預防和治療阿片類鎮痛藥止痛耐受性的紫堇達明藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了紫堇達明(CDL)在鎮痛藥物領域的新用途，具體公開紫堇達明在制備預防或治療阿片類鎮痛藥物鎮痛耐受性的藥物中的用途。所述紫堇達明配合阿片類藥物使用，或是與阿片類藥物制成復方制劑使用，可以增強其鎮痛效能，預防或減輕慢性阿片類藥物治療過程中出現的阿片耐受現象。這種作用具體是通過紫堇達明抑制阿片類藥物誘導脊髓小膠質細胞過度活化、抑制阿片誘導的過度上調的p?P38、p?ERK和p?JNK等途徑實現的。
【專利說明】
預防和治療阿片類鎮痛藥止痛耐受性的紫堇達明藥物組合物
技術領域
[0001]本發明屬于制藥領域，概況地講，本發明涉及一種預防和治療阿片類鎮痛藥止痛耐受作用的藥物及其組合物，更具體地，本發明涉及包含紫堇達明(CDL)及其藥學上可接受的鹽作為預防和治療阿片類鎮痛藥止痛耐受性的有效成分的藥物及其組合，涉及該藥物及其組合物在制備具有增強阿片類藥物鎮痛效應、延緩或減輕阿片耐受的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]疼痛是一種復雜的生理心理活動，包括傷害性刺激作用于機體所引起的痛感覺，以及機體對傷害性刺激的痛反應。1995年世界疼痛學會提出將疼痛與心率、血壓、呼吸、體溫同列為生命的第五大體征。疼痛是臨床上最常見的癥狀之一，也是醫務工作者迫切需要解決的重要問題。
[0003]疼痛可分為急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛為持續時間較短的疼痛，常與損傷或疾病有關。慢性疼痛則為持續較長時間的疼痛，病人常伴有焦慮、抑郁等精神心理改變。
[0004]阿片類鎮痛藥一直是治療中、重度急性疼痛的首選藥物，主要包括嗎啡、芬太尼、氫嗎啡酮、可待因、羥考酮、哌替啶、曲馬多和美沙酮等。阿片類鎮痛藥具有優異的鎮痛作用，廣泛用于術后急性疼痛，癌癥痛及神經病理性疼痛等臨床治療。阿片類藥物發揮鎮痛作用有著共同的作用機制，主要通過作用于神經系統中的特異性的阿片受體，降低痛覺傳遞神經元的興奮性而發揮其鎮痛作用。
[0005]阿片類藥物在使用過程中具有多種不良反應，如惡心嘔吐、鎮靜嗜睡、呼吸抑制、便秘、急性中毒、成癮、依賴等，這些不良反應嚴重限制了阿片類藥物作為優良鎮痛藥物的廣泛使用。阿片類藥物的不良反應多是阿片鎮痛藥劑量相關的，臨床上需要在理想鎮痛藥效劑量與該劑量帶來的難以處理的不良反應之間進行平衡，常常需要犧牲鎮痛藥效來減輕不良反應。除了上述的不良反應外，“阿片耐受”也是影響阿片類藥物臨床應用的重要問題。反復使用阿片類止痛藥物會導致其鎮痛效果逐步降低，并最終導致對阿片類藥物鎮痛作用的耐受性的發展，進一步導致其鎮痛效果降低，需要給予更高劑量的阿片類鎮痛藥物才能達到最初的鎮痛效果，使得病人需要承受更高劑量阿片類鎮痛藥帶來的不良反應。嚴重限制了阿片類藥物在臨床領域的應用。因此，預防和治療阿片類鎮痛藥止痛耐受性具有重要的意義和臨床價值。
[0006]紫堇達明(CDL)為常用鎮痛中藥延胡索中的痕量成分，是一種四氫原小檗堿類生物堿，中國專利ZL02138363.4公開了一種紫堇達明的生物轉化制備方法及其在制備鎮痛藥中的應用，使得紫堇達明(CDL)大量制備成為可能。紫堇達明(CDL)作為一種自身具備鎮痛作用的化合物，其鎮痛作用機制尚未得到清晰闡明，迄今為止也沒有紫堇達明(CDL)與阿片相關的鎮痛效應增強或阿片耐受方面的研究報道。需要指出的是，即使是相同用途的兩種不同藥物聯合使用的藥效也是復雜和難以預期的，可能產生藥效協同、相加甚至拮抗的現象。因此對本領域專業人員除非通過必要的實驗研究，否則難以簡單根據紫堇達明(CDL)自身具有鎮痛作用而建立紫堇達明(CDL)能增強阿片類藥物鎮痛效應或延緩阿片耐受的邏輯命題。
[0007]發明人在紫堇達明(CDL)對病理性疼痛鎮痛作用及機制研究過程中，通過大量實驗數據得出:紫堇達(CDL)明在不影響正常動物痛閾的劑量下，能顯著增強其鎮痛作用，并能延緩慢性阿片類藥物導致的阿片耐受現象的發生。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種包含紫堇達明(CDL)為有效成分藥物和/或組合，用于預防和治療阿片類藥物鎮痛耐受性現象。
