋白質提取，蛋白質濃度測定，SDS-PAGE凝膠電泳， Western blot分析，用針對PARP和化spase 3的特異性抗體檢測抑制劑作用于細胞是否出現PARP裂解和活化的化spase 3裂解片段。結果見圖6,從圖6結果可W看出，在乳腺癌細胞中隨著MLN9708從低到高濃度的作用，出現了PARP裂解和活化的化spase 3的裂解片段。說明MLN9708可W誘導乳腺癌細胞發生調亡。
[0056] 2、檢測蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素對乳腺癌細胞生物學行為的影響
[0057] (1)檢測蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素對乳腺癌細胞存活能力的影響
[005引乳腺癌細胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549分別按每孔5 ΧΙΟ3個接種入96孔板培養，24h后加入阿霉素使其終濃度為化Μ、 0.0扣Μ、0. ΙμΜ、0.2μΜ、0.5μΜ、ΙμΜ、2μΜW及扣Μ，單獨或聯合應用MLN9708 0. ΙμΜ培養48h。加入CCK-8解育化后讀取450nm吸光值，繪制細胞存活柱形圖，結果如圖7所示，從圖7結果可W 看出，聯合應用阿霉素和MLN9708后細胞存活數量明顯低于單獨使用阿霉素時的細胞存活數量，說明MLN9708可W增強阿霉素誘導的細胞毒性作用，增強了乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性。
[0059] (2)檢測蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素誘導乳腺癌細胞調亡的作用
[0060] 乳腺癌細胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549,加入阿霉素 ΙμΜ單獨應用或聯合應用MLN9708 Ο.ΙμΜ作用0、16h或2地。常規蛋白質提取，蛋白質濃度的測定，SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot分析，檢測抑制劑作用于細胞是否出現PARP裂解和活化的化spase 3裂解片段。結果見圖8,從圖8結果可W看出，在乳腺癌細胞中隨著MLN9708加入，PARP裂解和活化的化spase 3的裂解片段相比于單獨使用阿霉素時提前出現，或者加強。說明MLN9708可W增強乳腺癌細胞對阿霉素誘導細胞調亡的敏感性。
[0061] (3)檢測蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合應用阿霉素誘導的信號通路的改變
[0062] 乳腺癌細胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549,加入阿霉素20μΜ單獨應用或聯合應用MLN9708 ΙμΜ作用0、化、祉或地。常規蛋白質提取，蛋白質濃度的測定，SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot分析，檢巧UMLN9708作用于細胞是否對阿霉素誘導的細胞信號通路有影響。結果見圖9,從圖9結果可W看出，在乳腺癌細胞中阿霉素可W誘導細胞出現MAPK通路JNK和p38發生憐酸化，并可W誘導ΙκΒα降解而激活 NF-κΒ通路。當阿霉素聯合應用MLN970別寸，細胞出現ΜΑΡΚ通路JNK和ρ38的憐酸化水平明顯增加，ΙκΒα降解NF-KB激活受到抑制。說明MLN9708可W增強阿霉素誘導的JNK和ρ3如溝酸化，從而誘導細胞出現調亡；并可W通過抑制ΙκΒα降解，抑制NF-KB通路激活，從而抑制了細胞的存活能力。
[0063] W上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 蛋白酶體抑制劑MLN9708作為唯一有效成分在制備治療乳腺癌藥物中的用途，所述的蛋白酶體抑制劑MLN9708的化學結構式如式I所示：2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的乳腺癌為浸潤性乳腺癌。3. 蛋白酶體抑制劑MLN9708聯合阿霉素在制備治療乳腺癌藥物中的用途，所述的蛋白酶體抑制劑MLN9708的仆-4. 如權利要求3所述的用途，其特征在于所述的乳腺癌為浸潤性乳腺癌。5. -種用于治療乳腺癌的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物的有效成分由蛋白酶體抑制劑MLN9708以及阿霉素組成，所述的蛋白酶體抑制劑MLN9708的化學結構式如式 I所示：
【文檔編號】A61K31/69GK105878257SQ201610202268
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月1日
【發明人】崔云甫, 王浩, 鐘翔宇, 王志東, 蘇志雷
【申請人】哈爾濱醫科大學

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