[0009]本發明所提供的含有紫堇達明(CDL)的藥物組合的用途是其在制備增強阿片類鎮痛效應、延緩或減輕阿片耐受的藥物中的用途。
[0010]本發明中，是以所述紫堇達明(CDL)為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分，制備成制劑配合阿片類藥物使用。
[0011]所述輔料或輔助性成分包括藥學領域可接受的載體如稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
[0012]本發明中，所述紫堇達明(⑶L)與阿片類藥物制成復方制劑使用。
[0013]本發明中，所述配合阿片類藥物使用的制劑選自注射液、皮下埋植劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、緩釋劑中的一種。
[0014]本發明中，所述復方制劑選自注射液、皮下埋植劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、緩釋劑中的一種。
[0015]上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。
[0016]本發明具有的有益效應為:本發明首次公開了紫堇達明(CDL)用于增強阿片類藥物的鎮痛作用，延緩或減輕阿片耐受的發生，并且闡述了紫堇達明(CDL)上述效應的作用機制:阿片類藥物急性或者慢性處理可以誘導小膠質細胞活化，P-P38、p-ERK和p-JNK上調，釋放多種炎癥因子，這在阿片類藥物急性鎮痛效應及慢性耐受過程中發揮關鍵的作用，紫堇達明(CDL)通過阻斷上述環節而發揮急性阿片鎮痛增強的效應與減輕阿片耐受現象的發生。本發明也提供了可以實現的制劑形式。本發明預期能夠加強阿片類藥物在中重度疼痛治療領域的應用空間:紫堇達明(CDL)能夠對抗慢性阿片應用過程中難以克服的耐受現象，充分發揮阿片類藥物強大的鎮痛作用，為疼痛治療提供更多的選擇。
【附圖說明】
[0017]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0018]圖1為局部鞘內給藥模式下，紫堇達明(CDL)對慢性嗎啡耐受作用的示意圖。
[0019]圖2為局部鞘內給藥模式下，紫堇達明(⑶L)對慢性嗎啡耐受上調的p-ERK，p-p38，p-JNK蛋白表達水平作用的示意圖。
[0020]圖3為局部鞘內給藥模式下，紫堇達明(CDL)對慢性嗎啡耐受激活的星形膠質細胞以及小膠質細胞的影響的示意圖。
[0021]圖4為局部鞘內給藥模式下，在慢性嗎啡耐受模型中，多巴胺D2受體激動劑quinpirole對紫堇達明(⑶L)作用的示意圖。
[0022]圖5為在動物在體水平，紫堇達明(CDL)對芬太尼處理導致的阿片耐受現象的示意圖。
【具體實施方式】
[0023]以下結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。下述實施例中所述試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法;所述試劑盒材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0024]嗎啡是阿片類鎮痛藥中應用的最為廣泛的代表性藥物，其它阿片類藥物與嗎啡具有相似的作用機制，如在通過與阿片受體結合發揮強大鎮痛效應的同時，都能誘導神經小膠質細胞活化及P-P38顯著上調，并且這種神經小膠質細胞炎癥及p-P38上調影響其鎮痛效應的發揮和促進耐受現象的發生。因此，本實施例主要公開最經典的阿片類藥物-嗎啡的研究結果，同時也公開了另一種廣泛應用的阿片類藥物芬太尼的研究結果，嗎啡和芬太尼有著廣泛的代表性，專業領域技術人員可以在其他的阿片類藥物中重現類似的研究結果。
[0025]實施例1、紫堇達明(⑶L)能夠緩解慢性給予嗎啡導致的阿片耐受現象
[0026](I)試驗動物:
[0027]健康雌性ICR小鼠，清潔級，體重為18_22g，由揚州大學動物中心提供。實驗動物飼養于12h-12h晝夜交替的獨立環境中，室溫維持在24±2°C，自由飲水和攝食，在適應環境I周后進行實驗。對動物的所有處理均遵循國際疼痛研究協會倫理委員會的要求。
[0028](2)試驗藥品及試劑:
[0029]鹽酸嗎啡，購自沈陽第一制藥廠
[0030](3)試驗方法
[0031]⑶L給藥劑量及方法:⑶L用含有1%DMS0的無菌生理鹽水溶解，劑量分別為lyg/10μ?，3.3μ/δ10μ1，10μδ/10μ1，給藥方式為鞘內注射；嗎啡給藥劑量及方法:嗎啡用無菌生理鹽水稀釋成loyg/1yi，給藥方式為鞘內注射；
[0032]鞘內注射方法:按壓小鼠腰骶部兩側固定，自L5-L6棘突間進針，以鼠尾突然出現側向運動為注射成功標志。用25μ1微量進樣器，注射容積為10μ1，注射時間1s，留針20s。
[0033]ICR小鼠隨機分為7組，分別為空白對照組，溶媒組，嗎啡模型組、嗎啡-CDL低劑量給藥組、嗎啡-CDL中劑量給藥組和嗎啡-CDL高劑量給藥組，CDL高劑量組，治療組小鼠在開始測定前15min腹腔注射CDL lyg/10yl，3.3yg/10yl，10yg/10yl，模型組和治療組在開始測定前30min鞘內注射嗎啡10yg/10yl，隨后進行疼痛的行為學測定，每天重復以上方式，連續7天。
[0034]慢性嗎啡耐受測試:每天嗎啡注射(lOyg/lOyl，鞘內)，連續7天，每次注射30min后測定鎮痛效應(52°C水浴)ο熱甩尾法測定CDL伴隨給藥對小鼠基礎痛閾以及嗎啡鎮痛效能的影響。分別將小鼠的尾巴(約3cm)浸入52°C的恒溫水浴鍋，以開始出現縮尾反映的時間作為痛閾指標。疼痛反應截止期為10s。記錄給藥前后的添足潛伏期，按照公式計算出最大鎮痛效應百分比(MPE)%) = (給藥后潛伏期-給藥前潛伏期)/(20-給藥前潛伏期)X100。
[0035](4)實驗結果描述:
[0036]如圖1A所示，隨著給藥天數的增加，嗎啡鎮痛作用降低，形成嗎啡耐受。而鞘內給予不同劑量紫堇達明(CDL)能夠緩解慢性嗎啡耐受的形成，其中高劑量的CDL(10yg，it.)效果最好。CDL在此劑量下對正常小鼠痛閾值沒有顯著影響。鎮痛效果以最大鎮痛百分率MPE)表示。圖lB為鎮痛曲線下面積(n = 12，與模型組相比，*P<0.05，#P<0.01)。
[0037]實施例2、紫堇達明(CDL)能夠降低慢性嗎啡耐受上調的p-ERK，p-p38以及p-JNK蛋白表達水平
[0038](I)試驗動物:
[0039]健康雌性ICR小鼠，清潔級，體重為18_22g，由揚州大學動物中心提供。實驗動物飼養于12h-12h晝夜交替的獨立環境中，室溫維持在24±2°C，自由飲水和攝食，在適應環境I周后進行實驗。對動物的所有處理均遵循國際疼痛研究協會倫理委員會的要求。
[0040](2)試驗藥品及試劑:
[0041 ] Tris nTEMED N β-Mer cap to ethanol、甘氨酸、吐溫-20SDS、30 % Acrylamide/Bis、Ammonium Persulfate、GAPDH購自 sigma ;Marker購自 Thermo ;溴酸藍、甘油、BovineSerumAlbumin購于Sunshine;甲醇、氯化鈉、丙三醇購于南京化學試劑有限公司；p-ERK，p-口38以及口-】服抗體，ant1-rabbit，ant1-mouse購于cel I signaling ； RI PA裂解液購自Beyotime B1technology;ECL發光液購自Pierce。
[0042](3)試驗方法
[0043]免疫印跡(Western blotting):小鼠給藥第7天時，給藥30min后取小鼠L4-L6脊髓節段按一定比例加入裂解液，三次勻漿處理，12000轉離心15min，吸取上清，加入5 Xloading buffer沸水浴6min，取50yg蛋白樣品上樣于10%SDS-PAGE進行凝膠電泳，4°C 110V電轉60min。5%BSA-TBS封閉2小時后，分別加入一抗(1:1000)室溫孵育3h，4°C過夜，TBST洗1min X 3，加入二抗，室溫下孵育3h，TBST洗1min X 3，加入ECL發光底物顯色。用分子顯影儀(Gel DocTM XR，170-8170)聯合Quantity One-4.6.5(B1-Rad Laboratories)軟件分析數據。用目的蛋白灰度值與胞漿蛋白內參GAPDH灰度值之比進行半定量分析。
[0044](4)實驗結果描述
[0045]如圖2所示，在慢性嗎啡耐受模型中，MAPK家族磷酸化蛋白水平顯著升高(與空白組相比#P<0.05，##p<0.01)，而紫堇達明(⑶L)能夠顯著抑制慢性嗎啡耐受模型中上調的MAPK家族蛋白水平的影響(與模型組相比，*P<0.05，#P<0.01)。
[0046]實施例3、紫堇達明(CDL)能夠抑制慢性嗎啡耐受激活的星形膠質細胞以及小膠質細胞
[0047](I)試驗動物:
[0048]健康雌性ICR小鼠，清潔級，體重為18_22g，由揚州大學動物中心提供。實驗動物飼養于12h-12h晝夜交替的獨立環境中，室溫維持在24±2°C，自由飲水和攝食，在適應環境I周后進行實驗。對動物的所有處理均遵循國際疼痛研究協會倫理委員會的要求。
[0049](2)試驗藥品及試劑:
[0050]Tris nTEMED N β-Mer cap to ethanol、甘氨酸、吐溫-20SDS、30 % Acrylamide/Bis、Ammonium Persulfate、GAPDH購自 sigma ;Marker購自 Thermo ;溴酸藍、甘油、BovineSerumAlbumin購于Sunshine;甲醇、氯化鈉、丙三醇購于南京化學試劑有限公司；免疫印跡抗體 GFAP 購自 Millipore ； I BA 購自 Wako Pure Chemical; an t 1-rabbi t、ant1-mouse購于cell signaling;RIPA裂解液購自Beyotime B1technology;ECL發光液購自Pierce。免疫焚光抗體GFAP及IBAl購于abeam;驢抗兔焚光二抗、驢血清購于Jackson Lab0[0051 ] (3)實驗方法
[°°52] 免疫焚光(Immunofluorescence):小鼠給藥第7天時，給藥30min，各組小鼠經腹腔10%水合氯醛麻醉后，經左心插管，灌注0.0lM PBS20ml(pH 7.4)，繼續灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(固定液)20ml行組織前固定。取L4-L6脊髓段，在上述固定液中后固定過夜，然后在40C冰箱環境內予以蔗糖0.0IM PBS緩沖液(30 % )中脫水直至沉底。再運用恒冷切片機(Leica 011900，德國)冰凍、連續冠狀切片(熒光片厚254111)。切片經0.0謂PBS(pH7.4)漂洗3次，每次1min;用10%驢血清室溫封閉2h后孵育一抗(l:200，abcam0)，4°C孵育過夜;PBS漂洗3次，每次1min;孵育二抗:加熒光二抗(1:300; Jackson Lab)，室溫孵育2h;避光漂洗3次，每次1min;貼片，熒光封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡(LSCM，LeiCaTCS SP2，德國)避光下放大100倍或400倍對脊髓組織切片進行觀察并攝片。
[0053](4)實驗結果描述
[0054]如圖3所示，圖3為western blot檢測脊髓水平星形膠質細胞標記物GFAP及小膠質細胞標記物IBAl蛋白表達水平，結果顯示，慢性嗎啡耐受過程中，GFAP及IBAl表達升高(與空白組相比，#P<0.05)，而CDL能夠顯著抑制慢性嗎啡耐受模型中上調的GFAP及IBAl蛋白表達水平(與模型組相比*P< 0.05，**P<0.01)。圖3C及3D為免疫熒光結果顯示，慢性嗎啡耐受過程中脊髓水平GFAP及IBAl熒光表達水平升高，CDL能夠降低慢性嗎啡耐受上調的6卩八?及1841熒光表達水平(樸<0.05，*樸<0.01)。
[0055]實施例4、慢性嗎啡耐受過程中，多巴胺D2受體激動劑quinpirole能夠取消紫堇達明(CDL)對慢性嗎啡耐受的影響
[0056](I)試驗動物:
[0057]健康雌性ICR小鼠，清潔級，體重為18_22g，由揚州大學動物中心提供。實驗動物飼養于12h-12h晝夜交替的獨立環境中，室溫維持在24±2°C，自由飲水和攝食，在適應環境I周后進行實驗。對動物的所有處理均遵循國際疼痛研究協會倫理委員會的要求。
[0058](2)試驗藥品及試劑:
[0059]多巴胺D2受體激動劑quinpirole購自Tocris公司。
[0060](3)試驗方法
[0061 ]多巴胺D2受體激動劑給藥劑量及方法:quinpir0le用無菌生理鹽水溶解，劑量為4μ8/10μ1，給藥方式為鞘內注射;CDL給藥劑量為3.3yg/10yl;嗎啡為10yg/10yl;
[0062]聯合給藥組quinpirole給藥后15min給予⑶L，15min后再給予嗎啡。各組均在給藥后30m i η運用熱用尾法測定小鼠痛閾值。
[0063](4)實驗結果描述
[0064]如圖4所示，隨著給藥天數的增加嗎啡鎮痛作用降低，形成嗎啡耐受。而給予CDL能夠緩解慢性嗎啡耐受的形成，多巴胺受體激動劑quinpirole能夠取消CDL對慢性嗎啡耐受的作用，表明CDL緩解嗎啡耐受與抑制多巴胺D2受體有關。鎮痛效果以最大鎮痛百分率MPE)表示。圖4B為鎮痛曲線下面積。
[0065]實施例5、紫堇達明(⑶L)能夠緩解慢性給予芬太尼導致的阿片耐受現象
[0066](I)試驗動物:
[0067]健康雌性ICR小鼠，清潔級，體重為18_22g，由揚州大學動物中心提供。實驗動物飼養于12h-12h晝夜交替的獨立環境中，室溫維持在24±2°C，自由飲水和攝食，在適應環境I周后進行實驗。對動物的所有處理均遵循國際疼痛研究協會倫理委員會的要求。
[0068](2)試驗藥品及試劑:
[0069]枸櫞酸芬太尼注射劑，江蘇恩華藥業股份有限公司。
[0070](3)試驗方法
[0071]⑶L給藥劑量及方法:⑶L用含有1%DMS0的無菌生理鹽水溶解，劑量分別為lyg/10μ?，3.3μδ/10μ1，10μδ/10μ1，給藥方式為鞘內注射;芬太尼給藥劑量及方法:芬太尼用無菌生理鹽水稀釋成10yg/10yl，給藥方式為鞘內注射；
[0072]ICR小鼠隨機分為7組，分別為空白對照組，溶媒組，芬太尼模型組、芬太尼-CDL低劑量給藥組、芬太尼-⑶L中劑量給藥組和芬太尼-CDL高劑量給藥組，⑶L高劑量組，治療組小鼠在開始測定前15min鞘內注射CDL lyg/10yl，3.3yg/10yl，10yg/10yl，模型組和治療組在開始測定前30min鞘內注射芬太尼lOyg/lOyl，隨后進行疼痛的行為學測定，每天重復以上方式，連續7天。
[0073]慢性耐受測試:每天芬太尼注射(lOyg/lOyl，鞘內)，連續7天，每次注射30min后測定鎮痛效應(52 0C水浴)ο熱甩尾法測定CDL伴隨給藥對小鼠基礎痛閾以及嗎啡鎮痛效能的影響。分別將小鼠的尾巴(約3cm)浸入52°C的恒溫水浴鍋，以開始出現縮尾反應的時間作為痛閾指標。疼痛反應截止期為10s。記錄給藥前后的添足潛伏期，按照公式計算出最大鎮痛效應百分比(MPE) 0MPE( % )=(給藥后潛伏期-給藥前潛伏期)/(20-給藥前潛伏期)X 100。
[0074](4)實驗結果描述:
[0075]如圖5所示，圖5A為隨著給藥天數的增加，芬太尼鎮痛作用降低，形成耐受現象。而鞘內給予不同劑量紫堇達明(CDL)能夠緩解慢性耐受的形成，其中高劑量的紫堇達明(CDL)(10yg，it.)效果最好。CDL在此劑量下對正常小鼠痛閾值沒有顯著影響。鎮痛效果以最大鎮痛百分率(％MPE)表示。圖5B為鎮痛曲線下面積(11 = 12，與模型組相比，沖<0.05，*沖<
0.01)。
【主權項】
1.一種藥物及其組合物在制備預防和治療阿片類藥物鎮痛作用耐受性的藥物中的用途，所述藥物及其組合物包含紫堇達明作為有效成分。2.如權利要求1所述，其特征在于，所述藥物及其組合物以紫堇達明為延緩或抑制阿片類藥物鎮痛作用耐受性的活性成分，加上藥學上可接受的載體，制備成制劑配合阿片類藥物使用。3.如權利要求1所述，其特征在于，所述藥物及其組合物以紫堇達明為延緩或抑制阿片類藥物鎮痛作用耐受性的活性成分，與阿片類藥物制成復方制劑使用。4.如權利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述制劑、復方制劑分別選自注射液、皮下埋植劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、緩釋劑中的一種。
【文檔編號】A61P29/00GK105878239SQ201610300240
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月4日
【發明人】劉吉華, 余伯陽, 洪緋, 戴文玲
【申請人】中國藥科大學, 漳州片仔癀藥業股份有限公司